Промежуточные соединения и способы синтеза производных калихеамицина

Изобретение относится к промежуточным соединениям формулы I

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью; каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²; каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью; r означает 0; G представляет собой кислород; Z¹ представляет собой С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью; Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен; W выбран из -О- и -S-; и Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью, а также к способам синтеза и очистки производных калихеамицина. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 пр.

 

Область изобретения

Изобретение относится к синтезу производных калихеамицина. Изобретение также относится к промежуточным соединениям и линкерным молекулам, используемых для получения производных калихеамицина и для конъюгирования калихеамицина с биомакромолекулой, такой как моноклональное антитело.

Предшествующий уровень техники

MYLOTARG® (гемтузумаб озогамицин) состоит из моноклонального антитела к CD33, которое связано с калихеамицином посредством гидролизуемого кислотой линкера. Этот коммерческий продукт поступил на рынок как первый антитело-химиотерапевтический агент направленного воздействия и был одобрен для лечения острого миелоидного лейкоза (AML) у пожилых пациентов. Инотузумаб озогамицин представляет собой антитело к CD22, связанное с калихеамицином, и в настоящее время проходит клинические испытания для лечения некоторых типов рака.

Семейство сильнодействующих антибактериальных и

противоопухолевых агентов, известное в совокупности как калихеамицины, или комплекс LL-E33288, раскрыто в патенте США №4970198. В патенте США №5053394 также раскрыты метил-трисульфидные антибактериальные и противоопухолевые агенты. Эти соединения, раскрытые в патенте США №4970198 и в патенте США №5053394, содержат метилтрисульфидную группу, которая может взаимодействовать с подходящими тиолами с образованием дисульфидов с одновременным введением функциональной группы, такой как гидразид или подобный нуклеофил. Примеры этой реакции с калихеамицинами приведены в патенте США №5053394. Патент США №577070 относится к способу получения направленно доставляемых форм дисульфидных соединений комплекса LL-E33288. Линкер, 4-(4-ацетил-фенокси)бутановую кислоту, подвергают реакции конденсации с диметилгидразидом N-ацетил-гамма-калихеамицина с образованием карбоновая кислота-гидразона, который дополнительно обрабатывают N-гидроксисукцинимидом с получением сложного OSu эфира (N-сукцинимидилокси), который готов для конъюгирования с выбранной биомакромолекулой.

В патенте США №8273862 раскрыт синтетический способ создания линкерных промежуточных молекул (именуемых здесь "трилинкер-активированные сложные эфиры" или "трифункциональные линкерные промежуточные соединения"). Эти линкерные промежуточные соединения могут быть конъюгированы с калихеамицинами для получения производных калихеамицинов, которые затем могут быть дополнительно конъюгированы с биомакромолекулами, такими как моноклональные антитела. На стадиях, приводящих к получению линкерного промежуточного соединения, в способе синтеза, описанном в патенте США №8273862, в качестве промежуточного соединения используется меркаптосоединение ("соединение 2'' в указанном патенте), например гидразид 3-метил-3-меркаптобутановой кислоты.

В WO 2008/147765 раскрыт способ синтеза меркаптосодержащих промежуточных соединений, таких как гидразид 3-метил-3-меркаптобутановой кислоты, которые полезны в получении линкерных промежуточных соединений и производных калихеамицина, как описано в предыдущем абзаце. WO 2008/147765 альтернативно относится к гидразиду 3-метил-3-меркаптобутановой кислоты в качестве "DMH линкера". В WO 2008/147765 отмечено, что гидразид 3-метил-3-меркаптобутановой кислоты является предпочтительным меркаптосодержащим N-ацилгидразином в целях связывания калихеамицина с моноклональными антителами с получением, к примеру, гемтузумаба озогамицина или инотузумаба озогамицина.

В WO 2008/147765 гидразид 3-метил-3-меркаптобутановой кислоты получают путем удаления бензильной защитной группы с соединения гидразид пара-метоксибензилтиоэфира в кислотных условиях. Для того чтобы получить гидразид пара-метоксибензилтиоэфира, согласно WO 2008/137765 сначала подвергают взаимодействию пара-метоксибензилтиоэфирную кислоту с оксалилхлоридом в метиленхлориде с образованием хлорангидрида пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты. Хлорангидрид пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты затем добавляют в смесь безводного гидразина и метиленхлорида с получением гидразид пара-метоксибензилтиоэфира. Однако, как описано в WO 2008/147765, два реагента, пара-метилоксибензилтиоэфирная кислота и хлорангидрид пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты, сами вместе образуют нежелательный побочный продукт, гидразид бис-метоксибензилтиоэфира, что приводит к снижению выхода и качества. Кроме того, как описано в WO 2008/147765, вследствие реакционной и нестабильной природы молекулы хлорангидрида пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты необходимо использовать безводный гидразин и низкие температуры, например -70°С.

В другом аспекте получение производных калихеамицина включает в себя химическое связывание калихеамицина с линкерной молекулой. Для того чтобы конъюгировать калихеамицин с линкерным промежуточным соединением, в патенте США №8273862 проводят конечную реакцию между калихеамицином и "трилинкер-активированным сложным эфиром" (или "трифункциональным линкерным промежуточным соединением"). Структурно калихеамицины содержат трисульфидную группировку, как раскрыто выше, которую используют в их дериватизации, и химизм этой реакции между трисульфидной группировкой калихеамицина и трилинкер-активированным сложным эфиром важен для достижения хороших выходов и чистоты. Ранее используемые реакции обмена серы для производных калихеамицина давали сложные реакционные смеси, многочисленные побочные продукты и низкие выходы.

Наконец, производное калихеамицина должно быть очищено после его образования. Способ, описанный в патенте США №8273862, включает в себя очистку производного калихеамицина, включающую стадию нормально-фазной хроматографии. На стадии нормально-фазной хроматографии в процессе очистки, описанном в патенте США №8273862, используют метиленхлорид в качестве растворителя, и, как сказано выше, считается, что воздействие метил енхлорида свыше различных минимальных уровней наносит потенциальный вред здоровью. Поэтому при использовании нормально-фазной хроматографии с использованием метиленхлорида должны быть предприняты меры по ограничению воздействия метиленхлорида.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены новые промежуточные соединения и способы синтеза и очистки линкерных промежуточных соединений, которые полезны для конъюгирования калихеамициновых противоопухолевых антибиотиков с биомакромолекулами, такими как моноклональные антитела. Согласно настоящему изобретению также предложены новые способы синтеза производного калихеамицина, которое содержит калихеамицин, ковалентно связанный с линкером. Производное калихеамицина, полученное таким способом, может быть конъюгировано с биомакромолекулой, такой как моноклональное антитело, с получением конъюгата антитело-лекарственное средство. Промежуточные соединения и способы синтеза по настоящему изобретению могут быть использованы, например, для получения производного калихеамицина для изготовления гемтузумаба озогамицина (MYLOTARG®) или инотузумаба озогамицина.

Согласно заявленному изобретению предложены усовершенствования способов синтеза и очистки производных калихеамицина предшествующего уровня техники, которые решают проблемы, ассоциированные с этими предшествующими способами.

Как указано выше, согласно WO 2008/137765 сначала промежуточное соединение пара-метоксибензилтиоэфирную кислоту подвергают взаимодействию с оксалилхлоридом в метиленхлориде с образованием промежуточного хлорангидрида пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты, используемого для синтеза производного калихеамицина. В WO 2008/137765 промежуточный хлорангидрид пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты затем добавляют в смесь безводного гидразина и метиленхлорида для получения промежуточного гидразида пара-метоксибензилтиоэфира. Однако, как описано в WO 2008/147765, эти два реагента, пара-метилоксибензилтиоэфирная кислота и хлорангидрид пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты сами вместе образуют нежелательный побочный продукт, гидразид бис-метоксибензилтиоэфира, что приводит к снижению выхода и качества. Настоящее изобретение всецело решает эту проблему образования побочного продукта гидразида бис-метоксибензилтиоэфира за счет устранения полностью использования хлорангидрида пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты в качестве промежуточного соединения. За счет устранения полностью использования хлорангидридного промежуточного хлорангидрида пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты заявленное изобретение теперь дает возможность также использовать гидратированные формы гидразина, которые не требуют таких же специальных процедур обработки, каких требует безводный гидразин, и новый способ также исключает обременительное требование низкой температуры. Наконец, поскольку хлорангидрид пара-метоксибензилтиоэфирной кислоты обойден в настоящем изобретении, меры предосторожности в отношении метиленхлорида и безопасности, используемые в связи с этим, нет необходимости использовать.

Настоящее изобретение также повышает выход реакции между калихеамицином и линкерным промежуточным соединением по сравнению со способами предшествующего уровня техники, такими как способ, описанный в патенте США №8273862. Настоящее изобретение повышает выход получаемого производного калихеамицина за счет включения в реакцию карбодиимида.

Было также установлено, как описано в данном документе, что может быть осуществлен новый способ очистки производных калихеамицина, включающий использование обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), несмотря на присутствие двух водолабильных групп (гидразона и эфира N-гидроксисукцинимида) на производном калихеамицина. Данное изобретение решает упомянутые выше проблемы, связанные с очисткой производных калихеамицина с использованием нормально-фазной хроматографии, например с использованием метиленхлорида, как описано в патенте США №8273862.

Согласно настоящему изобретению предложены соединения формулы I

,

где R¹² выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбран из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число 0 или 1;

G представляет собой кислород или серу;

Z¹ представляет собой Н или С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из C₁-C₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₅)алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4 и 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил; и

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₂-С₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью.

Соединения формулы I полезны в качестве промежуточных соединений для синтеза линкерных промежуточных соединений и производных калихеамицина, содержащих такие линкерные промежуточные соединения, и эти производные калихеамицина, в свою очередь, могут быть конъюгированы с биомакромолекулами, такими как моноклональные антитела.

