Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская ajuga turkestanica (regel) briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона



Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская ajuga turkestanica (regel) briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона
Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская ajuga turkestanica (regel) briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона
Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская ajuga turkestanica (regel) briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона
Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская ajuga turkestanica (regel) briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона

Владельцы патента RU 2639566:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской академии наук (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Каллусный штамм живучки туркестанской Ajuga turkestanica (Regel) Briq. At21, обладающий способностью продуцировать в условиях in vitro туркестерон, депонирован во Всероссийской Коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88. Штамм может быть использован для получения туркестерона. Изобретение обеспечивает высокий выход туркестерона. 2 ил.,2 табл.

 

Область применения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию клеток растения живучки туркестанской, и может быть использовано для получения ценного биологически активного соединения - туркестерона, которое широко применяется в спортивной медицине и косметологии.

Уровень техники

Живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Rgl.) Briq. многолетнее травянистое растение, относится к семейству Lamiaceae - эндемик Западного Тянь-Шаня и Гиссаро-Алая, произрастает на территории Узбекистана и Таджикистана, полукустарник семейства Яснотковые. Побеги живучки туркестанской применяются в спортивной медицине и косметологии, благодаря наличию в них специфического фитоэкдистероида - туркестерона, который по анаболическому эффекту не уступает синтетическим препаратам, не являясь при этом допингом. Туркестерон не токсичен, проявляет тонизирующее действие, стимулирует работоспособность, предохраняет от негативного воздействия различных стрессорных факторов. Живучка туркестанская является источником фитоэкдистероидов. Вид продуцирует экдистерон, аюгалактон, аюгастерон, циастерон, 22-ацетилциастерон, туркестерон [Б.З. Усманов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров. Фитоэкдизоны Ajuga turkestanica V. // Химия природных соединений. - 1977. - №5. - Р. 710-714].

Для соединений установлен широкий спектр биологической активности при различных экспериментальных патологических состояниях [З. Саатов, В.Н. Сыров, А.У. Маматханов, Н.К. Абубакиров. Фитоэкдистероиды растений рода Ajuga и их биологическая активность. 1. Распространение и химические структуры выделенных соединений // Химия природных соединений. - 1994. - №2. - С. 152]. Сумма экдистероидов растения обладает гипогликемической активностью [Т.А. Кутепова, В.Н. Сыров, З.А. Хушбактова, З. Саатов. Кутепова Т.А. Гипогликемическая активностьсуммы экдистероидов из Ajuga turkestanica. // Химико фармацевтический журнал, - Т. 35 - №11 - С. 24-25].

Экдистерон и туркестерон оказывают благотворное действие на энергетические реакции организма [Ташмухамедова М.А., К.Г. Алматов, З.А. Хушбактова, В.Н. Сыров, А.А. Абидов. Функционирование митохондрий печени крыс при введении им фитоэкдистероидов и неробола. // Узбекский биологический журнал, - 1987 - т. 3 - с. 3].

Также эти соединения обладают способностью блокировать процессы свободнорадикального окисления. Растение является среднеазиатским эндемиком с узким ареалом распространения. В связи с этим большой интерес представляет разработка биотехнологического способа получения экдистероидов с использованием культур клеток Ajuga turkestanica.

Ранее было установлено, что полученная культура тканей и клеток Ajuga turkestanica сохраняет биосинтез доминирующих в растении экдистероидов: экдистерона (20Е) и туркестерона [С.В. Лев, Р.П. Закирова, З. Саатов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров. Экдистероиды культуры тканей и клеток Ajuga turkestanica. II Химия природных соединений-1990. - №1. - С. 51-52].

