Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80ос


A01N1/02 - Консервирование тел людей или животных, или растений или их частей; биоциды, например дезинфектанты, пестициды, гербициды (препараты для медицинских,стоматологических или гигиенических целей A61K; способы или устройства для дезинфекции или стерилизации вообще, или для дезодорации воздуха A61L); репелленты или аттрактанты (приманки A01M 31/06; лекарственные препараты A61K); регуляторы роста растений (соединения вообще C01,C07,C08; удобрения C05; вещества, улучшающие или стабилизирующие состояние почвы C09K 17/00)

Владельцы патента RU 2639892:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" (RU)

Изобретение относится к области криобиологии и медицине, а именно, к технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток крови (ЯКК) человека. Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови предусматривает смешивание криопротектора ДМСО с 6% декстраном (полиглюкин) в условиях гипотермии +4°С до получения 10% концентрации, добавление к концентрату ЯКК в равных объемах, фасовку в пластиковую тару и помещение в программный замораживатель. Далее образец охлаждают на первом этапе от стартовой температуры +22°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин до точки эвтектики -4,1°С, выполняют холодовую остановку в течение 5 мин, на втором этапе образец охлаждают со скоростью 10°С в 1 минуту от -4,1°С до температуры -80°С, после чего переносят в биохранилище, сохраняют в замороженном виде до 2 лет. Оттаивают образец в водяной ванне при +37°÷+39°С при интенсивном покачивании в течение 35-50 с и незамедлительно используют по целевому назначению. Предлагаемый способ криоконсервирования позволяет максимально сохранить жизнеспособность криоконсервированных ядросодержащих клеток крови человека и может успешно применяться в программах комплексной терапии многих тяжелых заболеваний, включая онкогематологические. 1 пр.

 

Изобретение относится к области криобиологии и медицине, а именно, к технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток крови (ЯКК) человека с криопротектором диметилсульфоксид (ДМСО) и может быть использовано при ауто- и аллотрансплантации. Сущность способа: в условиях гипотермии +4°С криопротектор ДМСО смешивают с 6% декстраном (полиглюкин) до получения 10% концентрации, добавляют к концентрату ЯКК в равных объемах, фасуют в пластиковую тару, помещают в программный замораживатель, охлаждают на первом этапе от стартовой температуры +22°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин до точки эвтектики -4,1°С, выполняют холодовую остановку в течение 5 мин, на втором этапе образец охлаждают со скоростью 10°С в 1 минуту от -4,1°С до температуры -80°С, после чего переносят в биохранилище, сохраняют в замороженном виде до 2 лет, оттаивают в водяной ванне при +37°÷+39°С при интенсивном покачивании в течение 35-50 с и незамедлительно используют по целевому назначению. Технический результат: способ позволяет максимально сохранить жизнеспособность криоконсервированных ядросодержащих клеток крови человека и может успешно применяться в программах комплексной терапии многих тяжелых заболеваний, включая онкогематологические.

В настоящее время оптимизация криоконсервирования ЯКК путем модификации рецептур криоконсервантов не обеспечивает достаточного увеличения морфологической и функциональной сохранности размороженных биологических объектов. Повысить количественную и качественную сохранность ЯКК позволяют не только криопротекторы, но и усовершенствование программ криоконсервирования биоматериала [Костяев А.А. Низкотемпературное консервирование гемопоэтических стволовых клеток при -80°С в режиме быстрого двухступенчатого замораживания (экспериментальное исследование). Автореф… дисс. докт. мед. наук.- СПб, 2003. - 35 с., Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - 80 с. (Коми научный центр УрО РАН), Полежаева Т.В. Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов. Автореф… дисс. докт. биол. наук.- СПб. - 2013. - 38 с.].

К перспективам усовершенствования программ замораживания (ПЗ) донорских ЯКК следует отнести введение дополнительных этапов ПЗ с определенными для каждого из них скоростями охлаждения клеточных суспензий и варьирование темпами замораживания биологических образцов на каждом из этапов с помощью программного замораживателя клеточных суспензий.