В одном воплощении изобретения каждый R¹⁰ в соединении формулы I представляет собой водород. В еще одном воплощении каждый R¹⁰ в соединении формулы I представляет собой водород, и R¹² представляет собой метил.

В другом воплощении изобретения соединение формулы I представляет собой соединение, имеющее структуру

.

В другом воплощении изобретения R⁸ и R⁹ в соединении формулы I оба представляют собой метил, r означает О, G представляет собой кислород, Z¹ представляет собой метил, Ar представляет собой 1,4-фенилен, W представляет собой -О-, и Y представляет собой -(СН₂)₃-.

В другом воплощении изобретения R⁸ и R⁹ в соединении формулы I оба представляют собой метил.

В другом воплощении изобретения r в соединении формулы I означает 0. В другом воплощении изобретения, r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой кислород. В другом воплощении изобретения r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой серу.

Согласно настоящему изобретению предложен также способ синтеза вышеупомянутых соединений формулы I, которые, как указано, полезны в качестве промежуточных соединений для синтеза линкерных промежуточных соединений и производных калихеамицина, содержащих указанные группы линкерных промежуточных соединений. В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ синтеза соединения формулы I

,

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбран из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число 0 или 1;

G представляет собой кислород или серу;

Z¹ представляет собой Н или С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из C₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₆алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(C₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4 и 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(C₁-С₄)алкил; и Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₂-С₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью; включающий взаимодействие соединения формулы II

,

где R¹⁰, R¹², R⁸, R⁹, r и G такие, как определено выше, с соединением формулы III

,

где Z¹, Ar, W и Y такие, как определено выше. В одном воплощении способа синтеза соединения формулы I r означает 0, G представляет собой кислород, Z¹ представляет собой метил, Ar представляет собой 1,4-фенилен, W представляет собой -О-, и Y представляет собой -(СН₂)₃-. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы I R⁸ и R⁹ представляют собой метил. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы I каждый R¹⁰ представляет собой водород. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы I каждый R¹⁰ представляет собой водород, и R¹² представляет собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы I R⁸ и R⁹ в соединении формулы II оба представляют собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы I r в соединении формулы II означает 0. В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы I r в соединении формулы II означает 0, и G представляет собой кислород. В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы I r в соединении формулы II означает 0, и G представляет собой серу.

Согласно настоящему изобретению предложен также способ синтеза соединения формулы II

,

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбраны из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число, выбранное из 0 и 1; и

G представляет собой кислород или серу; включающий обработку соединения формулы VII

,

где R¹⁶ представляет собой -С(=O)ОН или -C(=V)SH, где V представляет собой кислород или серу, или R¹⁶ представляет собой -NH2;

азольным активирующим агентом формулы IX

,

где V' представляет собой кислород или серу; и

где Е представляет собой

; ; ;

; . или ;

где m означает целое число 0,1,2 или 3; q означает целое число 0, 1 или 2; и p означает целое число 0, 1, 2, 3 или 4; и где каждый R¹⁷, присоединенный к Е, независимо выбран из (С₁-С₆)алкильных групп с прямой и разветвленной цепью;

в органическом растворителе с образованием соединения формулы VIII

,

где когда R¹⁶ представляет собой -С(=O)ОН, тогда r означает 0, и G представляет собой кислород; когда R¹⁶ представляет собой -C(=V)SH, тогда r означает 0, и G представляет собой V; и когда R¹⁶ представляет собой -NH₂, тогда r означает 1, и G представляет собой V';

с последующим объединением соединения формулы VIII с гидразином с получением в результате соединения формулы II. Соединения формулы II полезны в качестве промежуточных соединений для синтеза линкерных промежуточных соединений и производных калихеамицина, содержащих указанные группы линкерных промежуточных соединений, и эти производные калихеамицина, в свою очередь, могут быть конъюгированы с биомакромолекулой, такой как моноклональное антитело.

Азольный активирующий агент представляет собой любое азол-содержащее соединение данной формулы IX, которое при взаимодействии с соединением формулы VII обеспечивает образование соединения формулы VIII, где Е такой, как описано выше. Примеры азольных активирующих агентов, которые могут быть использованы в заявленном изобретении, включают карбонилдиимидазол, тиокарбонилдиимидазол, карбонил-бис-пиразол, где каждый пиразол возможно замещен одной-тремя (С₁-С₆)алкильными группами, карбонил-бис-1,2,3-триазол, карбонил-бис-бензотриазол и карбонил-бис-1,2,4-триазол. Предпочтительно, азольный активирующий агент представляет собой карбонилдиимидазол.

Соединение формулы VIII возможно выделяют перед объединением с гидразином. В одном воплощении соединение формулы VIII не выделяют перед объединением с гидразином. В еще одном воплощении соединение формулы VIII выделяют перед объединением с гидразином.

Предпочтительно, R¹⁶ представляет собой -С(=O)ОН, и азольный активирующий агент представляет собой карбонилдиимидазол.

В одном воплощении настоящего способа получения соединения формулы II r означает 0, и G представляет собой кислород в соединении формулы II. В еще одном воплощении настоящего способа получения соединения формулы II r означает 0, и G представляет собой кислород в соединении формулы II, и R¹⁶ в соединении формулы VII представляет собой -С(=O)ОН. В дополнительном воплощении способа получения соединения формулы II r означает 0, и G представляет собой кислород в соединении формулы II, R¹⁶ в соединении формулы VII представляет собой -С(=O)ОН, и азольный активирующий агент представляет собой карбонилдиимидазол.

В еще одном воплощении настоящего способа получения соединения формулы II соединение формулы VIII имеет структуру:

.

В дополнительном воплощении способа получения соединения формулы II соединение формулы VIII имеет структуру:

,

и азольный активирующий агент представляет собой карбонилдиимидазол.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы II R⁸ и R⁹ в соединении формулы VII оба представляют собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы II соединение формулы VII содержит R¹⁶, представляющий собой -C(=V)SH, и V, представляющий собой кислород или серу. Следует иметь в виду, что когда соединение формулы VII содержит R¹⁶, представляющий собой -C(=V)SH, и V, представляющий собой кислород, тогда такое соединение формулы VII может существовать в таутомерной форме, которая представляет собой то же самое соединение формулы VII, но где R¹⁶ представляет собой -(C=S)OH. Когда соединение формулы VII содержит R¹⁶, представляющий собой -C(=O)SH, и его таутомер, где R¹⁶ представляет собой -C(=S)OH, тогда полученный продукт соединение формулы II содержит G, представляющий собой кислород.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы II соединение формулы VII содержит R¹⁶, представляющий собой -NH₂. Когда соединение формулы VII в способе синтеза соединения формулы II содержит R¹⁶, представляющий собой -NH₂, тогда r в соединении формулы II, полученном этим способом, означает 1. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы II способ включает использование соединения формулы VII, где R¹⁶ представляет собой -NH₂, и соединения формулы IX, где V представляет собой кислород, и соединение формулы II, полученное указанным способом, содержит r, означающий 1, и G, представляющий собой V (т.е. кислород). В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы II способ включает использование соединения формулы VII, где R¹⁶ представляет собой -NH₂, и соединения формулы IX, где V' представляет собой серу, и соединение формулы II, полученное указанным способом, содержит r, означающий 1, и G, представляющий собой V' (т.е. серу).

В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы II способ включает использованием азольного активирующего агента формулы IX, где V' представляет собой кислород. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы II способ включает использование азольного активирующего агента формулы IX, где V' представляет собой серу.

В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы II гидразин представляет собой безводный гидразин. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы II гидразин представляет собой моногидрат гидразина. В еще одном воплощении гидразин представляет собой водный раствор гидразина. В еще одном воплощении гидразин представляет собой тетрагидрофурановый раствор гидразина.

Как раскрыто выше, соединения формулы I полезны в качестве промежуточных соединений для синтеза линкерных промежуточных соединений и производных калихеамицина, содержащих указанные группы линкерных промежуточных соединений. Соответственно, согласно заявленному изобретению предложен способ синтеза соединений формулы IV, которые также полезны в качестве промежуточных соединений для синтеза линкерных промежуточных соединений и производных калихеамицина, содержащих указанные группы линкерных промежуточных соединений. В одном воплощении заявленного изобретения предложен способ синтеза соединения формулы IV

,

где каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбран из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число, выбранное из 0 и 1;

G представляет собой кислород или серу;

Z¹ представляет собой Н или С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₅)алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4 и 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил; и Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₂-С₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью, включающий обработку соединения формулы I

,

где R¹² выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

и R⁸, R⁹, r, G, Z¹, Ar, W и Y такие, как определено; с сильной кислотой с образованием смеси, содержащей соединение формулы IV. Сильная кислота, используемая в способе синтеза соединения формулы IV, может быть определена специалистом в данной области техники, так как она является любой кислотой, которая будет удалять замещенный фенил-метиленовую группу с атома серы с получением в результате соединения формулы IV. В одном воплощении сильная кислота, используемая в способе по изобретению для синтеза соединения формулы IV, выбрана из трифторуксусной кислоты, серной кислоты, трифторметансульфоновой кислоты, HCl, HBr, HI. В одном воплощении способа синтеза соединения формулы IV R⁸ и R⁹ представляют собой метил, r означает 0, G представляет собой кислород, Z¹ представляет собой метил, Аr представляет собой 1,4-фенилен, W представляет собой -О-, и Y представляет собой -(СН₂)₃-. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы IV каждый R¹⁰ представляет собой водород. В еще одном воплощении способа синтеза соединения формулы IV каждый R¹⁰ представляет собой водород, и R¹² представляет собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы IV R⁸ и R⁹ в соединении формулы I оба представляют собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы IV r в соединении формулы I означает 0. В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы IV r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой кислород. В другом воплощении изобретения для синтеза соединения формулы IV r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой серу.

