Улучшенные высококонцетрированные жидкие препараты антител против tnf-альфа

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается жидкого водного фармацевтического препарата, содержащего человеческое антитело против TNFα, а именно: адалимумаба в концентрации 100 мг/мл, 1 мг/мл полисорбата-80, 42 мг/мл маннита и воду. Заявлены также способы лечения болезней, ассоциированных с вредной активностью TNFα, путем введения пациенту указанного препарата. Группа изобретений обеспечивает повышенную биодоступность при подкожном введении субъекту, при этом уменьшается боль, ассоциированная с инъекцией препарата у субъекта.10 н. и 11 з.п. ф-лы, 26 табл., 9 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США № 61/412728, поданной 11 ноября 2010, и предварительной заявки на выдачу патента США № 61/413960, поданной 15 ноября 2010, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Получение препарата терапевтических белков, таких как антитела, часто является проблемой, с учетом многочисленных необходимых свойств, которые препарат должен иметь для того, чтобы он был экономически и терапевтически эффективным, например, стабильности, пригодности для введения, концентрации. Известно, что во время производства, хранения и доставки терапевтические белки подвергаются физическому и химическому разрушению. Такая нестабильность может снижать эффективность белка и увеличивать риск неблагоприятных эффектов у пациентов, и, следовательно, в значительной степени влиять на вынесение разрешения контролирующими органами (смотри, например, Wang с соавторами, J. Pharm. Sci. 96: 1, 2007). В это связи стабильный препарат белка необходим для успешности терапевтического белка.

Для эффективности многие терапевтические белки требуют введения высоких доз, которые в идеальном случае готовят в виде высококонцентрированных препаратов. Препараты с высокой концентрацией белка являются желательными, поскольку они могут повлиять на способ (например, внутривенное введение по сравнению с подкожным) и частоту введения лекарственного средства субъекту.

Несмотря на пользу препаратов с высокой концентрацией белка, приготовление препаратов терапевтических белков высокой концентрации связано с многочисленными проблемами. Например, увеличение концентрации белка часто отрицательно влияет на агрегацию, растворимость, стабильность белка и вязкость (смотри, например, Shire с соавторами, J. Pharm. Sci. 93: 1390, 2004). Повышенная вязкость, которая является очень распространенной проблемой для растворов белков в высокой концентрации, может иметь отрицательное влияние на развитие событий при введении препарата, например, вызывать синдромы ощущения боли и жжения, и вызывать ограничения при производстве, обработке, заполнении и параметрах устройств для доставки лекарственных средств (смотри, например, Shire с соавторами, J. Pharm. Sci. 93: 1390, 2004). Даже в случае терапевтических белков, обладающих обычными структурными признаками, например, антител, одобренные в настоящее время препараты содержат варьирующие ингредиенты и диапазоны концентраций. Например, антитело против CD20 ритуксан готовят для внутривенного введения в концентрации 10 мг/мл, тогда как антитело против RSV синагис готовят для внутримышечного введения в концентрации 100 мг/мл. Таким образом, препараты с высокой концентрацией белка, особенно препараты антител, которые можно применять в терапевтических целях, остаются проблематичными.

Другой проблемой, связанной с терапевтическими белками, такими как антитела, является доставка лекарственного средства. В то время как устройства для самостоятельного введения позволяют пациентам избегать не являющихся необходимыми походов в медицинские учреждения для получения лечения, самоанализ и боязнь пациентом боли, ассоциированной с самостоятельным введением, часто могут влиять на доставку самостоятельно вводимого лекарственного средства. Кроме того, препараты, имеющие высокие концентрации белка, могут иметь высокую вязкость, что приводит к повышенной боли при доставке, особенно в случае подкожного введения. Таким образом, существует необходимость в высококонцентрированных препаратах, которые, в частности, снижают боль, ассоциированную с доставкой лекарственного средства (например, самостоятельной инъекцией).

Соответственно, существует необходимость в стабильных препаратах белков с высокой концентрацией, которые обеспечивают преимущества при дозировании и введении, особенно в отношении уменьшения боли у пациента и/или в отношении улучшенной биодоступности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии новых препаратов терапевтических антител высокой концентрации (включая человеческие антитела против TNFα или их антигенсвязывающие фрагменты, например, адалимумаб). Препараты согласно изобретению обеспечивают ряд неожиданных свойств, учитывая высокую концентрацию терапевтического антитела. В частности, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические препараты, содержащие человеческие антитела против TNFα, которые неожиданно имеют улучшенную биодоступность или обеспечивают уменьшенную боль при подкожной инъекции.

В частности, настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном и удивительном открытии того, что препарат, содержащий высокую концентрацию антител, поверхностно-активное вещество и полиол, обеспечивает значительно уменьшенную боль у пациента во время доставки лекарственного средства, особенно при подкожном введении антитела, например, при самостоятельной инъекции. Препараты согласно изобретению созданы, по меньшей мере отчасти, на неожиданном открытии того, что терапевтический белок (например, антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающая часть) может оставаться растворимым при высокой концентрации белка (например, по меньшей мере приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 105, 110 мг/мл или больше) и сохранять вязкость, подходящую для инъекции (например, в случае подкожного введения). Кроме того, препарат согласно настоящему изобретению является удивительным в том, что препарат не содержит буфера или соли, и, тем не менее, имеет высокую концентрацию антитела. Примечательно, что препарат согласно изобретению уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией у пациента по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или больше) по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, содержащего по меньшей мере одну соль и/или по меньшей мере один буфер.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть; поверхностно-активное вещество; и полиол; при этом препарат не содержит буфера или соли и уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией, у пациента по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или больше) по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, содержащего по меньшей мере одну соль и/или по меньшей мере один буфер.

В другом аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть, поверхностно-активное вещество и менее чем 50 мг/мл полиола, при этом инъекция препарата человеку приводит к оценке боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) меньше чем 1,0. В одном варианте изобретение относится к жидкому водному препарату, по существу, состоящему из выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, поверхностно-активного вещества и менее чем 50 мг/мл полиола, при этом инъекция препарата человеку приводит к оценке боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) менее чем 1,0. В одном варианте шкала ВАШ имеет диапазон от 0 (нет боли) до 10 (мучительная боль).

В следующем аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему выделенное человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть, поверхностно-активное вещество и менее чем 50 мг/мл полиола, при этом препарат не содержит буфера и соли, и при этом инъекция препарата уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией, у человека по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, который содержит соль и/или буфер. В одном варианте во всем остальном идентичный препарат содержит цитратный и фосфатный буфер и хлорид натрия.

Изобретение, кроме того, относится к жидкому водному препарату, содержащему антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть в концентрации по меньшей мере приблизительно 50 мг/мл; поверхностно-активное вещество; и полиол, при этом препарат имеет проводимость менее чем приблизительно 2 мС/см. В одном варианте препарат имеет проводимость менее чем 1 мС/см. В другом варианте препарат имеет проводимость менее чем 0,9 мС/см.

В другом варианте изобретение также относится к жидкому водному препарату, содержащему антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть в концентрации по меньшей мере приблизительно 50 мг/мл; поверхностно-активное вещество; и полиол, при этом антитело или его антигенсвязывающая часть имеет в препарате гидродинамический диаметр менее чем 4 нм. В одном варианте антитело или его антигенсвязывающая часть имеет в препарате гидродинамический диаметр менее чем 3 нм.

Настоящее изобретение также относится к жидкому водному препарату, содержащему выделенное человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть; поверхностно-активное вещество; и менее чем 50 мг/мл полиола; при этом препарат обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из проводимости менее чем приблизительно 2 мС/см; гидродинамического диаметра (D_h), который по меньшей мере приблизительно на 50% меньше чем D_h белка в забуференном растворе в данной концентрации; и гидродинамического диаметра (D_h) менее чем приблизительно 4 нм. В одном варианте препарат имеет проводимость менее чем приблизительно 1 мС/см. В другом варианте препарат имеет проводимость менее чем приблизительно 0,9 мС/см. В одном варианте антитело или его антигенсвязывающая часть имеет гидродинамический диаметр в препарате менее чем приблизительно 3 нм. В другом варианте антитело или его антигенсвязывающая часть имеет в препарате гидродинамический диаметр менее чем приблизительно 2 нм.

Изобретение также относится к жидкому водному препарату, по существу, состоящему из антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части; поверхностно-активного вещества; и полиола; при этом концентрация антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части составляет по меньшей мере приблизительно 50 мг/мл, 75 мг/мл, 100 мг/мл или больше 100 мг/мл.

В конкретном варианте изобретение относится к жидкому водному препарату, по существу, имеющему концентрацию 90-110 мг/мл выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, имеющей вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO: 3, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 1, 4, 5, 7 или 8, домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и имеющей вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность SEQ ID NO: 4, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11, домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; полисорбат, например, полисорбат 80; и приблизительно 38-46 мг/мл полиола, например, маннита.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему выделенное человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть; поверхностно-активное вещество; и менее чем 50 мг/мл полиола; при этом препарат является стабильным вплоть до приблизительно 30 градусов C в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток, приблизительно 10 суток, или приблизительно 14 суток, или является стабильным приблизительно при 28 градусах C в течение приблизительно до 24 месяцев.

В другом аспекте изобретение относится к способу введения выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части субъекту так, чтобы боль, вызванная инъекцией, была уменьшена при введении, при этом указанный способ включает в себя подкожное введение субъекту препарата, содержащего антитело или его антигенсвязывающую часть, при котором боль, вызванная инъекцией, уменьшена при введении, при этом препарат содержит больше 50 мг/мл антитела, или его антигенсвязывающей части; поверхностно-активное вещество; и менее чем 50 мг/мл полиола. В одном варианте определяют, что вызванная инъекцией боль имеет оценку меньше 1,0 согласно визуальной аналоговой шкале боли (ВАШ).

В некоторых вариантах боль, ассоциированную с инъекцией, оценивают, используя визуальную аналоговую шкалу боли (ВАШ). В одном варианте шкала ВАШ имеет диапазон от 0 (нет боли) до 10 (мучительная боль).

В некоторых вариантах боль, ассоциированную с инъекцией, оценивают после инъекции (например, сразу же, не более чем через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 минут, или не более чем 15 минут после инъекции).

В некоторых вариантах препарат уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией, у пациента по меньшей мере приблизительно на 60%, 70%, 80% или больше по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, содержащего по меньшей мере одну соль и/или по меньшей мере один буфер.

Изобретение, кроме того, относится к жидкому водному препарату, содержащему антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть в концентрации по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100 мг/мл или больше 100 мг/мл; поверхностно-активное вещество; и полиол; при этом препарат не содержит буфера и соли.

В другом аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему выделенное человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть; поверхностно-активное вещество; и менее чем 50 мг/мл полиола; при этом препарат является стабильным вплоть до приблизительно 30 градусов C в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 7 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 8 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 9 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 10 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 11 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 12 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 13 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 14 суток. В одном варианте препарат является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере приблизительно 15 суток.

В одном варианте полиолом, используемым в препарате согласно изобретению, является маннит или сорбит.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит приблизительно 20-60 мг/мл маннита или альтернативно, приблизительно 30-50 мг/мл. В одном варианте препарат содержит приблизительно 38-46 мг/мл маннита.

Настоящее изобретение также основано, по меньшей мере частично, на неожиданном и удивительном открытии того, что препарат, имеющий высокую концентрацию антитела и поверхностно-активное вещество, обеспечивает значительно более высокую биодоступность, чем сходные препараты, содержащие дополнительные эксципиенты, такие как буфер, полиол и/или соль.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему поверхностно-активное вещество и 30-90 мг выделенного человеческого антитела против TNFα или антигенсвязывающей части, при этом препарат имеет концентрацию антитела 90-110 мг/мл, и при этом препарат обеспечивает повышенную биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части у человека при подкожной инъекции препарата по сравнению с препаратом, содержащим цитратно-фосфатный буфер, хлорид натрия и маннит.

В одном аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, по существу, состоящему из поверхностно-активного вещества и 30-90 мг выделенного человеческого антитела против TNFα или антигенсвязывающей части, при этом концентрация антитела или его антигенсвязывающей части составляет 90-110 мг/мл.

В другом аспекте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему поверхностно-активное вещество и 30-90 мг выделенного человеческого антитела против TNFα или антигенсвязывающей части, при этом препарат имеет концентрацию антитела 90-110 мг/мл, и при этом препарат обеспечивает повышенную биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части у человека при подкожной инъекции препарата, так что антитело или его антигенсвязывающая часть имеет AUC_0-360 больше чем приблизительно 1300 мкг*час/мл.

В другом аспекте изобретение относится к способу повышения биодоступности выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части у человека, при этом указанный способ включает в себя введение субъекту препарата, содержащего эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части и поверхностно-активное вещество, при котором биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышена, при этом препарат не содержит буфера, полиола или соли.

В следующем аспекте изобретение относится к способу повышения биодоступности выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части у субъекта, при этом указанный способ включает в себя введение препарата, содержащего эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части и поверхностно-активное вещество, субъекту так, что биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части у субъекта при этом повышена по меньшей мере приблизительно на 15% по сравнению со вторым препаратом, при этом препарат не содержит буфера, полиола или соли, и при этом второй препарат содержит буфер, полиол и соль. В одном варианте биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышена по меньшей мере приблизительно на 30% по сравнению со вторым препаратом. В одном варианте биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышена по меньшей мере приблизительно на 40% по сравнению со вторым препаратом.

Изобретение, кроме того, относится к способу повышения биодоступности выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части у человека, при этом указанный способ включает в себя введение препарата, содержащего поверхностно-активное вещество и эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части, субъекту, в результате такого введения биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышается, при этом препарат обладает свойством, выбранным из группы, состоящей из проводимости, составляющей менее чем, приблизительно 2 мС/см; при этом антитело или его антигенсвязывающая часть имеет гидродинамический диаметр (D_h), который по меньшей мере приблизительно на 50% меньше, чем D_h антитела или его антигенсвязывающей части в забуференном растворе при данной концентрации; и антитело или его антигенсвязывающая часть имеет гидродинамический диаметр (D_h), составляющий меньше чем приблизительно 4 нм. В одном варианте препарат имеет проводимость меньше, чем приблизительно 1 мС/см. В другом варианте препарат имеет проводимость меньше, чем приблизительно 0,9 мС/см. В одном варианте антитело или его антигенсвязывающая часть имеет в препарате гидродинамический диаметр меньше, чем приблизительно 3 нм.

В одном варианте биодоступность определяют в соответствии либо с уровнем AUC, либо с Cmax. В одном варианте биодоступность определяют в соответствии либо с AUC_0-360, либо с AUC_0-1344. В одном варианте биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части соответствует AUC_0-360 больше чем приблизительно 1300 мкг*час/мл при подкожной инъекции человеку.

В некоторых вариантах антитело против TNFα представляет собой выделенное антитело человека (например, антитело IgG1 каппа человека), гуманизированное антитело, химерное антитело или мышиное антитело. Например, химерное антитело может представлять собой инфликсимаб или биологически подобный ему препарат, и человеческое антитело может представлять собой голимумаб или адалимумаб или биологически подобный им препарат.

В одном варианте человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть представляет собой IgG1 или IgG4.

В одном варианте человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNFα человека с K_d 1×10^-8 М или меньше и имеет константу скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, при этом оба показателя определяют с использованием резонанса поверхностного плазмона. В некоторых вариантах человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNFα человека с K_d 1×10^-8 М или меньше и константу скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, при этом оба показателя определяют с использованием резонанса поверхностного плазмона, и нейтрализует цитотоксичность TNFα человека в стандартном анализе in vitro L929 с IC₅₀ 1×10^-7 М или меньше.

В некоторых вариантах человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики: диссоциирует из комплекса с TNFα человека с константой скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, которую определяют с использованием резонанс поверхностного плазмона; имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO: 3, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или от одной до пяти консервативными аминокислотными заменами в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9; и (c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность SEQ ID NO: 4, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или от одной до пяти консервативными аминокислотными заменами в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

В некоторых вариантах человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть имеет вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO: 3, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность SEQ ID NO: 4, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

В некоторых вариантах человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть имеет вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO: 3, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 1, 4, 5, 7 или 8, домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и имеет вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность SEQ ID NO: 4, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11, домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В некоторых вариантах человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть имеет вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В одном варианте человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть содержит CDR, соответствующий адалимумабу.

В одном варианте человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть представляет собой адалимумаб или голимумаб, или биологически подобный им препарат.

В некоторых вариантах концентрация человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 50 мг/мл, приблизительно 75 мг/мл, приблизительно 100 мг/мл или больше 100 мг/мл. В одном варианте концентрация человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в препарате согласно изобретению составляет 90-110 мг/мл. В одном варианте концентрация человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в препарате согласно изобретению составляет 95-105 мг/мл. В одном варианте препарат содержит более 75 мг/мл антитела или его антигенсвязывающей части. В одном варианте изобретение относится к стабильному жидкому водному препарату, содержащему высокую концентрацию, например, 75-125 мг/мл человеческого антитела против hTNFα.

В некоторых вариантах поверхностно-активным веществом, используемым в препарате согласно изобретению, является полисорбат. В одном варианте концентрация полисорбата составляет приблизительно 0,1-1,5 мг/мл, приблизительно 0,2-1,4 мг/мл, приблизительно 0,3-1,3 мг/мл, приблизительно 0,4-1,2 мг/мл, приблизительно 0,5-1,1 мг/мл, приблизительно 0,6-1,0 мг/мл, приблизительно 0,6-1,1 мг/мл, приблизительно 0,7-1,1 мг/мл, приблизительно 0,8-1,1 мг/мл или приблизительно 0,9-1,1 мг/мл. В некоторых вариантах полисорбат имеет концентрацию приблизительно 0,1-10 мг/мл, приблизительно 0,5-5 мг/мл, приблизительно 0,1-2 мг/мл или приблизительно 1 мг/мл. В одном варианте поверхностно-активным веществом является полисорбат 80.

В некоторых вариантах пациентом является человек или млекопитающее, отличное от человека. В некоторых вариантах препаратом является препарат 3 или препарат 4, описанные в примерах.

В некоторых вариантах во всем остальном идентичным препаратом является коммерчески доступный препарат адалимумаб, содержащий адалимумаб, хлорид натрия, дигидрат одноосновного фосфата натрия, дигидрат двухосновного фосфата натрия, цитрат натрия, моногидрат лимонной кислоты, маннит, полисорбат 80 и воду для инъекций.

В одном варианте во всем остальном идентичный препарат содержит буфер и соль. В некоторых вариантах соль представляет собой нейтральную соль или соль основания (например, NaOH), используемую для корректировки pH. В некоторых вариантах буфер содержит фосфатный буфер и/или цитратный буфер. Например, фосфатный буфер может содержать приблизительно 1,35-1,75 мг/мл или приблизительно 1,50-1,56 мг/мл Na₂HPO₄·2H₂O и приблизительно 0,75-0,95 мг/мл или приблизительно 0,83-0,89 мг/мл NaH₂PO₄·2H₂O). Цитратный буфер может содержать приблизительно 1,15-1,45 мг/мл или приблизительно 1,30-1,31 мг/мл лимонной кислоты·H₂O и приблизительно 0,2-0,4 мг/мл или приблизительно 0,30-0,31 мг/мл дигидрата цитрата натрия. По меньшей мере, одна соль может представлять собой нейтральную соль, такую как нейтральная натриевая соль (например, NaCl).

В одном варианте препарат согласно изобретению является фармацевтическим препаратом.

В некоторых вариантах препарат согласно изобретению подходит для подкожной инъекции. В одном варианте препарат согласно изобретению подходит для самостоятельного подкожного введения субъектом.

В некоторых вариантах объем водного препарата составляет не более чем 1,5 мл, 1,0 мл, 0,8 мл, 0,5 мл или 0,4 мл.

В некоторых вариантах препарат содержит дозу приблизительно 30-90 мг антитела или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит приблизительно 40 мг антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит приблизительно 50 мг антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит приблизительно 60 мг антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит приблизительно 70 мг антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит приблизительно 80 мг антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит приблизительно 90 мг антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит 60-85 мг. В другом варианте препарат содержит 70-90 мг. В еще одном варианте препарат содержит 30-110 мг. В одном варианте препарат содержит 70-110 мг.

Другой аспект изобретения относится к предварительно заполняемому шприцу или автоинжекторному устройству, содержащему любой из препаратов согласно изобретению, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах водный препарат, который хранится в предварительно заполняемом шприце или автоинжекторном устройстве, содержит приблизительно 40 мг адалимумаба или биологически подобного ему препарата. В некоторых вариантах водный препарат, который хранится в предварительно заполняемом шприце или автоинжекторном устройстве, содержит приблизительно 80 мг адалимумаба или биологически подобного ему препарата.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения расстройства, ассоциированного с вредной активностью TNFα у пациента, включающему в себя введение пациенту любого из препаратов, описанных в настоящей заявке.

В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего ревматоидный артрит. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего болезнь Крона. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего псориатический артрит. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего псориаз. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего ювенильный идиопатический артрит (JIA). В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего анкилозирующий спондилит. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего язвенный колит. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего гнойный гидраденит. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего диабетическую ретинопатию. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего гигантоклеточный артериит. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего болезнь Бехчета. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего саркоидоз, например, саркоидоз кожи. В одном варианте препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего аксиальную спондилоартропатию. В одном варианте, препарат или способ согласно изобретению применяют для лечения субъекта, имеющего увеит.

В одном варианте препарат вводят субъекту с периодичностью, выбранной из группы, состоящей из еженедельного введения, введения раз в две недели, каждые три недели и ежемесячно. В одном варианте препарат согласно изобретению содержит 30-90 мг человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, его и вводят по схеме дозирования раз в две недели. В другом варианте препарат согласно изобретению содержит 30-90 мг человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, и его вводят согласно ежемесячной схеме дозирования. В одном варианте препарат согласно изобретению содержит 60-85 мг человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, и его вводят по схеме дозирования раз в две недели. В другом варианте препарат согласно изобретению содержит 60-85 мг человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, и его согласно ежемесячной схеме дозирования.

В некоторых вариантах введение препарата согласно изобретению субъекту осуществляют посредством самостоятельного введения.

Предполагается, что любой вариант, описанный в настоящей заявке, можно сочетать с одним или несколькими другими вариантами осуществления изобретения, включая варианты, описанные только в отношении одного аспекта изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой панель графиков, которые показывают, что введение высококонцентрированных препаратов 1 (F1) и 2 (F2) приводит к значимому уменьшению оценки боли во всех временных точках после инъекции (немедленно, 15 минут и 30 минут), по сравнению с другими группами лечения (F4 и современный коммерческий препарат).

На фигуре 2 на линейной шкале показаны средние и стандартные отклонения концентраций адалимумаба в сыворотке на протяжении периода времени 56 суток после однократной подкожной дозы 40 мг адалимумаба.

Фигуры 3A и 3B представляют собой графики, которые показывают стабильность различных препаратов адалимумаба, оцениваемой по суммарному количеству агрегатов в препаратах (3A) или суммарному количеству агрегатов (3B) в определенном диапазоне полисорбата или диапазоне полиола.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Определения

Чтобы настоящее изобретение можно было легко понять, сначала определены некоторые термины. Кроме того, следует отметить, что во всех случаях, когда указано значение или диапазон значений параметра, имеют в виду, что значения и диапазоны, промежуточные относительно указанных значений также считаются частью настоящего изобретения.

Термин «боль, ассоциированная с инъекцией (у пациента)» в используемом в настоящем описании смысле относится к боли, ассоциированной с инъекцией лекарственного средства в ткань пациента или субъекта. В одном варианте боль является независимой от боли, вызываемой устройством для инъекции (если таковая имеет место), такого как устройство с иглой для инъекций. В одном варианте боль, ассоциированная с инъекцией, может быть вызвана лекарственным препаратом, инъецируемым в ткань пациента.

Боль, ассоциированную с инъекцией, можно оценить, используя ряд известных в данной области средств, таких как визуальная аналоговая шкала боли (ВАШ). Измерение боли в одном варианте поддается количественной оценке, так что уменьшение/увеличение в процентах по шкале боли можно непосредственно сравнить, используя статистические способы. Например, когда используют визуальную аналоговую шкалу боли, числовое значение боли (например, среднее ± SD) можно оценить для каждой группы лечения, так что можно рассчитать увеличение или уменьшение в процентах.

В общем, визуальная аналоговая шкала (ВАШ) является инструментом измерения, который измеряет характеристику или положение, которое, как полагают, находится в определенном диапазоне непрерывного множества значений (смотри, например, Singer and Thods (1998) Academic Emergency Medicine 5: 1007). Например, количество боли, которое пациент чувствует, находится в диапазоне непрерывного множества от отсутствия боли (оценка, например, 0) до экстремального количества боли (оценка, например, 10). С точки зрения пациента такой спектр кажется непрерывным - их боль не делает дискретных прыжков, так как ранжирование может предлагать отсутствие боли, слабую, умеренную и тяжелую боль. В процессе оценки ВАШ обычно представляет собой горизонтальную линию длиной 100 мм, фиксированную словесными дескрипторами на каждом конце, такими как «нет боли» на одном конце и «экстремальная боль» (или некоторые его вариации) на другом конце. Пациенты делает пометку на линии в точке (например, оценка 0-10), которую, как они чувствуют, соответствует их ощущению имеющегося на данный момент состояния. Оценку ВАШ можно определить, измеряя расстояние в миллиметрах с левой стороны линии до точки, которую пациент отмечает.

Существуют различные способы представления ВАШ, включая вертикальные линии и линии с дополнительными дескрипторами. Смотри публикацию Wewers и Lowe («A critical review of visual analogue scales in the measurement of clinical phenomena». Research in Nursing and Health 13: 227-236, 1990, включенную в настоящее описание в виде ссылки), в которой приведено основанное на информации обсуждение преимуществ и недостатков разных стилей ВАШ.

Термин «жидкий препарат» относится к препарату в жидком состоянии, и не предназначен для обозначения ресуспендированных лиофилизированных препаратов. Жидкий препарат согласно изобретению является стабильным при хранении, и не основан на лиофилизации (или других способах изменения состояния, например, распылительной сушке) для обеспечения стабильности.

Термин «жидкий водный препарат» относится к жидкому препарату, в котором в качестве растворителя используют воду. В одном варианте жидкий водный препарат представляет собой препарат, который сохраняет стабильность (например, химическую и/или физическую стабильность/и/или биологическую активность) без необходимости в лиофилизации, распылительной сушке и/или замораживании.

Термин «фармацевтическая» в используемом в настоящем описании смысле относится к композиции, например, к водному препарату, который применим для лечения заболевания или расстройства.

Подразумевается, что термин «субъект» или «пациент» включает организмы млекопитающих. Примеры субъектов/пациентов включают человека и млекопитающих, отличных от человека, например, приматов, отличных от человека, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. В конкретных вариантах осуществления изобретения субъектом является человек.

Термин «эксципиент» относится к средству, которое может быть добавлено к препарату, чтобы обеспечить требуемое свойство, например, консистенцию, повышенную стабильность и/или чтобы скорректировать осмоляльность. Примеры обычно используемых эксципиентов включают без ограничения сахара, полиолы, аминокислоты, поверхностно-активные вещества и полимеры.

Обычно используемым эксципиентом является полиол. В используемом в настоящем описании смысле «полиол» представляет собой вещество с множеством гидроксильных групп, и включает сахара (восстанавливающие и невосстанавливающие сахара), сахарные спирты и сахарные кислоты. Неограничивающими примерами полиолов являются фруктоза, манноза, мальтоза, лактоза, арабиноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза, глюкоза, сахароза, трегалоза, сорбоза, мелезитоза, раффиноза, маннит, ксилит, эритрит, треит, сорбит, глицерин, L-глюконат и их соли с металлами. В одном варианте полиолом, используемым в препарате или способах согласно изобретению является маннит. В одном варианте полиолом, используемым в препарате или способах согласно изобретению является сорбит.

«Терапевтически активное антитело» или «терапевтическое антитело» относится к антителу, которое может быть применено в терапевтических целях, т.е., для лечения расстройства у субъекта. Следует отметить, что хотя терапевтические белки могут быть применены в целях лечения, изобретение не ограничено таким применением, так как указанные белки также могут быть использованы для исследований in vitro.

В используемом в настоящем описании смысле «буфер» является средством (средствами) в растворе, которое позволяет раствору противодействовать изменениям pH при действии его кислотно-щелочных конъюгированных компонентов. Примеры буферов включают ацетат (например, ацетат натрия), сукцинат (такой как сукцинат натрия), глюконат, гистидин, метионин, цитрат, фосфат, цитрат/фосфат, имидазол, их сочетания и другие буферы на основе органических кислот. В одном варианте буфер не является белком. Буфер может обеспечивать pH раствора в диапазоне приблизительно от 4 до приблизительно 8; приблизительно от 4,5 до приблизительно 7; или приблизительно от 5,0 до приблизительно 6,5.

Хотя препараты согласно изобретению не содержат буфера(ов), во всем остальном идентичные препараты, содержащие один или несколько буферов, могут быть использованы в целях сравнения боли или биодоступности. Примеры таких буферов включают фосфат, ацетат {например, ацетат натрия), сукцинат (такой как сукцинат натрия), глюконат, глутамат, гистидин, цитрат и другие буферы на основе органических кислот. В одном варианте типичный буфер, входящий в состав во всем остальном идентичного препарата, содержит цитратный буфер и/или фосфатный буфер.

В используемом в настоящем описании смысле термин «поверхностно-активное вещество», в общем, включает средство, которое защищает белок, например, антитело, от индуцированного поверхностью раздела воздух/раствор стресса, индуцированного раствором/поверхностью стресса, чтобы уменьшить агрегацию антитела или минимизировать образование частиц в препарате. Примеры поверхностно-активных веществ включают без ограничения неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20 и 80) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Термин «поверхностно-активное вещество» или «детергент» включает неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как без ограничения полисорбаты. В одном варианте поверхностно-активное вещество включает полоксамеры, например, полоксамер 188, полоксамер 407; алкиловые эфиры полиоксиэтилена, например, Brij 35, кремофор A25, Sympatens ALM/230; и полисорбаты/твины, например, полисорбат 20 (твин 20), полисорбат 80 (твин 80), Mirj и полоксамеры, например, полоксамер 188.

«Стабильный» препарат представляет собой препарат, в котором антитело по существу сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность во время процесса производства и/или при хранении. Различные аналитические методики для измерения стабильности белков доступны в данной области, и обзор таких методик приведен в публикациях Peptide and Protein Drug Delivery 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991); and Jones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (обе публикации включены в виде ссылки). Например, в одном варианте стабильность белка определяют по процентному содержанию мономера белка в растворе, с низким процентным содержанием расщепленного (например, фрагментированного) и/или агрегированного белка. В одном варианте препарат может быть стабильным при комнатной температуре, приблизительно при 25-30°C или при 40°C в течение по меньшей мере 1 месяца и/или стабильным приблизительно при 2-8°C в течение по меньшей мере 1 месяца, 1 года или, альтернативно, в течение по меньшей мере 2 лет. В другом варианте препарат может быть стабильным приблизительно до 30 градусов C в течение по меньшей мере приблизительно 6 суток, приблизительно 10 суток или приблизительно 14 суток, или является стабильным приблизительно при 28 градусах C в течение приблизительно 24 месяцев. В одном варианте препарат может быть стабильным после заморозки (например, до -70°C) и размораживания препарата, далее называемых «циклом замораживания/размораживания».

Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если оно по существу не проявляет признаков, например, агрегации, преципитации и/или денатурации при визуальном исследовании окраски и/или прозрачности, или при измерении с использованием УФ-светорассеяния или эксклюзионной хроматографии по размеру. Агрегация представляет собой процесс, при котором отдельные молекулы или комплексы ассоциируют ковалентно или нековалентно с образованием агрегатов. Агрегация может происходить в такой степени, что образуется видимый осадок.

Стабильность, такую как физическая стабильность препарата, можно оценивать способами, хорошо известными в данной области, включая измерение кажущегося затухания в образце света (поглощение или оптическая плотность). Такое измерение затухания света имеет отношение к мутности препарата. Мутность препарата отчасти является свойством, присущим белку, растворенному в растворе, и ее обычно определяют с помощью нефелометрии, и измеряют в нефелометрических единицах мутности (NTU).