В технологии консервирования ЯКК человека известны способы их криоконсервирования, например, см. патент РФ на изобретение №2195111, МПК A01N 1/02, дата публикации патента 27.12.2002. Способ криоконсервирования клеточных суспензий. В нем использован экспоненциальный двухступенчатый режим замораживания, повышающий сохранность и устойчивость суспензий донорских ядросодержащих клеток крови: на первом этапе суспензию ядросодержащих клеток на холоде смешивают 1:1 с 10% раствором ДМСО, расфасовывают в эластичную полимерную упаковку до заполнения на 10-33%, помещают в морозильную камеру с раствором этилового спирта 38-40 об. % и температурой холодовой адаптации (ТА) от -22° до -25°С, выдерживают в хладагенте 22-24 мин, после чего на втором этапе упаковку с ЯКК помещают в морозильник и замораживают до -80°С на срок до 2,5 лет.

Исследованиями термограмм установлено, что в течение 2-4 мин первого этапа происходит охлаждение суспензии ЯКК до -2°÷-9°С, которые реагируют выбросом тепла на 4-5 мин. В последующие 22-24 мин низкотемпературного консервирования клеток идут процессы кристаллизации биообъекта, его переохлаждения, холодовой термодинамической стабилизации и на втором этапе - замораживания суспензии ЯКК.

Недостатком такого решения способа криоконсервирования ЯКК являются: способ не отработан для промышленного производства, обладает низким уровнем технологичности, использование этилового спирта оказывает высокое токсическое воздействие на организм персонала, является профессиональной и бытовой вредностью, в программе низкотемпературного консервирования биообъекта не предусмотрен обход точки кристаллизации клеточной суспензии, что приводит к снижению сохранности криоконсервированных ЯКК.

Наиболее близким к заявляемому по признакам является способ, описанный в статье авторов: Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Селиванов Е.А. «Наш опыт по заготовке, тестированию и хранению гемопэтических клеток пуповинной крови», журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия №1[3], 2006. - С. 63-65. Клеточную взвесь смешивали с 10% ДМСО в конечной концентрации и аутологичной сывороткой, замораживали по линейной программе от +22°С до -80°С-1°С/мин. Температура начала кристаллизации отмечалась от -5,3°С до -13,2°С. Выброс латентного тепла (фаза кристаллизации) длился в течение 23''-2'40''. Витальность криоконсервированных ЯК пуповинной крови составляла 76,7±17,4%. Сохранность ЯКК - 88,7±14,1%.

Недостатками прототипа являются: высокая трудоемкость, а также проявление критической кристаллизации извне и изнутри замораживаемого биообъекта, приводящей к снижению сохранности ЯКК.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека, лишенного указанных недостатков и обеспечивающего высокую сохранность ядросодержащих клеток.

Технический результат достигается путем изменения программы замораживания суспензии ЯКК, включающей охлаждение объекта на первом этапе - от стартовой температуры +22°С до точки эвтектики -4,1°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин, выполнение холодовой остановки на 5 мин, на втором этапе - от -4,1°С до температуры -80°С со скоростью 10°С/мин, перемещение ЯКК в электроморозильник с температурой минус 80°С и сохранение биообъекта до срока трансплантации.

Практически способ осуществляют следующим образом.

Экспериментальные исследования выполнены на базе отделения трансфузиологии и процессинга ГСК и лаборатории консервирования крови и тканей ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Пример выполнения