Согласно изобретению предложен также способ синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V с использованием промежуточных соединений формулы I и промежуточных соединений формулы IV. В одном воплощении изобретения предложен способ синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V

,

где каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбран из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число, выбранное из 0 и 1;

G представляет собой кислород или серу;

Z¹ представляет собой Н или С₁-C₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из C₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из C₁-C₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₅)алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(C₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4 и 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₂-С₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z выбран из группы, состоящей из

, , , ,

и ;

включающий

а) обработку соединения формулы I

,

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, и каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²,

сильной кислотой с образованием смеси, содержащей соединение формулы IV

; и

б) взаимодействие соединения формулы IV с соединением ZH;

тем самым синтезируя линкерное промежуточное соединение формулы V. В одном воплощении способа синтеза линкерных промежуточных соединений формулы V сильная кислота представляет собой трифторуксусную кислоту или серную кислоту.

В другом воплощении изобретения для синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V R⁸ и R⁹ в соединении формулы I оба представляют собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V r в соединении формулы I означает 0. В другом воплощении изобретения для синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой кислород. В другом воплощении изобретения для синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой серу.

В еще одном воплощении способа синтеза линкерных промежуточных соединений формулы V ZH представляет собой

.

В еще одном воплощении способа синтеза линкерных промежуточных соединений формулы V линкерное промежуточное соединение представляет собой соединение, имеющее структуру

.

В еще одном воплощении способа синтеза линкерных промежуточных соединений формулы V соединение формулы I, используемое в способе, получают путем взаимодействия соединения формулы II

;

с соединением формулы III

.

Как раскрыто, линкерные промежуточные соединения полезны для получения производных калихеамицина, содержащих указанные группы линкерных промежуточных соединений. Производные калихеамицина, в свою очередь, могут быть крнъюгированы с биомакромолекулами, такими как моноклональные антитела. Соответственно, соединения формулы I и способы синтеза, описанные в данном документе, полезны для получения таких производных калихеамицина. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ синтеза производного калихеамицина формулы VI

,

где J представляет собой

;

R₁ представляет собой или СН₃;

R₂ представляет собой или Н;

R₃ представляет собой или Н;

R₄ представляет собой или Н;

R⁵ представляет собой -СН₃, -С₂Н₅ или -СН(СН₃)₂;

X представляет собой атом йода или брома;

R^5' представляет собой водород или группу RCO, где R представляет собой водород, разветвленный или неразветвленный алкил из 1-10 атомов углерода, алкилен из 2-10 атомов углерода, арил из 6-11 атомов углерода, группу (С₆-С₁₁)арил-алкил(С₁-С₅), или гетероарил или группу гетероарил-алкил(С₁-С₅), где гетероарил определен как 2- или 3-фурил, 2- или 3-тиенил, 2-или 3-(N-метилпирролил), 2-, 3- или 4-пиридинил, 2-, 4- или 5-(N-метилимидазолил), 2-, 4- или 5-оксазолил, 2-, 3-, 5- или 6-пиримидинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-хинолил или 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-изохинолил, и все арильные и гетероарильные группы возможно замещены одной или более группами гидрокси, амино, карбокси, галогенами, нитро, (С₁-С₃)алкокси или тиоалкокси из 1-5 атомов углерода;

каждый из R₆ и R₇ независимо выбран из Н и

;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбран из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число 0 или 1;

G представляет собой кислород или серу;

Z¹ представляет собой Н или С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из C₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из C₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₅)алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, и 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₁-C₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z выбран из группы, состоящей из

, , , ,

и ;

включающий

а) обработку соединения формулы I

,

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью,

и каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

сильной кислотой с образованием смеси, содержащей соединение формулы IV

;

б) взаимодействие соединения формулы IV с соединением ZH с образованием линкерного промежуточного соединения формулы V

и

в) взаимодействие линкерного промежуточного соединения формулы V, полученного на стадии (б), с метилтрисульфидным соединением СН₃-S-S-S-J; тем самым синтезируя производное калихеамицина формулы VI. В одном воплощении способа синтеза производного калихеамицина формулы VI сильная кислота представляет собой серную кислоту или трифторуксусную кислоту. В еще одном воплощении способа синтеза производного калихеамицина формулы VI R⁸ и R⁹ представляют собой метил, r означает 0, G представляет собой кислород, Z¹ представляет собой метил, Ar представляет собой 1,4-фенилен, W представляет собой -О-, и Y представляет собой -(СН₂)₃-. В еще одном воплощении способа синтеза производного калихеамицина формулы VI каждый R¹⁰ представляет собой водород. В еще одном воплощении способа синтеза производного калихеамицина формулы VI каждый R¹⁰ представляет собой водород, и R¹² представляет собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза производного калихеамицина формулы VI R⁸ и R⁹ в соединении формулы I оба представляют собой метил.

В другом воплощении изобретения для синтеза производного калихеамицина формулы VI r в соединении формулы I означает 0. В другом воплощении изобретения для синтеза производного калихеамицина формулы VI r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой кислород. В другом воплощении изобретения для синтеза производного калихеамицина формулы VI r в соединении формулы I означает 0, и G представляет собой серу.

В еще одном воплощении способа синтеза производного калихеамицина формулы VI соединение формулы I получают путем взаимодействия соединения формулы II

;

с соединением формулы III

.

В еще одном воплощении способа синтеза производного калихеамицина формулы VI один из R₆ и R₇ представляет собой водород, а другой из R₆ и R₇ представляет собой

.

В одном воплощении промежуточных соединений формулы I и способов синтеза по настоящему изобретению Z¹ представляет собой метил. В еще одном воплощении промежуточных соединений и способов синтеза по настоящему изобретению r означает 0, и G представляет собой кислород. В еще одном воплощении промежуточных соединений и способов синтеза по настоящему изобретению Z¹ представляет собой метил, r означает 0, и G представляет собой кислород.

В еще одном воплощении способов синтеза по настоящему изобретению J представляет собой озогамициновую группировку.

В еще одном воплощении способов синтеза по настоящему изобретению производное калихеамицина формулы VI имеет структуру

.

Производные калихеамицина формулы VI, синтезированные способами по настоящему изобретению, могут быть конъюгированы с биомакромолекулой, например с моноклональным антителом. Производные калихеамицина формулы VI, синтезированные способами по настоящему изобретению, могут быть конъюгированы, например, с моноклональным антителом к CD22 инотузумабом (антитело, специфически связывающееся с антигеном CD22, экспрессированным на поверхности некоторых раковых клеток) или с антителом к CD33 гемтузумабом (антитело, специфически направленно воздействующее на анти-CD33 антиген, экспрессированный на поверхности некоторых раковых клеток). Производные калихеамицина формулы VI, синтезированные способами по настоящему изобретению, когда они конъюгированы с моноклональным антителом, в одном воплощении имеют структуру:

,

где Ab представляет собой моноклональное антитело. Примеры моноклонального антитела Ab включают, без ограничения, гемтузумаб и инотузумаб.

Термины, использованные в этом описании изобретения, обычно имеют их общепринятые в данной области техники значения, в контексте изобретения и в специфическом контексте, где использован каждый термин.

Термин "производное калихеамицина", используемый в данном документе, если не указано иное, относится к производному соединения формулы СН₃-S-S-S-J, где J такой, как определено в данном документе, которое содержит калихеамициновую группировку -S-S-J, связанную с группой линкерного промежуточного соединения:

,

где R⁸, R⁹, r, G, Z¹, Ar, W, Y и Z такие, как определено в данном документе. Производное калихеамицина может быть дополнительно конъюгировано (т.е. ковалентно связано) по концу, содержащему группировку -C(=O)Z, с биомакромолекулой, такой как моноклональное антитело. Примеры соединений формулы CH₃-S-S-S-J приведены, например, в патенте США №4970198 и в патенте США №5053394, которые оба во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки. Примером соединения СН₃-S-S-S-J является калихеамицин озогамицин.

Термин "линкерное промежуточное соединение", используемый в данном документе, если не указано иное, относится к тем выделенным молекулам формулы V, описанным в данном документе, которые способны ковалентно связываться по одному их концу с молекулой формулы СН₃-S-S-S-J, и которые имеют функциональную группу на другом конце (конец -C(=O)Z), с которым может быть ковалентно связана биомакромолекула, такая как моноклональное антитело. Выделенные линкерные промежуточные соединения полезны в качестве компонентов для получения производных калихеамицина и калихеамицина, связанного с биомакромолекулой, такой как моноклональное антитело.

Если не указано иное, термин "алкил", один или как часть другого термина, относится к прямоцепочечному или разветвленному, насыщенному или ненасыщенному углеводороду, имеющему указанное количество атомов углерода (например, "С₁-С₈алкил" относится к алкильной группе, имеющей от 1 до 8 атомов углерода). Когда количество атомов углерода не указано, тогда алкильная группа имеет от 1 до 8 атомов углерода (если она является ненасыщенной, в этом случае алкильная группа будет иметь от 2 до 8 атомов углерода). Репрезентативные C₁-С₈алкилы с прямой цепью включают, без ограничения, метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и н-октил, а разветвленные С₁-С₈алкилы включают, без ограничения, -изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил, -изопентил и -2-метилбутил; ненасыщенные С₂-С₈алкилы включают, без ограничения, винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентенил и 3-метил-1-бутинил.