Содержание веществ в первые циклы выращивания составляло соответственно 0,12% и 0,032% на сухой вес. В процессе длительного культивирования биосинтетическая активность каллусной культуры существенно снижалась [Р.П. Закирова М.Р. Якубова. Продуктивность каллусной ткани Ajuga turkestanica при многолетнем культивировании. // Химия природных соединений. - 2002. - №4. - С. 298]. Как правило, содержание вторичных соединений в условиях in vitro на порядок ниже и беднее по составу, чем в интактном растении и часто снижается при культивировании в течение нескольких лет. Была показана возможность повышения синтеза туркестерона путем индукции морфогенеза, но повышенный синтез не был стабилен и сохранялся на срок до 11-12 циклов субкулитивирования [Р.П. Закирова, И.Т. Абдукадыров, М.Р. Якубова Возможность повышения содержания экдистероидов в каллусных и суспензионных культурах клеток Ajuga turkestanica за счет использования индуцированного морфогенеза. // Биотехнология. 2012. №3. С. 44-47]. Также для повышения синтеза туркестерона добавляли элиситоры, либо проводили трансформацию с помощью агробактерий [Cheng, D. M., Yousef, G. G., Grace, M., Rogers, R. В., & Lila, M. A. (2007). In vitro production of phytoecdysteroids from Ajuga turkestanica II The FASEB Journal - V. 21(6) - A1079].

Таким образом, в литературе не было найдено работ по получению культуры клеток живучки туркестанской, обладающей стабильным и относительно высоким синтезом туркестерон в клетках самого штамма, а также высокими ростовыми характеристиками.

Задача изобретения

Задача изобретения - создание нового каллусного штамма живучки туркестанской (Ajuga turkestanica (Regel) Briq.), который является продуцентом туркестерона, со стабильными ростовыми параметрами, высокой жизнеспособностью, устойчивым синтезом туркестерона в процессе культивирования и отсутствием сезонной зависимости его получения.

Решение задачи

Эта задача была решена созданием нового каллусного штамма живучки туркестанской в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением At21 №88, который является продуцентом туркестерона.

Новизна изобретения

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм растения живучка туркестанская - продуцент туркестерона с высокими ростовыми характеристиками и стабильным относительно высоким синтезом туркестерона, по сравнению с описанными в литературе аналогами, сохраняющимся без дополнительных методов индукции синтеза.

Сущность изобретения

По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты листья, черешки и завязи растений живучки туркестанской, привезенных из горных районов Узбекистана, которые стерилизуют и помещают в жидкую питательную среду в качестве эксплантов. В результате был создан новый каллусный штамм - продуцент туркестерона.

Перечень иллюстративных материалов

Фигура 1. Ростовые характеристики культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Фигура 2. ВЭЖХ-хроматограмма анализа содержания туркестерона в биомассе культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Таблица 1. Состав сред для инициации каллусообразования и последующего выращивания каллусов живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Таблица 2. Ростовые параметры культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Реализация изобретения

Культуру клеток живучки туркестанской получают из интактных растений, используя в качестве эксплантов листья, стебли и завязи. Образцы растений для получения были привезены из горных районов Узбекистана. Растительные образцы промывают проточной водой, после чего выдерживают 20 сек. в 96% этаноле. Потом промывают стерильной дистиллированной водой. Затем растительные образцы помещают в раствор диацида на 4 мин., промывают стерильной дистиллированной водой, снова помещают в раствор диацида на 4 мин, после чего 3-кратно промывают в дистиллированной стерильной воде. Завязи, листовые пластинки и стебли подсекают скальпелем, предварительно разрезав на сегменты длиной 5 мм, и используют в качестве эксплантов, которые помещают на агаризованную питательную среду. Для инициации каллусообразования живучки туркестанской используют агаризованную среду Гамборга без гормонов (табл.1, среда 1), через неделю помещают на среду Гамборга с добавлением 4 мг/л 2,4-дихлорфеноскиуксусной кислоты (2,4-Д) и 0,1 мг/л кинетина (табл.1, среда 2), на которой культуры выращивают в течение 1 недели. Затем полученные каллусные культуры переводят на среду с 2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина (табл.1, среда 3), на которой проводят 2 цикла субкультивирования по 2 недели. Для последующего выращивания используют среду с 1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 0,05 мг/л бензиламинопурина (БАП) (табл. 1, среда 4).