Степень мутности, например, в виде функции концентрации одного или нескольких компонентов в растворе, например, концентрации белка и/или соли, также называют «опалесценцией» или «видимой опалесценцией» препарата. Степень мутности можно вычислить по стандартной кривой, полученной с использованием суспензий с известной мутностью. Эталонные стандарты для определения степени мутности в случае фармацевтических композиций могут быть основаны на критериях Европейской фармакопеи (European Pharmacopoeia, Fourth Ed., Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe (EDQM), Strasbourg, France). Согласно критериям Европейской фармакопеи Pharmacopeia прозрачный раствор определяют как раствор с мутностью меньше или равной мутности эталонной суспензии, которая имеет мутность примерно 3 согласно стандартам Европейской фармакопеи. Нефелометрические измерения мутности могут регистрировать рэлеевское рассеяние, которое обычно изменяется линейно с изменением концентрации в отсутствие ассоциации или эффектов отклонения от идеальности. Другие способы оценки физической стабильности хорошо известны в данной области.

Антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом препарате, если химическая стабильность в данный момент времени такова, что считается, что антитело еще сохраняет свою биологическую активность, которая определена ниже. Химическую стабильность можно оценивать, например, выявляя и количественно оценивая химически измененные формы антитела. Химическое изменение может включать модификацию размера (например, усечение), которую можно оценивать, используя, например, эксклюзионную хроматографию по размеру, SDS-ПААГ и/или матрично-ассоциированную лазерную десорбцию и ионизацию/времяпролетную масс-спектрометрию (MALDI/TOF MS). Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например, возникающее в результате дезамидирования или окисления), которое можно оценить, например, при ионообменной хроматографии.

Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом препарате, если антитело в фармацевтическом препарате является биологически активным для предполагаемой цели. Например, биологическая активность сохраняется, если биологическая активность антитела в фармацевтическом препарате составляет приблизительно 30%, приблизительно 20% или приблизительно 10% (в пределах погрешностей анализа) от биологической активности, проявляемой в момент, когда фармацевтический препарат получали (например, как определено в анализе связывания антигена).

В фармакологическом смысле в контексте настоящего изобретения «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» антитела относится к количеству, эффективному для профилактики или лечения или ослабления симптома расстройства, в случае лечения которого антитело является эффективным.

Подразумевают, что термин «TNF-альфа человека» (сокращенно в настоящем описании hTNF-альфа, TNFα или просто hTNF) в используемом в настоящем описании смысле относится к цитокину человека, который существует в секретируемой форме массой 17 кД и в ассоциированной с мембраной форме массой 26 кД, биологически активная форма которого, состоит из триммера нековалентно связанных молекул с молекулярной массой 17 кД. Структура hTNF-альфа дополнительно описана, например, в публикациях Pennica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J. M., et al. (1987) Biochem 26:1322-1326; and Jones, E. Y., et al. (1989) Nature 338:225-228. Подразумевают, что термин TNF-альфа человека включает рекомбинантный TNF-альфа человека (rhTNF-альфа), который может быть получен стандартными способами экспрессии рекомбинантов или может быть приобретен коммерчески (R & D Systems, № в каталоге 210-TA, Minneapolis, Minn.).

Подразумевается, что термин «антитело» в используемом в настоящем описании смысле относится к молекулам иммуноглобулина, содержащим четыре полипептидных цепи, две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Другие встречающиеся в природе антитела с измененной структурой, такие как, например, антитела верблюдовых, также считаются включенными в данное определение. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно называемой в настоящем описании HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в настоящем описании LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), между которыми находятся более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые распределены от амино-конца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В одном варианте согласно изобретению препарат содержит антитело с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3, подобными последовательностям, описанным в патентах США № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. В некоторых вариантах препарат содержит антитело, которое заявлено в патентах США № 6090382 и 6258562.

В используемом в настоящем описании смысле термин «CDR» относится к определяющей комплементарность области в вариабельной последовательности антитела. Существует три CDR в каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, которые обозначают CDR1, CDR2 и CDR3 для каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Точные границы таких CDR были определены по-разному в соответствии с разными системами. Система, описанная Кабатом (там же), не только обеспечивает четкую систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также позволяет выявить точные границы остатков, определяющих три CDR. Такие CDR могут быть названы CDR согласно системе Кабата. Chothia с соавторами обнаружили, что некоторые субфрагменты в CDR согласно системе Кабата принимают почти идентичные конформации пептидного остова, несмотря на наличие большого разнообразия на уровне аминокислотной последовательности (Chothia с соавторами (1987) Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia с соавторами (1989) Nature 342: 877-883). Такие субфрагменты названы L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где «L» и «H» означают области легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно. Такие области могут быть названы CDR согласно системе Chothia, которые имеют границы, которые перекрываются с CDR согласно системе Кабата. Другие границы, определяющие CDR, перекрывающиеся с CDR согласно системе Кабата, описаны Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 и MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45. Другие определения границ CDR могут не строго следовать одной из указанных выше систем, однако будут перекрываться с CDR согласно Кабату, хотя они могут быть более короткими или более длинными в свете предварительных оценок или экспериментальных данных о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже полные CDR значимо не влияют на связывание антигена. В способах применяемых согласно настоящему изобретению, можно использовать CDR, определяемые согласно любой из указанных систем, хотя в конкретных вариантах использованы CDR, определяемые согласно Кабату или Chothia. В одном варианте антитело, применяемое в способах и композициях согласно изобретению, содержит шесть CDR из антитела адалимумаба.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») в используемом в настоящем описании смысле относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, с hTNF-альфа). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL1 и CH1; (ii) F(ab’)₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два F(ab)-фрагмента, связанных дисульфидной связью в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward с соавторами (1989) Nature 241: 544-546), который состоит из домена VH; и (vi) изолированную область, определяющую комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны с использованием способов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет получать из них одну непрерывную цепь, в которой области VL и VH составляют пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); смотри, например, Bird с соавторами (1988) Science 242: 423-426; и Huston с соавторами (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела. Диантитела являются бивалентными, биспецифичными антителами, в которых домены VH и VL экспрессированы в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, что вынуждает домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и приводит к созданию двух антигенсвязывающих участков (смотри, например, Holliger, P. С соавторами (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. с соавторами (1994) Structure 2: 1121-1123). В одном варианте осуществления изобретения препарат содержит антигенсвязывающие части, описанные в патентах США № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Фраза «рекомбинантное антитело» относится к антителам, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены основанными на рекомбинации способами, например антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител, антитела, выделенные из организма животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулина человека (смотри, например, Taylor с соавторами (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который заключается в сращивании конкретных последовательностей генов иммуноглобулинов (таких как последовательности генов иммуноглобулина человека) с другими последовательностями ДНК. Примеры рекомбинантных антител включают рекомбинантные антитела человека, химерные, CDR-привитые и гуманизированные антитела.

Предполагается, что термин «антитело человека» в используемом в настоящем описании смысле охватывает антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека, применяемые в изобретении, могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные в результате случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo), например, в CDR, и в частности в CDR3. Однако термин «антитело человека» в используемом в настоящем описании смысле не предназначен для определения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты в каркасные последовательности человека.

Термин «химерное антитело» относится к антителам, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи одного вида и последовательности константных областей другого вида, такие как антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепи мыши, связанные с константными областями человека.

Термин «CDR-привитое антитело» относится к антителам, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей одного вида, но в которых последовательности одной или нескольких областей CDR VH и/или VL заменены последовательностями CDR другого вида, таким как антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, в которых одна или несколько CDR мыши (например, CDR3) были заменены последовательностями CDR человека.

Подразумевается, что «выделенное антитело» в используемом в настоящем описании смысле, относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфично связывает hTNF-альфа, по существу не содержит антител, которые специфично связывают другие антигены, отличные от hTNF-альфа). Однако выделенное антитело, которое специфично связывает hTNF-альфа, может обладать перекрестной реактивностью по отношению к другим антигенам, таким как молекулы TNF-альфа других видов. Кроме того, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

Подразумевается, что термин «нейтрализующее» антитело в используемом в настоящем описании смысле (или «антитело, которое нейтрализует активность hTNF-альфа) относится к антителу, связывание которого с hTNF-альфа приводит к ингибированию биологической активности hTNF-альфа. Такое ингибирование биологической активности hTNF-альфа можно оценить измерением одного или нескольких показателей биологической активности hTNF-альфа, таких как индуцированная hTNF-альфа цитотоксичность (либо in vitro, либо in vivo), индуцированная hTNF-альфа активация клеток и связывание hTNF-альфа с рецепторами hTNF-альфа. Такие показатели биологической активности hTNF-альфа можно оценить в нескольких стандартных анализах in vitro или in vivo, известных в данной области и описанных в патентах США № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. В одном варианте способность антитела нейтрализовать активность hTNF-альфа оценивают по ингибированию индуцированной hTNF-альфа цитотоксичности в клетках L929. В качестве дополнительного или альтернативного параметра активности hTNF-альфа можно оценивать способность антитела ингибировать индуцированную hTNF-альфа экспрессию ELAM-1 на HUVEC, в качестве меры индуцированной hTNF-альфа активации клеток.

Термин «резонанс поверхностного плазмона» в используемом в настоящем описании смысле относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ взаимодействий в режиме реального времени посредством регистрации изменений в концентрациях белков на биосенсорной матрице, например, используя систему BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden и Piscataway, N.J.). Дополнительно описание смотри в публикациях Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Подразумевается, что термин «k_on» в используемом в настоящем описании смысле относится к константе скорости ассоциации связывающего белка (например, антитела) с антигеном с образованием, например, комплекса антитело/антиген, как известно в данной области.

Подразумевается, что термин «k_off» в используемом в настоящем описании смысле относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Подразумевается, что термин «K_d» в используемом в настоящем описании смысле относится к константе диссоциации в случае конкретного взаимодействия антитело-антиген, и относится к значению, получаемому при измерении с использованием титрования в равновесии или делением константы скорости диссоциации (k_off) на константу скорости ассоциации (k_on).

В используемом в настоящем описании смысле «биологически подобный» (одобренному эталонному продукту/биологическому лекарственному средству, такому как терапевтический белок, антитело и т.д.) относится к биологическому продукту, который подобен эталонному продукту на основании данных, полученных в результате (a) аналитических исследований, которые демонстрируют, что биологический продукт в высокой степени подобен эталонному продукту, несмотря на небольшие различия в клинически неактивных компонентах; (b) исследований на животных (включая оценку токсичности); и/или (c) клинического исследования или исследований (включая оценку иммуногенности и фармакокинетики или фармакодинамики), которые достаточны для демонстрации безопасности, чистоты и эффективности в одном или нескольких соответствующих условиях применения, для которых эталонный продукт лицензирован и предназначен для применения и для которых нужна лицензия на данный биологический продукт. В одном варианте биологически подобный биологический продукт и эталонный продукт используют один и тот же механизм или механизмы действия в случае условия или условий применения, предписанных, рекомендуемых или предлагаемых на представленной этикетке, но только в той степени, в которой механизм или механизмы действия известны для эталонного продукта. В одном варианте условие или условия применения, предписанные, рекомендуемые или предлагаемые на этикетке, представленной для данного биологического продукта, ранее были одобрены для эталонного продукта. В одном варианте путь введения, форма дозирования и/или сила действия биологического продукта такие же, как в случае эталонного продукта. В одном варианте предприятие, на котором биологический продукт производят, обрабатывают, пакуют или хранят, удовлетворяет стандартам, предназначенным для гарантии того, что биологический продукт продолжает быть безопасным, чистым и эффективным. Эталонный продукт может быть одобрен по меньшей мере в одной из стран: в США, Европе или Японии.

Термин «дозирование» в используемом в настоящем описании смысле относится к введению вещества (например, антитела против TNFα) для достижения терапевтической цели (например, для лечения TNFα-ассоциированного расстройства).

Термины «схема еженедельного дозирования», «еженедельное дозирование» и «еженедельное введение» в используемом в настоящем описании смысле относятся к определенному временному курсу (или периодичности) введения вещества (например, антитела против TNFα) субъекту для достижения терапевтической цели (например, для лечения TNFα-ассоциированного расстройства). В одном варианте антитело или его антигенсвязывающую часть вводят каждые 6-8 суток, или альтернативно каждые 7 суток.

Термины «схема дозирования раз в две недели», «дозирование раз в две недели» и «введение раз в две недели в используемом в настоящем описании смысле относятся к определенному временному курсу (или периодичности) введения вещества (например, антитела против TNFα) субъекту для достижения терапевтической цели (например, для лечения TNFα-ассоциированного расстройства). Подразумевают, что схема дозирования раз в две недели не включает схему еженедельного дозирования. В одном варианте антитело или его антигенсвязывающую часть вводят каждые 9-19 суток, более предпочтительно каждые 11-17 сток, еще более предпочтительно каждые 13-15 суток и наиболее предпочтительно каждые 14 суток.

Термины «схема ежемесячного дозирования», «ежемесячное дозирование» и «ежемесячное введение» в используемом в настоящем описании смысле относятся к определенному временному курсу (или периодичности) введения вещества (например, антитела против TNFα) субъекту для достижения терапевтической цели (например, для лечения TNFα-ассоциированного расстройства). В одном варианте антитело или его антигенсвязывающую часть вводят каждые 28-31 суток. В другом варианте схема ежемесячного дозирования означает, что антитело или его антигенсвязывающую часть вводят каждые 28-31 суток. В другом варианте схема ежемесячного дозирования означает, что антитело или его антигенсвязывающую часть вводят один раз в месяц, например, в один и тот же день каждого месяца, такой как, например, первый день каждого месяца.

AUC, Cmax и Tmax являются фармакокинетическими параметрами, которые можно использовать для характеристики фармакокинетических ответов на конкретный лекарственный продукт у животного или человека. Термин «AUC» относится к «площади под кривой», которая представляет изменения в концентрациях в крови, сыворотке или плазме вещества, например, человеческого антитела против TNFα, с течением времени. В используемом в настоящем описании смысле термин «Cmax» относится к максимальной или пиковой концентрации вещества в крови, плазме или сыворотке, наблюдаемой у субъекта после введения. Термин «Tmax» относится к моменту времени, в который достигается Cmax, который измеряют от временной точки введения.

Термин «гидродинамический диаметр» или «D_h» частицы относится к диаметру сферы, которая имеет плотность воды и такую же скорость, как частица. Таким образом, термин «гидродинамический диаметр антитела» в используемом в настоящем описании смысле относится к определению размера антитела или его антигенсвязывающей части, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента, в растворе с использованием динамического светорассеяния (DLS). Прибор для измерения DLS измеряет зависимые от времени флуктуации интенсивности света, рассеиваемого от антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в растворе при фиксированном угле рассеяния. D_h определяют на основании автокорреляционной функции интенсивности для зависимой от времени флуктуации интенсивности. Данные об интенсивности светорассеяния обрабатывают, используя компьютерную программу для DLS-прибора, чтобы определить значение гидродинамического диаметра и распределение по размеру рассеивающих молекул, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента, в образце.

Термин «проводимость» в используемом в настоящем описании смысле относится к способности водного раствора проводить электрический ток между двумя электродами. Обычно электрическая проводимость или удельная проводимость является мерой способности материала проводить электрический ток. В растворе ток протекает благодаря транспорту ионов. Следовательно, с увеличением количества ионов, присутствующих в водном растворе, раствор будет иметь более высокую проводимость. Единицей измерения проводимости является мкС (мС/см), и проводимость может быть измерена с использованием кондуктометра, продаваемого, например, Orion Research, Inc. (Beverly, MA). Проводимость раствора может быть изменена при изменении концентрации ионов в растворе. Например, концентрация буфера и/или соли в растворе может быть изменена для достижения требуемой проводимости.

Проводимость раствора измеряют способами, известными в данной области. Кондуктометры и ячейки можно использовать для определения проводимости водного препарата, и их следует калибровать по стандартному раствору перед применением. Примеры кондуктометров, имеющихся в данной области, включают цифровой MYRON L (Cole Parmer®), кондуктометр (Metrohm AG) и комбинированные анализаторы проводимости серии 3105/3115 (Kemotron).

Измерения проводимости могут быть проведены с использованием любого коммерчески доступного кондуктометра, подходящего для анализа проводимости в растворах белков, например, кондуктометра модели SevenMulti с возможностью расширения для широкого диапазона pH (Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland). Работу на приборе осуществляют согласно инструкциям производителя (например, если производят замену сенсора проводимости в приборе Mettler Toledo, то необходимо снова осуществить калибровку, так как сенсоры имеют разные константы ячейки; смотри инструкции по эксплуатации кондуктометра модели SevenMulti). Если следовать инструкции, то измерения проводимости можно осуществить, непосредственно погружая измеряющий зонд в образец раствора.

Различные аспекты изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.

II. Препараты и способы согласно изобретению

Отличительным признаком настоящего изобретения являются стабильные жидкие водные фармацевтические препараты, содержащие антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть, имеющую улучшенные свойства по сравнению с известными в данной области препаратами. Хотя высококонцентрированные препараты, содержащие человеческие антитела против TNFα, известны в данной области (смотри, например, US20060153846 и US20100278822), в настоящем изобретении предлагаются высококонцентрированные препараты, имеющие неожиданные характеристики, т.е., в значительной степени уменьшенную боль или повышенную биодоступность. Препараты согласно изобретению основаны, по меньшей мере частично, на сочетании только с одним или двумя эксципиентами, т.е. поверхностно-активным веществом и полиолом или альтернативно только с поверхностно-активным веществом. Несмотря на наличие небольшого количества эксципиентов препараты согласно изобретению содержат высокую концентрацию антитела, например 90-110 мг/мл, и являются стабильными.

Как описано в рабочих примерах ниже, было показано, что препарат, содержащий концентрацию антитела более чем 50 мг/мл выделенного человеческого антитела против TNFα, менее чем 50 мг/мл полиола (такого как маннит) и поверхностно-активное вещество (такое как полисорбат), вызывает очень сильно уменьшенную боль при инъекции по сравнению с другими высококонцентрированными препаратами, включая коммерческий препарат адалимумаб, описанный в US20060153846, и препарат, описанный в US20100278822, при этом каждая из публикаций включена в настоящее описание в виде ссылки. Таким образом, в одном варианте препараты согласно изобретению ассоциированы с уменьшением боли, несмотря на наличие высокой концентрации антитела (например, 100 мг/мл) и отсутствие буфера или соли. Препараты, вызывающие небольшую боль, описанные в настоящей заявке, основаны, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии того, что при удалении или исключении соли (например, NaCl) и/или буфера (например, фосфатного/цитратного буфера) концентрация человеческого антитела против TNF-альфа в препарате может быть увеличена, например, приблизительно до 100 мг/мл, при этом может быть снижена боль при доставке пациенту.

В одном варианте препарат согласно изобретению является неожиданным в отношении того, что препарат не содержит буфера или соли и уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией у пациента по меньшей мере приблизительно на 50% по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, содержащего по меньшей мере одну соль и/или по меньшей мере один буфер. В одном варианте препарат уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией, у человека по меньшей мере приблизительно на 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80% (например, приблизительно на 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80%) по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, который дополнительно содержит соль и/или буфер.

В одном варианте во всем остальном идентичный препарат, используемый для анализа сравнения боли, содержит по меньшей мере один буфер, такой как цитратный буфер и фосфатный буфер и/или соль, например, NaCl. Например, буфер (исключенный из препарата согласно изобретению и присутствующий в эталонном препарате для сравнения боли) может включать моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, дигидрат двузамещенного фосфата натрия и/или дигидрат однозамещенного фосфата натрия. Буфер может содержать приблизительно 1,15-1,45 мг/мл лимонной кислоты (например, приблизительно 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40 или 1,45), приблизительно 0,2-0,4 мг/мл дигидрата цитрата натрия (например, приблизительно 0,2, 0,25, 0,3, 0,35 или 0,4), приблизительно 1,35-1,75 мг/мл дигидрата двузамещенного фосфата натрия (например, приблизительно 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1,70 или 1,75), приблизительно 0,75-0,95 мг/мл дигидрата однозамещенного фосфата натрия (например, приблизительно 0,75, 0,80, 0,85, 0,9 или 0,95). Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к указанным выше концентрациям, также рассматриваются как часть настоящего изобретения. Кроме того, предполагают, что диапазоны значений с использованием сочетания любых из перечисленных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов включены в изобретение, например, от 0,1 до 0,5 мг/мл или 1,20-1,40 мг/мл. В одном варианте pH препарата корректируют, используя гидроксид натрия.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит высокие концентрации человеческих антител против TNFα или их антигенсвязывающих частей, например, 90-110 мг/мл, полиол в концентрации менее чем 50 мг/мл и поверхностно-активное вещество, при этом препарат является подходящим для введения без существенной боли, которую определяют на основании оценки по визуальной аналоговой шкале (ВАШ). В одном варианте препарат и способы согласно изобретению содержат высокие концентрации антител против TNFα или их антигенсвязывающих частей, и не содержат буфера или соли, так что они являются подходящими для введения, например, подкожного введения без существенной ощущаемой боли, которую определяют на основании оценки по визуальной аналоговой шкале (ВАШ). Например, препарат согласно изобретению может приводить к оценке ВАШ меньше 1 по шкале от 0 (нет боли) до 10 (непостижимая боль) после подкожной инъекции. Как описано в примере 1, препарат, содержащий 100 мг/мл адалимумаба, полисорбат 80 и маннит (менее чем 50 мг/мл) приводил к оценке ВАШ меньше 1, например, 0,56, тогда как другие препараты с высокой концентрацией антител приводили к оценке ВАШ в диапазоне от 1,79 до 4,12.

В одном варианте изобретение относится к жидкому водному препарату, содержащему выделенное человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть, поверхностно-активное вещество и менее чем 50 мг/мл полиола, при этом подкожная инъекция препарата дает оценку боли по визуальной аналоговой школе меньше 1,0 после инъекции. В одном варианте препарат не содержит буфера и соли, и приводит к уменьшению боли по меньшей мере приблизительно на 50% при подкожной инъекции по сравнению с инъекцией во всем остальном идентичного препарата, который дополнительно содержит соль и/или буфер (буферы).

Таким образом, в одном аспекте изобретения жидкие препараты согласно изобретению имеют предпочтительные свойства переносимости, которые заключаются в том, что препараты вызывают меньше боли по сравнению с препаратами, содержащими буфер и соль. В некоторых вариантах препарат уменьшает боль, ассоциированную с инъекцией (или любой другой формой введения) у субъекта. В некоторых вариантах боль, ассоциированная с инъекцией, уменьшена по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 95% (например, по меньшей мере приблизительно на 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95%). В одном варианте боль уменьшена по меньшей мере приблизительно на 50%.

Боль можно оценивать, используя любой тип оценки боли, известный в данной области, включая, например, визуальные аналоговые шкалы, качественные оценки боли или оценки боли от иглы. Например, ощущаемую субъектом боль в месте инъекции можно оценивать, используя визуальную аналоговую шкалу боли (ВАШ). ВАШ является измерительным инструментом, который измеряет боль, которая находится в определенном диапазоне непрерывного множества значений, например, от отсутствия боли до экстремального количества боли. В процессе оценки ВАШ обычно представляет собой горизонтальную линию длиной примерно 100 мм, фиксированную числовыми и/или словесными дескрипторами, например, 0 или 10, или «отсутствие боли» или «мучительная боль», необязательно с дополнительными словесными или числовыми дескрипторами между экстремальными значениями, например, слабая, умеренная и тяжелая; или 1-9) (смотри, например, Lee JS, с соавторами (2000) Acad. Emerg. Med. 7: 550, или Singer and Thods (1998) Academic Emergency Medicine 5: 1007). Боль можно оценивать в один момент времени или в разных временных точках после введения препарата согласно изобретению, таких как, например, сразу после инъекции, приблизительно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 45 минут после инъекции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения инъекция препарата субъекту приводит в оценке боли по визуальной аналоговой шкале меньше 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0 по шкале от 0 (нет боли) до 10 (мучительная боль).

В данной области известны другие средства для оценки боли, включая, например, цифровую рейтинговую шкалу, словесную оценочную шкалу и краткий опросник оценки боли. Такие средства также можно использовать для оценки боли согласно изобретению.

Можно использовать дополнительные показатели раздражения кожи, включая, например, шкалу Дрейза (геморрагия, петехии, эритема, отек, зуд).

Препараты согласно изобретению, содержащие полиол, предпочтительно содержат менее чем приблизительно 50 мг полиола. В одном варианте препараты содержат менее чем приблизительно 45 мг/мл полиола. В другом варианте препараты согласно изобретению содержат приблизительно 38-46 мг/мл полиола (например, маннита), например, приблизительно 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 или 55 мг/мл полиола. Кроме того, подразумевается, что диапазоны значений с использованием сочетания любых из перечисленных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов включены в изобретение, например, 39-45 мг/мл, 40-44 мг/мл или 37-47 мг/мл. В одном варианте препараты согласно изобретению содержат приблизительно 12-72 мг/мл полиола, например, маннита. В одном варианте подходящими полиолами для применения в препаратах и способах согласно изобретению являются маннит или сорбит.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит адалимумаб (или биологически подобный ему препарат), полисорбат 80, маннит и воду для инъекций. В одном варианте препарат содержит 80 мг адалимумаба, воду для инъекций, 42 мг/мл маннита и 1 мг/мл полисорбата 80. В одном варианте препарат может содержать 20-110 мг, альтернативно 20-90 мг адалимумаба или альтернативно 30-80 мг антитела. В одном варианте препарат содержит 30 мг, 31 мг, 32 мг, 33 мг, 34 мг, 35 мг, 36 мг, 37 мг, 38 мг, 39 мг, 40 мг, 41 мг, 42 мг, 43 мг, 44 мг, 45 мг, 46 мг, 47 мг, 48 мг, 49 мг, 50 мг, 51 мг, 52 мг, 53 мг, 54 мг, 55 мг, 56 мг, 57 мг, 58 мг, 59 мг, 60 мг, 61 мг, 62 мг, 63 мг, 64 мг, 65 мг, 66 мг, 67 мг, 68 мг 69 мг, 70 мг, 71 мг, 72 мг, 73 мг, 74 мг, 75 мг, 76 мг, 77 мг, 78 мг, 79 мг, 80 мг, 81 мг, 82 мг, 83 мг, 84 мг, 85 мг, 86 мг, 87 мг, 88 мг, 89 мг, 90 мг, 91 мг, 92 мг, 93 мг, 94 мг, 95 мг, 96 мг, 97 мг, 98 мг, 99 мг, 100 мг, 101 мг, 102 мг, 103 мг, 104 мг, 105 мг, 106 мг, 107 мг, 108 мг, 109 мг или 110 мг антитела. Также подразумевается, что диапазоны, включающие указанные выше числа, включены в изобретение, например, 70-90 мг, 65-95 или 60-85 мг.

Настоящее изобретение также основано, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии того, что жидкий водный фармацевтический препарат, имеющий высокую концентрацию человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части и поверхностно-активное вещество (т.е., в отсутствие дополнительных эксципиентов) имеет более высокую биодоступность, чем другие высококонцентрированные препараты, имеющие дополнительные эксципиенты. Как описано в рабочих примерах ниже, показано, что препарат, содержащий больше 50 мг/мл выделенного человеческого антитела против TNFα и полисорбат, имеет повышенную биодоступность по сравнению с другими высококонцентрированными препаратами, включая коммерческий препарат адалимумаб, описанный в US20060153846.

Как описано в примере 2 ниже, биодоступность антитела против TNFα может быть увеличена в результате сочетания антитела с поверхностно-активным веществом, например, полисорбатом 80. Повышение биодоступности основано на сочетании антитела и поверхностно-активного вещества и исключении или удалении других эксципиентов, включая буфер, полиол и соль. Повышение биодоступности приводит к AUC_0-360 антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части больше, чем приблизительно 1300 мкг*час/мл или к AUC_0-1344 антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части больше, чем приблизительно 2600 мкг*час/мл при подкожной инъекции человеку.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способам повышения биодоступности выделенного антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в фармацевтическом препарате. Способы включают в себя сочетание терапевтически эффективного количества антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части с поверхностно-активным веществом и исключение или удаление других эксципиентов, например, буфера(ов), соли и полиола или их сочетания, так что биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышается. В одном варианте препарат инъецируют подкожно человеку. Способы могут повышать биодоступность, обеспечивая AUC_0-360 антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части больше, чем приблизительно 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475 или приблизительно 1500 мкг*час/мл при подкожной инъекции человеку.

Изобретение, кроме того, относится к способу повышения биодоступности выделенного человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части у субъекта, при этом указанный способ включает в себя введение препарата, содержащего поверхностно-активное вещество и эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части, субъекту, при этом биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части у субъекта повышена по меньшей мере приблизительно на 15% по сравнению со вторым препаратом. В одном варианте препарат согласно изобретению не содержит буфера, полиола или соли, а второй препарат содержит буфер, полиол и соль. В одном варианте биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышена по меньшей мере приблизительно на 30% по сравнению со вторым препаратом. В одном варианте биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части повышена по меньшей мере приблизительно на 40% по сравнению со вторым препаратом. В одном варианте биодоступность может быть определена на основании либо уровня AUC, например, AUC_0-360 или AUC_0-1344, либо Cmax.

В одном варианте настоящее изобретение относится к жидкому водному препарату, который содержит поверхностно-активное вещество и приблизительно 30-90 мг выделенного человеческого антитела против TNFα или антигенсвязывающей части, при этом препарат имеет концентрацию антитела, составляющую приблизительно 90-110 мг/мл, и при этом препарат обеспечивает повышенную биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части у человека при подкожной инъекции препарата по сравнению с препаратом, содержащим цитратно-фосфатный буфер, хлорид натрия и маннит.

В одном варианте настоящее изобретение относится к жидким водным препаратам, которые содержат поверхностно-активное вещество и 30-90 мг выделенного человеческого антитела против TNFα или антигенсвязывающей части, при этом препарат имеет концентрацию антитела 90-110 мг/мл, и при этом препарат обеспечивает повышенную биодоступность антитела или его антигенсвязывающей части у человека при подкожной инъекции препарата, при этом антитело или его антигенсвязывающая часть имеет AUC_0-360 больше, чем приблизительно 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475 или приблизительно 1500 мкг*час/мл.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит адалимумаб (или биологически подобный ему препарат), полисорбат 80 и воду для инъекций. В одном варианте препарат содержит 80 мг адалимумаба, воду для инъекций и 1 мг/мл полисорбата 80. Препарат может содержать 20-110 мг, альтернативно 20-90 мг адалимумаба или, альтернативно, 30-80 мг антитела. В одном варианте препарат содержит 30 мг, 31 мг, 32 мг, 33 мг, 34 мг, 35 мг, 36 мг, 37 мг, 38 мг, 39 мг, 40 мг, 41 мг, 42 мг, 43 мг, 44 мг, 45 мг, 46 мг, 47 мг, 48 мг, 49 мг, 50 мг, 51 мг, 52 мг, 53 мг, 54 мг, 55 мг, 56 мг, 57 мг, 58 мг, 59 мг, 60 мг, 61 мг, 62 мг, 63 мг, 64 мг, 65 мг, 66 мг, 67 мг, 68 мг 69 мг, 70 мг, 71 мг, 72 мг, 73 мг, 74 мг, 75 мг, 76 мг, 77 мг, 78 мг, 79 мг, 80 мг, 81 мг, 82 мг, 83 мг, 84 мг, 85 мг, 86 мг, 87 мг, 88 мг, 89 мг, 90 мг, 91 мг, 92 мг, 93 мг, 94 мг, 95 мг, 96 мг, 97 мг, 98 мг, 99 мг, 100 мг, 101 мг, 102 мг, 103 мг, 104 мг, 105 мг, 106 мг, 107 мг, 108 мг, 109 мг или 110 мг антитела. Диапазоны, включающие указанные выше числа, также включены в изобретение, например, 70-90 мг, 65-95 или 60-85 мг.

Таким образом, препараты с высокой концентрацией антител и способы согласно изобретению не только преодолевают ряд известных проблем, связанных с фармацевтическими препаратами, включая высокие концентрации в стабильном препарате, но также имеют дополнительное преимущество, которое заключается в обеспечении повышенной биодоступности или обеспечении значимо более низких уровней боли при инъекции пациентам.