Если не указано иное, "алкилен", один или как часть другого термина, относится к насыщенному разветвленному или прямоцепочечному или циклическому углеводородному радикалу с указанным количеством атомов углерода, имеющему центры одновалентного радикала, получаемого в результате удаления двух атомов водорода с одного и того же или двух разных атомов углерода родительского алкана. В одном воплощении "алкилен" относится к насыщенному разветвленному или прямоцепочечному алкиленовому радикалу с указанным количеством атомов углерода, имеющему два центра одновалентного радикала. Типичные алкиленовые радикалы включают, без ограничения: метилен (-СН₂-), 1,2-этилен -СН₂СН₂-), 1,3-пропилен (-СН₂СН₂СН₂-), 1,4-бутилен (-СН₂СН₂СН₂СН₂-) и тому подобное. Термин "алкенилен" относится к разветвленному, или прямоцепочечному, или циклическому углеводородному радикалу с указанным количеством атомов углерода, но имеющему по меньшей мере два атома углерода, связанных двойной связью, где этот радикал имеет два центра одновалентного радикала, получаемого в результате удаления двух атомов водорода с двух разных атомов углерода родительского алкана. В одном воплощении "алкилен" относится к разветвленному или прямоцепочечному радикалу с указанным количеством атомов углерода, но имеющему по меньшей мере два атома углерода, связанных двойной связью, где этот радикал имеет два центра одновалентного радикала. Примеры алкениленовых радикалов включают, без ограничения, -СН=СН-, -СН₂СН=СН- и -СН(СН₃)СН=СН.

Если не указано иное, "арил", один или как часть другого термина, означает карбоциклический ароматический углеводородный радикал из 6-20, предпочтительно 6-14 атомов углерода, получаемый в результате удаления одного атома водорода с каждого одного или более атомов углерода родительской ароматической кольцевой системы. Типичные арильные группы включают, без ограничения, радикалы, получаемые из бензола, нафталина, антрацена, бифенила и тому подобного. Если указано, то арильная группа может быть возможно замещенной. Термин "арилен" относится к двухвалентному радикалу, получаемому из арильной группы, как определено в данном документе.

"Галоген" относится к атому фтора, хлора, брома или йода.

Согласно настоящему изобретению предложен также способ синтеза производного калихеамицина формулы VI

,

где J представляет собой

;

R₁ представляет собой или СН₃;

R₂ представляет собой или Н;

R₃ представляет собой или Н;

R₄ представляет собой или Н;

R⁵ представляет собой -СН₃, -С₂Н₅ или -СН(СН₃)₂;

X представляет собой атом йода или брома;

R^5' представляет собой водород или группу RCO, где R представляет собой водород, разветвленный или неразветвленный ал кил из 1-10 атомов углерода, алкилен из 2-10 атомов углерода, арил из 6-11 атомов углерода, группу (С₆-С₁₁)арил-алкил(С₁-С₅), или гетероарил или группу гетероарил-алкил(С₁-С₅), где гетероарил определен как 2- или 3-фурил, 2- или 3-тиенил, 2-или 3-(N-метилпирролил), 2-, 3- или 4-пиридинил, 2-, 4- или 5-(N-метилимидазолил), 2-, 4- или 5-оксазолил, 2-, 3-, 5- или 6-пиримидинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-хинолил или 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-изохинолил, и все арильные и гетероарильные группы возможно замещены одной или более группами гидрокси, амино, карбокси, галогенами, нитро, (С₁-С₃)алкокси или тиоалкокси из 1-5 атомов углерода;

каждый из R₆ и R₇ независимо выбран из Н и

;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из водорода и С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью, где каждый алкил, указанный для R⁸ и R⁹, независимо возможно замещен -NH₂, -NHR¹¹, -NR¹¹R¹³, -OR¹¹, -ОН или -SR¹¹, где каждый R¹¹ и каждый R¹³ независимо выбран из С₁-С₅алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число 0 или 1;

G представляет собой кислород или серу;

Z¹ представляет собой Н или C₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₅)алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(C₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, and 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(C₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₁-С₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z выбран из группы, состоящей из

, , , ,

и ;

включающий взаимодействие линкерного промежуточного соединения формулы V

с метилтрисульфидным соединением СН₃-S-S-S-J в присутствии карбодиимида, тем самым синтезируя производное калихеамицина формулы VI.

Согласно настоящему изобретению предложен также способ синтеза производного калихеамицина формулы X

,

где J представляет собой

;

R₁ представляет собой или СН₃;

R₂ представляет собой или Н;

R₃ представляет собой или Н;

R₄ представляет собой или Н;

R⁵ представляет собой -СН₃, -С₂Н₅ или -СН(СН₃)₂;

X представляет собой атом йода или брома;

R^5' представляет собой водород или группу RCO, где R представляет собой водород, разветвленный или неразветвленный алкил из 1-10 атомов углерода, алкилен из 2-10 атомов углерода, арил из 6-11 атомов углерода, группу (С₆-С₁₁)арил-алкил(С₁-С₅), или гетероарил или группу гетероарил-алкил(С₁-С₅), где гетероарил определен как 2- или 3-фурил, 2- или 3-тиенил, 2-или 3-(N-метилпирролил), 2-, 3- или 4-пиридинил, 2-, 4- или 5-(N-метилимидазолил), 2-, 4- или 5-оксазолил, 2-, 3-, 5- или 6-пиримидинил, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-хинолил, или 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- или 8-изохинолил, и все арильные и гетероарильные группы возможно замещены одной или более группами гидрокси, амино, карбокси, галогенами, нитро, (С₁-С₃)алкокси или тиоалкокси из 1-5 атомов углерода;

каждый из R₆ и R₇ независимо выбран из Н и

;

Y' представляет собой (С₁-С₁₈)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью, (С₂-С₁₈)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью, ариленовую группу или гетероариленовую группу, арилен(С₁-С₁₈)алкиленовую группу, арилен(С₂-С₁₈)алкениленовую группу, гетероарилен(С₁-С₁₈)алкиленовую группу или гетероарилен(С₁-С₁₈)алкениленовую группу, где указанная гетероариленовая группа представляет собой двухвалентный радикал, получаемый из фурила, тиенила, N-метилпирролила, пиридинила, N-метилимидазолила, оксазолила, пиримидинила, хинолила, изохинолила, N-метилкарбазоила, аминокумаринила или феназинила, и где указанный Y' возможно может быть замещен диалкиламино из 1-5 атомов углерода, алкокси из 1-5 атомов углерода, гидрокси, -SH или алкилтио из 1-5 атомов углерода;

Q выбран из -C(=O)NHN=, -C(=S)NHN=, -NHC(=O)NHN=, -NHC(=S)NHN=, и -O-N=;

Z¹ представляет собой H или С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴, или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- или 2,7-нафтилиден, возможно замещенный одной, двумя, тремя или четырьмя группами, независимо выбранными из С₁-С₆алкила с прямой или разветвленной цепью, -OR¹⁴, -SR¹⁴, галогена, нитро, -COOR¹⁴, -C(=O)NHR¹⁴, -O(CH₂)_nCOOR¹⁴, -S(CH₂)_nCOOR¹⁴, -O(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴ и -S(CH₂)_nC(=O)NHR¹⁴;

где каждый R¹⁴ независимо выбран из (С₁-С₅)алкила, и каждый R¹⁴ независимо возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(C₁-С₄)алкил;

каждый n означает целое число, независимо выбранное из 0, 1, 2, 3, 4 и 5;

W выбран из -О-, -S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)- и -NR¹⁵-, где R¹⁵ представляет собой (С₁-С₅)алкил, и R¹⁵ возможно замещен одной или двумя группами, выбранными из -ОН, -(С₁-С₄)алкила и группы -S(С₁-С₄)алкил;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью или (С₂-С₆)алкениленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z выбран из группы, состоящей из

, , , ,

и ;

включающий взаимодействие линкерного промежуточного соединения формулы XI

с метилтрисульфидным соединением СН₃-S-S-S-J в присутствии карбодиимида, тем самым синтезируя производное калихеамицина формулы X.

В одном воплощении этого способа синтеза производного калихеамицина формулы VI или формулы X в присутствии карбодиимида один из R₆ и R₇ представляет собой водород, а другой из R₆ и R₇ представляет собой

.

В еще одном воплощении способа по настоящему изобретению для синтеза производного калихеамицина формулы VI или формулы X метилтрисульфид имеет начальную концентрацию в указанной реакции с линкерным промежуточным соединением формулы V (или формулы XI в случае необходимости) более примерно 3 г/л реакционной смеси. В еще одном воплощении метилтрисульфидное соединение имеет начальную концентрацию в указанной реакции с линкерным промежуточным соединением формулы V (или формулы XI в случае необходимости) от примерно 10 г/л до 110 г/л реакционной смеси.

В еще одном воплощении этого способа синтеза производного калихеамицина формулы VI или формулы X карбодиимид представляет собой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. Карбодиимид в этом способе по изобретению для синтеза производного калихеамицина формулы VI или формулы X может представлять собой любую молекулу, содержащую карбодиимидную группировку, и такие молекулы известны в данной области техники. Примеры карбодиимидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, без ограничения, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N-циклогексил-N'-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, тозилат N-циклогексил-N'-[2-(4-метилморфолин-4-ий-4-ил)этил]карбодиимида, тозилат N-циклогексил-N'-[4-(диэтилметиламмонио)циклогексил]карбодиимида, N,N'-бис(2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил)метил]карбодиимид и N-бензил-N'-изопропилкарбодиимид. Другие карбодиимиды, подходящие для использования в способах по настоящему изобретению, могут быть установлены специалистами в данной области техники.

