Длинные жесткие спейсеры для улучшения кинетики связывания в иммуноанализах

Группа изобретений относится к области детектирования молекулы-мишени в образце. Устройство для детектирования молекулы-мишени в образце содержит контейнер для образцов для количественного определения молекулы-мишени в образце; по меньшей мере одну первую частицу, функционализированную первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с молекулой-мишенью; поверхностную структуру, содержащую вторую связывающую молекулу, где поверхностная структура покрывает плоскую поверхность или присутствует на по меньшей мере одной второй частице. При этом первая частица, образовавшая захватывающий комплекс с молекулой-мишенью, способна к связыванию второй связывающей молекулы поверхностной структуры напрямую или ненапрямую; где каждая первая и/или вторая связывающая молекула присоединена к поверхности частицы одной из первой и/или второй частиц и/или плоской поверхности посредством длинной и жесткой линкерной молекулы; где длина линкерной молекулы выбрана так, чтобы в результате была получена средняя протяженность удлинения линкера более 60 нм; и где количество кластеров первых и/или вторых частиц, связанных друг с другом, или связанных первых и/или вторых частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце. Также раскрывается способ детектирования наличия или количества молекулы-мишени в образце. Группа изобретений обеспечивает повышение вероятности связывания функционализированной частицы, связавшей молекулу-мишень, с поверхностью. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к устройству для детектирования молекулы-мишени в образце, содержащему контейнер для образцов для количественного определения молекулы-мишени в образце, первую частицу, где указанная первая частица функционализирована первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью, и поверхностной структурой, содержащей вторую связывающую молекулу, где указанная поверхностная структура покрывает плоский сенсор или присутствует на второй частице, где указанная первая частица способна к связыванию указанной второй связывающей молекулы поверхностной структуры напрямую или ненапрямую; где указанная первая и/или вторая связывающая молекула ненапрямую присоединена к поверхности частицы указанной первой и/или второй частицы и/или поверхности плоского сенсора посредством длинной и жесткой линкерной молекулы; где длина и консистенция указанной линкерной молекулы выбраны так, чтобы в результате была получена средняя протяженность удлинения указанного линкера более 60 нм; и где количество кластеров частиц или связанных частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце. В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу детектирования наличия или количества молекулы-мишени в образце. Настоящее изобретение также описывает применение частицы в соответствии с изобретением для детектирования молекулы-мишени в образце.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Потребность в повсеместном и эффективном медицинском обслуживании направляет область in vitro диагностики к интегрированному произвольному доступу и решениям по месту лечения. Для достижения таких решений требуется, чтобы тесты были быстрыми, чувствительными, количественными и точными. Кроме того, необходимо, чтобы платформа, на которой выполняется тест, была простой в применении и компактной.

В аффинных анализах применяются биологические молекулы, захватывающие специфические молекулы-мишени из образца и позволяющие определение их концентрации. Как правило, аффинный захват достигается посредством диспергирования нано- или микрочастиц, покрытых захватывающими молекулами в пробную жидкость (Luchini et al., 2008, Nano Lett., 8(1), 350-361). Типичные основанные на аффинности анализы, таким образом, применяются в огромном количестве приложений, таких как диагностические анализы, детектирование биомолекул в исследовании, таких как белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, при этом применяя аффинные молекулы, такие как, например, антитела, которые, как правило, характеризуются высокой аффинностью связывания по отношению к специфической биомолекуле. По существу, функционализированные магнитные частицы прикреплены к сенсорной поверхности, где частицы могут ненапрямую, т.е. посредством захваченного аналита, или напрямую связываться с зондами захвата, такими как антитела, размещенные на поверхности. Количество связанных частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце. Как правило, в таких биосенсорных приложениях частицы могут быть детектированы с применением любой технологии, чувствительной к частице рядом с поверхностью, часто такие технологии основаны на оптическом детектировании, таком как детектирование рассеянного света или нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR), как описано, например, в Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9, 2504-3510.

WO 2008/0833 A1 раскрывает способы, реагенты и устройства для детектирования агентов. Описаны виды анализов для детектирования одного или более целевых агентов в образце на основании общепринятых прямых и непрямых сандвичевых анализов.