Другое затруднение преодолевают благодаря препарату согласно изобретению за счет способности сохраняться стабильным при комнатной температуре (приблизительно при 25 градусах C или приблизительно до 30 градусов C). Такая стабильность обеспечивает преимущества для пользователя антителом с учетом более гибких возможностей хранения, так как постоянная необходимость в охлаждении не является необходимой. И препарат, вызывающий уменьшенную боль и препарат с повышенной биодоступностью (примерами которых являются препараты F3 и F4, соответственно, приведенные в разделе «Примеры» ниже) являются стабильными в течение по меньшей мере 6 суток приблизительно при 25 градусах C или приблизительно до 30 градусов C. Как описано более подробно в разделе «Примеры», препараты согласно изобретению являются стабильными вплоть до 30 градусов C в течение по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 7 суток, по меньшей мере 8 суток, по меньшей мере 9 суток, по меньшей мере 10 суток, по меньшей мере 11 суток, по меньшей мере 12 суток, по меньшей мере 13 суток и по меньшей мере 14 суток. Таким образом, изобретение дополнительно относится к препаратам, имеющим более длительный (т.е., по меньшей мере 6 суток, 10 суток или 14 суток) срок годности при комнатной температуре (или приблизительно при 25 градусов C или приблизительно до 30 градусов C). В одном варианте препарат согласно изобретению является стабильным при 20-32 градусах C в течение по меньшей мере 6 суток. Подразумевается, что температуры, являющиеся промежуточными для указанных выше температур, также являются частью настоящего изобретения, т.е., 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 и 32 градуса по Цельсию (C). Диапазоны, включающие указанные выше температуры, также включены в изобретение, например, 22-26 градусов C, 25-30 градусов C и т.д..

Препараты согласно изобретению содержат высокую концентрацию антитела, включая, например, концентрацию антитела приблизительно 50 мг/мл, 55 мг/мл, 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл, 95 мг/мл 100 мг/мл, 105 мг/мл, 110 мг/мл, 115 мг/мл (или выше) человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающего фрагмента. Соответственно, как описано в примерах ниже, в одном аспекте изобретения жидкие фармацевтические препараты согласно изобретению содержат концентрацию человеческого антитела против TNF-альфа 50-100 мг/мл или выше. В одном варианте препараты согласно изобретению могут содержать концентрацию антитела приблизительно 1 мг/мл - 150 мг/мл или приблизительно 40 мг/мл - 125 мг/мл. В одном варианте концентрация антитела в препарате составляет 50-150 мг/мл, 55-150 мг/мл, 60-150 мг/мл, 65-150 мг/мл, 70-150 мг/мл, 75-150 мг/мл, 80-150 мг/мл, 85-150 мг/мл, 90-150 мг/мл, 90-110 мг/мл, 95-105 мг/мл, 95-150 мг/мл, 100-150 мг/мл, 105-150 мг/мл, 110-150 мг/мл, 115-150 мг/мл, 120-150 мг/мл, 125-150 мг/мл, 50-130 мг/мл, 75-125 мг/мл и т.д.. Также подразумевается, что концентрации и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным выше концентрациям, также являются частью настоящего изобретения (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 мг/мл).

Препараты согласно изобретению могут содержать эффективное количество антитела. В одном варианте эффективное количество составляет приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или приблизительно 100 мг человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препараты и способы согласно изобретению содержат приблизительно 20-100, приблизительно 20-90, приблизительно 30-90, приблизительно 30-100, приблизительно 60-100, приблизительно 70-90, приблизительно 40-90, приблизительно 60-85 мг или приблизительно 40-100 мг человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части. В одном варианте препарат содержит 30 мг, 31 мг, 32 мг, 33 мг, 34 мг, 35 мг, 36 мг, 37 мг, 38 мг, 39 мг, 40 мг, 41 мг, 42 мг, 43 мг, 44 мг, 45 мг, 46 мг, 47 мг, 48 мг, 49 мг, 50 мг, 51 мг, 52 мг, 53 мг, 54 мг, 55 мг, 56 мг, 57 мг, 58 мг, 59 мг, 60 мг, 61 мг, 62 мг, 63 мг, 64 мг, 65 мг, 66 мг, 67 мг, 68 мг 69 мг, 70 мг, 71 мг, 72 мг, 73 мг, 74 мг, 75 мг, 76 мг, 77 мг, 78 мг, 79 мг, 80 мг, 81 мг, 82 мг, 83 мг, 84 мг, 85 мг, 86 мг, 87 мг, 88 мг, 89 мг или 90 мг антитела. Также подразумевается, что диапазоны, включающие указанные выше числа, включены в изобретение, например, 70-90 или 75-85 мг или 60-85 мг.

Важным аспектом препаратов и способов согласно изобретению является исключение буфера и соли. Таким образом, в одном варианте препараты и способы согласно изобретению не содержат никакого буфера(ов) (например, цитратного и фосфатного) и солей. Однако следует отметить, что хотя предпочтительные препараты согласно изобретению не содержат буферов или солей (например, NaCl), небольшое количество буфера и/или соли может присутствовать в препаратах. Таким образом, в одном варианте препараты согласно изобретению не содержат регистрируемых уровней буфера(ов) и/или соли.

В одном варианте буфер (буферы), исключенный из препаратов согласно изобретению (или буферы в препарате для сравнения, которые содержат буфер (буферы)) может включать лимонную кислоту (например, приблизительно 1,3-1,31 мг/мл или 1,305 мг/мл). В другом варианте буферная система содержит дигидрат цитрата натрия (например, приблизительно 0,27-0,33 мг/мл или приблизительно 0,305 мг/мл). В одном варианте буферная система содержит дигидрат двузамещенного фосфата натрия (например, приблизительно 1,5-1,56 мг/мл или приблизительно 1,53 мг/мл). В другом варианте буферная система содержит дигидрат однозамещенного фосфата натрия (например, приблизительно 0,83-0,89 мг/мл или приблизительно 0,86 мг/мл).

В одном варианте согласно изобретению проводимость препарата может быть использована для определения того, содержит ли препарат буфер и/или соль. Было определено, что оба препарата F3 и F4 (описанные в рабочих примерах ниже) имеют проводимость менее чем приблизительно 2 мС/см, например, приблизительно 0,7 мС/см. Таким образом, в одном варианте препараты согласно изобретению, вызывающие уменьшенную боль и имеющие повышенную биодоступность, имеют проводимость менее чем приблизительно 2 мС/см. В другом варианте препараты согласно изобретению имеют проводимость менее чем приблизительно 1 мС/см.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80), полиол (например, сорбит или маннит) и имеет проводимость менее чем 2 мС/см. В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), приблизительно 0,8-1,3 мг/мл поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 80), менее чем приблизительно 50 мг/мл полиола (например, сорбита или маннита) и имеет проводимость менее чем 2 мС/см.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80) и имеет проводимость менее чем 2 мС/см. В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), приблизительно 0,8-1,3 мг/мл поверхностно-активного вещества (например, полисорбат 80) и имеет проводимость менее чем 2 мС/см.

В другом варианте изобретение относится к стабильному препарату, имеющему высокую концентрацию антитела или его антигенсвязывающей части, при этом антитело или антиген имеет гидродинамический диаметр (z-среднее) меньше, чем приблизительно 4 нм, или при этом антитело или антиген имеет гидродинамический диаметр (z-среднее), который по меньшей мере приблизительно на 50% меньше, чем гидродинамический диаметр в случае забуференного раствора с такой же концентрацией антитела. В одном варианте антитело или антиген имеет гидродинамический диаметр (z-среднее) меньше, чем приблизительно 3 нм.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80), полиол (например, сорбит или маннит) и имеет гидродинамический диаметр менее чем 4 нм. В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), приблизительно 0,8-1,3 мг/мл поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 80), менее чем приблизительно 50 мг/мл полиола (например, сорбита или маннита) и имеет гидродинамический диаметр меньше, чем 4 нм.

В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80) и имеет гидродинамический диаметр меньше 4 нм. В одном варианте препарат согласно изобретению содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), приблизительно 0,8-1,3 мг/мл поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 80) и имеет гидродинамический диаметр меньше 4 нм.

Детергент или поверхностно-активное вещество включают в состав препарата антитела согласно изобретению. Примеры детергентов включают неионогенные детергенты, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавляемого детергента таково, что оно уменьшает агрегацию приготовленного в виде препарата антитела и/или минимизирует образование частиц в препарате и/или уменьшает адсорбцию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат содержит поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат содержит детергент полисорбат 80. В одном варианте препарат содержит приблизительно от 0,1 до приблизительно 2,0 мг/мл поверхностно-активного вещества (например, полисорбата), например, приблизительно 1 мг/мл. Другие диапазоны полисорбата, которые могут входить в состав препаратов согласно изобретению, включают от 0,1 до 1,5 мг/мл, альтернативно 0,2-1,4 мг/мл, 0,3- 1,3 мг/мл, 0,4-1,2 мг/мл, 0,5-1,1 мг/мл, 0,6-1,0 мг/мл, 0,6-1,1 мг/мл, 0,7-1,1 мг/мл, 0,8-1,1 мг/мл или 0,9-1,1 мг/мл. Подразумевается, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным выше концентрациям, также являются частью настоящего изобретения, например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9. Кроме того, подразумевается, что диапазоны значений, в которых использовано сочетание любых из перечисленных выше значений в качестве верхних и/или нижних пределов, включены в изобретение, например, от 0,3 до 1,1 мг/мл.

В одном варианте препарат согласно изобретению по существу состоит из человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части в концентрации приблизительно 100 мг/мл (или 75-125 мг/мл), поверхностно-активного вещества (например, полисорбата 80), полиола (например, сорбита или маннита), не содержит буфера(ов) (например, моногидрата лимонной кислоты, цитрата натрия, дигидрата двузамещенного фосфата натрия и/или дигидрата однозамещенного фосфата натрия) и не содержит соли (например, NaCl).

В некоторых вариантах во всем остальном идентичный препарат, с которым сравнивают препарат согласно изобретению в целях оценки боли или биодоступности, представляет собой препарат, содержащий адалимумаб, хлорид натрия, дигидрат однозамещенного фосфата натрия, дигидрат двузамещенного фосфата натрия, цитрат натрия, моногидрат лимонной кислоты, маннит, полисорбат 80 и воду для инъекций.

Препарат согласно настоящему изобретению также можно сочетать с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, которые необходимы в случае конкретного показания к лечению. В одном варианте такими средствами с дополнительными активностями являются средства, которые не оказывают неблагоприятного влияния на антитело в препарате. Такие терапевтические средства соответственно присутствуют в сочетании в количествах, которые являются эффективными в отношении предполагаемой цели. Дополнительные терапевтические средства, которые можно сочетать с препаратом согласно изобретению, дополнительно описаны в патентах США № 6090382 и 6258562, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Все препараты, описанные в настоящей заявке, также можно использовать в способах согласно изобретению.

III. Антитела для применения в препаратах и способах согласно изобретению.

Препараты и способы согласно изобретению включают антитело или его антигенсвязывающую часть, в частности, антитело против TNFα или его антигенсвязывающую часть или фрагмент. Примеры антител, которые можно применять в изобретении, включают химерные антитела, антитела животных, отличных от человека, изолированные антитела человека, гуманизированные антитела и доменные антитела (dAb). Все антитела, описанные в настоящей заявке, также можно использовать в способах согласно изобретению.

В одном варианте, препараты согласно изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающую часть, которая связывает TNFα человека, включая, например, адалимумаб (также называемый хумира, адалимумаб или D2E7; Abbott Laboratories). В следующем варианте препарат содержит антитело, которое связывает такой же эпитоп, как и адалимумаб, такое как без ограничения биологически подобное адалимумабу антитело. В одном варианте антитело является IgG1-антителом человека, имеющим шесть CDR, соответствующих CDR легкой и тяжелой цепи адалимумаба.

В одном варианте отличительным признаком изобретения является выделенное антитело человека или его антигенсвязывающая часть, которая связывается с TNF-альфа человека с высокой аффинностью и низкой скоростью распада комплекса, а также обладает высокой нейтрализующей способностью. В одном варианте антитела человека, используемые в изобретении, являются рекомбинантными нейтрализующими антителами против hTNF-альфа человека.

В одном аспекте изобретение относится к антителу адалимумабу и частям антитела, родственным адалимумабу антителам и частям антител и другими человеческим антителам и частям антител со свойствами, эквивалентными свойствам адалимумаба, такими как высокоаффинное связывание с hTNFα с низкой кинетикой диссоциации и высокой нейтрализующей способностью. В одном варианте антитело или его антигенсвязывающий фрагмент определяют в соответствии с характеристиками диссоциации и связывания, сходными с характеристиками адалимумаба. Например, препарат может содержать антитело человека, которое диссоциирует из комплекса с TNFα человека с K_d 1×10^-8 М или меньше, и константой скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, оба параметра определяют с использованием резонанса поверхностного плазмона. В другом варианте антитело человека диссоциирует из комплекса с TNFα человека с K_d 1×10^-9 М или меньше.

В одном варианте антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело человека, которое диссоциирует из комплекса с TNFα человека с K_d 1×10^-8 М или меньше, и константой скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, при этом оба параметра определяют, используя резонанс поверхностного плазмона, и нейтрализует цитотоксичность TNFα человека в стандартном анализе in vitro на L929 с IC₅₀ 1×10^-7 М или меньше. Примеры и способы получения человеческих нейтрализующих антител, которые обладают высокой аффинностью по отношению к TNFα человека, включая последовательности антител, описаны в патенте США № 6090382 (называемые D2E7), включенном в настоящее описание в виде ссылки. Аминокислотные последовательности D2E7, которые описаны в US 6090382, включены в настоящее описание в полном объеме.

В одном варианте антителом, используемым в препарате согласно изобретению, является D2E7, также называемое хумира^ТМ или адалимумаб (аминокислотная последовательность VL-области D2E7 показана в SEQ ID NO: 1; аминокислотная последовательность VH-области D2E7 показана в SEQ ID NO: 2). Свойства D2E7 (адалимумаба/хумира®) описаны Salfeld с соавторами в патентах США № 6090382, 6258562 и 6509015, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

В одном варианте антитело к TNF-альфа человека или антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNF-альфа человека с K_d 1×10^-8 М или меньше, и константой скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, при этом оба показателя определяют, используя резонанс поверхностного плазмона, и нейтрализует цитотоксичность TNF-альфа человека в стандартном анализе in vitro на L929 с IC₅₀ 1×10^-7 М или меньше. В одном варианте выделенное антитело человека или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNF-альфа человека с k_off 5×10^-4 сек^-1 или меньше; или в одном варианте с k_off 1×10^-4 сек^-1 или меньше. В одном варианте выделенное антитело человека или его антигенсвязывающая часть нейтрализует цитотоксичность TNF-альфа человека в стандартном анализе in vitro на L929 с IC₅₀ 1×10^-8 М или меньше; или в одном варианте с IC₅₀ 1×10^-9 М или меньше; или в одном варианте с IC₅₀ 1×10^-10 М или меньше. В одном варианте антитело представляет собой выделенное рекомбинантное антитело человека или его антигенсвязывающую часть.

В данной области хорошо известно, что домены CDR3 тяжелой и легкой цепи играют важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела по отношению к антигену. Соответственно, в другом аспекте, антитело, используемое в препарате согласно изобретению, имеет медленную кинетику диссоциации в случае ассоциации с hTNF-альфа, и имеет домены CDR3 легкой и тяжелой цепи, которые структурно идентичны или родственны CDR3 адалимумаба. Положение 9 CDR3 VL адалимумаба может быть занято Ala или Thr без существенного влияния на k_off. Соответственно, консенсусный мотив CDR3 VL адалимумаба содержит аминокислотную последовательность: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Кроме того, положение 12 CDR3 VH адалимумаба может быть занято Tyr или Asn без существенного влияния на k_off. Соответственно, консенсусный мотив CDR3 VH адалимумаба содержит аминокислотную последовательность: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Кроме того, как показано в примере 2 патента США № 6090382, домен CDR3 тяжелой и легкой цепей адалимумаба поддается замене одним остатком аланина (в положении 1, 4, 5, 7 или 8 в CDR3 VL или в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 в CDR3 VH) без существенного влияния на k_off. Более того, специалисту в данной области будет понятно, что с учетом допустимости замен в доменах CDR3 VL и VH адалимумаба аланином, может быть возможна замена других аминокислот в доменах CDR3 при сохранении низкой константы скорости распада комплекса антитела, в частности замены консервативными аминокислотами. В одном варианте осуществляют не более чем одну-пять консервативных аминокислотных замен в доменах CDR3 VL и/или VH адалимумаба. В одном варианте осуществляют не более одной-трех консервативных аминокислотных замен в доменах CDR3 VL и/или VH адалимумаба. Кроме того, консервативные аминокислотные замены не следует осуществлять в положениях аминокислот, важных для связывания с hTNF-альфа. Положения 2 и 5 CDR3 VL адалимумаба и положения 1 и 7 CDR3 VH адалимумаба, по-видимому, являются важными для взаимодействия с hTNF-альфа, и, следовательно, консервативные аминокислотные замены предпочтительно не осуществляют в таких положениях (хотя аланиновая замена в положении 5 CDR3 VL адалимумаба является допустимой, как описано выше) (смотри патент США № 6090382).

Соответственно, в одном варианте антитело или его антигенсвязывающая часть, используемая в препарате согласно изобретению, имеет следующие характеристики:

a) диссоциирует из комплекса с TNFα человека с константой скорости k_off 1×10^-3 сек^-1 или меньше, которую определяют с использованием резонанса поверхностного плазмона;

b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO: 3, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или одной-пятью консервативными аминокислотными заменами в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность SEQ ID NO: 4, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или одной-пятью консервативными аминокислотными заменами в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

В некоторых вариантах антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNF-альфа человека с k_off 5×10^-4 сек^-1 или меньше. В некоторых вариантах антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNF-альфа человека с k_off 1×10^-4 сек^-1 или меньше.

В еще одном варианте антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO: 3, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или последовательность SEQ ID NO: 4, модифицированную одной аланиновой заменой в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11. В одном варианте LCVR дополнительно имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (т.е., CDR2 VL D2E7), и HCVR дополнительно имеет домен CDR2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (т.е., CDR2 VH D2E7). В одном варианте LCVR дополнительно имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (т.е., CDR1 VL D2E7), и HCVR имеет домен CDR1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (т.е., CDR1 VH D2E7). Каркасные области VL могут быть получены из семейства зародышевой линии человека Vκ1 или из гена Vκ зародышевой линии человека A20, или из каркасных последовательностей VL адалимумаба, показанных на фигурах 1A и 1B в патенте США № 6090382. Каркасные области VH могут быть получены из семейства зародышевой линии человека VH3 или из гена VH зародышевой линии человека DP-31, или из каркасных последовательностей VH D2E7, показанных на фигурах 2A и 2B в патенте США № 6090382. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие вариабельным областям легкой и тяжелой цепей адалимумаба, описаны в SEQ ID NO: 36 и 37, соответственно.

Соответственно, в другом варианте антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (т.е., VL адалимумаба), и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (т.е., VH адалимумаба). В некоторых вариантах антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. В некоторых вариантах константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или константную область тяжелой цепи IgG4. Кроме того, антитело может содержать константную область легкой цепи, либо константную область легкой цепи каппа, либо константную область легкой цепи лямбда. В одном варианте антитело содержит константную область легкой цепи каппа. Альтернативно, часть антитела может представлять собой, например, Fab-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.

В других вариантах изобретение включает в себя применения изолированного антитела человека или его антигенсвязывающей части, содержащей родственные адалимумабу домены CDR3 VL и VH. Например, антитела или их антигенсвязывающие части могут иметь вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, или вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35.

В одном варианте TNFα-антитело, используемое в изобретении, включает химерное антитело инфликсимаб (ремикад®, Johnson and Johnson; описанный в патенте США № 5656272, включенном в настоящее описание в виде ссылки), CDP571 (гуманизированное моноклональное IgG4-антитело против TNF-альфа), CDP 870 (фрагмент гуманизированного моноклонального антитела против TNF-альфа), анти-TNF-dAb (Peptech) или CNTO 148 (голимумаб; Medarex and Centocor, смотри WO 02/12502). Дополнительные TNF-антитела, которые можно использовать в изобретении, описаны в патентах США № 6593458, 6498237, 6451983 и 6448380, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Антитело или часть антитела, применяемые в способах и композициях согласно изобретению, могут быть получены в результате рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Чтобы рекомбинантно экспрессировать антитело, клетку-хозяина трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными экспрессирующими векторами, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую иммуноглобулиновые цепи антитела, так что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, и из такой среды антитела могут быть извлечены. Стандартные методики получения рекомбинантной ДНК, используемые для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, основаны на включении таких генов в рекомбинантные экспрессирующие векторы и введении векторов в клетки-хозяева, такие как клетки-хозяева, описанные в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и в патенте США № 4816397, Boss с соавторами.

Чтобы экспрессировать антитело против TNFα, например, адалимумаб (D2E7) или родственное адалимумабу (D2E7) антитело, сначала получают фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Такие ДНК могут быть получены амплификацией и модификацией вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепи зародышевой линии с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепей человека известны в данной области (смотри, например, базу данных о последовательностях зародышевой линии человека «Vbase»; также смотри Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J.P.L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из публикаций специально включено в настоящее описание в виде ссылки). Например, чтобы получить фрагмент ДНК, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи D2E7 или D2E7-родственного антитела, представитель семейства VH3 генов VH зародышевой линии человека амплифицируют, используя стандартную ПЦР. В некоторых вариантах амплифицируют последовательность VH DP-31 зародышевой линии. Чтобы получить фрагмент ДНК, кодирующий вариабельную область легкой цепи D2E7 или D2E7-родственного антитела, представитель семейства VκI генов VL зародышевой линии человека амплифицируют, используя стандартную ПЦР. В некоторых вариантах амплифицируют последовательность VL A20 зародышевой линии. ПЦР-праймеры, подходящие для применения при амплификации последовательностей VH DP-31 зародышевой линии и VL A20 зародышевой линии, могут быть сконструированы на основе нуклеотидных последовательностей, раскрытых в публикациях, цитированных выше, с использованием стандартных способов.

После получения фрагментов VH и VL зародышевой линии такие последовательности могут быть подвергнуты мутациям так, чтобы они кодировали аминокислотные последовательности антитела против TNFα, раскрытые в настоящем описании. Аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями ДНК VH и VL зародышевой линии, сначала сравнивают с аминокислотными последовательностями VH и VL антитела против TNFα, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки в последовательности антитела против TNFα, которые отличаются от последовательностей зародышевой линии. Затем соответствующие нуклеотиды последовательностей ДНК зародышевой линии подвергают мутациям, так чтобы мутантная последовательность зародышевой линии кодировала аминокислотную последовательность данного антитела против TNFα, используя генетический код для определения того, какие изменения нуклеотидов необходимо осуществить. Мутагенез последовательностей зародышевой линии осуществляют стандартными способами, такими как ПЦР-опосредованный мутагенез (при котором мутантные нуклеотиды включают в ПЦР-праймеры, так чтобы продукт ПЦР содержал мутации) или сайт-специфичный мутагенез.

Кроме того, следует отметить, что если последовательности «зародышевой линии», полученные в результате ПЦР-амплификации, кодируют аминокислотные отличия в каркасных областях по сравнению с истинной конфигурацией зародышевой линии (т.е., отличия в амплифицированной последовательности по сравнению с истинной последовательностью зародышевой линии, например, в результате соматической мутации), то может быть желательным обратное изменение таких аминокислотных отличий, чтобы вернуть их к истинным последовательностям зародышевой линии (т.е., «обратная мутация» каркасных остатков к конфигурации зародышевой линии).

После получения фрагментов ДНК, кодирующих участки VH и VL антитела против TNFα (например, в результате амплификации и мутагенеза генов VH и VL зародышевой линии, как описано выше), такие фрагменты ДНК могут быть подвергнуты дальнейшей обработке стандартными способами рекомбинации ДНК, например, чтобы превратить гены вариабельных областей в гены полноразмерных цепей антитела, в гены Fab-фрагментов или в гены scFv. В ходе таких обработок фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, оперативно связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Подразумевают, что термин «оперативно связывают», который использован в данном контексте, означает, что два фрагмента ДНК соединяют так, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке.

Изолированная ДНК, кодирующая область VH, может быть превращена в полноразмерный ген тяжелой цепи, благодаря оперативному связыванию VH-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов константных областей тяжелой цепи человека известны в данной области (смотри, например Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие такие области, могут быть получены в результате стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно является константной областью IgG1 или IgG4. В случае гена тяжелой цепи Fab-фрагмента VH-кодирующая ДНК может быть оперативно связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область CH1 тяжелой цепи.

Изолированная ДНК, кодирующая область VL, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи (а также ген легкой цепи Fab), благодаря оперативному связыванию VL-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи CL. Последовательности генов константных областей легкой цепи человека известны в данной области (смотри, например, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие такие области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда. В одном варианте константной областью легкой цепи является константная область каппа.

Чтобы создать ген scFv, VH- и VL-кодирующие фрагменты ДНК оперативно связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly₄-Ser)₃, так чтобы последовательности VH и VL могли быть экспрессированы в виде непрерывного одноцепочечного белка, при этом области VL и VH связаны гибким линкером (смотри, например, Bird с соавторами (1988) Science 242: 423-426; Huston с соавторами (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty с соавторами Nature (1990) 348: 552-554).

Чтобы экспрессировать антитела или части антител, используемых в изобретении, ДНК, кодирующие неполные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные, как описано выше, встраивают в экспрессирующие векторы, так чтобы гены были оперативно связаны с последовательностями регуляции транскрипции и трансляции. Подразумевают, что в данном контексте термин «оперативно связанный» означает, что ген антитела лигирован в вектор так, что последовательности регуляции транскрипции и трансляции в векторе выполняют предназначенную им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности регуляции экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы, или более часто оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антител встраивают в экспрессирующий вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или лигированием тупых концов, если нет сайтов рестрикции). До инсерции последовательностей легкой и тяжелой цепи антитела против TNFα экспрессирующий вектор уже может нести последовательности константных областей антитела. Например, один способ превращения последовательностей VH и VL антитела против TNFα в гены полноразмерных антител заключается в их инсерции в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи, соответственно, так чтобы участок VH был оперативно связан с участком(ами) CH в векторе, и участок VL был оперативно связан с участком CL в векторе. Дополнительно или альтернативно рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в векторе так, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, отличного от иммуноглобулина).

Кроме генов цепей антител рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению несут регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию генов цепей антител в клетке-хозяине. Подразумевается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые регулируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антител. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в публикации Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Специалистам в данной области будет понятно, что конструирование экспрессирующего вектора, включая подбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которую необходимо трансформировать, уровень экспрессии требуемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), обезьяньего вируса 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Для дальнейшего знакомства с описанием вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, смотрите, например, патент США № 5168062, Stinski; патент США № 4510245, Bell с соавторами; и патент США № 4968615, Schaffner с соавторами.

Кроме генов цепей антител и регуляторных последовательностей рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетке-хозяине (например, начала репликации) и гены селективных маркеров. Ген селективного маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (смотри, например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017, все патенты Axel с соавторами). Например, ген селективного маркера обычно придает клетке-хозяину, в которую был введен вектор, резистентность к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные гены селективных маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в клетках-хозяевах dhfr- при селекции/амплификации с метотрексатом) и ген neo (для селекции с помощью G418).

Для экспрессии легких и тяжелых цепей экспрессирующим вектором (векторами), кодирующим тяжелые и легкие цепи трансфицируют клетку-хозяина стандартными способами. Подразумевается, что различные формы термина «трансфекция» охватывают широкое множество способов, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с использованием DEAE-декстрана и тому подобные. Хотя теоретически можно экспрессировать антитела согласно изобретению в любых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительна экспрессия антител в эукариотических клетках. В одном варианте клетки-хозяева млекопитающих являются наиболее предпочтительными, поскольку в таких эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, более вероятно, чем в прокариотических клетках, происходит сборка и секреция подвергнутого правильному фолдингу и иммунологически активного антитела. Сообщалось, что прокариотическая экспрессия генов антител является неэффективной в отношении получения высоких выходов активного антитела (Boss, M.A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

Предпочтительными клетками-хозяевами млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению являются клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO) (включая клетки dhfr-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), клетки миеломы NS0, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают посредством культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить экспрессию антитела в клетках-хозяевах или в одном варианте секрецию антитела в культуральную среду, в которой клетки-хозяева выращивают. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.

Клетки-хозяева также можно использовать для получения частей интактных антител, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Будет понятно, что изменения указанного выше способа входят в объем настоящего изобретения. Например, может быть желательна трансфекция клетки-хозяина с использованием ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе цепи) антитела согласно настоящему изобретению. Также можно использовать методику рекомбинантной ДНК для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих любую или обе легкую и тяжелую цепи, которые не являются необходимыми для связывания hTNF-альфа. Молекулы, экспрессированные с таких укороченных молекул ДНК, также относятся к антителам согласно изобретению. Кроме того, могут быть получены бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь представляют антитело согласно изобретению, а другие тяжелая и легкая цепи специфичны для другого антигена, отличного от hTNF-альфа, посредством поперечного сшивания антитела, согласно изобретению, со вторым антителом, стандартными химическими способами поперечного сшивания.

В предпочтительной системе рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части согласно изобретению, рекомбинантный экспрессирующий вектор, кодирующий и тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, вводят в клетки CHO dhfr- путем опосредованной фосфатом кальция трансфекции. В рекомбинантном экспрессирующем векторе гены тяжелой и легкой цепей антитела оперативно связаны с регуляторными элементами энхансером CMV/промотором AdMLP, чтобы получать высокие уровни транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также несет ген DHFR, который обеспечивает возможность селекции клеток CHO, которые были трансфицированы вектором, с использованием селекции/амплификации в присутствии метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют, обеспечивая возможность экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, и интактное антитело извлекают из культуральной среды. Используют стандартные способы молекулярной биологии для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфекции клеток-хозяев, селекции трансформантов, культивирования клеток-хозяев и извлечения антитела из культуральной среды.

В свете вышесказанного, композиции нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев, которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии антител и частей антител, применяемы в изобретении, включают нуклеиновые кислоты и векторы, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности TNF-альфа-антитела человека адалимумаба (D2E7). Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи D2E7, показана в SEQ ID NO: 36. Домен CDR1 LCVR охватывает нуклеотиды 70-102, домен CDR2 охватывает нуклеотиды 148-168, и домен CDR3 охватывает нуклеотиды 265-291. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи D2E7, показана в SEQ ID NO: 37. Домен CDR1 HCVR охватывает нуклеотиды 91-105, домен CDR2 охватывает нуклеотиды 148-198, и домен CDR3 охватывает нуклеотиды 295-330. Специалисту в данной области будет понятно, что нуклеотидные последовательности, кодирующие D2E7-родственные антитела или их части (например, CDR-домен, такой как домен CDR3), могут быть получены из нуклеотидных последовательностей, кодирующих LCVR и HCVR D2E7, с использованием генетического кода и стандартных способов молекулярной биологии.

В одном варианте жидкий фармацевтический препарат содержит человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть, а именно биологический эквивалент или антитело, биологически подобное антителу адалимумабу. В одном варианте биологически подобное антитело представляет собой антитело, в случае которого не наблюдают клинически значимого отличия от эталонного антитела, например, адалимумаба. Биологически подобное антитело имеет безопасность, чистоту и эффективность, эквивалентные указанным характеристикам эталонного антитела, например, адалимумаба.

IV. Введение препаратов согласно изобретению для лечения связанных с TNFα расстройств.

Преимущество препаратов согласно изобретению заключается в том, что их можно применять для доставки субъекту подкожно высокой концентрации антитела против TNF-альфа или антигенсвязывающей части (например, адалимумаба), при этом либо уменьшена боль при инъекции, либо биодоступность антитела повышена. Таким образом, в одном варианте, препарат согласно изобретению доставляют субъекту подкожно. В одном варианте субъект вводит препарат сам себе (самостоятельное введение).

В одном варианте вводят эффективное количество препарата. Примером эффективного количества препарата является количество, достаточное для ингибирования вредной активности TNF-альфа или для лечения расстройства, при котором активность TNF-альфа является вредной.