Согласно настоящему изобретению предложен также способ очистки производного калихеамицина формулы VI или производного калихеамицина формулы X, где формула VI и формула X такие, как определено в данном документе выше, включающий подвергание производного калихеамицина формулы VI или производного калихеамицина формулы X процедуре очистки обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ-ВЭЖХ). Неожиданным является то, что процедура обращено-фазной очистки может быть использована для очистки молекул производного калихеамицина формулы VI или формулы X с учетом того, что эти соединения имеют две водолабильные группы, а именно гидразоновую группу и N-гидрокси-сукцинимид (NHS)эфирную группу, каждая из которых имеет зависимость от разного рН для ее гидролиза. Кроме того, использование обращенно-фазной очистки имеет преимущество относительно очистки нормально-фазной хроматографией, описанной в предшествующем уровне техники (смотри патент США №8273862), поскольку в нормально-фазной хроматографии используется токсический, вредный для окружающей среды растворитель, такой как метиленхлорид и метанол. Процедура обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) влечет за собой использование С-18 стационарной фазы, которая связывает компоненты реакционной смеси. Эти компоненты затем элюируют и разделяют с использованием градиента, состоящего из водной и органической подвижных фаз, в диапазоне рН от примерно 4 до примерно 6 для оптимальной стабильности двух присутствующих гидролизуемых групп. В одном воплощении градиент содержит по меньшей мере две фазы. В еще одном воплощении градиент содержит 1, 2, 3, 4 или 5 фаз. В еще одном воплощении градиент содержит 2 или 3 фазы. В еще одном воплощении градиент содержит 2 фазы. Каждая фаза может быть органической, водной или комбинированной. Градиент меняется во времени от водной составляющей фазы к увеличению органической составляющей фазы. В заявленном изобретении могут быть использованы водные фазы, известные в данной области техники. Примеры водных фаз, которые могут быть использованы в заявленном изобретении, включают, без ограничения, ацетат натрия (NaOAc), сукцинат натрия, N-метил-морфолин, цитрат натрия и 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту. В заявленном изобретении могут быть использованы органические фазы, известные в данной области техники. Примеры органических фаз, которые могут быть использованы в заявленном изобретении, включают, без ограничения, ацетонитрил, изопропанол, ацетон, диметоксиэтан и N-метил-2-пирролидон. Как указано, любая фаза может содержать смесь водной фазы и органической фазы, например смесь NaOAc и ацетонитрила. Например, подвижная фаза, состоящая из 55% 20 мМ ацетата натрия, рН 5, и 45% ацетонитрила, представляет собой водную/органическую подвижную фазу, которая может быть использована для очистки методом ОФ-ВЭЖХ по изобретению. В качестве дополнительного примера, примером градиента, полезного в заявленном изобретении, является градиент, содержащий первую подвижную фазу, состоящую из 55% 20 мМ ацетата натрия, рН 5, и 45% ацетонитрила, с последующей второй подвижной фазой, состоящей из ацетонитрила.

В одном воплощении способа очистки производного калихеамицина формулы VI или формулы X, включающего процедуру ОФ-ВЭЖХ, производное калихеамицина формулы VI или формулы X содержит Z, выбранный из:

, , , ,

и .

В еще одном воплощении способа очистки производного калихеамицина формулы VI или формулы X, включающего процедуру ОФ-ВЭЖХ, производное калихеамицина формулы VI или формулы X содержит Z, выбранный из:

и .

В еще одном воплощении способа очистки производного калихеамицина формулы VI или формулы X, включающего процедуру ОФ-ВЭЖХ, производное калихеамицина формулы VI или формулы X содержит Z, представляющий собой:

.

После обращенно-фазной очистки полученное очищенное производное калихеамицина может быть выделено, как описано в данной области, например путем концентрирования и расслоения, или очищенное производное калихеамицина может быть выделено с использованием процедуры твердофазной экстракции (ТФЭ). Процедура твердофазной экстракции была идентифицирована как эффективная замена расслоения дихлорметаном выделением продукта из фракций ОФ-ВЭЖХ. В процессе твердофазной экстракции продукт связывают с обращенно-фазной смолой путем нанесения в слабом растворителе, промывают для удаления буферных солей (оставшихся после ОФ-ВЭЖХ очистки) и затем элюируют органическими растворителями, такими как ацетонитрил, с получением концентрированного раствора продукта, не содержащего или по существу не содержащего солей.

Таким образом, дополнительные воплощения любого из способов по изобретению, описанных в данном документе для синтеза производного калихеамицина формулы VI или формулы X, включают также очистку синтезированного производного калихеамицина формулы VI или формулы X путем подвергания процедуре обращенно-фазной очистки. В дополнительных воплощениях изобретения производное калихеамицина формулы VI или формулы X, полученное в результате процедуры обращенно-фазной очистки впоследствии подвергают процедуре твердофазной экстракции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ по настоящему изобретению для синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V представлен на приведенных ниже реакционных Схемах I-IV. В химических формулах на Схемах I-IV R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹², Q, Ar, W, Y, Z¹ и Z такие, как определено в данном документе выше.

Схема I

В соответствии со Схемой I (4-алкоксифенил)метантиол 1, где R¹² такой, как определено в данном документе, подвергают взаимодействию с метилсенециоатом 2 с образованием промежуточного карбоновой кислоты 3. В промежуточное соединение 3 затем загружают подходящий органический растворитель, такой как тетрагидрофуран, и азольный активирующий агент формулы IX, как описано в данном документе, такой как карбонилдиимидазол (CDI). Получают промежуточное соединение 3.5. После этой реакции соединение 3.5 объединяют с гидразином. Источником гидразина может быть безводный гидразин, как описано в WO 2008/147765; однако предпочтительным источником гидразина является водный гидразин, такой как моногидрат гидразина. В результате этой реакции образуется промежуточное соединение 4. Соединение гидразид пара-метоксибензилтиоэфира, которое является промежуточным соединением 4,. где R¹² представляет собой метил, и каждый R¹⁰ представляет собой водород, описано в WO 2008/147765, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки.

Схема II

На Схеме II промежуточное соединение 4 подвергают взаимодействию с соединением 5,. где Z¹ такой, как описано в данном документе, например 4-(4-ацил-фенокси)бутановая кислота, в инертном (другими словами нереакционноспособном) растворителе, возможно с кислотным катализатором, с получением промежуточного соединения 6. Примеры инертных растворителей, которые могут быть использованы в этой реакции, включают, без ограничения, спирты (например, метанол), простые эфиры и сложные эфиры, такие как этилацетат. Специалист в данной области может определить подходящий инертный растворитель для этой реакции. Кислотные катализаторы также могут быть определены специалистом в данной области техники; примеры кислотных катализаторов включают, без ограничения, уксусную кислоту.

Схема III

На Схеме III с промежуточного соединения 6 удаляют защитную группу с образованием соединения 7. В этой реакции в соединение 6 загружают метоксибензол и сильную кислоту, возможно при нагревании, например трифторуксусную кислоту при нагревании, с получением промежуточного соединения 7. Вместо трифторуксусной кислоты можно использовать другую сильную кислоту, например серную кислоту.

Схема IV

На Схеме IV промежуточное соединение 7 превращают в соединение 8, которое является воплощением линкерного промежуточного соединения формулы V, описанного в данном документе. Промежуточное соединение 7 может быть превращено в линкерное промежуточное соединение, такое как соединение 8,. которое описано в данной области техники, например в патенте США №8273862, который во всей его полноте включен в данное описание посредством ссылки. Однако предпочтительно, как изображено на Схеме IV, промежуточное соединение 7 подвергают взаимодействию с третичным аминным основанием, таким как триэтиламин (TEA), и с триметилацетилхлоридом (PivCl) в присутствии инертного растворителя, такого как тетрагидрофуран. Затем вводят соединение формулы ZH, например N-гидроксисукцинимид, для обеспечения получения линкерного промежуточного соединения 8.

После синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V (например соединения 8) затем синтезируют производное калихеамицина формулы VI, используя линкерное промежуточное соединение, полученное в результате реакции, представленной на Схеме IV, и способами, известными в данной области техники, например как описано в патенте США №8273862. Например, линкерное промежуточное соединение формулы V сначала может быть подвергнуто реакции с карбонатом щелочного металла, включая, без ограничения, карбонат натрия, с образованием натриевой соли линкерного промежуточного соединения в ацетонитриле при нагревании в условиях умеренной дефлегмации. Дополнительно, в результате реакции натриевой соли линкерного промежуточного соединения с метилтрисульфидом СН₃-S-S-S-J при примерно -15°С в инертном органическом растворителе, предпочтительно ацетонитриле, получают производное калихеамицина формулы VI. Предпочтительной является реакция в ацетонитриле при примерно 0°С. Возможно, вместо карбоната щелочного металла может быть использовано органическое основание, которое предпочтительно представляет собой триэтиламин, в ацетонитриле при примерно 0°С.

Альтернативно, производное калихеамицина формулы VI может быть синтезировано из линкерного промежуточного соединения формулы V в результате реакции с молекулой формулы CH₃-S-S-S-J с использованием способа, описанного в данном документе, включающего использование карбодиимида.

Производное калихеамицина формулы VI затем может быть конъюгировано с биомакромолекулой, такой как моноклональное антитело, с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство, способами, описанными в данной области техники, например способами, описанными в патенте США №5053394 и в патенте США №5770701, которые оба во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки.

Приведенные ниже примеры представлены для иллюстрации некоторых воплощений настоящего изобретения, но их не следует толковать как ограничивающие объем данного изобретения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что могут быть использованы известные варианты конкретных условий, приведенных в примерах.

Пример 1

3-(4-метоксибензилтио)-3-метилбутановая кислота

85 г соединения 1 и 255 мл 2-метилтетрагидрофурана добавляли в реактор при 20-25°С. 125,05 г соединения 2 добавляли в этот реактор, и реактор дегазировали барботированием потока азота в перемешиваемый раствор в течение 15-20 мин. В реактор добавляли бромид тетрабутиламмония (1M в THF, 0,05 экв., 36,1 мл) и поддерживали температуру реакции 20-30°С в течение 2 часов.