US 2004/110220 A1 раскрывает способы и устройства для детектирования нуклеиновых кислот. В частности, система детектирования в основном основана на наночастицах с прикрепленными к ним олигонуклеотидами (конъюгаты наночастица-олигонуклеотид). Олигонуклеотиды, описанные в этом документе, имеют участок, который комплементарен участку последовательности нуклеиновой кислоты (распознающий участок) для предоставления возможности гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой.

WO 2009/005552 A2 описывает способы и композиции для мультивалентного связывания и количественного захвата компонентов в образце. В частности, описаны модификации общепринятых сандвичевых видов анализа такие, чтобы в результате были получены поливалентные "авидные" связующие вещества для повышения наблюдаемой Kd. Это достигается посредством закрепления более чем одного антитела или антигена на "остове", который может являться основной цепью полимера, такого как одно- или двухцепочечная нуклеиновая кислота, такая как ПНК, ДНК, РНК и т.д.

US 2009/148863 раскрывает платформы для детектирования на основании функционализированных наночастиц. В частности, наночастицы содержат компонент первого монослоя, который приспособлен для связывания биологической группы, которая в свою очередь может быть приспособлена для связывания с аналитом. Поверхность наночастиц может дополнительно содержать компонент второго монослоя, который вносит вклад в экспонирование первого компонента монослоя на поверхности. Наночастицы связаны посредством первого и второго монослоя с захватываемой молекулой, например, антителом, которое позволяет детектирование одиночной молекулы в реальном времени.

ЕР 1441217 А2 описывает анализ связывания с оптическим волноводом на основании детектирования рассеяния света, направленного в TIR элементы или волноводные устройства посредством иммобилизации компонентов специфического связывания (SBM) различными средствами.

US 2005/0048599 раскрывает детектирование микроорганизмов на фиксированном субстрате. Связывание основано на предоставление сандвичевой конфигурации и происходит посредством связывающего метку компонента, который связывает метку с мишенью при помощи средства, которое является специфичным к мишени (например, антитела или аптамеры). Индикаторный компонент является обнаруживаемым детектором.

Существенным недостатком аффинных анализов предшествующего уровня техники, тем не менее, является тот факт, что связывание функционализированных частиц, имеющих связанную молекулу-мишень с поверхностью, все еще является очень медленным, ограничивающим скорость и неэффективным. Одна из причин этой медленной реакции в числе прочего заключается в трудности связывания относительно большой (например, приблизительно 500 нм) частицы с поверхностью посредством маленькой (например, приблизительно 10 нм) молекулы-мишени. Диспропорция изображена на фиг.3, иллюстрирующей относительные размеры мишени и частицы. Как следствие, существует не много ориентаций комплекса частица-мишень, которые в результате приводят к эффективному связыванию. Хотя частица может поворачиваться, находясь в контакте с поверхностью, вероятность связывания все-таки остается маленькой.

Таким образом, существует сильная потребность в разработке новых структур частица-мишень, которые способны к эффективному связыванию с поверхностью, такой как поверхность плоского сенсора или поверхность частицы.

ОБЪЕКТЫ И СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на указанные потребности и предоставляет средство для увеличения эффективности связывания частиц с поверхностями. Вышеупомянутая цель, в частности, достигается посредством устройства для детектирования молекулы-мишени в образце, содержащего контейнер для образцов для количественного определения молекулы-мишени в образце, первую частицу, где указанная первая частица функционализирована первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью и поверхностной структурой, содержащей вторую связывающую молекулу, где указанная поверхностная структура покрывает плоский сенсор или присутствует на второй частице, где указанная первая частица способна к связыванию указанной второй связывающей молекулы поверхностной структуры напрямую или ненапрямую; где указанная первая и/или вторая связывающая молекула ненапрямую присоединена к поверхности частицы указанной первой и/или второй частицы и/или поверхности плоского сенсора посредством длинной и жесткой линкерной молекулы; где длина и консистенция указанной линкерной молекулы выбраны так, чтобы в результате была получена средняя протяженность удлинения указанного линкера более 60 нм; и где количество кластеров частиц или связанных частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

Изобретение описывает то, как вероятность связывания большой частицы с поверхностью с мишенью может быть значительно повышена прикреплением к частице линкерных молекул, имеющих некоторую длину. Неожиданно, возможно было наблюдать то, что предоставление длинной и жесткой линкерной или спейсерной молекулы устраняет трудности связывания частиц, которые были в предшествующем уровне техники, и таким образом позволяет более эффективное связывание.