Подразумевается, что в используемом в настоящем описании смысле термин «расстройство, при котором активность TNF-альфа является вредной» включает заболевания и другие расстройства, в случае которых показано, что присутствие TNF-альфа у субъекта, страдающего от расстройства, является или предполагается либо ответственным за патофизиологию расстройства, либо фактором, который вносит вклад в ухудшение состояния при таком расстройстве. Соответственно, расстройство, при котором активность TNF-альфа является вредной, представляет собой расстройство, когда предполагается, что ингибирование активности TNF-альфа ослабляет симптомы и/или прогрессирование расстройства. Такие расстройства могут быть обнаружены, например, по увеличению концентрации TNF-альфа в биологической жидкости субъекта, страдающего от расстройства (например, по увеличению концентрации TNF-альфа в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости субъекта и т.д.), которое можно выявить, например, используя антитело против TNF-альфа.

В одном варианте эффективное количество антитела может быть определено в соответствии со строго основанной на массе схемой дозирования (например, в мг/кг) или может представлять собой суммарную дозу для организма (также называемую фиксированной дозой), которая не зависит от массы. В одном варианте эффективное количество антитела составляет приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или приблизительно 100 мг антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части. В одном варианте эффективное количество антитела составляет приблизительно 20-100, приблизительно 20-90, приблизительно 30-90, приблизительно 30-100, приблизительно 60-100, приблизительно 70-90, приблизительно 40-90, приблизительно 60-85 мг или приблизительно 40-100 мг. В одном варианте препарат содержит эффективное количество антитела 30 мг, 31 мг, 32 мг, 33 мг, 34 мг, 35 мг, 36 мг, 37 мг, 38 мг, 39 мг, 40 мг, 41 мг, 42 мг, 43 мг, 44 мг, 45 мг, 46 мг, 47 мг, 48 мг, 49 мг, 50 мг, 51 мг, 52 мг, 53 мг, 54 мг, 55 мг, 56 мг, 57 мг, 58 мг, 59 мг, 60 мг, 61 мг, 62 мг, 63 мг, 64 мг, 65 мг, 66 мг, 67 мг, 68 мг 69 мг, 70 мг, 71 мг, 72 мг, 73 мг, 74 мг, 75 мг, 76 мг, 77 мг, 78 мг, 79 мг, 80 мг, 81 мг, 82 мг, 83 мг, 84 мг, 85 мг, 86 мг, 87 мг, 88 мг, 89 мг, 90 мг , 91 мг, 92 мг, 93 мг, 94 мг, 95 мг, 96 мг, 97 мг, 98 мг, 99 мг или 100 мг антитела. Диапазоны, включающие указанные выше числа, также включены в изобретение, например, 70-90 или 75-85 мг или 60-85 мг.

В одном примере эффективное количество препарата составляет 0,4 мл или 0,8 мл препарата, содержащего суммарную дозу на организм приблизительно 80 мг антитела (т.е., 0,8 мл с концентрацией 100 мг/мл препарата антитела согласно изобретению). В другом примере эффективное количество препарата составляет 0,4 мл препарата согласно изобретению, содержащих суммарную дозу на организм приблизительно 40 мг антитела (т.е., 0,4 мл с концентрацией 100 мг/мл препарата антитела согласно изобретению). В еще одном примере эффективное количество препарата составляет два раза по 0,8 мл препарата, содержащих суммарную дозу на организм приблизительно 160 мг антитела (т.е., две единицы, содержащие по 0,8 мл каждая с концентрацией 100 мг/мл препарата антитела согласно изобретению). В следующем примере эффективное количество препарата составляет 0,2 мл препарата согласно изобретению, содержащих суммарную дозу на организм приблизительно 20 мг антитела (т.е., 0,2 мл с концентрацией 100 мг/мл препарата антитела согласно изобретению). Альтернативно эффективное количество можно определять в соответствии с основанной на массе фиксированной схемой дозирования (смотри, например, WO 2008/154543, включенную в настоящее описание в виде ссылки).

В одном варианте TNF-альфа представляет собой TNF-альфа человека, и субъектом является человек. Альтернативно субъектом может быть млекопитающее, экспрессирующее TNF-альфа, с которым перекрестно взаимодействует антитело согласно изобретению. Следующим субъектом может быть млекопитающее, которому был введен hTNF-альфа (например, посредством введения hTNF-альфа или в результате экспрессии трансгена hTNF-альфа).

Препарат согласно изобретению можно вводить человеку с терапевтическими целями (дополнительно обсуждаемыми ниже). В одном варианте осуществления изобретения жидкий фармацевтический препарат легко поддается введению, и включает, например, препарат, который пациент вводит самостоятельно. В одном варианте препарат согласно изобретению вводят посредством подкожной инъекции, например, посредством одноразовой подкожной инъекции. Кроме того, препарат согласно изобретению можно вводить млекопитающему, отличному от человека, экспрессирующему TNF-альфа, с которым антитело перекрестно взаимодействует (например, примату, свинье или мыши) с ветеринарными целями или в качестве модели заболевания человека на животном. В отношении последнего, такие модели на животных могут быть применимы для оценки терапевтической эффективности антител согласно изобретению (например, для тестирования доз и временных параметров введения).

Препараты согласно изобретению можно вводить согласно определенной схеме дозирования. Например, препараты можно вводить в соответствии со схемой дозирования еженедельно, раз в две недели или ежемесячно. Альтернативно, препарат можно вводить один раз каждые три недели. В одном варианте препараты и способы включают в себя введение субъекту человеческого антитела против TNFα с периодичностью, выбранной из группы, состоящей из введения еженедельно, раз в две недели, каждые три недели и ежемесячно.

В одном варианте жидкий водный препарат согласно изобретению можно вводить субъекту, например, через предварительно заполняемый шприц, автоинжектор или безыгольное устройство для введения. Таким образом, отличительным признаком изобретения также является автоинжектор, предварительно заполняемый шприц или безыгольное устройство для введения, содержащие жидкий водный препарат согласно изобретению. В одном варианте отличительным признаком изобретения является устройство для доставки, содержащее дозу препарата, содержащего 100 мг/мл антитела против TNF-альфа человека или его антигенсвязывающей части, например, автоинжектор или предварительно заполняемый шприц содержит дозу приблизительно 19 мг, 20, мг, 21 мг, 22 мг, 23 мг, 24 мг, 25 мг, 26 мг, 27 мг, 28 мг, 29 мг, 30 мг, 31 мг, 32 мг, 33 мг, 34 мг, 35 мг, 36 мг, 37 мг, 38 мг, 39 мг, 40 мг, 41 мг, 42 мг, 43 мг, 44 мг, 45 мг, 46 мг, 47 мг, 48 мг, 49 мг, 50 мг, 51 мг, 52 мг, 53 мг, 54 мг, 55 мг, 56 мг, 57 мг, 58 мг, 59 мг, 60 мг, 61 мг, 62 мг, 63 мг, 64 мг, 65 мг, 66 мг, 67 мг, 68 мг, 69 мг, 70 мг, 71 мг, 72 мг, 73 мг, 74 мг, 75 мг, 76 мг, 77 мг, 78 мг, 79 мг, 80 мг, 81 мг, 82 мг, 83 мг, 84 мг, 85 мг, 86 мг, 87 мг, 88 мг, 89 мг, 90 мг, 91 мг, 92 мг, 93 мг, 94 мг, 95 мг, 96 мг, 97 мг, 98 мг, 99 мг, 100 мг, 101 мг, 102 мг, 103 мг, 104 мг, 105 мг и т.д. препарата. В одном варианте шприц или автоинжектор содержит 60-100 мг, 70-90 мг, или приблизительно 80 мг антитела.

В одном варианте препараты согласно изобретению можно вводить самостоятельно, используя, например, предварительно заполняемый шприц или автоматическое устройство для инъекции. Автоматические устройства для инъекций являются альтернативой ручным шприцам для доставки терапевтических средств в организм пациента, и позволяют пациентам самостоятельно осуществлять инъекции.

Автоматические устройства для инъекции описаны, например, в следующих публикациях, каждая из которых при этом включена в настоящее описание в виде ссылки: WO 2008/005315, WO 2010/127146, WO 2006/000785, WO 2011/075524, WO 2005/113039, WO 2011/075524.

Соответственно, в одном варианте настоящее изобретение относится к предварительно заполняемым шприцам или автоинжекторным устройствам, содержащим препараты согласно изобретению, а также к применению предварительно заполняемых шприцев или автоинжекторных устройств, содержащих препараты, описанные в настоящей заявке, в способах согласно изобретению.

В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения расстройств, при которых активность TNF-альфа является вредной. В используемом в настоящем описании смысле подразумевается, что термин «расстройство, при котором активность TNF-альфа является вредной» включает заболевания и другие расстройства, при которых показано, что присутствие TNF-альфа у субъекта, страдающего от расстройства, является или предполагается либо ответственным за патофизиологию расстройства, либо фактором, который вносит вклад в ухудшение состояния при таком расстройстве. Соответственно, расстройство, при котором активность TNF-альфа является вредной, представляет собой расстройство, когда предполагается, что ингибирование активности TNF-альфа ослабляет симптомы и/или прогрессирование расстройства. Такие расстройства могут быть обнаружены, например, по увеличению концентрации TNF-альфа в биологической жидкости субъекта, страдающего от расстройства (например, по увеличению концентрации TNF-альфа в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости субъекта и т.д.), которое можно выявить, например, используя антитело против TNF-альфа, как описано выше.

Существуют многочисленные примеры расстройств, при которых активность TNF-альфа является вредной. Примеры, в случае которых активность TNF-альфа является вредной, также описаны в патентах США № 6015557, 6177077, 6379666, 6419934, 6419944, 6423321, 6428787 и 6537549 и в публикациях PCT № WO 00/50079 и WO 01/49321, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки. Препараты согласно изобретению также можно применять для лечения расстройств, при которых активность TNF-альфа является вредной, которые описаны в патентах США № 6090382, 6258562 и публикации заявки на выдачу патента США № US20040126372, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Применение препаратов согласно изобретению при лечении конкретных приведенных в качестве примеров расстройств обсуждается ниже:

A. Сепсис

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих сепсис. Фактор некроза опухолей играет общепризнанную роль в патофизиологии сепсиса, оказывая биологические эффекты, которые включают гипотензию, угнетение миокарда, синдром сосудистой утечки, некроз органов, стимуляцию высвобождения токсических вторичных медиаторов и активацию каскада свертывания (смотри, например, Tracey, K. J. and Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D and Thompson, R. C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). Соответственно препарат согласно изобретению можно применять для лечения сепсиса в любой из клинических ситуаций, включая септический шок, эндотоксический шок, грамотрицательный сепсис и синдром токсического шока.

Кроме того, для лечения сепсиса препарат согласно изобретению можно вводить совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, которые могут дополнительно уменьшать сепсис, такие как ингибитор интерлейкина-1 (такой как ингибиторы, описанные в публикациях PCT № WO 92/16221 и WO 92/17583), цитокин интерлейкин-6 (смотри, например, публикацию PCT № WO 93/11793) или антагонист фактора активации тромбоцитов (смотри, например, публикацию заявки на выдачу Европейского патента № EP 374510).

Кроме того, в одном варианте препарат согласно изобретению вводят человеку в подгруппе пациентов с сепсисом, имеющих концентрацию IL-6 в сыворотке или плазме выше 500 пг/мл; или в одном варианте 1000 пг/мл во время лечения (смотри публикацию PCT № WO 95/20978).

B. Аутоиммунные заболевания

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих аутоиммунное заболевание. Фактор некроза опухолей непосредственно связывали с ролью, которую он играет в патофизиологии различных аутоиммунных заболеваний. Например, TNF-альфа был вовлечен в активацию воспаления тканей и вызывает разрушение суставов при ревматоидном артрите (смотри, например, Tracey and Cerami, supra; Arend, W. P. and Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38:151-160; Fava, R. A., et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266). TNF-альфа также вовлечен в стимуляцию гибели островковых клеток и опосредование резистентности к инсулину при диабете (смотри, например, Tracey и Cerami, выше; публикацию PCT № WO 94/08609). TNF-альфа также был вовлечен в опосредование цитотоксичности в отношении олигодендроцитов и индукцию воспалительных бляшек при рассеянном склерозе (смотри, например, Tracey и Cerami, выше). Также к аутоиммунным заболеваниям, которые можно лечить, используя препараты и способы согласно изобретению, относится ювенильный идиопатический артрит (JIA) (также называемый ювенильным ревматоидным артритом) (смотри Grom с соавторами (1996) Arthritis Rheum. 39: 1703; Mangge с соавторами (1995) Arthritis Rheum. 8:211).

Препарат согласно изобретению можно применять для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, заболеваний, ассоциированных с воспалением, включая ревматоидный артрит, ревматоидный спондилит (также называемый анкилозирующим спондилитом), остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит, ювенильный идиопатический артрит (также называемый ювенильным ревматоидным артритом) и нефротический синдром.

C. Инфекционные болезни

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих инфекционное заболевание. Фактор некроза опухолей был вовлечен в опосредование биологических эффектов, наблюдаемых при различных инфекционных болезнях. Например, TNF-альфа был вовлечен в опосредование воспаления головного мозга и тромбоз капилляров и инфаркт при малярии (смотри, например, Tracey и Cerami, выше). TNF-альфа также был вовлечен в опосредование воспаления головного мозга, индукцию повреждения гематоэнцефалического барьера, запуск синдрома септического шока и активацию венозного инфаркта при менингите (смотри, например, Tracey и Cerami, выше). TNF-альфа также был вовлечен в индукцию кахексии, стимуляцию пролиферации вирусов и опосредование повреждения центральной нервной системы, в случае синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) (смотри, например, Tracey и Cerami, выше). Соответственно, антитела и части антител согласно изобретению можно применять при лечении инфекционных болезней, включая бактериальный менингит (смотри, например, публикацию заявки на выдачу Европейского патента № EP 585705), церебральную малярию, СПИД и родственный СПИДу комплекс (ARC) (смотри, например, публикацию заявки на выдачу Европейского патента № EP 230574), а также вторичную цитомегаловирусную инфекцию при трансплантации (смотри, например, Fietze, E. С соавторами (1994) Transplantation 58: 675-680). Препарат согласно изобретению также можно применять для ослабления симптомов, ассоциированных с инфекционными болезнями, включая лихорадку и миалгию, вследствие инфекции (такой как грипп) и кахексию, вторичную по отношению к инфекции (например, вторичную по отношению к СПИДу или ARC).

D. Трансплантация

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих трансплантацию. Фактор некроза опухолей был вовлечен в качестве ключевого медиатора отторжения аллотрансплантата и болезни «трансплантат против хозяина» (GVHD) и в опосредование неблагоприятной реакции, которая наблюдается, когда антитело OKT3 крысы, направленное против CD3-рецепторного комплекса T-клеток, используют для ингибирования отторжения трансплантатов почек (смотри, например, Tracey и Cerami, выше; Eason, J. D., с соавторами (1995) Transplantation 59: 300-305; Suthanthiran, M. and Strom, T. B. (1994) New Engl. J. Med. 331: 365-375). Соответственно, препараты согласно изобретению можно применять для ингибирования отторжения трансплантата, включая отторжения аллотрансплантатов и ксенотрансплантатов, и для ингибирования GVHD. Хотя антитело или часть антитела можно использовать отдельно, его можно использовать и в сочетании с одним или несколькими другими средствами, которые ингибируют иммунный ответ против аллотрансплантата или ингибируют GVHD. Например, в одном варианте препараты согласно изобретению применяют в сочетании с OKT3 для ингибирования OKT3-индуцированных реакций. В другом варианте препарат согласно изобретению применяют в сочетании с одним или несколькими антителами, направленными к другим мишеням, вовлеченным в регуляцию иммунных ответов, таким как молекулы клеточной поверхности CD25 (рецептор интерлейкина-2 альфа), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) и/или CD86 (B7-2). В еще одном варианте препарат согласно изобретению применяют в сочетании с одним или несколькими общими иммунодепрессантами, такими как циклоспорин A или FK506.

E. Злокачественное новообразование

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих рак или злокачественную опухоль. Фактор некроза опухолей был вовлечен в индукцию кахексии, стимуляцию опухолевого роста, усиление метастатического потенциала и опосредование цитотоксичности при злокачественных новообразованиях (смотри, например, Tracey и Cerami, выше). Соответственно, препараты согласно изобретению можно применять для лечения злокачественных опухолей, чтобы ингибировать рост опухолей или метастазы и/или ослабить кахексию, вторичную по отношению к злокачественному новообразованию. Препарат согласно изобретению можно вводить системно или локально в место опухоли.

F. Легочные расстройства

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих легочное заболевание. Фактор некроза опухолей был вовлечен в патофизиологию респираторного дистресс-синдрома взрослых, включая стимуляцию активации эндотелия и лейкоцитов, направленность цитотоксичности к пневмоцитам и индукцию синдрома сосудистой утечки (смотри, например, Tracey и Cerami, выше). Соответственно, препараты согласно изобретению можно применять для лечения различных легочных расстройств, включая респираторный дистресс-синдром взрослых (смотри, например, публикацию PCT № WO 91/04054), шоковое состояние легких, хроническое воспалительное заболевание легких, саркоидоз легких, фиброз легких и силикоз. Препарат согласно изобретению можно вводить системно или местно на поверхность легкого, например, в виде аэрозоля.

G. Кишечные расстройства

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих кишечное расстройство. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию воспалительных расстройств кишечника (смотри, например, Tracy, K. J. с соавторами (1986) Science 234: 470-474; Sun, X-M. с соавторами (1988) J. Clin. Invest. 81: 1328-1331; MacDonald, T. T. с соавторами (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 301-305). Химерные мышиные антитела против hTNF-альфа были подвергнуты клиническому исследованию в отношении лечения болезни Крона (van Dullemen, H. M. с соавторами (1995) Gastroenterology 109: 129-135). Препарат согласно изобретению также можно применять для лечения кишечных расстройств, таких как идиопатическое воспалительное заболевание кишечника, которое включает два синдрома, болезнь Крона и язвенный колит. В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения болезни Крона. В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения язвенного колита.

H. Сердечные расстройства

Препараты и способы согласно изобретению также можно применять для лечения различных сердечных расстройств, включая ишемию сердца (смотри, например, публикацию заявки на выдачу Европейского патента № EP 453898) и сердечную недостаточность (слабость сердечной мышцы) (смотри, например, публикацию PCT № WO 94/20139).

I. Спондилоартропатии

Препараты и способы согласно изобретению также можно применять для лечения субъектов, которые имеют спондилоартропатию, включая, например, аксиальную спондилоартропатию. TNFα вовлечен в патофизиологию широкого множества расстройств, включая воспалительные заболевания, такие как спондилоартропатии (смотри, например, Moeller, A. с соавторами (1990) Cytokine 2: 162-169; патента США № 5231024, Moeller с соавторами; публикацию Европейского патента № 260610 B1, Moeller, A). В одном варианте спондилоартропатия представляет собой аксиальную спондилоартропатию. Другие примеры спондилоартропатий, которые можно лечить TNFα-антителом согласно изобретению, описаны ниже:

1. Псориатический артрит

Препараты и способы согласно изобретению также можно применять для лечения субъектов, которые имеют псориатический артрит. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию псориатического артрита (Partsch с соавторами (1998) Ann Rheum Dis. 57: 691; Ritchlin с соавторами (1998) J Rheumatol. 25: 1544). Как указано в настоящем описании, псориатический артрит (PsA) или псориаз, ассоциированный с кожей, относится к хроническому воспалительному артриту, который ассоциирован с псориазом. Псориаз является обычным хроническим состоянием кожи, которое вызывает красные пятна на теле. Приблизительно у 1 из 20 пациентов с псориазом будет развиваться артрит наряду с состоянием кожи, и приблизительно в 75% случаев псориаз предшествует артриту. PsA сам проявляется по-разному в диапазоне от слабого до тяжелого артрита, при этом артрит обычно поражает пальцы и позвоночник. В случае поражения позвоночника симптомы сходны с симптомами анкилозирующего спондилита, который описан выше.

PsA иногда ассоциирован с мутилирующим артритом. Мутилирующий артрит относится к расстройству, которое характеризуется избыточной эрозией костей, приводящей к тяжелой эрозийной деформации, которая уродует сустав. В одном варианте препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения мутилирующего артрита.

2. Реактивный артрит/синдром Рейтера

Препараты и способы согласно изобретению также можно применять для лечения субъектов, которые имеют синдром Рейтера или реактивный артрит. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию реактивного артрита, который также называют синдромом Рейтера (Braun с соавторами (1999) Arthritis Rheum. 42(10): 2039). Реактивный артрит (ReA) относится к артриту, который осложняет инфекцию в любом месте организма, часто после кишечных или мочеполовых инфекций. ReA часто характеризуется определенными клиническими симптомами, включая воспаление суставов (артрит), уретрит, конъюнктивит и поражения кожи и слизистых оболочек. Кроме того, ReA может возникать после инфекций, вызывающих заболевания, передаваемые половым путем, или дизентерийной инфекции, включая хламидии, Campylobacter, сальмонеллы или иерсинии.

3. Недифференцированные спондилоартропатии

Препараты и способы согласно изобретению также можно применять для лечения субъектов, которые имеют недифференцированную спондилоартропатию (смотри Zeidler с соавторами (1992) Rheum. Dis. Clin. North. Am. 18: 187). Другие термины, используемые для описания недифференцированных спондилоартропатий, включают серонегативный олигоартрит и недифференцированный олигоартрит. Недифференцированные спондилоартропатии в используемом в настоящем описании смысле относятся к расстройству, при котором у субъекта наблюдают только некоторые из симптомов, ассоциированных со спондилоартропатией. Такое состояние обычно наблюдают у молодых взрослых людей, которые не имеют IBD, псориаза или классических симптомов AS или синдрома Рейтера. В некоторых случаях недифференцированные спондилоартропатии могут быть ранним показателем AS.

J. Расстройства кожи и ногтей

В одном варианте препараты и способы согласно изобретению применяют для лечения расстройства кожи и/или ногтей. В используемом в настоящем описании смысле подразумевается, что термин «расстройство кожи и ногтей, при котором активность TNFα является вредной» включает расстройства кожи и ногтей и другие расстройства, при которых показано, что присутствие TNF альфа у субъекта, страдающего от расстройства, является или предполагается либо отвечающим за патофизиологию расстройства, либо фактором, который вносит вклад в ухудшение состояния в случае расстройства, например, псориаза. Примером расстройства кожи, которое можно лечить, используя препарат согласно изобретению, является псориаз. В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения бляшечным псориазом. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию псориаза (Takematsu с соавторами (1989) Arch. Dermatol. Res. 281: 398; Victor and Gottlieb (2002) J. Drugs Dermatol. 1(3): 264).

1. Псориаз

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих псориаз, включая субъектов, имеющих бляшечный псориаз. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию псориаза (Takematsu с соавторами (1989) Arch. Dermatol. Res. 281: 398; Victor and Gottlieb (2002) J. Drugs Dermatol. 1(3): 264). Псориаз описан как воспаление кожи (раздражение и покраснение), характеризуемое частыми эпизодами покраснения, зуда и утолщенными сухими серебристыми чешуйками на коже. В частности, образуются поражения, которые включают в себя первичные и вторичные изменения пролиферации эпидермальных клеток, воспалительные реакции кожи и экспрессию регуляторных молекул, таких как лимфокины и воспалительные факторы. Псориатическая кожа морфологически характеризуется повышенным обновлением эпидермальных клеток, утолщением эпидермиса, аномальной кератинизацией, инфильтратами воспалительных клеток в эпидермис и инфильтрацией полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов в слой эпидермиса, приводящими к увеличению цикла базальных клеток. Псориаз часто поражает ногти, на которых часто наблюдаются появление точек, отделение ногтя, утолщение и изменение цвета. Псориаз часто ассоциирован с другими воспалительными расстройствами, например артритом, включая ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника (IBD) и болезнь Крона.

Проявления псориаза наиболее часто наблюдаются на туловище, локтях, коленях, коже черепа, складках кожи или ногтях пальцев рук, но он также может поражать любую или все части кожи. В норме требуется приблизительно месяц для того, чтобы новые клетки кожи переместились из нижних слоев на поверхность. При псориазе такой процесс занимает только несколько суток, что приводит к накоплению мертвых клеток кожи и образованию толстых чешуек. Симптомы псориаза включают: пятна на коже, которые являются сухими или красными, покрытыми серебристыми чешуйками, приподнятые пятна на коже с красными границами, которые могут трескаться и становиться болезненными и которые обычно локализованы на локтях, коленях, туловище, коже головы и руках; поражения кожи, включая пустулы, трещины на коже и покраснение кожи; боль в суставах или боли, которые могут быть ассоциированы с артритом, например, псориатическим артритом.

Лечение псориаза часто включает в себя лечение местными кортикостероидами, аналогами витамина D и местными или пероральными ретиноидами или их сочетаниями. В одном варианте ингибитор TNF-альфа согласно изобретению вводят в сочетании или в присутствии с одним из таких обычных средств лечения.

Диагностика псориаза обычно основана на проявлениях на коже. Кроме того может быть необходима биопсия кожи или соскобы и культивирование кожных бляшек, чтобы исключить другие расстройства кожи. Можно использовать рентгеновское излучение для проверки в случае псориатического артрита присутствует ли и является ли постоянной суставная боль.

В одном варианте осуществления изобретения применяют ингибитор TNF-альфа для лечения псориаза, включая хронический бляшечный псориаз, каплевидный псориаз, инвертированный псориаз, пустулезный псориаз, вульгарный пемфигус, эритродермический псориаз, псориаз, ассоциированный с воспалительным заболеванием кишечника (IBD) и псориаз, ассоциированный с ревматоидным артритом (РА). Конкретные типы псориаза, включенные в способы лечения согласно изобретению, описаны подробно ниже:

a. Хронический бляшечный псориаз

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих хронический бляшечный псориаз. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию хронического бляшечного псориаза (Asadullah с соавторами (1999) Br. J. Dermatol. 141: 94). Хронический бляшечный псориаз (также называемый вульгарным псориазом) является наиболее распространенной формой псориаза. Хронический бляшечный псориаз характеризуется приподнятыми покрасневшими пятнами на коже в диапазоне от размера монеты до намного большего размера. При хроническом бляшечном псориазе бляшки могут быть одиночными или множественными, они могут варьировать по размеру от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Обычно бляшки имеют красный цвет с чешуйчатой поверхностью и отражают свет при осторожном расчесывании, создавая «серебристый» эффект. Поражения (которые часто являются симметричными) в результате хронического бляшечного псориаза возникают по всему телу, но преимущественно на разгибательной поверхности, включая колени, локти, пояснично-крестцовые области, коже головы и ногтях. Иногда хронический бляшечный псориаз может возникать на пенисе, женских наружных половых органах и сгибах, но образование чешуй обычно отсутствует. Диагностика пациентов с хроническим бляшечным псориазом обычно основана на клинических признаках, описанных выше. В частности, распределение, окраска и типичная серебристая чешуйчатость поражения при хроническом бляшечном псориазе являются характерной особенностью хронического бляшечного псориаза.

b. Каплевидный псориаз

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих каплевидный псориаз. Каплевидный псориаз относится к форме псориаза с характерными имеющими форму водяных капель чешуйчатыми бляшками. Вспышки каплевидного псориаза обычно следуют после инфекции, особенно стрептококковой инфекции горла. Диагностика каплевидного псориаза обычно основана на проявлениях на коже и на часто встречающемся факте наличия недавней болезни горла в анамнезе.

c. Инвертированный псориаз

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих инвертированный псориаз. Инвертированный псориаз является формой псориаза, при которой у пациента имеются гладкие, обычно влажные области на коже, которые являются красными и воспаленными, в отличие от чешуйчатости, ассоциированной с бляшечным псориазом. Инвертированный псориаз также называют интертригинозным псориазом или псориазом складок. Инвертированный псориаз возникает главным образом в подмышках, паху, под молочными железами и в других складках кожи вокруг половых органов и ягодиц, и в результате в таких местах проявления натирание и выделение пота могут раздражать пораженные области.

d. Пустулезный псориаз

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих пустулезный псориаз. Пустулезный псориаз является формой псориаза, который вызывает образование заполненных гноем пузырьков, которые варьируют по величине и положению, но часто появляются на ладонях рук и ступнях. Пузырьки могут быть расположены или распространены на большие области тела. Пустулезный псориаз может быть как ноющим, так и болезненным, может вызывать лихорадку.

e. Другие псориатические расстройства

Другие примеры псориатических расстройств, которые можно лечить препаратами и способами согласно изобретению, включают эритродермический псориаз, вульгарный псориаз, псориаз, ассоциированный с IBD, и псориаз, ассоциированный с артритом, включая ревматоидный артрит.

2. Вульгарный пемфигус

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих вульгарный пемфигус. Вульгарный пемфигус является серьезным аутоиммунным системным дерматологическим заболеванием, которое часто поражает слизистую оболочку ротовой полости и кожу. Считается, что патогенез вульгарного пемфигуса представляет собой аутоиммунный процесс, который направлен на десмосомы кожи и слизистой оболочки ротовой полости. Как следствие, между клетками нет адгезии. Расстройство проявляется в виде крупных, заполненных жидкостью легко лопающихся пузырей и имеет характерные гистологические признаки. Противовоспалительные средства являются единственными эффективными средствами терапии в случае такого заболевания, которое имеет высокий показатель смертности. Осложнениями, которые возникают у пациентов, страдающих от вульгарного пемфигуса, являются некупируемая боль, затруднения питания и потеря жидкости и инфекции.

3. Атопический дерматит/экзема

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих атопический дерматит. Атопический дерматит (также называемый экземой) является хроническим расстройством кожи, которое классифицируют по чешуйчатым и зудящим бляшкам. Люди с экземой часто имеют в семейном анамнезе аллергические состояния, подобные астме, сенной лихорадке или экземе. Атопический дерматит представляет собой реакцию гиперчувствительности (подобную аллергии), которая появляется на коже, вызывая хроническое воспаление. Воспаление приводит к тому, что кожа становится зудящей и чешуйчатой. Хроническое раздражение и расчесывание приводят к тому, что кожа утолщается, и становится жесткой. Воздействие раздражителей окружающей среды может ухудшать симптомы, как например, сухость кожи, воздействие воды, изменения температуры и стресс.

Субъектов с атопическим дерматитом можно идентифицировать по определенным симптомам, которые часто включают зуд, пузыри, которые сочатся и покрываются коркой, покраснение кожи или воспаление вокруг пузырей, сыпь, сухость, области огрубевшей кожи, области содранной кожи от расчесывания и выделения/кровотечение из ушей.

4. Саркоидоз

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих саркоидоз. Саркоидоз представляет собой заболевание, при котором возникает гранулематозное воспаление в лимфатических узлах, легких, печени, глазах, коже и/или других тканях. Саркоидоз включает кожный саркоидоз (саркоидоз кожи) и нодулярный саркоидоз (саркоидоз лимфатических узлов). Пациенты с саркоидозом могут быть идентифицированы по симптомам, которые часто включают общий дискомфорт, тревожность или плохое самочувствие; лихорадку; поражения кожи.

5. Узловатая эритема

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих узловатую эритему. Узловатая эритема относится к воспалительному расстройству, которое характеризуется болезненными красными узелками под кожей, обычно на передней части голени. Поражения, ассоциированные с узловатой эритемой, часто начинаются в виде плоских, но плотных, горячих красных болезненных бугорков (диаметром примерно дюйм (2,54 см)). В течение нескольких суток поражения могут становиться с лиловым оттенком и затем на протяжении нескольких недель тускнеют до буроватого плоского пятна.

В некоторых случаях узловатая эритема может быть ассоциирована с инфекциями, включая, стрептококковую инфекцию, кокцидиоидомикоз, туберкулез, гепатит B, сифилис, болезнь от кошачьих царапин, туляремию, иерсинеоз, лептоспироз, попугайную болезнь, гистоплазмоз, мононуклеоз (EBV). В других случаях узловатая эритема может быть ассоциирована с чувствительностью к некоторым лекарственным препаратам, включая, пероральные контрацептивы, пенициллин, сульфонамиды, сульфоны, барбитураты, гидантоин, фенацетин, салицилаты, йодиды и прогестин. Узловатая эритема часто ассоциирована с другими расстройствами, включая лейкоз, саркоидоз, ревматический полиартрит и язвенный колит.