Добавляли раствор дигидрата хлорида кальция (0,35 экв., 28,060 г) в 255 мл воды. После перемешивания в течение 20 минут нижнюю водную фазу удаляли. К верхней органической фазе добавляли 252 мл метанола и 3 экв. NaOH в 252 мл воды. Реакционную смесь перемешивали до полного расходования промежуточного сложного эфира (3).

Реакционную смесь охлаждали до 15°С и добавляли 2-метилтетрагидрофуран (252 мл), затем 252 мл воды. Медленно добавляли концентрированную HCl (3,1 экв., 184 мл), поддерживая температуру реакционной смеси в пределах 15-30°С. Нижнюю водную фазу удаляли. Органический слой промывали 1М HCl (252 мл) и добавляли гептаны (1940 мл). Раствор дистиллировали для удаления 2-метилтетрагидрофурана. Полученную суспензию перемешивали в течение часа, затем фильтровали и сушили. Маточную жидкость концентрировали с получением второй порции твердого вещества.

Суммарный выход указанной в заголовке кислоты 4 составил 162,59 г (88,5%). ¹Н ЯМР (CDCl₃): δ (м.д.) 1.5 (s, 6Н), 2.3 (s, 2Н), 3.6 (m, 5Н), 6.7 (d, 2Н), 7.6 (d, 2Н).

Пример 2

3-(4-метоксибензилтио)-3-метилбутангидразид

Кислоту 4 (81,67 г, 321 ммоль) добавляли к 375 мл THF (тетрагидрофуран). CDI (1,05 экв., 54,7 г) загружали тремя порциями, и реакционную смесь перемешивали при 20°С в течение 2,5 часов. В отдельном реакторе готовили раствор моногидрата гидразина (2,5 экв., 40,19 г) в 200 мл THF. Раствор промежуточного соединения 5 добавляли в раствор гидразингидрата, поддерживая внутреннюю температуру 20°С. После окончания добавления реакционную смесь перемешивали в течение 18 часов, затем концентрировали до 100 мл. Добавляли 850 мл EtOАс (этилацетат), и раствор промывали 3 раза 500 мл воды, затем 200 мл рассола. Органический слой сушили Na₂SO₄, фильтровали через диатомитовую землю и концентрировали на роторном испарителе до белой суспензии. Добавляли 300 мл гептана, и 200 мл удаляли на роторном испарителе. Добавляли еще 200 мл гептана и выпаривали до густой белой суспензии. Смесь фильтровали, промывали гептанами и сушили. Из соединения 4 было получено 83,15 г (96,5%) указанного в заголовке соединения 6. МС (масс-спектрометрия) 269 (М+1), 121, 120.

Пример 3

4-(4-(1-(2-(3-(4-метоксибензилтио)-3-метилбутаноил)гидразоно)-этил)фенокси)бутановая кислота

68 г соединения 6 и 57,43 г соединения 7 добавляли к 680 мл метанола (МеОН). Добавляли 68 мл уксусной кислоты (НОАс), и эту смесь нагревали при 45°С в течение 3 часов, охлаждали до 20°С и выдерживали в течение 16 часов. Суспензию фильтровали, промывали метанолом и сушили. Было получено 112,60 г указанного в заголовке соединения 8 в виде смеси Е- и Z-изомеров. ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): δ (м.д.) 1.5 (m, 6Н), 2.0 (m, 2Н), 2.2 (m, 3Н), 2.4 (m, 2Н), 2.7 (s, 1.1Н), 3.0 (s, 0.9Н), 3.7 (m, 3Н), 3.8 (m, 2Н), 4.0 (m, 2Н), 6.8 (m 2Н), 6.9 (m, 2Н), 7.3 (m, 2Н), 7.7 (m, 2Н), 10.2&10.3 (s, 1Н), 12.1 (s, 1Н). ЖХ/МС (жидкофазная хроматография/масс-спектрометрия) m/z 473 [М+Н]⁺.

Пример 4

4-(4-(1-(2-(3-меркапто-3-метилбутаноил)гидразоно)этил)-(ренокси)бутановая кислота

290,5 г (614,7 ммоль) соединения 8 и 1162 мл анизола загружали в реактор при 20-25°С. Добавляли трифторуксусную кислоту (1162 мл) в течение 2 минут, и эту реакционную смесь нагревали до 65-70°С в течение 2,5 часов. Реакционную смесь охлаждали до 40°С. TFA (трифторуксусную кислоту) отгоняли вакуумной дистилляцией и заменяли 2-метилтетрагидрофураном (2905 мл). Проводили дистилляцию до образования густой суспензии (конечный объем суспензии составлял приблизительно 2 л). Суспензию охлаждали до 15°С и фильтровали. Неочищенный продукт ресуспендировали в метаноле (1836,6 мл), нагревали до 55°С и затем охлаждали до 20°С в течение ночи. Суспензию фильтровали, промывали метанолом и сушили. Из соединения 8 было получено 171,80 г (93,54%) указанного в заголовке соединения 9 в виде смеси Е- и Z-изомеров. ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): δ (м.д.) 1.5 (m, 6Н), 2.0 (m, 2Н), 2.2 (m, 3Н), 2.4 (m, 2Н), 2.7 (s, 1.1Н), 3.0 (s, 0.9Н), 3.3 (s 1Н), 4.0 (m, 2Н), 6.9 (m, 2Н), 7.7 (m, 2Н), 10.2&10.3 (s, 1Н), 12.1 (s, 1Н).

Пример 5

2,5-диоксопирролидин-1-ил-4-(4-(1-(2-(3-меркапто-3-метилбутаноил)-гидразоно)этил)фенокси)бутаноат

Реактор: 2-литровый реактор с рубашкой, Tr датчик (температурный датчик), вход для подачи азота.

60 г (170,3 ммоль) добавляли к 2400 мл THF и охлаждали до 10°С. Медленно добавляли триэтиламин (2 экв., 34,46 г), затем триметилацетилхлорид (1,1 экв., 22,81 г) в течение 10 минут, поддерживая температуру в пределах 10-20°С Смесь перемешивали при 10-20°С в течение 30 минут. В реактор добавляли N-гидроксисукцинимид (1,1 экв., 21,99 г), и смесь перемешивали при 20-25°С в течение 30 минут.

Суспензию фильтровали для удаления TEA-HCI солей и концентрировали в вакууме до объема приблизительно 800 мл. Медленно добавляли гексан (780 мл) для кристаллизации продукта. Суспензию перемешивали в течение 1,5 часов, затем фильтровали, промывали гептанами и сушили. Из соединения 9 было получено 70,4 г (выход 92%) указанного в заголовке линкерного промежуточного соединения 10.

Неочищенный продукт подвергали перекристаллизации путем добавления 144 г соединения 10 к 2100 мл THF и нагревали до 60°С. Смесь фильтровали через диатомитовую землю и медленно добавляли 2100 мл гексана и охлаждали до 20°С в течение 1,5 часов. Суспензию фильтровали, промывали холодной смесью THF/гексан (1:1), затем гексаном и сушили. Из соединения 9 было получено 126 г (выход 87,5%) указанного в заголовке линкерного промежуточного соединения 10. ¹Н ЯМР (DMSO-d₆): δ (м.д.) 1.5 (m, 6Н), 2.1 (m, 2Н), 2.2 (m, 3Н), 2.7 (s, 1.1Н), 2.9 (М, 5Н) 3.0 (s, 1.9Н), 3.3 (s 1Н), 4.3 (m, 2Н), 7.0 (m, 2Н), 7.5 (m, 2Н), 10.2&10.3 (s, 1Н).

Пример 6

Получение бутановой кислоты, 3-[[(2Е)-2-[(1R,4Z,8S)-8-[[2-O-[4-(ацетилэтиламино)-2,4-дидеокси-3-O-метил-a-L-трео-пентопиранозил]-4,6-дидеокси-4-[[[2,6-дидеокси-4-S-[4-[(6-деокси-3-O-метил-а-L-маннопиранозил)окси]-3-йод-5,6-диметокси-2-метилбензоил]-4-тио-β-D-рибо-гексопиранозил]окси]амино]-β-D-глюкопиранозил]окси]-1-гидрокси-10-[(метоксикарбонил)амино]-11-оксобицикло[7.3.1]тридека-4,9-диен-2,6-диин-13-илиден]этил]дитио]-3-метил-, 2-[(1Е)-1-[4-[4-[(2,5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-4-оксобутокси]фенил]этилиден]гидразида

К раствору N-ацетил-калихеамицина (50 мг, 0,035 ммоль) в ацетонитриле (1,0 мл) при комнатной температуре добавляли линкерное промежуточное соединение бутановую кислоту, 3-меркапто-3-метил-,2-[(Е)-1-[4-[4-[(2,5-диоксо-1-пирролидинил)-окси]-4-оксобутокси]фенил]этилиден]гидразид (31,9 мг, 0,07 ммоль) одной порцией, после чего добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (6,7 мг, 0,035 ммоль) и затем триэтиламин (5,3 мг, 7,3 мкл, 0,053 ммоль). Эту реакционную смесь (суспензию) перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, и в этой точке она стала представлять собой желтый раствор. Выход определяли в виде процента площади относительно стандартного производного (выход 60%).