Фиг. 4 иллюстрирует принцип, лежащий в основе настоящего изобретения. Количество возможных ориентаций, в которых частица может связываться с поверхностью, сильно возрастает, если точка присоединения расположена более далеко от частицы. Применение длинной спейсерной молекулы, однако, не в обязательном порядке решает задачу. Фиг. 5 иллюстрирует, что даже если применен очень длинный линкер, например, молекула ПЭГ, то гибкость молекулы скорее всего приведет к сворачиванию с получением в результате глобулярной структуры и таким образом незначительному удлинению захватывающей молекулы от поверхности частиц.

Без привязки к какой-либо теории, одним объяснением для наблюдаемой повышенной эффективности связывания является то, что применение длинных и жестких линкерных молекул для размещения связывающей молекулы далеко от поверхности частицы значительно улучшает кинетику связывания частицы с поверхностью. Авторы данной заявки обнаружили, что получающееся в результате расстояние от конца до конца цепи является функцией средней протяженности удлинения, контурной длины и жесткости молекулы, и смогли продемонстрировать, что такие характеристики вносят значительный вклад в наблюдаемое улучшение кинетики связывания.

В эксперименте с применением покрытых стрептавидином 500 нм наночастиц и жестких дцДНК молекул в качестве линкерных молекул варьирующейся длины, можно в частности показать, что количество связанных частиц возрастает с длиной дцДНК-линкера (смотрите фиг. 6). В частности, авторы смогли продемонстрировать, что длина линкерных молекул на частицах вносит существенный вклад в количество связанных на поверхности сенсора частиц. Эти обнаружения и другое обнаружение, которое будет описано подробно в данном документе, привели к разработке усовершенствованной конструкции линкера. Следовательно конфигурация линкера, как описано в данном документе, обуславливает улучшенную кинетику связывания, таким образом повышая скорость, эффективность и точность аффинных анализов на основе наночастиц.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первая и/или вторая частица представляет собой магнитную частицу.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления диаметр указанной первой и/или второй частицы составляет по меньшей мере приблизительно 100 нм. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления средняя протяженность удлинения линкера, как упомянуто выше, составляет по меньшей мере 10% диаметра частицы, имеющей диаметр по меньшей мере приблизительно 100 нм.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанная жесткая линкерная молекула имеет среднюю протяженность удлинения по меньшей мере 20% от контурной длины указанной линкерной молекулы.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первая связывающая молекула является антителом или его фрагментом, аптамером, лигандом или комплементарной нуклеиновой кислотой.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения жесткость и длина указанной линкерной молекулы определяются через корень из квадрата среднего расстояния от конца до конца цепи линкера √<R²>, где <R²> может быть описана в соответствии с формулой

<R²>=2Pl[1-(P/l)(1-e^l/p)],

в которой P является персистентной длиной полимера и l является контурной длиной линкера.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула представляет собой или содержит молекулу нуклеиновой кислоты или небиологический полимер. В особенно предпочтительном варианте осуществления линкерная молекула может быть выбрана из группы, состоящей из двухцепочечной нуклеиновой молекулы, такой как дцДНК, молекула ПНК, дуплекс ПНК-ДНК и дуплекс РНК-ДНК.