Симптомы узловатой эритемы обычно присутствуют на голени, но поражения также могут возникать на других участках тела, включая ягодицы, икры, щиколотки, бедра и верхние конечности. Другие симптомы у субъектов с узловатой эритемой могут включать лихорадку и недомогание.

6. Гнойный гидраденит

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих гнойный гидраденит. Гнойный гидраденит относится к расстройству кожи, при котором распухшие болезненные воспаленные поражения или бугорки развиваются в паховой области и, иногда, в подмышках и под молочными железами. Гнойный гидраденит возникает в том случае, когда выводные протоки апокринных желез закупорены при потоотделении или не способны к нормальному дренированию, вследствие неполного развития железы. Секрет, задерживаемый в железах, вытесняет пот и бактерии в окружающие ткани, вызывая подкожные уплотнения, воспаление и инфекцию. Гнойный гидраденит ограничен участками тела, которые содержат апокринные железы. Такими участками являются подмышки, околососковые кружки, паховая область, промежность, околоанальные и околопупочные области.

7. Красный плоский лишай

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих красный плоский лишай. Фактор некроза опухолей был вовлечен в патофизиологию красного плоского лишая (Sklavounou с соавторами (2000) J. Oral. Pathol. Med. 29: 370). Красный плоский лишай относится к расстройству кожи и слизистых оболочек, приводящему к воспалению, зуду и характерным кожным поражениям. Красный плоский лишай может быть ассоциирован с гепатитом C или некоторыми лекарственными средствами.

8. Синдром Свита

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих синдром Свита. Воспалительные цитокины, включая фактор некроза опухолей, вовлечены в патофизиологию синдрома Свита (Reuss-Borst с соавторами (1993) Br. J. Haematol. 84: 356). Синдром Свита, который описан R. D. Sweet в 1964, характеризуется внезапным появлением жара, лейкоцитоза и кожных высыпаний. Высыпания состоят из болезненных эритематозных папул и бляшек с четкими границами, в которых под микроскопом видны плотные нейтрофильные инфильтраты. Поражения могут появляться в любом месте, но преимущественно в верхней части тела, включая лицо. Отдельные поражения часто описывают как пвесдовезикулярные или псевдопустулезные, но они могут быть явно пустулезными, буллезными или язвенными. Также часто сообщалось о вовлечении ротовой полости и глаз (конъюнктивит или эписклерит) у пациентов с синдромом Свита. Лейкоз также был ассоциирован с синдромом Свита.

9. Витилиго

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих витилиго. Витилиго относится к состоянию кожи, при котором отсутствие пигмента на участках кожи приводит к неравномерным белым пятнам с нормальной структурой кожи. Поражения, характерные для витилиго, появляются в виде плоских лишенных пигмента участков. Контуры поражений четко определены, но неровные. Часто поражаемые участки у субъектов с витилиго включают лицо, локти и колени, руки и ступни и половые органы.

10. Склеродермия

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих склеродермию. Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию склеродермии (Tutuncu Z. c соавторами (2002) Clin. Exp. Rheumatol. 20(6 Suppl. 28): S146-51; Mackiewicz Z. c соавторами (2003) Clin. Exp. Rheumatol. 21(l): 41-8; Murota H. c соавторами (2003) Arthritis Rheum. 48(4): 1117-25). Склеродермия относится к диффузному соединительно-тканному заболеванию, характеризуемому изменениями в коже, кровеносных сосудах, скелетных мышцах и внутренних органах. Склеродермию также называют КРЕСТ-синдромом или прогрессирующим системным склерозом, и обычно она поражает людей в возрасте 30-50 лет. Женщины болеют чаще мужчин.

Причина склеродермии неизвестна. Заболевание может вызывать местные или системные симптомы. Протекание и тяжесть заболевания у больных широко варьируют. Избыточные отложения коллагена в коже и других органах вызывают симптомы. Также происходит повреждение мелких кровеносных сосудов в коже и пораженных органах. В коже могут возникать язвы, кальциноз и изменения пигментации. Системные признаки могут включать фиброз и дегенерацию сердца, легких, почек и желудочно-кишечного тракта.

У пациентов, страдающих от склеродермии, наблюдают некоторые клинические признаки, включая, бледность, посинение или покраснение пальцев рук и ног в ответ на тепло и холод (феномен Рейно), боль, ригидность и отек пальцев и суставов, утолщение кожи и блестящая кожа кистей рук и предплечья, гастроэзофагеальный рефлюкс или изжога, затрудненное глотание и отдышка. Другие клинические симптомы, используемые для диагностики склеродермии, включают повышенную скорость оседания эритроцитов (СОЭ), повышенный уровень ревматоидного фактора (РФ), позитивный результат теста на антинуклеарные антитела, анализ мочи, который показывает наличие белка и микроскопически определяемой крови, рентгенография грудной клетки, которая показывает фиброз, и исследования функции легких, которые показывают рестриктивное легочное заболевание.

11. Расстройства ногтей

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих расстройство ногтей. Расстройства ногтей включают любую аномалию ногтей. Конкретные расстройства ногтей включают без ограничения рубцевание, койлонихию, борозды Бо-Рейля, ложкообразные ногти, онихолиз, желтые ногти, птеригиум (смотри раздел «красный плоский лишай») и лейконихию. Рубцевание характеризуется наличием небольших вдавливаний на поверхности ногтей. Гребни или линейные возвышения могут развиваться вдоль ногтя либо в «продольном», либо в «поперечном» направлении. Борозды Бо-Рейля представляют собой углубления, которые возникают «поперечно» (в поперечном направлении) на ногтях пальцев рук. Лейконихия описывает белые полоски и пятна на ногтях. Койлонихия представляет собой аномальную форму ногтей пальцев рук, когда на ногте имеются приподнятые края, и он истончается и становится вогнутым. Койлонихия часто ассоциирована с недостаточностью железа.

Расстройства ногтей, которые можно лечить TNF-альфа-антителом согласно изобретению также включают псориаз ногтей. Псориаз ногтей включает в себя изменения ногтей, которые связаны с псориазом. В некоторых случаях псориаз может возникать только на ногтях и больше нигде на теле. Псориатические изменения ногтей могут быть в диапазоне от слабых до тяжелых, обычно отражающие степень псориатического поражения ногтевой пластины, матрикса ногтя, т.е., ткани, из которой ноготь растет, ногтевого ложа, т.е., ткани под ногтем, и кожи у основания ногтя. Повреждение ногтевого ложа псориазом пустулезного типа может приводить к потере ногтя. Изменения ногтей при псориазе подпадают под общие категории, которые могут возникать отдельно или все вместе. В одной категории псориаза ногтей ногтевая пластина имеет точечные углубления, вероятно вследствие дефектов роста ногтей, вызванных псориазом. В другой категории ноготь имеет изменение цвета от желтого до желто-розового, вероятно вследствие псориатического поражения ногтевого ложа. Третий подтип псориаза ногтей характеризуется белыми участками, которые появляются под ногтевой пластиной. Белые участки на самом деле являются пузырьками воздуха, оставляющие след в виде пятен в местах, где ногтевая пластина отходит от ногтевого ложа. Также может быть покраснение кожи вокруг ногтя. Четвертая категория проявляется в том, что ногтевая пластина крошится в местах желтых пятен, т.е., в ониходистрофии, вероятно, вследствие псориатического поражения матрикса ногтя. Четвертая категория характеризуется полной потерей ногтя, вследствие псориатического поражения матрикса ногтя ногтевого ложа.

Препараты и способы согласно изобретению также можно использовать для лечения расстройств ногтей, часто ассоциированных с красным плоским лишаем. Ногти у субъектов с красным плоским лишаем часто утончаются, и имеют неровности на поверхности ногтевой пластины с продольными гребнями или птеригиума.

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения расстройств ногтей, таких как расстройства, описанные в настоящей заявке. Часто расстройства ногтей ассоциированы с кожными расстройствами. В одном варианте изобретение относится к способу лечения расстройств ногтей с применением антитела против TNF-альфа. В другом варианте расстройство ассоциировано с расстройством, включая кожное расстройство, такое как псориаз. В другом варианте расстройством, ассоциированным с расстройством ногтей, является артрит, включая псориатический артрит.

12. Другие расстройства кожи и ногтей

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения других расстройств кожи и ногтей, такие как хронический актинический дерматит, буллезный пемфигоид и очаговая алопеция. Хронический актинический дерматит (CAD) также называют фоточувствительным дерматитом/синдромом актинического ретикулоида (PD/AR). CAD является состоянием, при котором кожа становится воспаленной, особенно на участках, которые были подвержены воздействию солнечного света или искусственного света. Обычно пациенты с CAD имеют аллергию на некоторые вещества, которые соприкасаются с их кожей, в частности различные цветы, деревья, парфюмерные изделия, солнцезащитные средства и резиновые смеси. Буллезный пемфигоид относится к расстройству кожи, характеризуемому образованием больших пузырей на туловище и конечностях. Очаговая алопеция относится к потере волос, характеризуемой округлыми пятнами полного облысения на голове или на бороде.

K. Метаболические расстройства

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения метаболического заболевание. TNFα вовлечен в патофизиологию широкого множества расстройств, включая метаболические расстройства, такие как диабет и ожирение (Spiegelman and Hotamisligil (1993) Cell 73:625; Chu et al. (2000) Int J Obes Relat Metab Disord. 24:1085; Ishii et al. (2000) Metabolism. 49:1616).

Метаболические расстройства влияют на то, как организм перерабатывает вещества, необходимые для осуществления физиологических функций. Ряд метаболических расстройств согласно изобретению имеет некоторые общие характеристики, т.е., они ассоциированы с резистентностью к инсулину, отсутствие способности регулировать уровень сахара в крови, прибавкой веса и увеличением индекса массы тела. Примеры метаболических расстройств включают диабет и ожирение. Примеры диабета включают сахарный диабет типа 1, сахарный диабет типа 2, диабетическую невропатию, периферическую невропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическое изъязвление, язвы при ретинопатии, диабетическую макроваскулопатию и ожирение. Примеры метаболических расстройств, которые можно лечить с применением препаратов и способов согласно изобретению, более подробно описаны ниже.

1. Диабет

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения диабета. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию диабета (смотри, например, Navarro J.F., Mora C., Maca, Am J Kidney Dis. 2003 Jul; 42(1):53-61; Daimon M et al., Diabetes Care. 2003 Jul; 26(7):2015-20; Zhang M et al., J Tongji Med Univ. 1999; 19(3):203-5, Barbieri M et al., Am J Hypertens. 2003 Jul; 16(7):537-43). Например, TNFα вовлечен в патофизиологию резистентности к инсулину. Обнаружено, что уровни TNF в сыворотке у пациентов с раком желудочно-кишечного тракта коррелируют с резистентностью к инсулину (смотри, например, McCall с соавторами (1992) Br. J. Surg. 79: 1361-3).

Диабет включает два наиболее распространенных типа расстройства, а именно диабет I типа и диабет II типа, которые оба возникают в результате неспособности организма регулировать инсулин. Инсулин представляет собой гормон, высвобождаемый поджелудочной железой в ответ на увеличенные уровни сахара крови (глюкозы).

Термин «диабет типа 1» в используемом в настоящем описании смысле относится к хроническому заболеванию, которое возникает, когда поджелудочная железа продуцирует слишком мало инсулина, чтобы соответствующим образом регулировать уровни сахара в крови. Диабет типа 1 также называют инсулинозависимым сахарным диабетом, IDMM, ювенильным диабетом и диабетом типа I. Диабет типа 1 представляет собой результат прогрессирующего аутоиммунного разрушения β-клеток поджелудочной железы с последующей недостаточностью инсулина.

Термин «диабет типа 2» относится к хроническому заболеванию, возникающему, когда поджелудочная железа не производит достаточно инсулина для поддержания нормальных уровней глюкозы, часто из-за того, что организм не отвечает хорошо на инсулин. Диабет типа 2 также называют инсулиннезависимым сахарным диабетом, NDDM и диабетом типа II.

Диабет можно диагностировать посредством введения глюкозы для теста резистентности. Клинически диабет часто разделяют на несколько основных категорий. Основные примеры таких категорий включают аутоиммунный сахарный диабет, инсулиннезависимый сахарный диабет (NDDM типа 1), инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM типа 2), неаутоиммунный сахарный диабет, инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM типа 2) и диабет зрелого возраста у молодых (MODY). Дополнительная категория, часто называемая вторичной, относится к диабету, вызываемому некоторым поддающимся идентификации состоянием, которое вызывает диабетический синдром или позволяет диабетическому синдрому развиваться. Примеры вторичных категорий включают диабет, вызванный заболеванием поджелудочной железы, гормональными аномалиями, индуцированный лекарственными средствами или химическими веществами диабет, вызванный аномалиями рецептора инсулина, диабет, связанный с генетическими синдромами, и диабет, вследствие других причин (смотри, например, Harrison's (1996) 14th ed., New York, McGraw-Hill).

Диабет сам проявляется в нескольких категориях и может вызывать несколько осложнений, которые обсуждаются в следующих разделах. Соответственно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению можно применять для лечения диабета. В одном варианте TNFα-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению применяют для лечения диабета, ассоциированного с указанными выше категориями.

Диабет часто лечат диетой, дозами инсулина и различными лекарственными средствами, описанными в настоящей заявке. Соответственно, препараты согласно изобретению также можно вводить в сочетании со средствами, обычно применяемыми для лечения метаболических расстройств и боли, обычно связанных с диабетом.

Диабет проявляется во многих осложнениях и состояниях, связанных с диабетом, включая следующие категории.

a. Диабетическая невропатия и периферическая невропатия

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения диабетической невропатии или периферической невропатии. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию диабетической невропатии и периферической невропатии (Смотри Benjafield с соавторами (2001) Diabetes Care. 24:753; Qiang с соавторами (1998) Diabetologia 41: 132l; Pfeiffer с соавторами (1997) Horm. Metab. Res. 29: 111).

Термин «невропатия», также называемая диабетическим повреждением нервов, в используемом в настоящем описании смысле, относится к распространенному осложнению диабета, при котором нервы повреждаются в результате гипергликемии (высоких уровней сахара в крови). Распознают множество диабетических невропатий, таких как дистальная сенсомоторная полиневропатия, фокальная моторная невропатия и автономная невропатия.

Термин «периферическая невропатия», известная также как периферический неврит и диабетическая невропатия, в используемом в настоящем описании смысле, относится к неспособности нервов переносить информацию от головного и спинного мозга, и обратно. Периферическая невропатия вызывает такие симптомы, как боль, потерю чувствительности и неспособность контролировать мышцы. В некоторых случаях неспособность нервов контролировать кровеносные сосуды, функцию кишечника и других органов приводит к аномальному кровяному давлению, пищеварению и утрате других основных непроизвольных процессов. Периферическая невропатия может вовлекать повреждение отдельного нерва или группы нервов (мононевропатия) или может поражать множество нервов (полиневропатия).

Невропатии, которые поражают малые миелинизированные и немиелинизированные волокна симпатических и парасимпатических нервов, известны как «периферические невропатии». Кроме того, расстройство, родственное периферической невропатии, известное также как периферический неврит и диабетическая невропатия, относится к неспособности нервов переносить информацию от головного и спинного мозга, и обратно. Это вызывает такие симптомы, как боль, потерю чувствительности и неспособность контролировать мышцы. В некоторых случаях неспособность нервов контролировать кровеносные сосуды, функцию кишечника и других органов приводит к аномальному кровяному давлению, пищеварению и утрате других основных непроизвольных процессов. Периферическая невропатия может вовлекать повреждение отдельного нерва или группы нервов (мононевропатия) или может поражать множество нервов (полиневропатия).

Термин «диабетическая невропатия» относится к распространенному осложнению диабета, при котором нервы повреждаются в результате гипергликемии (высоких уровней сахара в крови). Диабетическую невропатию также называют невропатией и диабетическим повреждением нервов. Различают множество диабетических невропатий, таких как дистальная сенсомоторная полиневропатия, фокальная моторная невропатия и автономная невропатия.

b. Диабетическая ретинопатия

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения диабетической ретинопатии. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию диабетической ретинопатии (Scholz с соавторами (2003) Trends Microbiol. 11: 171). Термин «диабетическая ретинопатия» в используемом в настоящем описании смысле относится к прогрессирующему повреждению сетчатки глаза, вызванному долговременным диабетом. Диабетическая ретинопатия включает в себя пролиферативную ретинопатию. Пролиферативная невропатия, в свою очередь, включает неоваскуляризацию, ретинальную геморрагию и отслоение сетчатки.

При ретинопатии на поздних стадиях малые сосуды пролиферируют на поверхности сетчатки. Такие кровеносные сосуды являются хрупкими, проявляют тенденцию к кровотечению и могут вызывать ретинальную геморрагию. Геморрагия может нарушать зрение, и при геморрагии подвергнутая резорбции фиброзная ткань формирует предрасположенность к отслоениям сетчатки и потере зрения. Кроме того, диабетическая ретинопатия включает в себя пролиферативную ретинопатию, которая включает неоваскуляризацию, ретинальную геморрагию и отслоение сетчатки. Диабетическая ретинопатия также включает «фоновую ретинопатию», включающую в себя изменения, происходящие в слоях сетчатки.

c. Диабетическое изъязвление и язвы при ретинопатии

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения диабетического изъязвления и язв при ретинопатии. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию диабетического изъязвления (смотри Lee et al. (2003) Hum Immunol. 64:614; Navarro et al. (2003) Am J Kidney Dis. 42:53; Daimon et al. (2003) Diabetes Care. 26:2015; Zhang et al. (1999) J Tongji Med Univ. 19:203; Barbieri et al. (2003) Am J Hypertens. 16:537; Venn et al. (1993) Arthritis Rheum. 36:819; Westacott et al. (1994) J Rheumatol. 21:1710).

Термин «язвы при диабете» в используемом в настоящем описании смысле относится к язве, возникающей в результате осложнения диабета. Язва представляет собой кратерообразное поражение кожи или слизистой оболочки, вызванное воспалением, инфекцией, злокачественным состоянием или метаболическим расстройством. Как правило, язвы при диабете можно обнаружить на конечностях, более конкретно на ступнях. Такие язвы, вызванные диабетическими состояниями, такими как невропатия и сосудистая недостаточность, могут приводить к ишемии и плохому заживлению ран. Более обширные изъязвления могут прогрессировать до остеомиелита. После развития остеомиелита его может быть трудно устранить только с помощью антибиотиков, и может потребоваться ампутация.

Термин «язвы при ретинопатии» в используемом в настоящем описании смысле относится к язве, которая вызывает или приводит к повреждениям глаза и сетчатки глаза. Язвы при ретинопатии могут включать такие состояния, как ретинальная геморрагия.

d. Диабетическая макроваскулопатия

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения диабетической макроваскулопатии. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию диабетической макроваскулопатии (Devaraj с соавторами (2000) Circulation, 102: 191; Hattori с соавторами (2000) Cardiovasc. Res. 46: 188; Clausell с соавторами (1999) Cardiovasc. Pathol. 8: 145). Термин «диабетическая макроваскулопатия», также называемая «заболеванием крупных сосудов» в используемом в настоящем описании смысле, относится к заболеванию кровеносных сосудов, возникающему в результате диабета. Осложнение в виде диабетической макроваскулопатии возникает, например, в том случае, когда сгустки жира и крови накапливаются в крупных кровеносных сосудах, и прилипают к стенкам сосуда. Диабетические макроваскулопатиии включают такие заболевания, как коронарная болезнь сердца, заболевание сосудов головного мозга и заболевание периферических сосудов, гипергликемия и сердечнососудистое заболевание, и инсульты.

2. Ожирение

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения ожирения. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию ожирения (смотри, например, Pihlajamaki J. с соавторами (2003) Obes. Res. 11: 912; Barbieri с соавторами (2003) Am. J. Hypertens. 16: 537; Tsuda с соавторами (2003) J. Nutr. 133: 2125). Ожирение увеличивает для человека риск заболевания смерти, вследствие диабета, инсульта, болезни коронарных артерий, гипертензии, высокого уровня холестерина и расстройств почек и желчного пузыря. Ожирение может также увеличивать риск некоторых типов злокачественных опухолей, и может являться фактором риска в отношении развития остеоартрита и апноэ во сне. Ожирение можно лечить антителом согласно изобретению отдельно или в сочетании с другими метаболическими расстройствами, включая диабет.

L. Васкулиты

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, имеющих васкулит. TNFα вовлечен в патофизиологию ряда васкулитов (смотри, например, Deguchi с соавторами (1989) Lancet, 2: 745). В используемом в настоящем описании смысле подразумевают, что термин «васкулит, при котором активность TNFα является вредной» включает васкулит, при котором показано, что присутствие TNFα у субъекта, страдающего от расстройства, является или предполагается либо отвечающим за патофизиологию расстройства, либо фактором, который вносит вклад в ухудшение состояния при расстройстве. Такие расстройства можно подтвердить, например, по увеличению концентрации TNFα в биологической жидкости субъекта, страдающего от расстройства (например, по увеличению концентрации TNFα в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.д. субъекта), которую можно регистрировать, например, с использованием антитела против TNFα, которое описано выше.

Существуют многочисленные примеры васкулитов, при которых активность TNFα является вредной, включая болезнь Бехчета. Применение препаратов и способов согласно изобретению для лечения конкретных васкулитов дополнительно обсуждается ниже. В конкретных вариантах антитело или часть антитела вводят субъекту в сочетании с другим лекарственным средством, как описано ниже.

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения васкулита, при котором активность TNFα является вредной, при этом ожидают, что ингибирование активности TNFα будет облегчать симптомы и/или прогрессирование васкулита или предотвращать васкулит. Субъектов, страдающих от васкулита или подверженных риску развития васкулита, можно идентифицировать по клиническим симптомам и с использованием тестов. Например, у субъектов с васкулитами часто развиваются антитела к конкретным белкам в цитоплазме нейтрофилов, антинейтрофильные цитоплазматические антитела (ANCA). Таким образом, в некоторых случаях васкулиты можно подтверждать посредством тестов (например, ELISA), измеряющих присутствие ANCA.

Васкулит и его последствия могут являться единственным проявлением заболевания, или он может быть вторичным компонентом другого первичного заболевания. Васкулит может быть ограничен отдельным органом или может одновременно поражать несколько органов, и, в зависимости от синдрома, могут быть поражены артерии и вены всех размеров. Васкулит может поражать любой орган в организме.

При васкулите просвет сосуда обычно нарушен, что связано с ишемией тканей, снабжаемых затронутым сосудом. Широкий диапазон расстройств, которые могут являться результатом этого процесса, обусловлены тем фактом, что могут затрагиваться сосуды любого типа, размера и локализации (например, артерия, вена, артериола, венула, капилляр). Васкулиты, как правило, классифицируют согласно размеру поврежденных сосудов, как описано ниже. Следует отметить, что некоторые васкулиты мелких и крупных сосудов могут затрагивать артерии среднего размера; но васкулиты крупных сосудов и сосудов среднего размера не затрагивают сосуды, меньшие, чем артерии. Заболевание крупных сосудов включает в качестве не ограничивающих примеров гигантоклеточный артериит, также известный как височный артериит или краниальный артериит, ревматическую полимиалгию и болезнь или артериит Такаясу, который также известен как синдром дуги аорты, артериит молодых женщин и болезнь отсутствия пульса. Заболевание сосудов среднего размера включает в качестве не ограничивающих примеров классический узелковый полиартериит и болезнь Кавасаки, известную так же как слизисто-кожный лимфоузелковый синдром. Не ограничивающими примерами заболевания мелких сосудов являются синдром Бехчета, гранулематоз Вегенера, микроскопический полиангиит, гиперчувствительный васкулит, также известный как кожный васкулит, васкулит мелких сосудов, пурпура Геноха-Шенлейна, аллергический гранулематоз и васкулит, также известный как синдром Черджа-Строс. Другие васкулиты включают в качестве не ограничивающих примеров изолированный васкулит центральной нервной системы и облитерирующий тромбангиит, также известный как болезнь Бюргера. Классический узелковый полиартериит (PAN), микроскопический PAN и аллергический гранулематоз также часто группируют вместе и называют системными некротизирующими васкулитами. Дополнительное описание васкулита приведено ниже.

1. Васкулит крупных сосудов

В одном варианте препараты и способы согласно изобретению применяют для лечения субъектов, имеющих васкулит крупных сосудов. Термин «крупный сосуд(ы)», в используемом в настоящем описании смысле, относится к аорте и наиболее крупным ответвлениям, направленным к основным областям организма. Крупные сосуды включают, например, аорту и ее ветви и соответствующие вены, например подключичную артерию; плечеголовную артерию; общую сонную артерию; безымянную вену; внутреннюю и наружную яремные вены; легочные артерии и вены; полую вену; почечные артерии и вены; бедренные артерии и вены; и сонные артерии. Примеры васкулитов крупных сосудов описаны ниже.

a. Гигантоклеточный артериит (GCA)

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения гигантоклеточного артериита. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию гигантоклеточного артериита (Sneller (2002) Cleve. Clin. J. Med. 69: SII40; Schett с соавторами (2002) Ann. Rheum. Dis. 61: 463). Гигантоклеточный артериит (GCA) относится к васкулиту, в который вовлечено воспаление и повреждение кровеносных сосудов, в частности, крупных или средних артерий, которые ответвляются от внешней сонной артерии шеи. GCA также называют височным артериитом или краниальным артериитом, и он является наиболее распространенным первичным васкулитом у пожилых людей. Он почти исключительно поражает людей в возрасте старше 50 лет, однако существуют хорошо документированные случаи пациентов 40 лет и моложе. GCA обычно поражает внечерепные артерии. GCA может поражать ответвления сонных артерий, включая височную артерию. GCA также представляет собой системное заболевание, которое может затрагивать артерии в многочисленных местах.

Гистопатологически GCA представляет собой панартериит с инфильтратами воспалительных мононуклеарных клеток внутри стенки сосуда с частым образованием гигантских клеток типа Лангханса. Имеет место пролиферация интимы, гранулематозное воспаление и фрагментация внутренней эластичной ламины. Патологические признаки в органах являются результатом ишемии, связанной с пораженными сосудами.

У пациентов, страдающих от GCA, наблюдают некоторые клинические симптомы, включая лихорадку, головную боль, анемию и высокую скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Другие типичные признаки GCA включают «хромоту» челюсти или языка, болезненность кожи головы, системные симптомы, отек бледного диска зрительного нерва (в частности, отек «бледного как мел» диска) и нарушения зрения. Диагноз подтверждают биопсией височной артерии.

b. Ревматическая полимиалгия

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения ревматической полимиалгии. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию ревматической полимиалгии (Straub R.H с соавторами (2002) Rheumatology (Oxford) 41: 423; Uddhammar A. с соавторами (1998) Br. J. Rheumatol. 37: 766). Ревматическая полимиалгия относится к ревматическому расстройству, которое ассоциировано с мышечной болью от умеренной до сильной и ригидностью в шее, плечах и бедрах, наиболее заметной утром. Экспрессию IL-6 и IL-1β также регистрировали в большинстве циркулирующих моноцитов у пациентов с ревматической полимиалгией. Ревматическая полимиалгия может возникать независимо или она может существовать одновременно с GCA или предшествовать GCA, который представляет собой воспаление кровеносных сосудов.

c. Артериит Такаясу

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения артериита Такаясу. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию артериита Такаясу (Kobayashi Y. and Numano F. (2002) Intern. Med. 41: 44; Fraga A. and Medina F. (2002) Curr. Rheumatol. Rep 4: 30). Артериит Такаясу относится к васкулиту, характеризующемуся воспалением аорты и ее основных ответвлений. Артериит Такаясу (также известный как синдром дуги аорты, артериит молодых женщин и болезнь отсутствия пульса) поражает грудную и брюшную аорту и их основные ответвления или легочные артерии. Фиброзное утолщение стенки аорты и ее ответвлений (например, сонной, безымянной и подключичной артерий) может приводить к уменьшению размера просвета сосудов, отходящих от дуги аорты. Это состояние также как правило, поражает почечные артерии.

Артериит Такаясу преимущественно поражает молодых женщин, обычно в возрасте 20-40 лет, особенно азиатского происхождения, и может проявляться в виде недомогания, артралгий и постепенного появления хромоты конечностей. Большинство пациентов обладают асимметрично уменьшенным пульсом, обычно наряду с разницей кровяного давления в руках. Может возникать стеноз коронарной и/или почечной артерии.

Клинические признаки артериита Такаясу можно разделить на признаки раннего воспалительного заболевания и признаки более позднего заболевания. Клинические признаки ранней воспалительной стадии заболевания Такаясу представляют собой: недомогание, небольшое повышение температуры, потерю массы, миалгию, артралгию и полиформную эритему. Более поздние стадии болезни Такаясу характеризуются фиброзным стенозом артерий и тромбозом. Основными возникающими в результате клиническими признаками являются ишемические явления, например слабые и асимметричные пульсы артерий, несоответствие кровяного давления между руками, нарушение зрения, например скотома и гемианопсия, другие неврологические признаки, включая головокружение и обморок, гемипарез или инсульт. Клинические признаки возникают в результате ишемии, вследствие стеноза и тромбоза артерий.

2. Заболевание сосудов среднего размера

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения субъектов, которые имеют заболевание сосудов среднего размера. Термин «сосуд(ы) среднего размера» применяют по отношению к таким кровеносным сосудам, которые представляют собой основные висцеральные артерии. Примеры сосудов среднего размера включают брыжеечные артерии и вены, подвздошные артерии и вены и верхнечелюстные артерии и вены. Примеры васкулитов сосудов среднего размера описаны ниже.

a. Узелковый полиартериит

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения узелкового полиартериита. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию узелкового полиартериита (DiGirolamo N. с соавторами (1997) J. Leukoc. Biol. 61: 667). Узелковый полиартериит или узелковый периартериит относится к васкулиту, который является тяжелым заболеванием кровеносных сосудов, при котором артерии небольшого и среднего размера становятся опухшими и поврежденными, поскольку их атакуют вышедшие из-под контроля иммунные клетки. Узелковый полиартериит обычно поражает взрослых более часто, чем детей. Он повреждает ткани, снабжаемые пораженными артериями, поскольку они не получают достаточно кислорода и питательных веществ без надлежащего кровоснабжения.

Симптомы, которые наблюдают у пациентов с узелковым полиартериитом, как правило, являются результатом повреждения пораженных органов, часто кожи, сердца, почек и нервной системы. Общие симптомы узелкового полиартериита включают в себя лихорадку, утомляемость, слабость, потерю аппетита и потерю массы. Распространены боли в мышцах (миалгия) и боли в суставах (артралгия). На коже субъектов с узелковым полиартериитом также можно наблюдать сыпь, опухание, язвы и шишки (узелковые поражения).

Классический PAN (узелковый полиартериит) представляет собой системный артериит мышечных артерий от небольшого до среднего размера, при котором является общераспространенным затрагивание почечных и висцеральных артерий. Брюшные сосуды имеют аневризмы или окклюзии у 50% пациентов с PAN. Классический PAN не затрагивает легочные артерии, хотя может затрагивать бронхиальные сосуды. Гранулемы, значительная эозинофилия и аллергический диатез не являются частью синдрома. Хотя может быть вовлечена любая система органов, наиболее распространенные проявления включают периферическую невропатию, множественный мононеврит, ишемию желудочно-кишечного тракта, ишемию почек, боль в семенниках и гроздевидную кожу.

b. Болезнь Кавасаки

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения болезни Кавасаки. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию болезни Кавасаки (Sundel R.P. (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4: 474; Gedalia A. (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4: 25). Хотя причина болезни Кавасаки неизвестна, она ассоциирована с острым воспалением коронарных артерий, что позволяет предполагать, что повреждение тканей, связанное с этим заболеванием, может быть опосредовано провоспалительными агентами, такими как TNFα. Болезнь Кавасаки относится к васкулиту, который поражает слизистые оболочки, лимфатические узлы, выстилку кровеносных сосудов и сердце. Болезнь Кавасаки часто называют слизисто-кожным лимфоузелковым синдромом, слизисто-кожным лимфоузелковым заболеванием и детским полиартериитом. У субъектов, страдающих болезнью Кавасаки, развивается васкулит, часто затрагивающий коронарные артерии, что может приводить к миокардиту и перикардиту. Часто после уменьшения острого воспаления может развиваться аневризма, тромбоз коронарных артерий, и это может приводить к инфаркту миокарда.