Масс-спектрометрия:

(M+Na)=1801,4578

¹Н ЯМР:

¹Н ЯМР (CDCl₃ + 5% CD₃OD, 400 МГц): 8.69 (s, 1Н, 18C-NH-N=), 7.75 (d, J=8.7 Гц, 2Н, 22), 6.95 (d, J=8.7 Гц, 2Н, 23), 6.38 (br t, J=7 Гц, 1H, 14), 6.23 (d, J=1.5 Гц, 1H, 8), 5.90 (d, J=9.5 Гц, 1H, 4), 5.80 (dd, J=9.5, 1.5 Гц, 1H, 5), 5.72 (d, J=1.5 Гц, 1H, 1D), 5.63 (br d, J=2.2 Гц, 1H, 1E), 5.03 (dd, J=11.5, 1.6 Гц, 1H, 1B), 4.70 (m, 1H, 5E), 4.61 (d, J=7.8 Гц, 1H, 1A), 4.6 (m, 1H, 3E), 4.49 (m, 1H, 2D), 4.31 (m, 1H, 3B), 4.20 (m, 1H, 5D), 4.10 (m, 2H, 25), 4.07 (m, 1H, 5B), 4.03 (m, 1H, 3А), 3.91 (m, 1H, 15), 3.89 (s, 3H, 2C-OCH₃), 3.84 (s, 3Н, 3С-ОСН₃), 3.8 (m, 1H, 3D), 3.76 (m, 1H, 15), 3.75 (m, 1H, 4B), 3.65 (m, 1H, 5A), 3.63 (bs, 3H, 10-NHCOOCH₃), 3.62 (m, 1H, 2A), 3.6 (m, 1H, 4D), 3.57 (s, 3H, 3D-OCH₃), 3.4 (m, 1H, 5E), 3.37 (s, 3Н, 3Е-ОСН₃), 3.30 (m, 2H, 4E-N-CH₂CH₃), 3.12 (d, J=17.6 Гц, 1H, 12), 3.0 (m, 1H, 4E), 2.85 (m, 2H, 27), 2.85 (bs, 4, 30), 2.72 (d, J=17.6 Гц, 1H, 12), 2.5 (m, 2H, 17), 2.4 (m, 1H, 2E экваториальный), 2.33 (m, 1H, 4A), 2.25 (m, 2H, 26), 2.18 (s, 3H, 19), 2.08 (s, 3H, 4E-N-COCH₃), 2.0 (m, 1H, 2B), 1.8 (m, 1H, 2B), 1.50 (s, 3H, 16a), 1.44 (s, 3H, 16b), 1.42 (d, J=6.2 Гц, 3Н, 6B), 1.4 (m, 1H, 2E аксиальный), 1.31 (d, J=6.1 Гц, 3Н, 6А), 1.31 (d, J=6.1 Гц, 3Н, 6D), 1.19 (t, J=7.2 Гц, 3Н, 4E-N-CH₂CH₃).

Пример 7

Получение бутановой кислоты, 3-[[(2Е)-2-[(1R,4Z,8S)-8-[[2-O-[4-(ацетилэтиламино)-2,4-дидеокси-3-O-метил-а-L-трео-пентопиранозил]-4,6-дидеокси-4-[[[2,6-дидеокси-4-S-[4-[(6-деокси-3-O-метил-а-L-маннопиранозил)окси]-3-йод-5,6-диметокси-2-метилбензоил]-4-тио-β-D-рибо-гексопиранозил]окси]амино]-β-D-глюкопиранозил]окси]-1-гидрокси-10-[(метоксикарбонил)амино]-11-оксобицикло[7.3.1]тридека-4.9-диен-2.6-диин-13-илиден]этил]дитио]-3-метил-, 2-[(1Е)-1-[4-[4-[(2.5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-4-оксобутокси]фенил]этилиден] гидразида. без использования ЕDС

Для сравнения со способом по настоящему изобретению, проиллюстрированном в Примере 6, была проведена следующая реакция: К раствору N-ацетил-калихеамицина (50 мг, 0,035 ммоль) в ацетонитриле (1,0 мл) при комнатной температуре добавляли линкерное промежуточное соединение бутановую кислоту, 3-меркапто-3-метил-, 2-[(Е)-1-[4-[4-[(2,5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-4-оксобутокси]фенил]-этилиден]-гидразид (31,9 мг, 0,07 ммоль) одной порцией, после чего добавляли триэтиламин (5,3 мг, 7,3 мкл, 0,053 ммоль). Эту реакционную смесь (суспензию) перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, и в этой точке она стала представлять собой желтый раствор. Выход определяли в виде процента площади относительно стандартного производного (выход 35%).

Масс-спектрометрия:

(M+Na)=1801,4578

¹Н ЯМР:

¹Н ЯМР (CDCl₃ + 5% CD₃OD, 400 МГц): 8.69 (s, 1Н, 18C-NH-N=), 7.75 (d, J=8.7 Гц, 2H, 22), 6.95 (d, J=8.7 Гц, 2H, 23), 6.38 (br t, J=7 Гц, 1H, 14), 6.23 (d, J=1.5 Гц, 1H, 8), 5.90 (d, J=9.5 Гц, 1H, 4), 5.80 (dd, J=9.5, 1.5 Гц, 1H, 5), 5.72 (d, J=1.5 Гц, 1H, 1D), 5.63 (br d, J=2.2 Гц, 1H, 1E), 5.03 (dd, J=11.5, 1.6 Гц, 1H, 1B), 4.70 (m, 1H, 5E), 4.61 (d, J=7.8 Гц, 1H, 1A), 4.6 (m, 1H, 3E), 4.49 (m, 1H, 2D), 4.31 (m, 1H, 3B), 4.20 (m, 1H, 5D), 4.10 (m, 2H, 25), 4.07 (m, 1H, 5B), 4.03 (m, 1H, 3А), 3.91 (m, 1H, 15), 3.89 (s, 3H, 2C-OCH₃), 3.84 (s, 3Н, 3С-ОСН₃), 3.8 (m, 1H, 3D), 3.76 (m, 1H, 15), 3.75 (m, 1H, 4B), 3.65 (m, 1H, 5A), 3.63 (bs, 3H, 10-NHCOOCH₃), 3.62 (m, 1H, 2A), 3.6 (m, 1H, 4D), 3.57 (s, 3H, 3D-OCH₃), 3.4 (m, 1H, 5E), 3.37 (s, 3Н, 3Е-ОСН₃), 3.30 (m, 2H, 4E-N-CH₂CH₃), 3.12 (d, J=17.6 Гц, 1H, 12), 3.0 (m, 1H, 4E), 2.85 (m, 2H, 27), 2.85 (bs, 4, 30), 2.72 (d, J=17.6 Гц, 1H, 12), 2.5 (m, 2H, 17), 2.4 (m, 1H, 2E экваториальный), 2.33 (m, 1H, 4A), 2.25 (m, 2H, 26), 2.18 (s, 3H, 19), 2.08 (s, 3H, 4E-N-COCH₃), 2.0 (m, 1H, 2B), 1.8 (m, 1H, 2B), 1.50 (s, 3H, 16a), 1.44 (s, 3H, 16b), 1.42 (d, J=6.2 Гц, 3Н, 6B), 1.4 (m, 1H, 2E аксиальный), 1.31 (d, J=6.1 Гц, 3Н, 6А), 1.31 (d, J=6.1 Гц, 3Н, 6D), 1.19 (t, J=7.2 Гц, 3Н, 4E-N-CH₂CH₃)

Пример 8

Получение в укрупненном масштабе бутановой кислоты, 3-[[(2Е)-2-[(1R,4Z,8S)-8-[[2-O-[4-(ацетилэтиламино)-2,4-дидеокси-3-O-метил-а-L-трео-пентопиранозил]-4,6-дидеокси-4-[[[2,6-дидеокси-4-S-[4-[(6-деокси-3-O-метил-а-L-маннопиранозил)окси]-3-йод-5,6-диметокси-2-метилбензоил]-4-тио-β-D-рибо-гексопиранозил]окси]амино]-β-D-глюкопиранозил]окси]-1-гидрокси-10-[(метоксикарбонил)амино]-11-оксобицикло[7.3.1]тридека-4,9-диен-2,6-диин-13-илиден]этил]дитио]-3-метил-, 2-[(1Е)-1-[4-[4-[(2.5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-4-оксобутокси]фенил]этилиден]гидразида, с последующей очисткой

К раствору N-ацетил-калихеамицина (60,2 г, 42,7 ммоль) в ацетонитриле (900 мл) при 4°С добавляли линкерное промежуточное соединение бутановую кислоту, 3-меркапто-3-метил-, 2-[(Е)-1-[4-[4-[(2,5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-4-оксобутокси]-фенил]этилиден]гидразид (38,4 г, 85,4 ммоль) одной порцией, после чего добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (8,2 г, 42,7 ммоль). Сосуды, содержащие линкер и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид, ополаскивали ацетонитрилом (300 мл), и смывы добавляли в реакционную смесь. Затем в реакционную смесь добавляли триэтиламин (6,5 г, 8,9 мл, 64,1 ммоль). Реакционную смесь (суспензию) перемешивали в течение 1 часа при 4°С, и в этой точке она стала представлять собой желтый раствор. Реакционную смесь дополнительно разбавляли ацетонитрилом (600 мл) и 20 мМ буферным раствором ацетата натрия, рН 5,0 (1200 мл), и очищали обращенно-фазной колоночной HPLC, используя градиент подвижных фаз А и В (подвижная фаза А: 55:45 (об./об.) 20 мМ буферный раствор NaOAc с рН 5,0 (рН 4,5-5,5) : ацетонитрил : подвижная фаза В : ацетонитрил). Фракции желаемой чистоты собирали и затем подвергали твердофазной экстракции (ТФЭ). При ТФЭ очищенные фракции наносили на колонку, затем промывали смесью вода/ацетонитрил и затем элюировали ацетонитрилом с получением концентрированных фракций, содержащих продукт. Полученные фракции концентрировали в вакууме, переносили в этилацетат и осаждали добавлением гексана. Твердое вещество отфильтровывали и сушили с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества с чистотой 96,9% по результатам HPLC (45,2 г, выход 60%).