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°C, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри диаметром 60 мм (10 среды в чашке). Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве каллус делят на 3-5 частей, в зависимости от ростовых параметров культуры на данный момент.

Полученные каллусные культуры клеток выращивают в течение более 20 циклов. В процессе культивирования определяют ростовые и биосинтетические характеристики.

Штамм Ajuga turkestanica (Regel) Briq. под обозначением At21 №88 обладает следующими признаками.

Культуральные признаки: биомасса клеток гомогенная, светло-кремовой окраски.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования, промывают водой на бумажных фильтрах на вакуумном насосе и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после высушивания образцов при 25°±1С в потоке теплого воздуха. Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1% растворе феносафранина.

В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур стабильно держится на 90-97%. Ростовые характеристики культуры клеток живучки туркестанской представлены на фиг.1.

При анализе представленных кривых роста следует отметить отсутствие лаг-фазы. Начало экспоненциальной фазы роста отмечено на 14 сутки субкультивирвания. Замедление роста на 29 сутки культивирования позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в табл.2.

Для определения содержания туркестерона навеску лиофилизированной биомассы культуры клеток подвергают кислотному гидролизу в 1.0 н. растворе соляной кислоты. Реакцию проводят в течение 14 часов при температуре 85оС.После гидролиза содержимое колбы переносят в делительную воронку, разбавляют водой и нейтрализуют 1.0 н. NH4OH. Экдистероиды исчерпывающе экстрагируют этилацетатом, растворитель отгоняют на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси ацетонитрил-вода (27:73, по объему). Полученный раствор фильтруют через нейлоновый фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, США) и используют для ВЭЖХ анализа.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят на приборе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Пробу объемом 20 мкл наносят на колонку Zorbax С18 (250×4,6 мм, 5 мкм). Скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин. В качестве компонентов подвижной фазы используют ацетонитрил и воду. Элюирование осуществляют в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил:вода 27:73, по объему. Детектирование осуществляют по поглощению при 247 нм. Количественное содержание туркестерона определяют методом внешней калибровки по стандарту туркестерона.

Результаты изобретения

Как видно из таблицы 2, штамм обладает высокой жизнеспособностью - около 95% при стабильных ростовых характеристиках. В штамме At21 №88 культуры клеток живучки туркестанской был обнаружен туркестерон, содержание которого в сухой биомассе достигало 0,05%.

В результате изобретения был показан способ получения каллусной культуры клеток живучки туркестанской, обладающей высокими ростовыми и относительно высоким устойчивым синтезом туркестерона в процессе культивирования, превышающими таковые у мировых аналогов. Удобство такого способа получения туркестерона состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.

Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq., депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88, в условиях in vitro - продуцент туркестерона.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, а именно представлен полинуклеотид, который кодирует белок, обладающий активностью переноса сахара на гидроксильную группу в 4ʹ-положении флавона.

Данное изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, а именно к растительной клетке, которая экспрессирует рекомбинантный белок, способу ее получения и способу получения рекомбинантного белка.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к синтетической ДНК для экспрессии белковых токсинов Cry. Также раскрыты ДНК-конструкция для экспрессии белковых токсинов Cry и трансгенное растение, имеющее устойчивость к насекомым-вредителям, чувствительным к белковым токсинам Cry.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с чешуекрылыми насекомыми. Также раскрыта выделенная нуклеиновая последовательность, которая является праймером.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ стимуляции морфогенеза в культуре ткани ячменя, включающий получение каллуса на плотной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2 мг/л дихлорфеноксиуксусной кислоты; его пассирование для пролиферации на среду с 1 мг/л дихлорфеноксиуксусной кислоты, а через три недели - для индукции морфогенеза - пассирование на среду с 1 мг/л кинетина, 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты, 0,1 мг/л гибберелловой кислоты, при этом одну из сред (для пролиферации каллуса или индукции морфогенеза) готовят не плотной, а полужидкой (4 г/л агара) с добавлением 5 об.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с насекомыми-вредителями, такими как Pseudoplusia includens (соевая совка), Anticarsia gemmatalis (гусеница бархатных бобов), Spodoptera frugiperda (травяная совка).