В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой дцДНК, дуплекс ПНК-ДНК или дуплекс РНК-ДНК.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула представляет собой дцДНК.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первая частица дополнительно содержит отталкивающую поверхностную структуру, которая непосредственно присоединена к поверхности указанной частицы, где указанная отталкивающая поверхностная структура покрывает поверхность частицы так, чтобы в результате были получены специфический результирующий заряд и/или стерическое отталкивание частицы, и где указанная отталкивающая поверхностная структура переносит отталкивающий эффект на указанные частицы по отношению к указанной сенсорной поверхности.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула является более длинной, чем указанная отталкивающая поверхностная структура.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная отталкивающая поверхностная структура является заряженной структурой.

В особенно предпочтительном варианте осуществления заряженная структура представляет собой или содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, такой как двухцепочечная нуклеиновая кислота, например, дцДНК, ПНК, дуплекса ПНК-ДНК, РНК-ДНК, гидрогеля и полимера.

В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная отталкивающая поверхностная структура представляет собой пространственное покрытие.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула и/или указанная отталкивающая поверхностная структура не расщепляется ДНКазой и/или рестрикционным ферментом, способным к разрезанию молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления короткий гибкий спейсер содержит одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение в дополнительном аспекте относится к способу детектирования наличия или количества молекулы-мишени в образце, содержащему стадии:

(a) приведения образца в контакт с первой связывающей молекулой, присоединенной к первой частице, в устройстве в соответствии с настоящим изобретением; и

(b) приведения образца в контакт с

i) второй связывающей молекулой, способной к присоединению к плоской поверхности или ко второй частице, где первая связывающая молекула и/или вторая связывающая молекула способны к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью, или

ii) аналогом молекулы-мишени, присоединенным к плоской поверхности или ко второй частице; где молекула-мишень способна препятствовать связыванию первой связывающей молекулы с аналогом молекулы-мишени; и

(c) детектирования количества первой частицы, связанной с плоской поверхностью или со второй частицей посредством связывания первой связывающей молекулы со второй связывающей молекулой,

где количество кластеров частиц или связанных частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сила магнитного поля применяется для приведения частиц в непосредственную близость с указанной твердой подложкой или друг с другом, для того чтобы облегчить кластеризацию частиц.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения присоединение указанной второй связывающей молекулы к плоской поверхности или второй частице происходит перед или после связывания второй связывающей молекулы с молекулой-мишенью.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения детектирование связанных частиц происходит с помощью нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR) или с помощью измерения рассеянного света от указанных связанных частиц рядом с поверхностью или с помощью оптического детектирования кластерообразования.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение описывает применение частицы в соответствии с данным документом для детектирования молекулы-мишени в образце.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула-мишень, как упомянуто в отношении устройства, способа или применения, как описано выше в данном документе, представляет собой сердечный тропонин I (cTnI), NT-proBNP (N-терминальный фрагмент мозгового натрийуретического пептида) или паратиреоидный гормон.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 демонстрирует принцип FTIR детектирования. Свет из источника света проникает в картридж, отражается от границы раздела картридж/жидкость и отображается на детекторе. Если частицы представлены в рассеянном поле, создаваемом на этой границе раздела, то интенсивность отраженного света снижается.

Фиг. 2 демонстрирует сандвичевый иммуноанализ с применением технологии Magnotech. На панели (1) магнитные частицы, покрытые первичным антителом, направленным против мишени, распределяются в жидком образце и связывают мишень. На панели (2) верхний и нижний витки приводят в движение магнитные частицы пульсирующим образом, приводя в результате к связыванию с поверхностью сенсора, где вторичное антитело может связываться со связанной молекулой-мишенью. На панели (3) несвязанные частицы удаляются с сенсорной поверхности и связанные частицы детектируются с применением рассеянного поля.

Фиг. 3 иллюстрирует относительные размеры 10 нм молекулы-мишени (черный), расположенной между поверхностью сенсора и 500 нм частицей (изображена не полностью). Слева: частица соответствующим образом ориентирована для образования связи; справа: частица не ориентирована соответствующим образом для образования связи.

Фиг. 4 иллюстрирует повышенное количество ориентаций, в которых частица может связываться с поверхностью, если точка присоединения (отображенная маленьким черным кругом) дополнительно отдалена от частицы.