В условиях гипотермии +4°С криопротектор ДМСО смешивали с 6% декстраном (полиглюкин) до получения 10% концентрации, затем медленно (в течение 1-2 мин) добавляли в соотношении 1:1 к концентрату лейкоцитов (КЛ) объемом 17±2 мл, полученному методом цитафереза («Sorvall», США) из периферической крови доноров-добровольцев до получения 5% концентрации ДМСО, фасовали в пластиковые пробирки, герметизировали, маркировали, затем помещали в программный замораживатель KRYO (модель 360, производство фирмы «PLANER Plс», Великобритания). Замораживание осуществляли по двухэтапной программе: на первом этапе - от стартовой температуры +22°С до точки эвтектики -4,1°С со скоростью 1,2-2,0°С/мин, затем выполняли холодовую остановку в течение 5 мин, на втором этапе образец охлаждали от -4,1°С до температуры -80°С со скоростью 10°С в 1 мин, после чего переносили в биохранилище, где ЯКК сохраняли в замороженном виде до 2 лет. Размораживали биообъект в 20-литровой водяной ванне при температуре +37°÷+39°С при интенсивном покачивании в течение 35-50 с. Размороженные ЯКК незамедлительно использовали по целевому назначению.

По предложенному способу было заморожено 30 образцов КЛ. Исследованиями установлено, что сохранность лейкоцитов после замораживания-оттаивания оставалась на уровне 87,2-91,0%, а число жизнеспособных (эозинорезистентных) клеток в пределах 69,0-75,0% от исходного количества.

Технический результат: способ позволяет максимально сохранить жизнеспособность криоконсервированных ядросодержащих клеток крови человека, что гарантирует восстановление кроветворения реципиента при лечении тяжелых заболеваний крови, в том числе онкогематологических, и, в то же время, повышает технологичность этой медицинской технологии. Используемый ДМСО и полиглюкин (6% декстран) являются доступными для любого медицинского учреждения. Отказ от применения в технологии замораживания ЛК от этилового спирта является несомненным преимуществом на социальном и производственном уровне.

Таким образом, предлагаемый способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека, позволяющий максимально сохранить жизнеспособность ядросодержащих клеток, не требует этилового спирта и может применяться при многих тяжелых заболеваниях, включая онкогематологические.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека до температуры -80°С.

Использование простых приемов и доступного криогенного оборудования указывает на возможность промышленной применимости.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.

Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека при температуре минус 80°С, заключающийся в смешивании криоконсерванта 10% ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в соотношении 1:1 (по объему) при +4°С, двухэтапном программном замораживании клеточной суспензии до -80°С с последующим оттаиванием при +37° ÷ +39°С, отличающийся тем, что на первом этапе - от стартовой температуры +22°С охлаждение взвеси ядросодержащих клеток осуществляют со скоростью 1,2-2,0°С/мин до точки эвтектики -4,1°С, затем выполняют холодовую остановку на 5 мин, на втором этапе охлаждение биообъекта производят со скоростью 10°С в 1 минуту от -4,1°С до температуры -80°С, перекладывают в электроморозильник на минус 80°С и сохраняют до трансплантации.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, и может быть использовано для приготовления учебных препаратов коленного сустава. Для изготовления влажного анатомического препарата коленного сустава используют отпрепарированный путем удаления кожи, подкожной клетчатки, поверхностной фасции, собственной фасции и параартикулярных мышц и сухожилий сустав.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к агрохимическим составам. Состав для протравливания семян сельскохозяйственных культур в качестве активных компонентов содержит, г/л: ацетамиприд 80-170, флудиоксонил 20-40, ципроконазол 5-10, 4-хлорфенилуксусную кислоту 0,1-0,3, алкилполисахарид с углеродной цепью С8-С10 30-100 и вспомогательные добавки в количестве до 1 л состава.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к средам для искусственного осеменения сельскохозяйственной птицы. Среда для разбавления спермы птицы изготовлена путем растворения в 100 мл бидистиллированной воды сухих компонентов, взятых при следующем соотношении (г): сахароза - 4,0-5,0, глюкоза - 0,3-0,5, уксуснокислый натрий - 1,1-1,6, углекислый кислый натрий - 0,1-0,2, щавелевая кислота - 0,02-0,04, при этом среда обеспечивает время хранения разбавленной спермы при сохранении оплодотворяющей способности для кур 24 часа, цесарок и индеек - 7 часов, уток - 4 часа, гусей - 3 часа.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция содержит активное соединение, заключенное внутри капсулы, причем микрокапсула имеет стенку, содержащую полимочевину, образованную гидролизованным мономером полиизоцианата и сшивающим агентом, при этом сшивающий агент является продуктом взаимодействия соли гидроксида с продуктом сополимеризации стирола и малеинового ангидрида.
Изобретение относится к области консервации биологических объектов, в частности нервных тканей палеонтологических объектов, и может быть использовано в палеонтологии и музейном деле.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и касается ветеринарной композиции для точечного наружного нанесения с целью лечения или предотвращения паразитарных инфекций или инвазий у животного.