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре болиголова пятнистого (Conium maculatum L), включающий культивирование на питательной среде МС каллусной культуры болиголова пятнистого в присутствии 6-бензиламинопурина в течение 30 суток, сбор биомассы и выделение биологически активных веществ, отличающийся тем, что культивирование ведут при 26±1°С, влажности 70%, в темноте, 6-бензиламинопурин вводят в питательную среду при концентрации 1 - 0,1 мг/л совместно с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 1 - 0,5 мг/л или совместно с α-нафтилуксусной кислотой при концентрации в диапазоне 3 - 0,5 мг/л, а биологически активные вещества выделяют путем кислого и щелочного хлороформного извлечения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, содержащую компоненты в следующем количестве, мг/л: KNO3 1900; KH2PO4 170; NH4NO3 1650; MgSO4×7H2O 370; CaCl2×2H2O 440; FeSO4×7H2O 37,3; Na2EDTA×2H2O 27,8; KI 0,83; H3BO3 6,2; MnSO4×4H2O 22,3; CoCl2×6Н2О 0,025; CuSO4×5Н2О 0,025; ZnSO4×7H2O 8,6; Na2MoO4×2Н2О 0,25; тиамин-HCl 0,5-1,5; пиридоксин-HCl 0,4-0,6; никотиновая кислота 0,4-0,6; сахароза 30000; агар-агар 10000; НУК 1-3; 6-БАП 0,1-1; вода дистиллированная - остальное.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению, которое имеет устойчивость к кукурузному корневому жуку (Diabrotica spp.), содержащему ДНК, кодирующую белок Cry34Ab1, ДНК, кодирующую белок Cry35Ab1 и ДНК, кодирующую белок Cry3Ba1, его семени и клетке, а также к способу замедления развития устойчивости к белкам Cry34Ab1, Cry35Ab1 и Cry3Ba1 у кукурузного корневого жука с его использованием.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к биологически активной субстанции для подавления активности роста штаммов Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Proteus vulgaris ATCC 4636, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus subtilis ATCC 6633 и Candida albicans ATCC 653/885.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H5N1, содержащий аминокислотную последовательность из остатков 2-568 SEQ ID NO: 1, кодирующая его нуклеиновая кислота, содержащие предложенный полипептид слитый белок и вирусоподобная частица (VLP) для вызова ответа на вирус гриппа H5N1, вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, и выделенная клетка, его содержащая, композиция и способ вызова иммунного ответа против вируса гриппа H5N1, а также способ иммунизации субъекта.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ блокирования или уменьшения рецидивирующего роста опухоли или рецидивирующего роста раковых клеток, включающий введение эффективного количества антитела против VEGF субъекту, нуждающемуся в таком лечении, где антитело против VEGF содержит: HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или 5; HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или где антитело против VEGF содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44 или 45.

Представленные изобретения касаются химерного антигена, вакцинной композиции, содержащей такой химерный антиген, и применения химерного антигена для получения вакцин против вируса гепатита C (HCV).

Изобретение относится к медицине, конкретно к химико-фармацевтической промышленности, а именно к применению аскорбата лития в дозе, по меньшей мере, 5 мг/кг в качестве средства для профилактики и лечения хронической алкогольной интоксикации.

Изобретение относится к области косметологии и представляет собой твердую косметическую композицию для очищения волос и/или тела пользователя, включающую кукурузный крахмал в количестве, равном от 20 до 40%, агент, увеличивающий объем, в количестве, равном от 20 до 50%, поверхностно-активное вещество в количестве, равном от 5 до 30%, и глицерин в количестве, равном от 15 до 30%, где содержания указаны по массе в пересчете на всю композицию.
Группа изобретений касается композиции для ухода за полостью рта и способа ее применения. Предлагаемая композиция содержит: (i) пероксидное отбеливающее средство, содержащее отбеливающий комплекс поперечно-сшитого поливинилпирролидона, связанного в комплекс с пероксидом водорода, (ii) кислый пирофосфат натрия (Na2H2P2O7) в количестве от 0,1 до 5% масс.
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и касается применения композиции для изготовления продукта для использования для увеличения биоразнообразия микроорганизмов в кишечной флоре грудного ребенка, рожденного с помощью кесарева сечения.