Фиг. 5 демонстрирует схему, сравнивающую удлинение антитела, присоединенного к поверхности посредством ПЭГ линкера (слева) или дцДНК линкера (справа), оба из которых имеют одинаковую контурную длину.

Фиг. 6 изображает график, демонстрирующий количество связанных частиц в виде функции длины ДНК линкера. Покрытые стрептавидином 500 нм частицы инкубировали с дцДНК варьирующейся длины. Каждая молекула ДНК содержала одну группу биотина на одном конце молекулы ДНК, молекулу техасского красного на другом конце молекулы. Раствор, содержащий частицы и ДНК, вводили в картридж, и он связывался с поверхностью сенсора, покрытой антителами против техасского красного с использованием магнитного притяжения. Посредством многократного регистрирования количества частиц, которые были связаны с поверхностью после короткого магнитного этапа промывания, который удалял несвязанные частицы с поверхности, определяли скорость связывания (выраженную в количестве связанных частиц в единицу времени).

Фиг. 7 изображает график, демонстрирующий количество связанных частиц как функцию длины ДНК линкера. Подробности аналогичны фиг. 6, однако использовали частицы с диаметром 1000 нм.

Фиг. 8 демонстрирует частицу с высокой поверхностной плотностью линкерных молекул. Хотя линкерные молекулы относительно растянуты, сильное пространственное затруднение будет снижать подвижность линкера.

Фиг. 9 изображает эффект поверхностной плотности линкера на кинетику связывания. Сверху: схема формата анализа: 500 нм частица, покрытая стрептавидином (линкер), связана с одиночной молекулой-мишенью, цепью дцДНК с биотином на одном конце и молекулой техасского красного, присоединенной к другому концу (синий ромб), которая доступна для связывания с поверхностью сенсора, покрытой антителами против техасского красного. Впоследствии, различные количества нефункциональных дцДНК такой же длины (но без молекулы техасского красного) также были связаны с частицей, и сравнивали способность частиц связываться с поверхностью сенсора. В середине: эксперимент нагрузки частиц с применением дцДНК из 1999 п.о., отражающий относительное количество частиц, связывающихся при загрузке нефункциональной ДНК, по сравнению с частицей с только 1 функциональной молекулой ДНК. Внизу: такая же диаграмма, но для ДНК из 497 п.о.

Фиг. 10 демонстрирует частицу, предварительно нагруженную захватывающими молекулами, присоединенными к поверхности посредством длинного жесткого линкера. Во время анализа молекула-мишень (ромб) связана с частицей и впоследствии с поверхностью.

Фиг. 11 изображает частицу, предварительно нагруженную захватывающими молекулами, присоединенными непосредственно к поверхности. Во время анализа молекула-мишень (ромб) связана с частицей и второй захватывающей молекулой, распознающей мишень, которая соединена с длинным жестким линкером. Другой конец линкера соединен с распознаваемым элементом (например, биотин), который может связываться с совместимой захватывающей молекулой (например, стрептавидин) на поверхности сенсора.

Фиг. 12 демонстрирует частицы, связанные с поверхностью посредством специфического взаимодействия (слева) или неспецифического взаимодействия (справа).

Фиг. 13 демонстрирует возможную конструкцию линкера.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к средству и способам для детектирования молекулы-мишени в образце. Хотя настоящее изобретение будет описано применительно к конкретным вариантам осуществления, это описание не должно истолковываться в ограничивающем смысле.

Перед подробным описанием иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения приведены определения, существенные для понимания настоящего изобретения.

В использованном в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения значении формы единственного числа также включают соответствующие формы множественного числа, если в контексте особым образом не указано обратное.

В контексте настоящего изобретения термины "приблизительно" и "примерно" обозначают интервал с точностью, которая, как поймет специалист в данной области, все еще обеспечивает технический эффект рассматриваемого свойства. Термин, как правило, указывает отклонение от указанной численной величины на ±20%, предпочтительно ±15%, более предпочтительно ±10% и еще более предпочтительно ±5%.