Болезнь Кавасаки представляет собой фебрильный системный васкулит, ассоциированный с отеком ладоней и подошв ног, с увеличением шейных лимфатических узлов, растрескиванием губ и «малиновым языком». Хотя выявляют воспалительный ответ сосудов по всему организму, наиболее распространенным участком повреждения органа-мишени являются коронарные артерии. Болезнь Кавасаки преимущественно поражает детей в возрасте до 5 лет. Наивысшей частоты заболевание достигает в Японии, однако его все больше распознают на Западе, и в настоящее время оно является ведущей причиной приобретенного заболевания сердца у детей в США. Наиболее тяжелым осложнением болезни Кавасаки является коронарный артериит и образование аневризмы, которое происходит у трети пациентов без лечения.

3. Заболевание мелких сосудов

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения заболевания мелких сосудов. В одном варианте антитело против TNFα применяют для лечения субъектов с васкулитом мелких сосудов. Термин «мелкий сосуд(ы)» используют для обозначения артериол, венул и капилляров. Артериолы представляют собой артерии, содержащие только 1 или 2 слоя гладкомышечных клеток, и заканчиваются и продолжаются капиллярной сетью. Венулы переносят кровь от капиллярной сети к венам, и капилляры соединяют артериолы и венулы. Примеры васкулитов мелких сосудов описаны ниже.

a. Болезнь Бехчета

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения болезни Бехчета. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию болезни Бехчета (Sfikakis P.P. (2002) Ann. Rheum. Dis. 61: ii51-3; Dogan D. and Farah C. (2002) Oftalmologia, 52: 23). Болезнь Бехчета представляет собой хроническое расстройство, включающее в себя воспаление кровеносных сосудов по всему организму. Болезнь Бехчета может вызывать также различные типы поражений кожи, артрит, воспаление кишечника и менингит (воспаление мембран головного и спинного мозга). В результате болезни Бехчета субъект с расстройством может иметь воспаление в тканях и органах по всему организму, включая желудочно-кишечный тракт, центральную нервную систему, сосудистую систему, легкие и почки. Болезнь Бехчета является в три раза более распространенной у мужчин, чем у женщин, и является более распространенной в Восточном Средиземноморье и Японии.

b. Гранулематоз Вегенера

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения гранулематоза Вегенера. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию гранулематоза Вегенера (Marquez J. с соавторами (2003) Curr. Rheumatol. Rep. 5: 128; Harman L.E. and Margo C.E. (1998) Surv. Ophthalmol. 42: 458). Гранулематоз Вегенера относится к васкулиту, который вызывает воспаление кровеносных сосудов в верхних дыхательных путях (носу, синусах, ушах), легких и почках. Гранулематоз Вегенера также называют срединным гранулематозом. Гранулематоз Вегенера включает в себя гранулематозное воспаление, затрагивающее дыхательные пути, и некротизирующий васкулит, поражающий сосуды от небольшого до среднего размера. Субъекты с гранулематозом Вегенера часто страдают также артритом (воспалением суставов). Гломерулонефрит также может присутствовать у пораженных субъектов, но фактически может быть затронут любой орган.

c. Синдром Черджа-Стросс

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения синдрома Черджа-Стросс. Фактор некроза опухоли вовлечен в патофизиологию синдрома Черджа-Стросс (Gross W.L. (2002) Curr. Opin. Rheumatol. 14: 11; Churg W.A. (2001) Mod. Pathol. 14:1284). Синдром Черджа-Стросс относится к васкулиту, который является системным, и обладает ранними признаками проявления астмы и эозинофилии. Синдром Черджа-Стросс также называют аллергическим гранулематозом и ангиитом, и он возникает при развитии аллергического ринита, астмы и эозинофилии. Синуситы и инфильтрации легких также возникают при синдроме Черджа-Стросс, главным образом, поражая легкие и сердце. Распространенным является вовлечение периферической невропатии, коронарного артериита и поражений желудочно-кишечного тракта.

M. Другие заболевания

Препараты и способы согласно изобретению можно применять для лечения различных других расстройств, при которых активность TNF-альфа является вредной. Примеры других заболеваний и расстройств, при которых активность TNF-альфа вовлечена в патофизиологию, и которые, таким образом, можно лечить с использованием антитела или части антитела согласно изобретению, включают воспалительные расстройства кости, и заболевание резорбции кости (смотри, например, Bertolini. D. R., et al. (1986) Nature 319:516-518; Konig, A.. et al. (1988) J. Bone Miner. Res. 3:621-627; Lerner, U. H. and Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8:147-155; and Shanlar. G. and Stem, P. H. (1993) Bone 14:871-876), гепатит, включая алкогольный гепатит (смотри, например, McClain, C. J. and Cohen, D. A. (1989) Hepatology 9:349-351; Felver, M. E., el al. (1990) Alcohol. Clin. Exp. Res. 14:255-259; and Hansen, J., el al. (1994) Hepatology 20:461-474), вирусный гепатит (Sheron, N. с соавторами (1991) J. Hepatol. 12: 241-245; и Hussain, M. J. с соавторами (1994) J. Clin. Pathol. 47: 1112-1115), и скоротечный гепатит; нарушения коагуляции (смотри, например, van der Poll, T., el al. (1990) N. Engl. J. Med. 322:1622-1627; and van der Poll, T., et al. (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60), ожоги (смотри, например, Giroir, B. P. с соавторами (1994) Am. J. Physiol. 267: H118-124; и Liu X. S. соавторами (1994) Burns 20: 40-44), реперфузионное повреждение (смотри, например, Scales. W. E., et al. (1994) Am. J Physiol. 267:G1122-1127; Serrick, C., el al. (1994) Transplantation 58:1158-1162; and Yao, Y. M., et al. (1995) Resuscitation 29:157-168), келоидное образование (смотри, например, McCauley, R. L. С соавторами (1992) J. Clin. Immunol. 12: 300-308), образование рубцовой ткани; пирексию; периодонтальное заболевание; ожирение и лучевую токсичность.

Примеры других расстройств, которые можно лечить препаратами и способами согласно изобретению, описаны в публикациях US20040126372 и US6258562, каждая из которых включена в настоящее описание в виде ссылки.

В одном варианте препарат и способы согласно изобретению применяют для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. Препарат согласно изобретению, содержащий вылеленное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть, (например, адалимумаб) можно вводить человеку в соответствии со схемой дозирования и в дозовом количестве, эффективном для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. В одном варианте дозу, составляющую приблизительно 40 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части (например, адалимумаба) (например, 0,4 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) в препарате согласно изобретению вводят человеку через неделю для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. В одном варианте дозу, составляющую приблизительно 80 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части, (например, адалимумаба) (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) в препарате согласно изобретению вводят человеку ежемесячно для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилита. В одном варианте препарат вводят подкожно через неделю (также можно сказать раз в две недели, смотри способы введения, описанные в публикации US20030235585, включенной в настоящее описание в виде ссылки) для лечения ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита или псориатического артрита. В одном варианте препарат вводят подкожно ежемесячно для лечения ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита или псориатического артрита.

В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения болезни Крона или язвенного колита. Препарат согласно изобретению, содержащий выделенное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть (например, адалимумаб) можно вводить человеку в соответствии со схемой дозирования и в дозовом количестве, эффективном для лечения болезни Крона. В одном варианте дозу, составляющую приблизительно 160 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части (например, адалимумаба) (например, 1,6 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) в препарате согласно изобретению вводят человеку сначала приблизительно в 1 день, затем последующую дозу 80 мг антитела (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) спустя две недели с последующим введением приблизительно 40 мг (например, 0,4 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) через каждую неделю для лечения болезни Крона. В одном варианте препарат вводят подкожно в соответствии со схемой введения множества разных доз, включая индуцирующую дозу (дозы) и поддерживающую дозу (дозы) (смотри, например, публикации патентов США № US20060009385 и US20090317399, включенные в настоящее описание в виде ссылки) для лечения болезни Крона или язвенного колита. В одном варианте препарат вводят подкожно раз в две недели или ежемесячно для лечения болезни Крона или язвенного колита. В одном варианте дозу, составляющую приблизительно 80 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части (например, адалимумаба) (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) в препарате согласно изобретению вводят человеку ежемесячно для лечения болезни Крона или язвенного колита.

В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения псориаза. Препарат согласно изобретению, содержащий выделенное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть (например, адалимумаб), можно вводить человеку в соответствии со схемой дозирования и в дозовом количестве, эффективном для лечения псориаза. В одном варианте начальную дозу приблизительно 80 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части (например, адалимумаба) (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) в препарате согласно изобретению вводят человеку, затем вводят следующую дозу 40 мг антитела (например, 0,4 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) через каждую неделю, начиная через одну неделю после начальной дозы. В одном варианте препарат вводят подкожно в соответствии со схемой введения множества разных доз, включая индуцирующую дозу (дозы) и поддерживающую дозу (дозы) (смотри, например, публикации US 20060009385 и WO 2007/120823, каждая из которых включена в настоящее описание в виде ссылки) для лечения псориаза. В одном варианте препарат вводят подкожно, раз в две недели или ежемесячно для лечения псориаза. В одном варианте дозу, составляющую приблизительно 80 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части (например, адалимумаба) (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) в препарате согласно изобретению вводят человеку ежемесячно для лечения псориаза.

В одном варианте препарат согласно изобретению применяют для лечения ювенильного идиопатического артрита (JIA). Препарат согласно изобретению, содержащий выделенное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть (например, адалимумаба), можно вводить человеку в соответствии со схемой дозирования и в дозовом количестве, эффективном для лечения JIA. В одном варианте 20 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части в препарате согласно изобретению (например, 0,2 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) вводят субъекту массой от 15 кг (приблизительно 33 фунта) до менее чем 30 кг (66 фунтов) через каждую неделю для лечения JIA. В другом варианте 40 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части в препарате согласно изобретению (например, 0,4 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл) вводят субъекту массой больше или равной 30 кг (66 фунтов) через каждую неделю для лечения JIA. В одном варианте препарат вводят подкожно в фиксированной дозе, основанной на массе (смотри, например, публикацию патента США № 20090271164, включенную в настоящее описание в виде ссылки) для лечения JIA. В одном варианте препарат вводят подкожно раз в две недели или ежемесячно для лечения JIA.

В одном варианте выделенное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть (например, адалимумаб) можно вводить человеку для лечения расстройства, ассоциированного с вредной активностью TNFα, в соответствии со схемой ежемесячного введения доз, при этом антитело вводят один раз каждый месяц или один раз каждые четыре недели. Как описано выше, примеры расстройств, которые можно лечить в соответствии со схемой ежемесячного введения доз с использованием препаратов и способов согласно изобретению, включают без ограничения ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, JIA, псориаз, болезнь Крона, язвенный колит, гнойный гидраденит, гигантоклеточный артериит, болезнь Бехчета, саркоидоз, диабетическую ретинопатию или псориатический артрит. Таким образом, препарат согласно изобретению, содержащий выделенное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть (например, адалимумаб), можно вводить человеку для лечения расстройства, ассоциированного с вредной активностью TNFα, в соответствии со схемой ежемесячного введения доз. В одном варианте 80 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части в препарате согласно изобретению (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл), вводят субъекту, имеющему расстройство, ассоциированное с вредной активностью TNFα. В одном варианте 80 мг человеческого антитела против TNF-альфа или его антигенсвязывающей части в препарате согласно изобретению (например, 0,8 мл препарата согласно изобретению в концентрации 100 мг/мл), вводят ежемесячно или раз в две недели субъекту для лечения расстройств, ассоциированных с вредной активностью TNFα.

Дозовые количества, описанные в настоящей заявке, могут быть доставлены в виде однократной дозы (например, однократной дозы 40 мг в 0,4 мл или дозы 80 мг в 0,8 мл) или, альтернативно, могут быть доставлены в виде многократных доз (например, четырех доз по 40 мг или двух доз по 80 мг для доставки дозы 160 мг).

Препарат согласно изобретению, содержащий выделенное человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть (например, адалимумаб) также можно вводить субъекту в сочетании с дополнительным терапевтическим средством. В одном варианте препарат вводят человеку для лечения ревматоидного артрита в сочетании с метотрексатом или другими модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (DMARD). В другом варианте препарат вводят человеку для лечения JIA в сочетании с метотрексатом или другими модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (DMARD). Дополнительные способы комбинированной терапии описаны в патентах США № 6258562 и 7541031; и в публикации патента США № US20040126372, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Препарат согласно изобретению, содержащий человеческое антитело против TNF-альфа или его антигенсвязывающую часть, также можно применять для лечения субъекта, у которого была неудачной предыдущая терапия ингибиторами TNF, например, субъекта, у которого не было ответа, или который не переносит инфликсимаб.

Далее изобретение проиллюстрировано на следующих примерах, которые не следует рассматривать как дополнительное ограничение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: ПРЕПАРАТ С ВЫСОКОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ Антитела против TNFα УМЕНЬШАЕТ БОЛЬ ПРИ ИНЪЕКЦИИ

Имеются сообщения о боли, ассоциированной с подкожным введением человеческого антитела против TNFα, например, адалимумаба. В плацебо-контролируемых испытаниях у 20% пациентов, которых лечили адалимумабом, развивались реакции в месте инъекции (эритема и/или зуд, геморрагия, боль или опухание) по сравнению с 14% пациентов, получающих плацебо. Большинство реакций в месте инъекции являются слабыми и, в общем, не приводят к необходимости прекращения введения лекарственного средства.

Существует два основных компонента боли, ассоциированной с инъекцией адалимумаба: боль, ассоциированного с проколом иглой, и боль, ассоциированная с инъекцией лекарственного средства в ткань. Связанная с инъекцией боль может быть связана с препаратом адалимумаба и/или с объемом лекарственного средства. В следующем исследовании исследовали, влияют ли различные препараты на боль от инъекции после подкожной доставки адалимумаба.

Материалы и способы

Дизайн исследования

Основными целями настоящего исследования были: сравнение связанной с инъекцией боли в случае трех препаратов с высокой концентрацией (100 мг/мл) адалимумаба в предварительно заполняемом шприце PHYSIOLIS^TM с современным коммерческим препаратом адалимумаба (50 мг/мл), в имеющемся в настоящее время предварительно заполняемом шприце; и оценка биодоступности трех препаратов с высокой концентрацией (100 мг/мл) адалимумаба по сравнению с современным коммерческим препаратом адалимумаба (50 мг/мл). Вторичной целью настоящего исследования была оценка безопасности и переносимости всех четырех препаратов адалимумаба.

200 здоровых взрослых мужчин и женщин, которые удовлетворяли критериям отбора, были привлечены для участия в исследовании. В общем, исследование проводили в соответствии с дизайном рандомизированного исследования в параллельных группах. Данные по оценке боли предпочтительно получали для всех 200 субъектов. Оценку фармакокинетики (ФК) осуществляли только для первых 100 или около того субъектов.

Субъектам из каждой группы лечения было предписано получение одной подкожной инъекции 40 мг адалимумаба через предварительно заполняемый шприц. Было четыре группы лечения, в каждом случае одним из четырех препаратов, указанных в таблице 1 ниже. После определения того, что субъекты удовлетворяли критериям отбора, их, случайным образом, распределяли примерно в равном количестве в одну из четырех групп лечения, показанных в таблице 1.

Использовали три высококонцентрированных препарата (F1, F3, и F4), каждый из которых содержал 40 мг адалимумаба в 0,4 мл раствора в предварительно заполняемом шприце PHYSIOLIS^TM. F1, F3, и F4 сравнивали с имеющимся в настоящее время коммерческим препаратом адалимумаба, содержащим 40 мг адалимумаба в 0,8 мл раствора в имеющемся предварительно заполняемом шприце. Ингредиенты для каждого из препаратов описаны ниже в таблице 1. Препараты, описанные в таблице 1, также соответствуют препаратам, описанным в примерах 2-7 ниже.

Таблица 1 Группы лечения
Группа лечения	Количество субъектов	Подкожная инъекция в день исследования 1	Препарат
A	50	Высококонцентрированный препарат 1 (F1) (40 мг/0,4 мл в предварительно заполняемом шприце PHYSIOLISTM)	адалимумаб, манит, моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, дигидрат двузамещенного фосфата натрия, полисорбат 80, вода для инъекций, гидроксид натрия, добавляемый при необходимости для корректировки pH
B	50	Высококонцентрированный препарат 3 (F3) (40 мг/0,4 мл в предварительно заполняемом шприце PHYSIOLISTM)	адалимумаб, манит, полисорбат 80, вода для инъекций
C	50	Высококонцентрированный препарат 4 (F4) (40 мг/0,4 мл в предварительно заполняемом шприце PHYSIOLISTM)	адалимумаб, полисорбат 80, вода для инъекций
D	50	Современный коммерческий препарат (40 мг/0,8 мл в предварительно заполняемом шприце)	адалимумаб, манит, моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, дигидрат двузамещенного фосфата натрия, дигидрат однозамещенного фосфата натрия, хлорид натрия, полисорбат 80, вода для инъекций, гидроксид натрия, добавляемый при необходимости для корректировки pH

Первых приблизительно 100 субъектов, удовлетворяющих всем критериям отбора и набранных в исследование, случайным образом, распределяли по четырем группам лечения примерно в одинаковых количествах в каждой группе, и относили либо к когорте 1, либо к когорте 2. Вторых приблизительно 100 субъектов, удовлетворяющих всем критериям отбора и набранных в исследование, случайным образом, распределяли на четыре группы лечения примерно в равных количествах в каждой группе, и относили к когортам 3-5. Номер когорты указывает, проводили ли у субъекта оценку фармакокинетики (ФК) и оценку боли или только оценку боли, как описано в таблице 2 ниже.

Таблица 2
Распределение субъектов в исследовании
			Количество субъектов
Когорта	Общее количество	Оценки	A	B	C	D
1	50	ФК и боль	13	12	13	12
2	44	ФК и боль	11	12	10	11
3	38	боль	9	9	10	10
4	39	боль	10	10	10	9
5	29	боль	7	7	7	8

Сбор образцов для исследования фармакокинетики и оценку боли осуществляли у всех субъектов в первых двух когортах, насчитывающих приблизительно 100 пациентов (когорты 1 и 2). Субъекты в когортах 3-5 принимали участие только в оценках боли, и у таких пациентов не брали образцы для исследования фармакокинетики. Безопасность и переносимость подвергали оценке у всех субъектов во всех 5 когортах. Каждому субъекту случайным образом назначали введение одной инъекции адалимумаба в 1 день исследования. Каждую дозу исследуемого лекарственного средства должен был вводить подкожно сотрудник соответствующего центра проведения исследования через предварительно заполняемый шприц в соответствии с надлежащим способом инъекции. Инъекцию вводили подкожно в живот справа от пупка на расстоянии 2 дюймов (5,08 см). Анкеты заполнял другой сотрудник центра, не тот, который вводил инъекции, с частотой, которая только была возможна.

Субъекты в когортах 1 и 2 (фармакокинетические оценки и оценки боли) находились в центре проведения исследования под наблюдением в течение примерно 10 дней (9 ночей). В центре каждый субъект находился, начиная со дня исследования -1 (1 день перед днем введения дозы) и заканчивая, после сбора образцов крови во временной точке 192 часа, и запланированных процедур исследования на 9 день исследования. Серийные образцы крови собирали в ходе исследования до 57 дня после введения дозы у возвращающихся субъектов амбулаторно. Безопасность и переносимость оценивали на протяжении всего исследования. Субъекты в когортах 3-5 (только оценка боли) находились в центре исследования под наблюдением примерно 3 дня (2 ночи). В центре каждый субъект находился, начиная со дня исследования -1 (1 день перед днем введения дозы) и заканчивая, после завершения процедур исследования на 2 день исследования. Безопасность и переносимость оценивали на протяжении всего исследования.

В дополнение к биодоступности и анализам AAA предпочтительно оценивали переносимость следующим образом:

1) Сразу после инъекции в день исследования: модуль оценки боли выполнял субъект.

2) Примерно через 10 минут после инъекции в день исследования 1: оценку по шкале Дрейза (геморрагия, петехии, эритема, отек и зуд) осуществлял квалифицированный сотрудник центра.

3) Примерно через 15 минут после инъекции в день исследования 1: модуль оценки боли выполнял субъект.

4) Примерно через 30 минут после инъекции в день исследования 1: модуль оценки боли и оценку по шкале Дрейза выполняли субъект и квалифицированный сотрудник центра, соответственно.

Демографические данные субъектов в группах лечения показаны в таблице 3 ниже.

Таблица 3
Демография пациентов
Переменная	Высококонцентрированный препарат 1 (N=50)	Высококонцентрированный препарат 3 (N=50)	Высококонцентрированный препарат 4 (N=50)	Коммерческий препарат (N=50)
Возраст (годы)	29,6±8,7	29,5±9,4	30,0±8,9	30,3±9,7
Масса (кг)	68,3±13,9	69,6±9,6	67,0±8,4	68,5±10,0
Пол	31 Ж (62%), 19 M (38%)	25 Ж (50%), 25 M (50%)	31 Ж (62%), 19 M (38%)	30 Ж (60%), 20 M (40%)
Раса	37 белых (74%), 9 черных (18%), 4 других (8%)	45 белых (90%), 3 черных (6%), 2 других (4%)	36 белых (72%), 10 черных (20%), 4 других (8%)	40 белых (80%) 8 черных (16%), 2 других (4%)

Препараты

Три новых высококонцентрированных препарата (называемых в настоящем описании препарат 1, 3 или 4; или F1, F3 или F4, соответственно) исследовали по сравнению с коммерческим препаратом, содержащим 50 мг/мл адалимумаба. Составы каждого из таких препаратов перечислены ниже в таблицах 4-7.

Таблица 4: Препарат 1 (F1)

СОСТАВ НЕФАСОВАННОГО РАСТВОРА

1 мл нефасованного раствора содержит

Таблица 4
Название ингредиента	Концентрация [мг]
Активное вещество
адалимумаб (A-765865)*	100,00
Эксципиенты
Маннит	42,00
Моногидрат лимонной кислоты	1,31
Цитрат натрия	0,31
Дигидрат двузамещенного фосфата натрия	1,53
Дигидрат однозамещенного фосфата натрия	0,86
Полисорбат 80	1,00
Гидроксид натрия	q.s.
Вода для инъекций	до 1041,00
Азот	---
Плотность раствора: 1,041 г/мл * используемый в виде концентрата.

Таблица 5: Препарат 3 (F3)

СОСТАВ НЕФАСОВАННОГО РАСТВОРА

1 мл нефасованного раствора содержит

Таблица 5
Название ингредиента	Концентрация [мг]
Активное вещество
адалимумаб (A-765865)*	100,00
Эксципиенты
Маннит	42,00
Полисорбат 80	1,00
Вода для инъекций	до 1040,00
Азот	---
* используемый в виде концентрата. Плотность раствора: 1,040 г/мл

Таблица 6: Препарат 4 (F4)

СОСТАВ НЕФАСОВАННОГО РАСТВОРА

1 мл нефасованного раствора содержит

Таблица 6
Название ингредиента	Концентрация [мг]
Активное вещество
адалимумаб (A-765865)*	100,00
Эксципиенты
Полисорбат 80	1,00
Вода для инъекций	до 1026,00
Азот	---
* используемый в виде концентрата. Плотность раствора: 1,026 г/мл

Таблица 7: Коммерческий препарат адалимумаба 50 мг/мл

СОСТАВ НЕФАСОВАННОГО РАСТВОРА

1 мл нефасованного раствора содержит

Таблица 7
Название ингредиента	Концентрация [мг]
Активное вещество
адалимумаб (A-765865)*	50,00
Эксципиенты
Маннит	12,00
Моногидрат лимонной кислоты	1,30
Цитрат натрия	0,30
Дигидрат двузамещенного фосфата натрия	1,53
Дигидрат однозамещенного фосфата натрия	0,86
Полисорбат 80	1,00
Гидроксид натрия	q.s.
Вода для инъекций	до около 1000
Хлорид натрия	6,16
Азот	---

Введение исследуемого лекарственного средства

Исследуемое лекарственное средство (адалимумаб) в различных препаратах вводят утром в 0 час в день исследования 1. Четыре группы лечения указаны в таблице 1 выше в виде групп A, B, C и D. Субъектам в каждой группе лечения подкожно инъецировали только один препарат адалимумаба через предварительно заполняемый шприц.

В настоящем исследовании использовали два типа шприцев; имеющийся в настоящее время коммерчески доступный стеклянный предварительно заполняемый шприц («имеющийся в настоящее время предварительно заполняемый шприц») использовали для эталонного современного коммерческого препарата адалимумаба (40 мг адалимумаба в 0,8 мл раствора), и предварительно заполняемый шприц PHYSIOLIS^TM для трех высококонцентрированных тестируемых препаратов (40 мг адалимумаба в 0,4 мл раствора). Предварительно заполняемый шприц PHYSIOLIS^TM имеет иглу 29 калибра (имеющийся в настоящее время предварительно заполняемый шприц имеет иглу 27 калибра с фиксированной длиной 1/2 дюйма (1,27 см)), не содержащий латекса колпачок для иглы и ограничитель хода поршня, который имеет покрытие, чтобы минимизировать вымываемые вещества.

Тестирование боли: шкала боли

Визуальную аналоговую шкалу боли использовали для количественной оценки ощущения боли. Для оценки боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) следовали следующим инструкциям:

Шкалу боли представляли субъекту в трех разных временных точках после инъекции: немедленно после инъекции, через 15 минут после инъекции и через 30 минут после инъекции в день и исследования 1. Шкалу боли показывали и объясняли субъекту, которого просили поставить одну прямую вертикальную метку на линии шкалы боли, чтобы указать имеющийся у него, в данный момент уровень боли в месте инъекции (например, смотри ниже). Показатель 0 означает отсутствие боли, тогда как наибольшая оценка (10) показывала «наихудшую возможную боль». Иллюстративная шкала боли, используемая в исследовании, показана ниже:

Каков уровень боли у Вас в данный момент времени в месте инъекции?

0		10
нет боли	наихудшая возможная боль

Количественная оценка боли

После завершениия оценки по шкале боли, проводили качественную оценку боли три раза после инъекции: немедленно после инъекции, через 15 минут после инъекции и через 30 минут после инъекции в день исследования 1. Пример качественной оценки боли, используемой в данном исследовании, показан ниже:

Выберите все пункты, которые описывают Ваш уровень боли в данный момент в месте инъекции:

Стреляющая боль

Острая боль

Жгучая боль

Тупая

Неприятно

Давящая

Ноющая

Болезненная

Локализованное жжение

Другие___________________________________________________

или

В настоящий момент у меня нет неприятных ощущений в месте инъекции.

Оценка боли от иглы

После завершения качественной оценки боли проводили оценку боли от иглы сразу после инъекции. Пример оценки боли от иглы, используемой в данном исследовании, показан ниже:

Можете ли Вы рассказать о разнице боли от иглы, проникающей в кожу, и боли от раствора, который инъецируют?

Да

Нет

a) Если да, то вызвана ли наибольшая часть Вашей боли иглой, проникающей в Вашу кожу, или наибольшая часть вашей боли вызвана инъецируемым раствором?

Наибольшая часть моей боли вызвана проникновением иглы.

Наибольшая часть моей боли вызвана инъецируемым раствором.

Шкала Дрейза

Квалифицированный сотрудник цента осуществлял такую оценку для каждого субъекта примерно через 10 минут и 30 минут после инъекции в день исследования 1.

Геморрагия/петехии в месте инъекции:

- 0: Нет

- 1: изолированные; до 5 петехий

- 2: изолированные, но > 5 петехий

- 3: множество петехий, некоторые сливаются

- 4: Пятна крови на поверхности

- 5: видимое кровотечение

Эритема в месте инъекции:

- 0: нет эритемы

- 1: очень слабая (едва заметная) эритема

- 2: хорошо определяемая эритема

- 3: от умеренной до тяжелой эритемы

- 4: тяжелая эритема (цвета красной свеклы)

Отек в месте инъекции:

- 0: нет отека

- 1: очень слабый (едва заметный) отек

- 2: небольшой отек (края области хорошо определимы по небольшому поднятию)

- 3: умеренный отек (приподнят на ~1 мм)

- 4: тяжелый отек (приподнят > 1 мм, увеличивается, выходя за пределы области инъекции)

Зуд в месте инъекции:

- 0: нет зуда

- 1: периодический зуд

- 2: постоянный зуд

Результаты

Чтобы определить, может ли быть улучшена доставка адалимумаба, разработали новые высококонцентрированные препараты. Препараты F1, F3 и F4, которые показаны ниже, имеют половину объема (т.е., 0,4 мл по сравнению с 0,8 мл) и удвоенную концентрацию белка (100 мг/мл против 50 мг/мл) по сравнению с имеющимся современным коммерческим препаратом адалимумаба, и они также имеют другие составы эксципиентов. Эксперименты, описанные в настоящей публикации, были предназначены для оценки того, превосходит ли какой-либо из новых препаратов, имеющийся в настоящее время коммерческий препарат адалимумаба.

Визуальная аналоговая шкала боли была выбрана для оценки боли в месте инъекции, и была использована для оценки влияния состава препарата на ощущения боли. Кроме того, переносимость различных новых препаратов, содержащих 100 мг/мл адалимумаба, сравнивали с имеющимся в настоящее время коммерческим препаратом (препарат, содержащий 50 мг/мл адалимумаба). Данные, полученные в настоящем примере, подтверждают неожиданное открытие того, что новые препараты, особенно препарат 3 (F3), значимо снижают боль по сравнению с имеющимся в настоящее время коммерческим препаратом. Неожиданно F3 также значимо снижал боль по сравнению с препаратами F1 и F4.

В частности, на фигуре 1 показано, что введение высококонцентрированных препаратов 1 и 3 приводило к значимому снижению оценки боли во всех временных точках после инъекции (немедленно, 15 минут и 30 минут) по сравнению с другими группами лечения (F4 и имеющийся в настоящее время коммерческий препарат). В таблице 8, показанной ниже, суммированы отдельные данные, и показано сравнение препаратов F1, F3, и F4 с коммерческим препаратом 0,8 мл, 50 мг/мл.

Как описано в таблице 8, сразу после инъекции субъекты, которые получали имеющийся в настоящее время препарат хумиру, оценивали боль в среднем (SD) 3,29 (2,57) см. Средние оценки боли в случае препарата 1 и препарата 3 были статистически значимо ниже, чем в случае имеющегося в настоящее время препарата хумиры (p < 0,001). Оцениваемые отличия от имеющегося в настоящее время препарата хумиры составляли -1,50 (95% ДИ: от -2,31 до -0,69 см) для препарата F1, и -2,70 (95% ДИ: от -3,52 до -1,89 см) для препарата F3. Таким образом, средства лечения A и B (высококонцентрированные препараты 1 и 3) приводили к снижению боли в месте инъекции на 45,6% и 82,7%, соответственно. Статистические тесты не проводили в случае оценок боли через 15 минут и 30 минут после инъекции, поскольку большинство субъектов сообщали об отсутствии боли в таких временных точках. Как описано на фигуре 1, минимальные/максимальные оценки по шкале ВАШ сразу после инъекции составляли: препарат F1, 0,00-8,3; препарат F3, 0,00-2,20; препарат F4, 0,20-8,70; и имеющийся в настоящее время коммерческий препарат, 0,00-10,00.

Очевидно, что боль, ассоциированная с инъекцией препарата 3, была сильно уменьшена по сравнению с болью в случае, имеющегося в настоящее время коммерческого препарата. В частности, среднее значение боли, которое оценивали по визуальной аналоговой шкале боли (ВАШ) сразу после инъекции, снижалось от среднего значения 3,29 в случае, имеющегося в настоящее время коммерческого препарата до 0,56 в препарате 3, сильное снижение на 83%. Действительно, уменьшение боли, ассоциированной с препаратом 3, было таким значительным, она была снижена на 69% по сравнению с уровнем следующего наилучшего препарата (в отношении боли) - препараты 1 (1,79).

Подобным образом, среднее значение по шкале боли в случае препарата 1 снижалось до 1,79, снижение на 45% по сравнению с оценкой по шкале 3,29 в случае боли, ассоциированной с имеющимся в настоящее время коммерческим препаратом.