Изобретение относится к косметологии, а именно к жидкой косметической композиции для макияжа и/или ухода за кожей и/или губами, содержащей, в физиологически приемлемой среде, по меньшей мере одну жировую фазу, содержащую по меньшей мере одно масло, которое предпочтительно является нелетучим, по меньшей мере гидрофобные частицы аэрогеля на основе диоксида кремния, по меньшей мере один полукристаллический полимер, представляющий собой алкил(мет)акрилатные или алкил(мет)акриламидные гомополимеры с алкильной группой, такой как С14-С24 алкильная группа, сополимеры этих мономеров с гидрофильным мономером, отличающимся от (мет)акриловой кислоты, таким как N-винилпирролидон или гидроксиэтил(мет)акрилат, или их смеси, указанная композиция содержит менее 5 мас.% воды относительно общей массы композиции.

Группа изобретений относится к области фармацевтики, а именно к фармацевтической композиции для предупреждения и лечения полинейропатии в виде твердой лекарственной формы пролонгированного высвобождения, включающей в качестве активного агента Биотин – 40-60 мас.%, а в качестве вспомогательных веществ: Метоцел К100 LV – 14-21 мас.%, Метоцел К4М – 5-10 мас.%, микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) – 7-18 мас.%, коповидон – 1,5-3 мас.%, коллоидный диоксид кремния – 0,4-1 мас.% и фармацевтически приемлемую соль стеариновой кислоты – 0,6-1 мас.%, а также к способу ее получения, согласно которому Биотин, Метоцел К4М, Метоцел К100 LV, МКЦ и коповидон просеивают и перемешивают до однородности, добавляют соль стеариновой кислоты, коллоидный диоксид кремния, перемешивают, смесь уплотняют вальцеванием, добавляют коллоидный диоксид кремния и перемешивают вместе с предварительно уплотненными гранулами с последующим добавлением соли стеариновой кислоты, перемешиванием и формованием твердой лекарственной формы.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения магнитоактивного рентгеноконтрастного средства в виде водной дисперсии наночастиц, содержащих оксид железа Fe3O4 и оксид тантала Та2О5, путем последовательного осаждения из соответствующих растворов, содержащих соединения железа либо соединения тантала, с помощью раствора аммиака в присутствии стабилизатора, при этом оксид тантала осаждают из содержащего тантал водного фторидного либо водного сульфатооксалатного раствора, при этом раствор аммиака используют в количестве, обеспечивающем рН смеси не менее 10, полученный осадок отфильтровывают и промывают водой, после чего распульповывают его в воде, к полученной водной дисперсии добавляют при перемешивании водный раствор, содержащий соль железа (II) и соль железа (III), концентрированный раствор аммиака до значения рН смеси не менее 10 и раствор олеата натрия в качестве стабилизатора; в полученную смесь, содержащую оксид тантала Та2О5 и оксид железа Fe3O4, вводят содержащий тантал водный фторидный либо водный сульфооксалатный раствор, добавляют раствор аммиака до значения рН не менее 10 и раствор олеата натрия, после декантации образовавшегося осадка декантант сливают, оставшуюся пульпу отфильтровывают, промывают водой, полученный осадок распульповывают в воде и диспергируют ультразвуком. Изобретение обеспечивает повышение эффективности магнитоактивного рентгеноконтрастного средства. 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Каллусный штамм живучки туркестанской Ajuga turkestanica Briq. At21, обладающий способностью продуцировать в условиях in vitro туркестерон, депонирован во Всероссийской Коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88. Штамм может быть использован для получения туркестерона. Изобретение обеспечивает высокий выход туркестерона. 2 ил.,2 табл.

Наверх