Необходимо понимать, что термин "содержащий" не является ограничивающим. В целях настоящего изобретения считается, что термин "состоящий из" является предпочтительным вариантом термина "содержащий". Если в дальнейшем в этом документе группа определяется как содержащая по меньшей мере некоторое количество вариантов осуществления, это означает, что также охватывается группа, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.

Кроме того, термины "первый", "второй", "третий" или "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" и т.д. и тому подобные в описании и формуле изобретения, применяются для различения между подобными элементами и необязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Необходимо понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми при соответствующих обстоятельствах, и что варианты осуществления изобретения, описанные в данном документе, могут функционировать в отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе последовательностях.

В случае терминов "первый", "второй", "третий" или "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" "i", "ii" и т.д. относительно этапов способа или применения или анализа не существует времени или временного интервала между этапами, т.е. этапы могут быть осуществлены одновременно или могут иметь место временные интервалы из секунд, минут, часов, дней, недель, месяцев или даже лет между такими этапами, если в заявке особым образом не указано обратное, как установлено в данном документе ранее или далее.

Необходимо понимать, что это изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, реагентами и т.д., описанными в данном документе, так как все это может изменяться. Также необходимо понимать, что терминология, применяемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не подразумевается, что она ограничивает объем настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагающейся формулой изобретения. Если особым образом не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют такие же значения, как общепринято среди специалистов в данной области.

Как было указано выше, настоящее изобретение в одном аспекте относится к устройству для детектирования молекулы-мишени в образце, содержащему контейнер для образцов для количественного определения молекулы-мишени в образце, первую частицу, где указанная первая частица функционализирована первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью, и поверхностную структуру, содержащую вторую связывающую молекулу, где указанная поверхностная структура покрывает плоский сенсор или присутствует на второй частице, где указанная первая частица способна к связыванию указанной второй связывающей молекулы поверхностной структуры напрямую или ненапрямую; в котором указанная первая и/или вторая связывающая молекула ненапрямую присоединена к поверхности частицы указанной первой и/или второй частицы и/или поверхности плоского сенсора посредством длинной и жесткой линкерной молекулы; где длина и консистенция указанной линкерной молекулы выбраны так, чтобы в результате была получена средняя протяженность удлинения указанного линкера более 60 нм; и в котором количество кластеров частиц или связанных частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

Настоящим изобретением предусматривается пригодное устройство, предпочтительно для детектирования молекулы-мишени с применением биосенсорной системы. Различные аналитические процедуры для детектирования наличия и/или количества аналита в тестируемом образце или объеме образца известны в данной области. Как правило, такая система детектирования может оптически детектировать частицы, которые функционализированы с пригодной связывающей молекулой для того, чтобы связывать целевой аналит. Наличие или количество аналита может быть определено из количества аналита, связанного с частицами. Наличие или количество аналита может быть также определено из количества кластеров частиц. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения биосенсорную систему, содержащую устройство, как описано в данном документе, можно применять для детектирования одиночных частиц, связанных с плоским сенсором, как описано в данном документе, или наличия кластера частиц, и приведением частиц в движение магнитным полем, генерируемым генератором магнитного поля.

"Генератор магнитного поля" как это применяется в данном документе, как правило, содержит один или более магнитов внутри оптомагнитного устройства, как описано в данном документе, для генерирования магнитного поля в камере для образцов, где указанное магнитное поле будет направлять магнитные частицы к поверхности контакта. Магнитное поле будет, как правило, иметь ненулевой градиент, который позволяет воздействовать магнитными силами на магнитные (дипольные) частицы. Пригодные примеры таких генераторов магнитного поля или пригодных систем, содержащих такие генераторы магнитного поля известны специалисту в данной области. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения генератор магнитного поля может представлять собой генератор магнитного поля, как описано в Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9, 2504-3510, или содержаться в или являться частью системы как описано в Ranzoni et al., 2011, Nano Lett., 11, 2017-2022.