Масс-спектрометрия:

(M+Na)=1801,4578

¹Н ЯМР:

¹Н ЯМР (CDCl₃ + 5% CD₃OD, 400 МГц): 8.69 (s, 1Н, 18C-NH-N=), 7.75 (d, J=8.7 Гц, 2Н, 22), 6.95 (d, J=8.7 Гц, 2Н, 23), 6.38 (br t, J=7 Гц, 1H, 14), 6.23 (d, J=1.5 Гц, 1H, 8), 5.90 (d, J=9.5 Гц, 1H, 4), 5.80 (dd, J=9.5, 1.5 Гц, 1H, 5), 5.72 (d, J=1.5 Гц, 1H, 1D), 5.63 (br d, J=2.2 Гц, 1H, 1E), 5.03 (dd, J=11.5, 1.6 Гц, 1H, 1B), 4.70 (m, 1H, 5E), 4.61 (d, J=7.8 Гц, 1H, 1 A), 4.6 (m, 1H, 3E), 4.49 (m, 1H, 2D), 4.31 (m, 1H, 3B), 4.20 (m, 1H, 5D), 4.10 (m, 2H, 25), 4.07 (m, 1H, 5B), 4.03 (m, 1H, 3А), 3.91 (m, 1H, 15), 3.89 (s, 3H, 2C-OCH₃), 3.84 (s, 3Н, 3С-ОСН₃), 3.8 (m, 1H, 3D), 3.76 (m, 1H, 15), 3.75 (m, 1H, 4B), 3.65 (m, 1Н, 5А), 3.63 (bs, 3Н, 10-NHCOOCH₃), 3.62 (m, 1H, 2A), 3.6 (m, 1H, 4D), 3.57 (s, 3Н, 3D-OCH₃), 3.4 (m, 1H, 5E), 3.37 (s, 3Н, 3Е-ОСН₃), 3.30 (m, 2H, 4E-N-CH₂CH₃), 3.12 (d, J=17.6 Гц, 1H, 12), 3.0 (m, 1H, 4E), 2.85 (m, 2H, 27), 2.85 (bs, 4, 30), 2.72 (d, J=17.6 Гц, 1H, 12), 2.5 (m, 2H, 17), 2.4 (m, 1H, 2E экваториальный), 2.33 (m, 1H, 4A), 2.25 (m, 2H, 26), 2.18 (s, 3H, 19), 2.08 (s, 3H, 4E-N-COCH₃), 2.0 (m, 1H, 2B), 1.8 (m, 1H, 2B), 1.50 (s, 3H, 16a), 1.44 (s, 3H, 16b), 1.42 (d, J=6.2 Гц, 3Н, 6B), 1.4 (m, 1H, 2E аксиальный), 1.31 (d, J=6.1 Гц, 3Н, 6А), 1.31 (d, J=6.1 Гц, 3Н, 6D), 1.19 (t, J=7.2 Гц, 3Н, 4E-N-CH₂CH₃)

1. Соединение формулы I

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S-; и

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью.

2. Соединение по п. 1, имеющее структуру

3. Способ синтеза соединения формулы I

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из С₁-С₈алкила с прямой и

разветвленной цепью;

r означает 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S; и Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью; включающий взаимодействие соединения формулы II

с соединением формулы III

4. Способ по п. 3, где r означает 0, G представляет собой кислород, Z¹ представляет собой метил, Ar представляет собой 1,4-фенилен, W представляет собой -О-, и Y представляет собой -(СН₂)₃-.

5. Способ синтеза соединения формулы IV

включающий обработку соединения формулы I

где R¹² выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает целое число 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S; и

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью,

сильной кислотой с образованием смеси, содержащей соединение формулы IV.

6. Способ по п. 5, где R⁸ и R⁹ представляют собой метил, r означает 0, G представляет собой кислород, Z¹ представляет собой метил, Ar представляет собой 1,4-фенилен, W представляет собой -О-, и Y представляет собой -(СН₂)₃-.

7. Способ синтеза линкерного промежуточного соединения формулы V

где каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой C₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z представляет собой

включающий

а) обработку соединения формулы I

где R¹² выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью и каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²,

сильной кислотой с образованием смеси, содержащей соединение формулы IV

б) взаимодействие соединения формулы IV с соединением ZH; тем самым синтезируя линкерное промежуточное соединение формулы V.

8. Способ по п. 7, где линкерное промежуточное соединение имеет структуру

9. Способ по п. 7, где соединение формулы I получают путем

взаимодействия соединения формулы II

с соединением формулы III

10. Способ синтеза производного калихеамицина формулы VI

где J представляет собой

R₁ представляет собой

R₂ представляет собой

R₃ представляет собой Н;

R₄ представляет собой

R⁵ представляет собой -СН₃, -С₂Н₅ или -СН(СН₃)₂;

X представляет собой атом йода или брома;

R^5' представляет собой группу RCO, где R представляет собой водород или разветвленный или неразветвленный алкил из 1-10 атомов углерода;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z представляет собой

включающий

а) обработку соединения формулы I

где R¹² выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью,

и каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

сильной кислотой с образованием смеси, содержащей соединение формулы IV

б) взаимодействие соединения формулы IV с соединением ZH с образованием линкерного промежуточного соединения формулы V

и

в) взаимодействие линкерного промежуточного соединения формулы V, полученного на стадии (б), с метилтрисульфидным соединением CH₃-S-S-S-J; тем самым синтезируя производное калихеамицина формулы VI.

11. Способ по п. 10, где соединение формулы I получают путем взаимодействия соединения формулы II

с соединением формулы III

12. Способ по п. 10, где метилтрисульфидное соединение СН₃-S-S-S-J представляет собой озогамицин.

13. Способ по п. 12, дополнительно включающий

г) конъюгирование производного калихеамицина формулы VI, полученного на стадии (в), с моноклональным антителом, выбранным из инотузумаба и гемтузумаба.

14. Способ синтеза производного калихеамицина формулы VI

где J представляет собой

R₁ представляет собой

R₂ представляет собой

R₃ представляет собой Н;

R₄ представляет собой

R⁵ представляет собой -СН₃, -С₂Н₅ или -СН(СН₃)₂;

X представляет собой атом йода или брома;

R^5' представляет собой группу RCO, где R представляет собой водород или разветвленный или неразветвленный алкил из 1-10 атомов углерода;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой С₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z представляет собой

включающий взаимодействие линкерного промежуточного соединения формулы V

с метилтрисульфидным соединением СН₃-S-S-S-J в присутствии карбодиимида; тем самым синтезируя производное калихеамицина формулы VI.

15. Способ по п. 14, где метилтрисульфидное соединение CH₃-S-S-S-J представляет собой озогамицин.

16. Способ по п. 15, дополнительно включающий конъюгирование полученного производного калихеамицина формулы VI с моноклональным антителом, выбранным из инотузумаба и гемтузумаба.

17. Способ очистки производного калихеамицина формулы VI

где J представляет собой

R₁ представляет собой

R₂ представляет собой

R₃ представляет собой Н;

R₄ представляет собой

R⁵ представляет собой -СН₃, -С₂Н₅ или -СН(СН₃)₂;

X представляет собой атом йода или брома;

R⁵ представляет собой группу RCO, где R представляет собой водород, разветвленный или неразветвленный алкил из 1-10 атомов углерода;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает 0;

G представляет собой кислород;

Z¹ представляет собой C₁-С₅алкил с прямой или разветвленной цепью;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3- или 1,4-фенилен;

W выбран из -О- и -S-;

Y представляет собой (С₁-С₆)алкиленовую группу с прямой или разветвленной цепью; и

Z представляет собой

включающий подвергание производного калихеамицина формулы VI процедуре очистки методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

18. Способ по п. 17, где процедура очистки методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии включает элюирование фазами, содержащими водные и органические смеси, и эти фазы имеют значение рН в пределах от примерно 4 до примерно 6.

19. Способ по п. 18, где производное калихеамицина формулы VI, полученное в результате процедуры обращенно-фазной очистки, затем подвергают процедуре твердофазной экстракции.

20. Способ по п. 18 или 19, где J представляет собой озогамициновую группировку.

21. Способ по п. 20, дополнительно включающий конъюгирование очищенного производного калихеамицина формулы VI с моноклональным антителом, выбранным из инотузумаба и гемтузумаба.

22. Способ синтеза соединения формулы II

где R¹² выбран из С₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

каждый R¹⁰ независимо выбран из водорода, R¹² и -OR¹²;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из C₁-С₈алкила с прямой и разветвленной цепью;

r означает 0; и

G представляет собой кислород;

включающий обработку соединения формулы VII

где R¹⁶ представляет собой -С(=O)ОН;

азольным активирующим агентом формулы IX

где V' представляет собой кислород; и

где Е представляет собой

или ;

где m означает целое число 0, 1, 2 или 3; q означает целое число 0, 1 или 2; и р означает целое число 0, 1, 2, 3 или 4; и где каждый R¹⁷, присоединенный к Е, независимо выбран из (С₁-С₆)алкильных групп с прямой и разветвленной цепью;

в органическом растворителе с образованием соединения формулы VIII

с последующим объединением соединения формулы VIII с гидразином с получением в результате соединения формулы II.

23. Способ по п. 22, где азольный активирующий агент выбран из карбонилдиимидазола, карбонил-бис-пиразола, где каждый пиразол возможно замещен одной-тремя (С₁-С₆)алкильными группами; карбонил-бис-1,2,3-триазола, карбонил-бис-бензотриазола и карбонил-бис-1,2,4-триазола.

24. Способ по п. 22 или 23, где гидразин представляет собой безводный гидразин, моногидрат гидразина, водный раствор гидразина или тетрагидрофурановый раствор гидразина.