Изобретение относится к способу консервации донорской крови. При консервации эритроцитов для последующей трансфузии осуществляют этапы: a.

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу изготовления альгинатного гидрогеля с применением липазы, субстрата, гидролизуемого липазой, альгината и карбоната, высвобождающего двухвалентные катионы.

Изобретение относится к механической обработке костных образцов in vitro и может быть использовано в научных исследованиях в биологии и медицине при изготовлении биологических имплантатов с возможностью дальнейшего хранения в "тканевых банках".

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к буферным жидким композициям, предназначенным для хранения препаратов ДНК в жидком виде, а также для пропитки пористых носителей, используемых для сбора и хранения биологического материала.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ хранения почек поросят при субнормальных температурах (0÷4°C) от 2 до 7 суток для получения монослоя первично трипсинизированных культур. Изобретение позволяет увеличить длительность хранения изолированной почки. 2 з.п. ф-лы, 5 пр., 3 табл., 5 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для получения донорской боуменовой мембраны удаляют эпителий с роговицы донорского глаза. Выкраивают корнеосклеральный диск и размещают его в искусственной передней камере в условиях гипотонии. Проводят маркировку по центру и циркулярно по границе роговицы. Надрез роговицы проводят алмазным ножом с микрометром, отслаивают пинцетом боуменову мембрану от стромы. После отделения от стромы боуменову мембрану помещают эпителиальной стороной на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы, расправляют, прижимают выпуклой поверхностью второй мягкой контактной линзы и помещают мембрану, расположенную между линзами, в контейнер с консервирующим раствором или с силикагелем для последующего хранения. Нанесение надреза проводят с помощью микрометрического алмазного ножа, на шкале которого устанавливают преимущественно величину на 20 мкм меньше нулевой отметки. Способ обеспечивает формирование ультратонкого симметричного круглого трансплантата боуменовой мембраны равномерной толщины, не включающего в свой состав стромальную ткань. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Гербицидная композиция содержит синергетически гербицидно эффективное количество (а) фенокссулама или его сельскохозяйственно приемлемой соли и (b) пентоксамида или его сельскохозяйственно приемлемой соли. Изобретение позволяет повысить эффективность борьбы с нежелательной растительностью. 2 н. и 15 з.п. ф-лы. 1 табл.

Изобретение относится к области криобиологии и медицине, а именно, к технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток крови человека. Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови предусматривает смешивание криопротектора ДМСО с 6 декстраном в условиях гипотермии +4°С до получения 10 концентрации, добавление к концентрату ЯКК в равных объемах, фасовку в пластиковую тару и помещение в программный замораживатель. Далее образец охлаждают на первом этапе от стартовой температуры +22°С со скоростью 1,2-2,0°Смин до точки эвтектики -4,1°С, выполняют холодовую остановку в течение 5 мин, на втором этапе образец охлаждают со скоростью 10°С в 1 минуту от -4,1°С до температуры -80°С, после чего переносят в биохранилище, сохраняют в замороженном виде до 2 лет. Оттаивают образец в водяной ванне при +37°÷+39°С при интенсивном покачивании в течение 35-50 с и незамедлительно используют по целевому назначению. Предлагаемый способ криоконсервирования позволяет максимально сохранить жизнеспособность криоконсервированных ядросодержащих клеток крови человека и может успешно применяться в программах комплексной терапии многих тяжелых заболеваний, включая онкогематологические. 1 пр.

Наверх