Таблица 8
Визуальная аналоговая шкала боли (ВАШ)
Сразу после инъекции
Лечение	N	Среднее (SD)	Предел среднего&	Сравнение с современным препаратом&
Оценка	P-значение#	95% ДИ
Высококонцентрированный препарат 1	50	1,79 (2,08)	1,79	-1,50	<0,001	-2,31, -0,69
Высококонцентрированный препарат 3	50	0,56 (0,56)	0,58	-2,71	<0,001	-3,52, -1,90
Высококонцентрированный препарат 4	50	4,12 (2,50)	4,11	0,82	0,976	0,01, 1,63
Современный препарат	50	3,29 (2,57)	3,29
# Из одностороннего критерия с нулевой гипотезой, которая заключалась в том, что среднее для тестируемого препарата ≥ среднему для имеющегося современного препарата & на основе ANOVA.

Качественную оценку боли также проводили у субъектов сразу после инъекции, через 15 минут после инъекции и через 30 минут после инъекции для всех четырех случаев лечения адалимумабом. Сразу после инъекции оценку «нет неприятных ощущений» давали с наибольшей частотой 31 субъект (31/50, 62,0%), которые получали препарат 3, затем 19 субъектов (19/50, 38,0%), которые получали препарат 1, 7 субъектов (7/50, 14,0%), которые получали имеющийся в настоящее время препарат хумиру и один субъект (1/50, 2,0%), который получал препарат 4. Из тех субъектов, которые сообщали о неприятных ощущениях сразу после инъекции, наиболее часто сообщали об ощущении «жгучей боли», при этом по 30 субъектов (30/50, 60%) в случае имеющегося в настоящее время препарата и препарата 4, 16 субъектов (16/50, 32,0%) в случае препарата 1, и 4 субъекта (4/50, 8,0%) в случае препарата 3. Через 15 минут после инъекции подавляющее большинство субъектов, получающих каждый из препаратов, сообщали об «отсутствии неприятных ощущений» в месте инъекции.

Персонал в центре исследовании также использовал шкалу Дрейза для оценки геморрагии/петехий, эритемы, отека и зуда в месте инъекции у каждого субъекта. Через десять минут после инъекции большинство субъектов во всех группах лечения не имели наблюдаемых геморрагий или петехий, отека или зуда в месте инъекции.

Все четыре препарата были хорошо переносимы в ходе исследования. Суммарные предварительные данные о неблагоприятных явлениях (AE) показаны ниже в таблице 9.

Таблица 9
Предварительные неблагоприятные явления (AE)
	Высококонцентрированный препарат 1 (N=50)	Высококонцентрированный препарат 3 (N=50)	Высококонцентрированный препарат 4 (N=50)	Современный препарат (N=50)
Любое неблагоприятное явление (НЯ)	7 (14%)	7 (14%)	6 (12%)	3 (6%)
Любое НЯ, по меньшей мере, вероятно связанное с лекарственным средством	3 (6%)	3 (6%)	2 (4%)	1 (2%)
Любое тяжелое НЯ	0	0	0	0
Любое серьезное НЯ	0	0	0	0
Любое НЯ, приводящее к прекращению исследования	0	0	0	0
Смерть	0	0	0	0

Соответственно, данные показывают, что новые препараты с концентрацией 100 мг/мл, особенно препараты 1 и 3, хорошо переносимы и были эффективны в снижении боли в месте инъекции после подкожной инъекции сходных терапевтических доз по сравнению с продаваемым в настоящее время на рынке препаратом адалимумаба. Препарат F3 имел особенно низку оценку по шкале ВАШ по сравнению с другими тестированными препаратами.

Уменьшение боли по шкале ВАШ не было связано с разницей в размере иглы (иглу 27G использовали для введения, имеющегося в настоящее время коммерческого препарата адалимумаба, а иглу 29G использовали для введения препаратов F1, F3 и F4). В частности, ощущение укола является причиной немедленной болевой реакции, тогда как болевой ответ, измеряемый по шкале ВАШ, свидетельствовал о длительной персистирующей боли на протяжении нескольких минут, что свидетельствует о том, что инъецируемый раствор сам по себе вносит вклад в основную часть ответа. Кроме того, все тестируемые препараты (F1, F3 и F4) инъецировали, используя иглу одного и того же размера, тем не менее F1, F3 и F4 имели очень разные оценки ВАШ. Полученный результат дополнительно показывает, что препарат вносит вклад в болевой эффект, и что такой эффект можно отделить от эффекта размера иглы, используемой для введения препаратов.

ПРИМЕР 2: ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ Антител против TNFα ПОВЫШАЮТ БИОДОСТУПНОСТЬ У ЧЕЛОВЕКА

В следующем примере описана фаза 1 одностороннего слепого рандомизированного исследования в параллельных группах с введением однократной дозы здоровым добровольцам (такое же исследование описано выше, в примере 1). Основными целями настоящего исследования были: сравнение боли, связанной с инъекцией трех высококонцентрированных (100 мг/мл) препаратов адалимумаба в предварительно заполняемом шприце (ПЗШ) Physiolis с имеющимся в настоящее время препаратом адалимумаба (50 мг/мл) (хумира), в имеющемся в настоящее время ПЗШ (смотри пример 1), и оценка биодоступности трех высококонцентрированных препаратов адалимумаба (100 мг/мл) в сравнении, с имеющимся в настоящее время коммерческим препаратом адалимумаба (50 мг/мл) (хумира). Дополнительной целью настоящего исследования, была оценка безопасности и переносимости всех четырех препаратов адалимумаба.

Дизайн исследования

Двести здоровых добровольцев были набраны в исследование (таблица 10). Данные оценки боли получали от всех 200 субъектов. Фармакокинетику адалимумаба оценивали у первых 100 субъектов. Описание препаратов приведено выше в таблице 1.

Таблица 10
Группы лечения
Группа лечения	Количество субъектов в исследовании	Количество субъектов для получения фармакокинетических данных	День исследования 1, подкожная инъекция
A	50	24	Высококонцентрированный препарат адалимумаба №1 (40 мг/0,4 мл в ПЗШ Physiolis
B	50	24	Высококонцентрированный препарат адалимумаба №3 (40 мг/0,4 мл в ПЗШ Physiolis
C	50	23	Высококонцентрированный препарат адалимумаба №4 (40 мг/0,4 мл в ПЗШ Physiolis
D	50	23	Современный коммерческий препарат хумира (40 мг/0,8 мл в современном ПЗШ
* Смотри таблицы 4-7 в отношении составов препаратов

Субъекты в каждой группе лечения получали одну подкожную инъекцию 40 мг адалимумаба через ПЗШ в день исследования 1. Каждую дозу исследуемого лекарственного средства подкожно вводил сотрудник соответствующего центра в соответствии с надлежащим способом инъекции, как описано в протоколе. Инъекцию вводили подкожно в живот справа от пупка на расстоянии 2 дюймов (5,08 см). Анкеты заполнял другой сотрудник центра, не тот, который вводил инъекции, с частотой, которая только была возможна.

Результаты

Фармакокинетические результаты и заключение

После однократно подкожной дозы адалимумаба центральные значения фармакокинетических параметров T_max, C_max, AUC_0-360 и AUC_0-1344 были сходными для средств лечения A, B (высококонцентрированные препараты адалимумаба 1 и 3, соответственно) и D (имеющийся в настоящее время коммерческий препарат хумира). После введения однократной дозы среднее T_max наступало раньше в случае средства лечения C (высококонцентрированный препарат адалимумаба 4) по сравнению со средством лечения D (фигуры 2 и 3). Центральные значения C_max и AUC_0-360 были выше (p < 0,05) в случае средства лечения C по сравнению со средством лечения D.

Биодоступность/биоэквивалентность средств лечения A, B и C (высококонцентрированные препараты адалимумаба) по сравнению со средством лечения D (коммерческий препарат хумира)

Для группы лечения A по сравнению с D, точечные оценки отношений центральных значений C_max, AUC_0-360 и AUC_0-1344 для средств лечения A и B составляли почти единицу, и 90% доверительные интервалы были в диапазоне от 0,80 до 1,25. Для средства лечения B по сравнению с D, точечные оценки отношений центральных значений C_max и AUC_0-360 составляли почти единицу, и 90% доверительные интервалы были в диапазоне от 0,80 до 1,25. В случае AUC_0-1344 верхняя граница 90% доверительного интервала для средства лечения B по сравнению с D, была выше 1,25. Для средства лечения C по сравнению с D, точечные оценки отношения центральных значений C_max, AUC_0-360 и AUC_0-1344 составляли 1,429, 1,309 и 1,170 соответственно, что свидетельствует о том, что относительная биодоступность средства лечения C (препарат 4) была выше.

Таблица 11
Относительная биодоступность и 90% доверительные интервалы для оценки биоэквивалентности
Средства лечения£ Тестируемый по сравнению с эталонным	ФК-параметр	Центральное значение	Относительная биодоступность
Тест	Эталон	Точечная оценка	90% доверительный интервал
A по сравнению с D	Cmax	4,47	4,39	1,018	0,859-1,207
	AUC0-360	1192,14	1192,23	1,000	0,860-1,163
AUC0-1344	2306,91	2387,28	0,966	0,814-1,147
B по сравнению с D	Cmax	4,52	4,39	1,029	0,868-1,219
	AUC0-360	1222,24	1192,23	1,025	0,882-1,192
AUC0-1344	2547,95	2387,28	1,067	0,899-1,266
C по сравнению с D	Cmax	6,28	4,39	1,429	1,202-1,699
	AUC0-360	1561,05	1192,23	1,309	1,123-1,527
AUC0-1344	2794,29	2387,28	1,170	0,983-1,394
£ Лечение A, B или C: однократная доза высококонцентрированных препаратов адалимумаба 1, 3 или 4, соответственно, вводимых в виде однократной подкожной инъекции с использованием ПЗШ Physiolis (40 мг/0,4 мл). Лечение D: однократная доза современного препарата хумира, вводимого в виде однократной подкожной инъекции с использованием имеющего в настоящее время стеклянного ПЗШ (40 мг/0,8 мл). ФК = фармакокинетический.

Фармакокинетическое заключение

На основании фармакокинетических результатов относительная биодоступность средств лечения A и B была сходной с биодоступностью средства лечения D, продаваемого в настоящее время на рынке препарата хумира. Относительная биодоступность средства лечения C была выше по сравнению со средством лечения D. Неожиданное увеличение биодоступности средства лечения C свидетельствует, что эффективное дозовое количество, вводимое субъекту, может быть уменьшено.

Заключение об иммуногенности

Двенадцать субъектов имели позитивные образцы AAA в любой временной точке исследования, при этом только двух субъектов определяли как AAA-позитивных в соответствии с предварительным определением. Из-за небольшого размера образцов и относительно сходного количества AAA-позитивных образцов невозможно было сделать заключение о различиях в иммуногенности между средствами лечения.

Заключение о безопасности

Тестированные средства лечения, в общем, были переносимы субъектами. Не наблюдали клинически значимых жизненно важных показателей, ЭКГ или лабораторных измерений в ходе исследования. Большинство неблагоприятных явлений были оценены исследователем, как вероятно не связанные или не связанные с исследуемым лекарственным средством и умеренные по тяжести. Ни одно из неблагоприятных явлений не было оценено как тяжелое.

Смертности, серьезных неблагоприятных явлений или прерывания исследования в результате неблагоприятных явлений в ходе исследования не было.

Результаты других анализов безопасности, включая изменения и потенциально клинически значимые значения жизненно важных показателей, ЭКГ и лабораторных измерений у отдельных субъектов, были несущественными во всех группах лечения.

Переносимость

Проводимые оценки переносимости включали выполнение модуля оценки боли (визуальная аналоговая шкала боли [ВАШ], качественная оценка боли и оценка боли от иглы) и оценку по шкале Дрейза (смотри пример 1).

ПРИМЕР 3: ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ ПРЕПАРАТ Антитела против TNFα УВЕЛИЧИВАЕТ БИОДОСТУПНОСТЬ В ДОКЛИНИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ

Целью настоящего исследования была оценка фармакокинетических профилей препарата адалимумаба F4, в отличие от коммерческого препарата адалимумаба (смотри описание препарата в таблице 7 выше).

Фармакокинетические профили хумиры (адалимумаб) исследовали на самцах и самках собак Beagle (по 2 каждого пола/подкожное введение и 2 самца/внутривенное введение, Marshall Bio Resources USA, Inc., North Rose, NY 14516) после однократной подкожной (п/к) инъекции коммерческого препараты хумиры (адалимумаба) и тестируемого препарата хумиры, соответствующего препарату F4 в предыдущих примерах (адалимумаб), а также внутривенной (в/в) инъекции коммерческого препарата хумиры в качестве контроля. Вводимая доза составляла 40 мг/собаку (в концентрации 100 мг/мл в случае F4 и 50 мг/мл в случае коммерческого препарата).

Для определения уровней экспозиции адалимумаба в сыворотке собирали образцы крови через 0,083, 4, 24, 48, 96, 168, 240, 312, 384, 456, 528 и 864 часа после введения (п/в). В качестве исследуемых параметров использовали клинические признаки (дважды в неделю) и смертность.

Кроме слизистого кала у одного самца в контрольной группе не наблюдали клинических признаков, имеющих отношение к исследованию. Показатели клинических признаков суммированы в таблицах 14 и 15 ниже.

Фармакокинетические результаты (описанные в таблице 12 ниже), полученные в настоящем исследовании, показали, что биодоступность после п/к введения доз составляла приблизительно 80% и наблюдаемые уровни экспозиции были выше у самок, чем у самцов после п/к введения доз. Имела место тенденция к более высоким уровням экспозиции после п/к введения доз тестируемого препарата по сравнению с п/к введением коммерческого препарата у самцов.

Таблица 12
Фармакокинетические результаты
Лечение	Пол	Номер животного	AUC0-528 h (мкг*час/мл)	AUC/Доза (мкг*час/мл/мг/ кг)	Vdss (мл)	T1/2 (часы)
Тестируемый препарат, п/к	самцы	1001	9020	226	708	39,3
		1003	11400	286	870	187,2
	среднее	10200±1680	256±42,4	789±115	113,3±104,6
	самки	1002	15400	384	388	55,5
		1004	15800	395	469	54,5
среднее	15600±283	390±7,78	429±57,3	55±0,7
Коммерческий препарат, п/к	самцы	2001	8010	200	692	21,4
		2003	8230	206	695	72,7
	среднее	8120±156	203±4,24	694±2,12	47,1±36,3
	самки	2002	12700	319	385	34,0
		2004	17200	431	477	119,0
среднее	15000±3180	375±79,2	431±65,1	76,5±60,1
Коммерческий препарат, в/в	самцы	3001	9360	234	548	45,5
		3003	11900	298	407	22,2
среднее	10600±1800	266±45,3	478±99,7	33,9±16,5

Таблица 13
Идентификация животных
№ животного	№ на татуировке	Пол
1001	1246730	Самец
1003	1230230	Самец
1002	1282302	Самка
1004	1288688	Самка
2001	1284879	Самец
2003	1298951	Самец
2002	1297237	Самка
2004	1280491	Самка
3001	1285514	Самец
3003	1290143	Самец

Таблица 14
Суммарные данные клинических наблюдений на самцах
Группа дозирования:	2	3	1
Исследуемые животные:	4	4	2
Количество нормальных:	3	3	2
Категория, наблюдение	a	b	a	b
Выделение, кал.	1	4	0	0
Примечание: a = количество животных с наблюдаемым явлением; b = количество дней видимого наблюдаемого явления.

Таблица 15
Суммарные данные клинических наблюдений у самок
Группа дозирования:	2	3	1
Исследуемые животные:	2	2	2
Количество нормальных:	2	2	2
Категория, наблюдение
Примечание: a = количество животных с наблюдаемым явлением; b = количество дней видимого наблюдаемого явления.

ПРИМЕР 4: СТАБИЛЬНОСТЬ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ Антитела против TNFα В СЛУЧАЕ СТРЕССА, ВЫЗВАННОГО ЗАМОРАЖИВАНИЕМ/РАЗМОРАЖИВАНИЕМ

В следующем примере сравнивали стабильность высококонцентрированных препаратов F1, F3, и F4 с коммерческим препаратом адалимумаба. Стабильность исследовали, используя тестирование замораживания/размораживания.

Экспериментальные условия

Высококонцентрированные препараты человеческих антител против TNFα готовили, как описано в примере 1 и таблице 1 выше.

Приготовленные растворы стерильно фильтровали, и делили на аликвоты в 8×30 мл-флаконы PETG по 20 мл, соответственно. Растворы практически не содержали частиц при визуальном осмотре.

Образцы для T0 сразу помещали в холодильник при температуре 2-8°C. Другие флаконы помещали в куб на -80°C для заморозки.

На следующий день флаконы размораживали на водяных банях при температуре 25°C или 37°C, соответственно.

Циклы замораживания/размораживания повторяли 5 раз. В T0 (перед циклами замораживания-размораживания), T1 (после одного цикла замораживания-размораживания), T3 (после трех циклов замораживания-размораживания) и T5 (после пяти циклов замораживания-размораживания) брали образцы для анализа, и хранили в холодильнике при 2-8°C.

→ n = по 1 на точку в пуле из 4 образцов;

→ объем образца: 20 мл;

→ замораживание/размораживание: -80°C/25°C+37°C;

→ циклы замораживания/размораживания: 5.

После проведения циклов образцы анализировали в лаборатории, используя каждое из следующих измерений: визуально определяемые характеристики (в каждой временной точке); поглощение при 340 нм; частицы, невидимые невооруженным глазом (в GGDDA); фотонно-корреляционная спектроскопия (PCS); эксклюзионная хроматография по размеру (SEC); и ионообменная хроматография (IEC).

Частицы, невидимые невооруженным глазом

Измерение частиц, невидимых невооруженным глазом, осуществляли на устройстве для измерения частиц Klotz. Результаты показаны в таблице 16.

Таблица 16
Подсчет частиц >=1 мкм, >=10 мкм и >=25 мкм
	Частицы >=
Временная точка	Образец	Температура	Загрузка	1 мкм	10 мкм	25 мкм
T0	HC F1	(25°C)	E161118001CL	9	1	0
T0	HC F1	(37°C)	E161118001CL	7	2	1
T1	HC F1	25°C	E161118001CL	3	0	0
T1	HC F1	37°C	E161118001CL	33	1	0
T3	HC F1	25°C	E161118001CL	3	0	0
T3	HC F1	37°C	E161118001CL	20	1	0
T5	HC F1	25°C	E161118001CL	4	0	0
T5	HC F1	37°C	E161118001CL	94	0	0
T0	HC F3	(25°C)	E161119001CL	6	3	1
T0	HC F3	(37°C)	E161119001CL	12	2	0
T1	HC F3	25°C	E161119001CL	4	1	0
T1	HC F3	37°C	E161119001CL	7	2	0
T3	HC F3	25°C	E161119001CL	3	1	0
T3	HC F3	37°C	E161119001CL	9	2	1
T5	HC F3	25°C	E161119001CL	7	0	0
T5	HC F3	37°C	E161119001CL	5	0	0
T0	HC F4	(25°C)	E161120001CL	5	1	1
T0	HC F4	(37°C)	E161120001CL	7	1	0
T1	HC F4	25°C	E161120001CL	6	1	0
T1	HC F4	37°C	E161120001CL	5	1	0
T3	HC F4	25°C	E161120001CL	12	1	1
T3	HC F4	37°C	E161120001CL	60	0	0
T5	HC F4	25°C	E161120001CL	13	0	0
T5	HC F4	37°C	E161120001CL	22	1	0
T0	коммерческий	(25°C)	E161121001CL	464	2	1
T0	коммерческий	(37°C)	E161121001CL	198	0	0
T1	коммерческий	25°C	E161121001CL	143	1	0
T1	коммерческий	37°C	E161121001CL	285	0	0
T3	коммерческий	25°	E161121001CL	108	0	0
T3	коммерческий	37°C	E161121001CL	224	0	0
T5	коммерческий	25°C	E161121001CL	39	0	0
T5	коммерческий	37°C	E161121001CL	151	0	0

Данные о частицах >=1 мкм показывают явную тенденцию к более высокой нагрузке частицами в коммерческом препарате хумира и высококонцентрированном (HC) F1 в точке T5, что отражает характерное поведение препаратов адалимумаба, содержащих буферную соль или хлорид натрия.

Название образца		Суммарные агрегаты	Мономер	Суммарные фрагменты
T0, HC F1, 25°C		0,42	99,50	0,09
T0, HC F1, 37°C		0,43	99,46	0,11
T0, HC F3, 25°C		0,39	99,54	0,07
T0, HC F3, 37°C		0,41	99,50	0,09
T0, HC F4, 25°C		0,43	99,46	0,11
T0, HC F4, 37°C		0,42	99,48	0,11
T0, коммерческий, 25°C		0,36	99,55	0,09
T0, коммерческий, 37°C		0,35	99,56	0,09
T1, HC F1, 25°C		0,43	99,47	0,10
T1, HC F1, 37°C		0,44	99,48	0,08
T1, HC F3, 25°C		0,38	99,53	0,09
T1, HC F3, 37°C		0,37	99,54	0,09
T1, HC F4, 25°C		0,44	99,47	0,09
T1, HC F4, 37°C		0,44	99,46	0,10
T1, коммерческий, 25°C		0,35	99,56	0,08
T1, коммерческий, 37°C	0,35	99,56	0,10
T3, HC F1, 25°C		0,42	99,47	0,10
T3, HC F1, 37°C		0,42	99,48	0,11
T3, HC F3, 25°C		0,40	99,48	0,12
T3, HC F3, 37°C		0,40	99,52	0,08
T3, HC F4, 25°C		0,48	99,41	0,11
T3, HC F4, 37°C		0,44	99,48	0,08
T3, коммерческий, 25°C		0,36	99,54	0,10
T3, коммерческий, 37°C		0,34	99,55	0,11
T5, HC F1, 25°C		0,43	99,48	0,09
T5, HC F1, 37°C		0,45	99,45	0,10
T5, HC F3, 25°C		0,41	99,48	0,11
T5, HC F3, 37°C		0,39	99,48	0,13
T5, HC F4, 25°C		0,47	99,43	0,10
T5, HC F4, 37°C		0,49	99,40	0,11
T5, коммерческий, 25°C		0,36	99,56	0,08
T5, коммерческий, 37°C	0,40	99,47	0,13

Количество частиц, невидимых невооруженным глазом, >= 10 мкм и >= 25, было очень низким.

Циклы замораживания/размораживания не приводили к увеличению количества частиц, невидимых невооруженным глазом, что свидетельствует о том, что тестируемые препараты имели подходящую стабильность.

Эксклюзионная хроматография по размеру (SEC)

Результаты SEC показаны в таблице 17. В таблице 17 указано процентное содержание агрегатов, мономеров и фрагментов, определяемое с помощью SEC, в каждом из растворов в T0 (перед циклами замораживания-размораживания), T1 (после одного цикла замораживания-размораживания), T3 (после трех циклов замораживания-размораживания) и T5 (после пяти циклов замораживания-размораживания). Полученные результаты показывают, что каждый из препаратов 1, 3 и 4 имел стабильность, сходную со стабильностью коммерческого препарата.

Таблица 17: Процентное содержание агрегатов, мономеров и фрагментов до и после циклов замораживания-размораживания, которое оценивали, используя SEC

Ионообменная хроматография (IEC)

Ионообменная хроматография не выявила разной чувствительности тестированных растворов. Не было выявлено значимого разрушения.

Однако с увеличением количества циклов замораживания/размораживания в образцах, которые размораживали при 25°C, наблюдали большее количество во 2-ой кислотной области после 5 циклов.

Результаты IEC показаны в таблице 18.

Таблица 18
Измерения IEC до и после циклов замораживания-размораживания
Название образца	Суммарные пики лизина	1-ая кислотная область	2-ая кислотная область	Лизин 0	Лизин 1	Пик между	Лизин 2
T0, HC F1, 25°C	86,74	2,09	10,51	68,63	16,72	0,99	0,40
T0, HC F3, 25°C	87,29	1,89	10,22	66,35	16,16	0,91	3,87
T0, HC F4, 25°C	87,35	1,85	10,20	66,46	16,15	0,89	3,85
T0, коммерческий, 25°C	87,18	1,93	10,22	66,25	16,12	0,94	3,88
T1, HC F1, 25°C	87,17	1,98	10,18	66,24	16,11	0,94	3,87
T1, HC F3, 25°C	87,30	1,81	10,24	66,39	16,13	0,90	3,88
T1, HC F4, 25°C	87,21	1,88	10,25	66,31	16,11	0,90	3,88
T1, коммерческий, 25°C	87,19	2,01	10,20	66,27	16,11	0,93	3,88
T3, HC F1, 25°C	87,23	1,94	10,20	66,34	16,12	0,91	3,87
T3, HC F3, 25°C	87,27	1,86	10,25	66,37	16,14	0,88	3,88
T3, HC F4, 25°C	87,26	1,82	10,27	66,34	16,15	0,88	3,88
T3, коммерческий, 25°C	87,20	1,88	10,28	66,29	16,11	0,91	3,89
T5, HC F1, 25°C	87,39	1,74	10,21	66,43	16,18	0,89	3,88
T5, HC F3, 25°C	87,27	1,79	10,32	66,42	16,15	0,84	3,86
T5, HC F4, 25°C	87,33	1,69	10,32	66,49	16,14	0,85	3,85
T5, коммерческий, 25°C	87,05	1,95	10,38	66,17	16,10	0,89	3,88
T0, HC F1, 37°C	87,25	1,94	10,19	66,36	16,13	0,90	3,86
T0, HC F3, 37°C	87,42	1,82	10,19	66,54	16,16	0,85	3,87
T0, HC F4, 37°C	87,38	1,89	10,11	66,52	16,14	0,86	3,86
T0, коммерческий, 37°C	87,25	1,86	10,24	66,34	16,12	0,91	3,88
T1, HC F1, 37°C	87,21	1,98	10,17	66,27	16,11	0,95	3,88
T1, HC F3, 37°C	87,32	1,91	10,12	66,40	16,13	0,90	3,88
T1, HC F4, 37°C	87,27	1,98	10,13	66,36	16,14	0,91	3,86
T1, коммерческий, 37°C	87,28	1,97	10,14	66,34	16,12	0,93	3,88
T3, HC F1, 37°C	87,27	1,95	10,15	66,36	16,11	0,94	3,86
T3, HC F3, 37°C	87,18	2,03	10,11	66,29	16,13	0,90	3,87
T3, HC F4, 37°C	87,21	1,95	10,15	66,35	16,09	0,92	3,85
T3, коммерческий, 37°C	87,31	1,95	10,21	66,50	16,09	0,91	3,81
T5, HC F1, 37°C	87,29	2,01	10,06	66,40	16,11	0,93	3,85
T5, HC F3, 37°C	87,25	2,07	10,06	66,37	16,10	0,92	3,87
T5, HC F4, 37°C	87,28	2,04	10,02	66,42	16,11	0,93	3,83
T5, коммерческий, 37°C	87,53	1,91	10,02	66,72	16,11	0,88	3,83

ПРИМЕР 5: СТАБИЛЬНОСТЬ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNFα В УСЛОВИЯХ СТРЕССА, ВЫЗВАННОГО ПЕРЕМЕШИВАНИЕМ

В следующем примере описано исследование, в котором оценивали стабильность препаратов F1, F3 и F4, используя тест в условиях стресса, вызванного перемешиванием. Каждый препарат тестировали в определенном диапазоне уровней pH.

Материалы

▪	Хумира HC F1 100 мг/мл	pH 4,2
		pH 4,7
		pH 5,7
pH 6,2
▪	Хумира HC F3 100 мг/мл	pH 4,2
		pH 4,7
		pH 5,7
pH 6,2
▪	Хумира HC F4 100 мг/мл	pH 4,2
pH 4,7

		pH 5,7
pH 6,2

Способ

Флаконы, якори мешалки и пробки стерилизовали паром перед использованием.

Эксперимент по перемешиванию осуществляли в следующих экспериментальных условиях:

- Растворы белков: хумира HC F1, F3, F4, каждый с pH 4,2, 4,7, 5,7, 6,2, 100 мг/мл, хумира HC F3 pH 5,2, 100 мг/мл, хумира от Vetter 50 мг/мл;

- объем наполнения флакона 6R 5 мл;

- n = 3 → 2 перемешиваемых (якорем магнитной мешалки 7×2 мм), 1 неперемешиваемый контроль (без якоря магнитной мешалки);

- многоместная магнитная мешалка HP: 550 об./мин;

- температура окружающей среды;

- пул образцов: t = 0, t = 1 час, t = 4 час, t = 24 час, t = 48 час.

Наполняли три флакона 6R по 5 мл для каждого из растворов белков, и закрывали пробками. В два из них помещали якорь магнитной мешалки.

Флаконы хранили при 5°C в течение ночи. На следующее утро образцы (по одному из каждого раствора белка, поскольку вначале они все были одинаковыми) измеряли нефелометром. Измеренные растворы снова возвращали во флаконы перед началом эксперимента. Через 1, 4, 24 и 48 часов брали образцы, и определяли мутность.

Неперемешиваемые образцы измеряли только во временных точках 0 и 48 часов.

В случае хумиры HC F3 pH 5,2 также определяли частицы, невидимые невооруженным глазом, во всех временных точках.

Результаты

Мутность

Результаты определения мутности в образцах, подвергнутых стрессу в условиях перемешивания в течение 0, 1, 4, 24 или 48 часов, а также в неперемешиваемом контроле через 48 часов показаны в таблице 19.

Таблица 19
Мутность (NTU) образцов, подвергнутых стрессу в условиях перемешивания
Образец	0 час	1 час	4 час	24 час	48 час
Коммерческий адалимумаб	20,90	23,90	31,20	98,05	176,00
Хумира HC F3 pH 5.2	6,13	6,69	8,92	18,05	29,50
Хумира HC F1 4.2	8,62	8,89	9,40	6,48	15,05
Хумира HC F1 4.7	14,00	15,50	20,05	10,88	81,40
Хумира HC F1 5.7	30,70	33,25	36,40	23,40	100,40
Хумира HC F1 6.2	38,00	40,95	52,60	32,65	168,00
Хумира HC F3 4.2	3,20	3,35	3,72	4,88	6,69
Хумира HC F3 4.7	4,81	5,20	6,09	9,54	18,70
Хумира HC F3 5.7	8,75	10,03	11,30	25,90	46,10
Хумира HC F3 6.2	9,24	-	13,05	22,60	37,30
Хумира HC F4 4.2	3,44	3,74	3,80	6,48	9,79
Хумира HC F4 4.7	5,13	5,67	6,60	10,88	17,00
Хумира HC F4 5.7	9,23	10,15	12,50	23,40	32,20
Хумира HC F4 6.2	10,30	11,65	15,55	32,65	56,75

Повышенное значение pH коррелировало с повышенной мутностью в случае всех тестированных препаратов, как T0/неперемешиваемых, так и перемешиваемых образцов. Такой эффект был наиболее выраженным в случае препарата 1. Также в препарате 1 наблюдали самое большое увеличение мутности после 48 часов при всех значениях pH, за исключением 4,2. В препаратах 3 и 4 наблюдали сходное поведение, и значения мутности были сравнимы во всех временных точках.

В случае хумиры HC (100 мг/мл), F3, pH 5,2, наблюдали только небольшое увеличение мутности с течением времени. Напротив, в коммерческом растворе хумиры наблюдали как значимо более высокое исходное значение, так и увеличение мутности с течением времени. Таким образом, в препарате 3 мутность была меньше, чем в коммерческом препарате хумиры.

В перемешиваемых образцах наблюдали больше мутности по сравнению с неперемешиваемыми контролями. Мутность неперемешиваемых контролей оставалась почти неизменной по сравнению с образцами в точке 0 часов, что свидетельствует о том, что проведение эксперимента при комнатной температуре не приводит к отклонениям в результатах.

Частицы, невидимые невооруженным глазом

В таблице 20 показаны результаты определения количества частиц, невидимых невооруженным глазом.

Таблица 20
Подсчет частиц, невидимых невооруженным глазом, до и после стресса, вызванного перемешиванием
	Частицы, невидимые невооруженным глазом
Хумира HC F3 pH 5.2	>=1 мкм	>=10 мкм	>=25 мкм
0 час	103	3	1
1 час	194	4	0
4 час	202	4	0
24 час	262	2	0
48 час	192	3	0
48 час неперемешиваемые	80	1	0

Частицы ≥ 1 мкм

Перемешивание индуцировало небольшое увеличение количества частиц, невидимых невооруженным глазом размером ≥ 1 мкм. Неперемешиваемый контроль был сравним с образцом во временной точке 0 часов.

Частицы ≥ 10 мкм

Перемешивание не оказывало значимого влияния на количество частиц размером ≥ 10 мкм. Неперемешиваемый контроль был сравним с образцом во временной точке 0 часов.

Частицы ≥ 25 мкм

Перемешивание не оказывало значимого влияния на количество частиц размером ≥ 25 мкм. Неперемешиваемый контроль был сравним с образцом во временной точке 0 часов.

В общем, результаты экспериментов представленных в примере 5 показали, что препарат 3 в том случае, когда его подвергают стрессу, вызванному перемешиванием, был неожиданно стабильным по сравнению с коммерческим раствором хумиры. Препарат 3 был устойчив к стрессу, вызванному перемешиванием в соответствии с измерением мутности, и перемешивание препарата 3 также оказывало небольшое влияние или не оказывало влияния на образование частиц невидимых невооруженным глазом.

ПРИМЕР 6: СТАБИЛЬНОСТЬ ПРИ ДОЛГОВРЕМЕННОМ ХРАНЕНИИ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННОГО Антитела против TNFα

В следующем примере описано исследование, в котором оценивали стабильность при долговременном хранении (до 24 месяцев) препаратов F1, F3 и F4. Препараты F1, F3 и F4 тестировали перед долговременным хранением (исходные) и через 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяцев хранения. Использовали следующие условия хранения: (1) 5°C, (2) 25°C/относительная влажность (ОВ) 60% и (3) 40°C/ОВ 75%. Во время хранения образцы были помещены в предварительно заполняемый шприц объемом 1 мл (бесцветный, стеклянный типа I, Ph.Eur.); шприц BD Hypak BD 260 с серой пробкой DB Hypak 4023/50 Fluorotec. Следующие измерения использовали для оценки стабильности при хранении: загрязнение частицами: видимыми частицами; прозрачность и опалесценцию; окраску раствора (визуальную); нейтрализацию TNFα in vitro; катионообменную хроматографию (CEX-ВЭЖХ), эксклюзионную хроматографию по размеру (SE-ВЭЖХ); загрязнение частицами - частицами, невидимыми невооруженным глазом; целостность системы контейнер/крышка; pH; и микробиологическую чистоту.

Все тестированные препараты были стабильными в тестированных условиях хранения при 2-8°C.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты, полученные для препарата F1, представлены в таблице 21.

Таблица 21
Сводные данные о стабильности препарата F1
Тестируемый показатель	Компонент	Описание	Продолжительность тестирования	Условия хранения [°C/ % ОВ]
5°C	25°C/60% ОВ	40°C/75% ОВ
Загрязнение частицами: видимые частицы	Видимые частицы	NMT 4,5	Исходный	0,0	0,0	0,0
			3 месяца	0,0	0,0	0,0
			6 месяцев	0,0	0,1	0,0
			9 месяцев	0,0	-	-
			12 месяцев	0,0	-	-
			18 месяцев	0,0	-	-
24 месяца	0,0	-	-
Прозрачность и опалесценция	Оценка	Опаслесцирует не больше, чем эталонная суспензия IV	Исходный	<= RS III	<= RS III	<= RS III
			3 месяца	<= RS III	<= RS III	<= RS IV
			6 месяцев	<= RS III	<= RS III	<= RS IV
			9 месяцев	<= RS IV	-	-
			12 месяцев	<= RS III	-	-
			18 месяцев	<= RS III	-	-
24 месяца	<= RS III	-	-
Окраска раствора (визуальная)	Шкала BY	Значение в отчете	Исходный	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 7
			3 месяца	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 7
			6 месяцев	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 6
			9 месяцев	<= BY 7	-	-
			12 месяцев	<= BY 7	-	-
			18 месяцев	<= BY 7	-	-
24 месяца	<= BY 7	-	-
Нейтрализация TNF in vitro	(тест на цитотоксичность) [%]	от 80% до 125% от способности к нейтрализации эталонного стандарта	Исходный	99	99	99
			3 месяца	97	110	97
			6 месяцев	87	81	68
			9 месяцев	88	-	-
			12 месяцев	110	-	-
			18 месяцев	97	-	-
	24 месяца	111	-	-
	Нижняя граница доверительного интервала ошибки (p=0,95) [%]	NLT 64	Исходный	96,1	96,1	96,1
			3 месяца	91,1	104,7	93,2
			6 месяцев	84,2	76,3	64,4
			9 месяцев	84,3	-	-
			12 месяцев	105,2	-	-
			18 месяцев	95,3	-	-
	24 месяца	108,9	-	-
	Верхняя граница доверительного интервала ошибки (p=0,95) [%]	NMT 156	Исходный	101,3	101,3	101,3
			3 месяца	101,9	115,5	100,1
			6 месяцев	90,8	85,9	71,2
			9 месяцев	90,8	-	-
			12 месяцев	114,2	-	-
			18 месяцев	98,8	-	-
24 месяца	113,5	-	-
Катионообменная хроматография	Сумма вариантов лизина[%]	NLT 75	Исходный	86,8	86,8	86,8
			3 месяца	86,2	74,7	26,0
6 месяцев	85,9	65,0	11,9
(CEX-ВЭЖХ)			9 месяцев	85,2	-	-
			12 месяцев	85,2	-	-
			18 месяцев	84,1	-	-
24 месяца	83,9	-	-
Эксклюзионная хроматография по размеру (SE-ВЭЖХ)	Основной пик (мономер)[%]	NLT 98	Исходный	99,6	99,6	99,6
			3 месяца	99,5	99,0	96,4
			6 месяцев	99,4	98,5	92,9
			9 месяцев	99,4	-	-
			12 месяцев	99,4	-	-
			18 месяцев	99,3	-	-
24 месяца	99,3	-	-
Загрязнение частицами - частицами, невидимыми невооруженным глазом	Частицы >= 10 мкм [контейнер]	NMT 6000	Исходный	11	11	11
			3 месяца	8	37	55
			6 месяцев	33	102	98
			9 месяцев	32	-	-
			12 месяцев	58	-	-
			18 месяцев	44	-	-
	24 месяца	11	-	-
	Частицы >= 25 мкм [контейнер]	NMT 600	Исходный	0	0	0
			3 месяца	0	0	1
			6 месяцев	0	2	2
			9 месяцев	0	-	-
			12 месяцев	0	-	-
			18 месяцев	1	-	-
24 месяца	0	-	-
Целостность системы контейнер/ крышка	Оценка	Плотно	Исходный	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
			6 месяцев	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
			12 месяцев	Соответствует требованиям	-	-
			18 месяцев	Соответствует требованиям	-	-
24 месяца	Соответствует требованиям	-	-
pH	Отдельные	4,7 до 5,7	Исходный	5,3	5,3	5,3
	значения		3 месяца	5,2	5,2	5,2
			6 месяцев	5,3	5,3	5,3
			9 месяцев	5,3	-	-
			12 месяцев	5,3	-	-
			18 месяцев	5,3	-	-
24 месяца	5,3	-	-
Микробиологическая чистота	Стерильность лекарственного продукта	Не обнаружено свидетельств роста микроорганизмов	Исходный	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям

Результаты, описанные выше, показывают, что при хранении в течение 24 месяцев при 5°C в препарате F1 не наблюдали загрязнения видимыми частицами, прозрачность и опалесценция <= показателям эталонного стандарта (RS) III и визуальная окраска <= BY7 (коричневато-желтая 7). В препарате F1 также выявляли 111% TNF-нейтрализующей способности от эталонного стандарта, 83,9% вариантов лизина, 99,3% мономеров, 11 частиц >=10 мкм и не выявляли частиц >=25 мкм. Кроме того, в F1 сохранялось стабильное значение pH 5,3 и не выявлено признаков роста микроорганизмов. При хранении в течение 6 месяцев при 25°C/60% ОВ в препарате F1 выявляли 0,1 видимых частиц, прозрачность и опалесценцию <= RS III, визуальную окраску <= BY7, 81% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 65% вариантов лизина, 98,5% мономеров, 102 частицы >=10 мкм, 2 частицы >=25 мкм, стабильный pH 5,3 и не выявляли признаков роста микроорганизмов. При хранении в течение 6 месяцев при 45°C/75% ОВ в препарате F1 не выявляли видимых частиц, прозрачность и опалесценцию <= RS IV, визуальную окраску <= BY6, 68% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 11,9% вариантов лизина, 92,9% мономеров, 98 частиц >=10 мкм, 2 частицы >=25 мкм и не выявляли признаков роста микроорганизмов.

Результаты для препарата F3 представлены в таблице 22.

Таблица 22
Сводные данные о стабильности препарата F3
Тестируемый показатель	Компонент	Описание	Продолжительность тестирования	Условия хранения [°C/ % ОВ]
5°C	25°C/60% ОВ	40°C/75% ОВ
Загрязнение частицами: видимые частицы	Видимые частицы	NMT 4,5	Исходный	0,0	0,0	0,0
			3 месяца	0,0	0,0	0,2
			6 месяцев	0,2	0,1	0,0
			9 месяцев	0,0	-	-
			12 месяцев	0,0	-	-
			18 месяцев	0,0	-	-
24 месяца	0,0	-	-
Прозрачность и опалесценция	Оценка	Опаслесцирует не больше, чем эталонная суспензия IV	Исходный	<= RS II	<= RS II	<= RS II
			3 месяца	<= RS II	<= RS II	<= RS II
			6 месяцев	<= RS II	<= RS II	<= RS II
			9 месяцев	<= RS II	-	-
			12 месяцев	<= RS II	-	-
			18 месяцев	<= RS II	-	-
24 месяца	<= RS II	-	-
Окраска раствора (визуальная)	Шкала BY	Значение в отчете	Исходный	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 7
			3 месяца	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 7
			6 месяцев	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 6
			9 месяцев	<= BY 7	-	-
			12 месяцев	<= BY 7	-	-
			18 месяцев	<= BY 7	-	-
24 месяца	<= BY 7	-	-

Нейтрализация TNF in vitro	(тест на цитотоксичность) [%]	от 80% до 125% от способности к нейтрализации эталонного стандарта	Исходный	87	87	87
			3 месяца	101	106	89
			6 месяцев	100	101	90
			9 месяцев	98	-	-
			12 месяцев	96	-	-
			18 месяцев	96	-	-
	24 месяца	98	-	-
	Нижняя граница доверительного интервала ошибки (p=0,95) [%]	NLT 64	Исходный	85,4	85,4	85,4
			3 месяца	92,9	88,1	80,6
			6 месяцев	98,3	97,4	86,5
			9 месяцев	97,0	-	-
			12 месяцев	93,3	-	-
			18 месяцев	93,9	-	-
	24 месяца	96,7	-	-
	Верхняя граница доверительного интервала ошибки (p=0,95)[%]	NMT 156	Исходный	88,5	88,5	88,5
			3 месяца	110,5	122,2	97,9
			6 месяцев	101,7	103,8	92,6
			9 месяцев	99,8	-	-
			12 месяцев	99,2	-	-
			18 месяцев	98,1	-	-
24 месяца	99,6	-	-
Катионообменная хроматография (CEX-ВЭЖХ)	Сумма вариантов лизина[%]	NLT 75	Исходный	86,8	86,8	86,8
			3 месяца	86,6	77,8	32,8
			6 месяцев	86,4	70,1	16,5
			9 месяцев	86,0	-	-
			12 месяцев	86,2	-	-
			18 месяцев	85,2	-	-
24 месяца	85,1	-	-
Эксклюзионная хроматография по размеру (SE-ВЭЖХ)	Основной пик (мономер)[%]	NLT 98	Исходный	99,7	99,7	99,7
			3 месяца	99,6	99,2	96,9
			6 месяцев	99,5	98,8	93,8
			9 месяцев	99,5	-	-
12 месяцев	99,5	-	-
			18 месяцев	99,4	-	-
24 месяца	99,4	-	-
Загрязнение частицами - частицами, невидимыми невооруженным глазом	Частицы >= 10 мкм [контейнер]	NMT 6000	Исходный	10	10	10
			3 месяца	12	45	73
			6 месяцев	22	157	275
			9 месяцев	50	-	-
			12 месяцев	54	-	-
			18 месяцев	45	-	-
	24 месяца	14	-	-
	Частицы >= 25 мкм [контейнер]	NMT 600	Исходный	0	0	0
			3 месяца	0	0	1
			6 месяцев	0	2	9
			9 месяцев	0	-	-
			12 месяцев	1	-	-
			18 месяцев	0	-	-
24 месяца	0	-	-
Целостность системы контейнер/ крышка	Оценка	Плотно	Исходный	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
			6 месяцев	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
24 месяца	Соответствует требованиям	-	-
pH	Отдельные значения	4,7 до 5,7	Исходный	5,2	5,2	5,2
			3 месяца	5,3	5,3	5,3
			6 месяцев	5,2	5,2	5,3
			9 месяцев	5,3	-	-
			12 месяцев	5,4	-	-
			18 месяцев	5,2	-	-
24 месяца	5,1	-	-
Микробиологическая чистота	Стерильность лекарственного продукта	Не обнаружено свидетельств роста микроорганизмов	Исходный	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям

Результаты, представленные в таблице 22, показывают, что при хранении в течение 24 месяцев при 5°C в препарате F3 не наблюдали загрязнения видимыми частицами, прозрачность и опалесценция <= RS II и визуальная окраска <= BY7. В препарате F3 наблюдали 98% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 85,1% вариантов лизина, 99,4% мономеров, 14 частиц >=10 мкм и не наблюдали частиц >=25 мкм. Значение pH менялось незначительно, и не было признаков роста микроорганизмов.

При хранении в течение 6 месяцев при 25°C/60% ОВ в препарате F3 не наблюдали видимых частиц, прозрачность и опалесценция <= RS II, и видимая окраска <= BY7. Также в препарате F3 наблюдали 101% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 97,4% вариантов лизина, 70,1% мономеров, 157 частиц >=10 мкм и 2 частицы >=25 мкм. Значение pH было стабильным, и не было признаков роста микроорганизмов.

При хранении в течение 6 месяцев при 45°C/75% ОВ в препарате F3 не наблюдали видимых частиц, прозрачность и опалесценция <= RS II и визуальная окраска <= BY6. Также в препарате F3 наблюдали 90% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 16,5% вариантов лизина, 93,8% мономеров, 275 частиц >=10 мкм и 9 частиц >=25 мкм. Значение pH было довольно стабильным, и не было признаков роста микроорганизмов.

Результаты для препарата F4 представлены в таблице 23.

Таблица 23
Сводные данные о стабильности препарата F4
Тестируемый показатель	Компонент	Описание	Продолжительность тестирования	Условия хранения [°C/ % ОВ]
5°C	25°C/60% ОВ	40°C/75% ОВ
Внешний вид	Видимые частицы	NMT 4,5	Исходный	0,0	0,0	0,0
			3 месяца	0,0	0,0	0,0
			6 месяцев	0,0	0,0	0,0
			9 месяцев	0,0	-	-
			12 месяцев	0,0	-	-
18 месяцев	0,0	-	-
Прозрачность	Оценка	Опаслесцирует не больше, чем эталонная суспензия IV	Исходный	<= RS II	<= RS II	<= RS II
			3 месяца	<= RS II	<= RS II	<= RS II
			6 месяцев	<= RS II	<= RS II	<= RS II
			9 месяцев	<= RS II	-	-
			12 месяцев	<= RS II	-	-
18 месяцев	<= RS II	-	-
Окраска	Шкала BY		Исходный	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 7
			3 месяца	<= BY 6	<= BY 6	<= BY 6
			6 месяцев	<= BY 7	<= BY 7	<= BY 6
			9 месяцев	<= BY 7	-	-
			12 месяцев	<= BY 7	-	-
18 месяцев	<= BY 7	-	-
Нейтрализация TNF in vitro (тест на цитотоксичность)	(тест на цитотоксичность) [%]	от 80% до 125% от способности к нейтрализации эталонного стандарта	Исходный	111	111	111
			3 месяца	105	101	80
			6 месяцев	97	101	76
			9 месяцев	112	-	-
			12 месяцев	97	-	-
	18 месяцев	104	-	-
	Нижняя граница доверитель	NLT 64	Исходный	105,2	105,2	105,2
			3 месяца	103,2	100,1	79,2
6 месяцев	92,9	97,5	74,7
	ного интервала ошибки (p=0,95)[%]		9 месяцев	109,3	-	-
			12 месяцев	90,2	-	-
	18 месяцев	101,2	-	-
	Верхняя граница доверительного интервала ошибки (p=0,95)[%]	NMT 156	Исходный	116,3	116,3	116,3
			3 месяца	106,2	102,7	80,4
			6 месяцев	101,1	103,5	78,1
			9 месяцев	113,9	-	-
			12 месяцев	104,9	-	-
18 месяцев	107,5	-	-
Катионообменная хроматография (CEX-ВЭЖХ)	Сумма вариантов лизина[%]	NLT 75	Исходный	85,5	85,5	85,5
			3 месяца	85,8	76,8	31,6
			6 месяцев	85,4	68,7	15,7
			9 месяцев	85,2	-	-
			12 месяцев	84,5	-	-
18 месяцев	84,4	-	-
Эксклюзионная хроматография по размеру (SE-ВЭЖХ)	Основной пик (мономер)[%]	NLT 98	Исходный	99,7	99,7	99,7
			3 месяца	99,6	99,1	96,5
			6 месяцев	99,6	98,8	93,1
			9 месяцев	99,5	-	-
			12 месяцев	99,5	-	-
18 месяцев	99,4	-	-
Загрязнение частицами - частицами, невидимыми невооруженным глазом	Частицы >= 10 мкм [контейнер]	NMT 6000	Исходный	17	17	17
			3 месяца	51	174	207
			6 месяцев	39	144	218
			9 месяцев	82	-	-
	12 месяцев	57	-	-
	Частицы >= 25 мкм [контейнер]	NMT 600	Исходный	0	0	0
			3 месяца	0	1	5
			6 месяцев	0	1	1
			9 месяцев	1	-	-
12 месяцев	2	-	-

Целостность системы контейнер/ крышка	Оценка	Должна удовлетворять требованиям (нет голубого окрашивания)	Исходный	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
6 месяцев	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
pH	Отдельные значения	4,7 до 5,7	Исходный	5,1	5,1	5,1
			3 месяца	5,2	5,2	5,1
			6 месяцев	5,2	5,1	5,2
			9 месяцев	5,2	-	-
			12 месяцев	5,2	-	-
18 месяцев	5,1	-	-
Микробиологическая чистота	Стерильность лекарственного продукта	Не обнаружено свидетельств роста микроорганизмов	Исходный	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям

Результаты, представленные в таблице 23, показывают, что при хранении в течение 18 месяцев при 5°C в препарате F4 не наблюдали загрязнения видимыми частицами, прозрачность и опалесценция <= RS II и визуальная окраска <= BY7. В препарате F4 наблюдали 104% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 84,4% вариантов лизина и 99,4% мономеров. Кроме того, значение pH было стабильным, и не было признаков роста микроорганизмов.

При хранении в течение 6 месяцев при 25°C/60% ОВ в препарате F4 не наблюдали видимых частиц, прозрачность и опалесценция <= RS II и визуальная окраска <= BY7. В препарате F4 наблюдали 101% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 68,7% вариантов лизина, 98,8% мономеров, 144 частиц >=10 мкм и 1 частицу >=25 мкм. Кроме того, значение pH было довольно стабильным, и не было признаков роста микроорганизмов.

При хранении в течение 6 месяцев при 45°C/75% ОВ в препарате F4 не наблюдали видимых частиц, прозрачность и опалесценция <= RS II и визуальная окраска <= BY6. В препарате F4 наблюдали 76% TNF-нейтрализующей способности по сравнению с эталонным стандартом, 15,7% вариантов лизина, 93,1% мономеров, 218 частиц >=10 мкм и 1 частицу >=25 мкм. Кроме того, значение pH было довольно стабильным, и не было признаков роста микроорганизмов.

В заключении, результаты долговременных экспериментов по определению стабильности, которые представлены в таблицах 21-23, показывают, что высококонцентрированные препараты F1, F3 и F4 были неожиданно стабильными в том случае, когда их подвергали долговременному хранению. Стабильность таких препаратов была сходной со стабильностью коммерческого препарата. Препараты F1 и F3 проявляли стабильность, сходную со стабильностью коммерческого препарата, после длительного хранения в течение по меньшей мере 24 месяцев. Препарат F4 проявлял стабильность, сходную со стабильностью коммерческого препарата после длительного хранения в течение по меньшей мере 18 месяцев.

ПРИМЕР 7: СТАБИЛЬНОСТЬ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННОГО Антитела против TNFα ПРИ ХРАНЕНИИ В УСЛОВИЯХ КОМНАТНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ

Жидкие фармацевтические продукты, содержащие терапевтические антитела, часто требуют хранения при 2-8°C вплоть до окончания срока годности. Следовательно, охлаждение также необходимо осуществлять пациентам в период от покупки лекарственных средств до применения. В зависимости от предлагаемой схемы дозирования, это может приводить к тому, что время хранения, за которое отвечает пациент в случае самостоятельного введения лекарственных средств, будет составлять до нескольких недель.

Следовательно, лекарственные средства, которые не требуют хранения в условиях охлаждения, обеспечивают значительно больше удобства для пациента при использовании продуктов для лечения на дому и уменьшают проблемы, связанные с качеством лекарственного средства в случае ненадлежащего хранения, тем самым, уменьшая частоту поступления рекламаций и оценки резкого роста температуры.

Продаваемый в настоящее время на рынке продукт, содержащий адалимумаб (хумира), был заново успешно приготовлен с более высокой концентрацией белка в виде препарата F3, который описан выше в примерах 1-6. Следующие далее данные о стабильности препарата F3, привели к обнаружению улучшенной стабильности в отношении разложения белка. Полученная кинетика разложения, измеренная при 25°C удовлетворяет требованиям хранения в условиях окружающей среды вплоть до 3 месяцев.

Общие данные о долговременной стабильности, имеющие отношение к хранению при 25°C препарата F3, смотри пример 6 выше.

Следующие данные описывают характеристики препарата F3 при длительном хранении. Данные показывают, что даже после длительного хранения в течение 18 месяцев и 24 месяцев при 2-5°C приемлемо дополнительное хранение при 25°C/30°C.

Таблица 24
Хранение F3 в течение 24 месяцев при 2-8°C с последующим хранением в течение 7 суток/14 суток в условиях ускоренного распада (25°C, 30°C)
Тестируемый критерий	Описание	Характеристика	t0 (24 месяца 5°C)	+ 7 суток	+ 14 суток
25°C	30°C/65% ОВ	25°C	30°C/65% ОВ
Внешний вид	Раствор от бесцветного до слабо желтого		удовлетворяет требования	удовлетворяет требования	удовлетворяет требования	удовлетворяет требования	удовлетворяет требования
Видимые частицы*	Один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц, 1 флакон > 10=>		0,0	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц
Эксклюзионная ВЭЖХ по размеру	Чистота, % мономера NLT 98%	агрегат	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
		мономер	99,4	99,3	99,3	99,3	99,2
фрагменты	0,2	0,2	0,3	0,3	0,3

Катионообменная ВЭЖХ	NMT 8%	первая кислая область	2,7	2,8	3,0	2,9	3,3
	NMT 16%	вторая кислая область	10,5	10,9	11,4	11,6	12,7
	NLT 75%	сумма вариантов лизина	85,1	84,2	83,4	83,0	81,2
	NMT 4%	Пик между лизином 1 и лизином 2	1,5	1,7	1,9	1,6	1,8
сообщаемое значение [%]	пики после лизина 2	0,2	0,4	0,4	0,9	1,0
PCS	сообщаемое значение [%]	среднее Z	1,390	1,365	1,395	1,397	1,420
Pdl	0,193	0,176	0,188	0,175	0,210

Таблица 25
Хранение F3 в течение 18 месяцев при 2-8°C с последующим хранением в течение 7 суток/14 суток в условиях ускоренного распада (25°C, 30°C)
Тестируемый критерий	Описание	Характеристика	t0(18 месяцев 5°C)	+ 7 суток	+ 14 суток
25°C	30°C/65% ОВ	25°C	30°C/65% ОВ
Внешний вид	Раствор от бесцветного до слабо желтого			удовлетворяет требования	удовлетворяет требования	удовлетворяет требования	удовлетворяет требования
Видимые частицы*	один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц, 1 флакон > 10=> информировали руководителя лаборатории			Значение, полученное исследователем: 3× 0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц	Значение, полученное исследователем: 3×0; один флакон ≤ 2 => практически не содержит вещества в виде видимых частиц
Загрязнение	частицы ≤ 10	≤ 1 мкм/1 мл		2250	5623	9355	10252

частицами; частицы, невидимые невооруженным глазом	мкм: ≤ 6000 частиц/емкость, частицы ≤ 25 мкм: ≤ 600 частиц/емкость
		≤ 10 мкм/1 мл		6	7	39	45
≤ 25 мкм/1 мл		0	0	0	1
PCS	сообщаемое значение [%]	Среднее Z		2,378	2,344	2,353	2,358
Pdl		0,102	0,077	0,077	0,077

ПРИМЕР 8: ПРОВОДИМОСТЬ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNFα

Проводимость высококонцентрированных препаратов антител против TNFα F3 и F4 (смотри примеры 1-6, выше) определяли, используя устройство InoLab Cond Level2 WTW, нормализованное для 25°C. В таблице 26 показано влияние неионных эксципиентов на проводимость препаратов адалимумаба F3 и F4.

Таблица 26
Проводимость препаратов F3 и F4
Образец	Температура [°C]	Проводимость [мкСм/см]
адалимумаб DP F3
1	22,4	663
2	22,4	651
3	23,8	660
4	21,4	715
5	21,7	691
6	23,1	680
7	23,3	644
8	22,9	647
адалимумаб DP F4
1	22,0	797
2	22,9	746

Как описано выше в таблице 26, средняя проводимость обоих препаратов F3 и F4 составляла менее чем 2 мС/см.

ПРИМЕР 9: ДИНАМИЧЕСКОЕ РАССЕЯНИЕ СВЕТА (ДРС) ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ ПРЕПАРАТАМИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNFα

Анализ динамического рассеяния света разбавленных растворов использовали для оценки гидродинамического диаметра (получали в виде среднего или Z-среднего размера, вычисляемого в анализе кумулянтов ДРС-измеряемой автокорреляционной функции интенсивности и коэффициента полидисперсности, PDI, распределения частиц по размеру). Измерения ДРС специально использовали для выявления низких количеств видов молекул с более высокой молекулярной массой, например, агрегатов, в распределении по размеру, так как, такие виды обладают более высокой интенсивностью рассеяния (пропорциональной d6) и, следовательно, будут в значительной степени влиять на Z-среднее и коэффициент полидисперсности (PDI), как показатель распределения по Z-среднему размеру.

Образцы объемом 150 мкл из каждого из препаратов F3 и F4 (смотри примеры 1-6 выше) измеряли для того, чтобы проанализировать средний размер частиц (Z-среднее) и коэффициент полидисперсности (PDI), показатель «широты» распределения частиц по размеру, используя ДРС. Результаты показаны ниже. Данные ДРС не показали никаких признаков образования высокомолекулярных агрегатов, так как коэффициент полидисперсности, чувствительный показатель в случае низких уровней более высокомолекулярных субпопуляций, значимо не увеличивался.

Препарат F3
№ образца	Z-среднее (нм)	PDI
1	2,4	не анализировали
2	2,3	0,08
3	2,3	0,14
4	2,3	0,09

Препарат F4
№ образца	Z-среднее (нм)	PDI
1	1,3	не анализировали
2	2,5	не анализировали

Как описано выше, измерение z-среднего в случае как F3, так и F4 составляло менее чем 4 нм. Такой небольшой гидродинамический диаметр характерен для того факта, что оба препарата F3 и F4 не содержат других дополнительных эксципиентов, отличных от полисорбата и полиола или полисорбата.

ПРИМЕР 10: ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNFα

Исследовали влияние различных концентраций маннита и концентраций полисорбата на стабильность адалимумаба в воде.

Готовили препараты, содержащие 100 мг/мл адалимумаба в воде. Затем добавляли различные концентрации либо маннита, либо полисорбата в определенном диапазоне концентраций, чтобы определить влияние каждого эксципиента на стабильность препарата, которую измеряли по агрегации и фрагментации. Концентрации полисорбата и маннита были в диапазоне от 0,1 до 1,0 мг/мл и 0-72 мг/мл соответственно, как показано на фигурах 3A и 3B. Как показано на фигуре 3A, варьирование концентрации маннита приблизительно от 12 до приблизительно 72 мг/мл оказывало минимальное влияние на стабильность адалимумаба. Подобным образом, варьирование концентрации полисорбата-80 приблизительно от 0,1 до приблизительно 1,0 мг/мл не оказывало влияние на стабильность адалимумаба.

ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛОК

Содержание всех цитированных публикаций (включая, например, публикации в литературе, патенты, заявки на выдачу патентов и веб-сайты), которые могут быть цитированы на протяжении настоящей заявки, специально включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме для любой цели. При практическом осуществлении настоящего изобретения будут использованы обычные способы приготовления препаратов белков, которые хорошо известны в данной области, если не указано иное.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах, не отходя от его сути или существенных признаков. Таким образом, описанные выше варианты необходимо считать во всех аспектах иллюстративными, а не ограничивающими изобретение, описанное в настоящей заявке. При этом объем изобретения указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в приведенном выше описании, и, таким образом, все изменения, которые подпадают под значение и входят в диапазон эквивалентности формулы изобретения, охвачены изобретением.

1. Жидкий водный препарат, содержащий:

(1) 100 мг/мл адалимумаба;

(2) 1 мг/мл полисорбата-80;

(3) 42 мг/мл маннита; и

(4) воды,

где препарат не содержит буфер или соль и где инъекция препарата субъекту, являющемуся человеком, приводит к оценке боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) меньше чем 1,0.

2. Жидкий водный препарат, состоящий из:

(1) 100 мг/мл адалимумаба;

(2) 1 мг/мл полисорбата-80;

(3) 42 мг/мл маннита; и

(4) воды.

3. Жидкий водный препарат по п. 1 или 2, отличающийся тем, что препарат является стабильным вплоть до приблизительно 30°C в течение по меньшей мере 6 сут.

4. Препарат по п. 3, отличающийся тем, что препарат является стабильным вплоть до приблизительно 30°C в течение 10 сут.

5. Препарат по п. 3, отличающийся тем, что препарат является стабильным вплоть до приблизительно 30°C в течение 14 сут.

6. Жидкий водный препарат по п. 1 или 2, отличающийся тем, что препарат обладает проводимостью менее чем приблизительно 2 мС/см.

7. Способ лечения пациента с ревматоидным артритом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

8. Способ лечения пациента с болезнью Крона, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

9. Способ лечения пациента с псориатическим артритом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

10. Способ лечения пациента с псориазом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

11. Способ лечения пациента с ювенильным идиопатическим артритом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

12. Способ лечения пациента с анкилозирующим спондилитом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

13. Способ лечения пациента с язвенным колитом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

14. Способ лечения пациента с гнойным гидраденитом, включающий введение пациенту препарата по п. 1 или 2.

15. Способ по любому из пп. 7-14, в котором препарат вводят субъекту с периодичностью раз в неделю.

16. Способ по любому из пп. 7-14, в котором препарат вводят субъекту с периодичностью раз в две недели.

17. Способ по любому из пп. 7-14, в котором препарат вводят субъекту с периодичностью раз в три недели.

18. Способ по любому из пп. 7-14, в котором препарат вводят субъекту с периодичностью раз в месяц.

19. Способ по любому из пп. 7-14, в котором введение является самостоятельным введением.

20. Жидкий водный препарат по п. 1 или 2, отличающийся тем, что препарат обладает гидродинамическим диаметром (D_h), который по меньшей мере на 50% меньше, чем D_h белка в забуференном растворе при данной концентрации.

21. Жидкий водный препарат по п. 1 или 2, отличающийся тем, что препарат обладает гидродинамическим диаметром (D_h) менее чем приблизительно 4 нм.