Как правило, магнитные частицы могут быть приведены в движение применением магнитного поля так, что аналитическая процедура может быть ускорена. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения также предусмотрено, что применение магнитного поля может снизить фоновый сигнал благодаря удалению неспецифически связанных частиц. Фиг. 2 демонстрирует пример того, как частицы могут быть приведены в движение для эффективного удаления неспецифических или несвязанных частиц с плоского сенсора, как описано в этом документе. Верхний и нижний магнит, который может приводится в действие пульсирующим образом, эффективно удаляет несвязанные частицы так, что связанные частицы детектируются на поверхности сенсора.

Магнитное приведение в движение, как это используется в контексте настоящего изобретения, может быть применено по-другому, а именно для расположения магнитных частиц в образце в цепи для того, чтобы ускорить кластеризацию частиц. Также настоящим изобретением предусмотрено применение магнитного поля для приведения в движение для вибрирования и вращения кластеров частиц для определения наличия и количества образованных кластеров. В конкретных вариантах осуществления магнитное приведение частиц в движение может происходить в виде импульсного, т.е. приводящее в движение поле по меньшей мере один раз прерывается паузой. Было обнаружено, что динамическое приведение в движение на основе повторных импульсов снижает неспецифические взаимодействия и увеличивает количество событий связывания. Дополнительные подробности и параметры относительно детектирования молекулы-мишени на основании детектирования кластеров частиц должны быть известны специалисту в данной области или могут быть получены из Ranzoni et al., 2011, Nano Lett., 11, 2017-2022.

Биосенсорные системы, пригодные для применения в данном изобретении могут содержать, к примеру, биосенсорный картридж, содержащий контейнер для образца, сенсорное устройство для обнаружения частиц, систему детектирования и необязательно генератор магнитного поля. Системы могут в дополнительных вариантах осуществления содержать один или более добавочных функциональных блоков, таких как система считывания, например, экран или принтер, интерфейс для базы данных или компьютерной системы, блок калибровки, прямую или непрямую связь с устройствами с высокой пропускной способностью и т.д. Конкретно настоящим изобретением предусмотрены портативные устройства для быстрого и незамедлительного анализа, куда может быть введен картридж, содержащий формат анализа. Как правило, такое устройство содержит источник электропитания, предпочтительно в виде перезаряжаемых батарей, дисплей, возможность беспроводного подключения, такого как WLAN, для быстрого доступа к базе данных или доступа к информационной системе лаборатории. Иллюстративная биосенсорная система, которая может быть применена в контексте настоящего изобретения, описана в Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9, 2504-3510.

Особенно предпочтительными являются устройства обнаружения на основании оптического детектирования частиц рядом или на поверхности. Иллюстративное устройство без ограничения им, показано на фиг.1, оно содержит источник света и систему детектирования света.

"Образец", как это применяется в данном документе, относится к любому образцу, который содержит молекулу-мишень, как определено в данном документе. Такие образцы могут, к примеру, включать в себя образцы, полученные из или содержащие стул, цельную кровь, сыворотку, плазму, слезы, слюну, начальную жидкость, мокроту, ушную жидкость, генитальную жидкость, грудную жидкость, молоко, молозиво, плацентарную жидкость, амниотическую жидкость, перспират, синовиальную жидкость, жидкость асцитов, цереброспинальную жидкость, желчь, желудочную жидкость, внутриглазную жидкость, стекловидное тело, желудочно-кишечную жидкость, эксудат, транссудат, плевральную жидкость, плевральную жидкость, сперму, жидкость верхних дыхательных путей, перитонеальную жидкость, жидкость, отобранную из участка иммунологической реакции, жидкость, отобранную из объединенного участка отбора, бронхиальный лаваж, мочу, биопсийный материал, например, из пригодных органов, например, легкое, мышца, мозг, печень, кожа, поджелудочная железа, желудок и т.д., образец ядросодержащей клетки, жидкость, относящуюся к поверхности слизистой оболочки, волосы или кожу. Дополнительно могут быть использованы образцы из источников окружающей среды, например, образцы воды, образцы мяса или домашней птицы, образцы из источников потенциального заражения и т.д.

Термин "молекула-мишень", как это применяется в данном документе, относится к любой молекуле, связанной связывающей молекулой и может, к примеру, являться биологическим веществом, таким как биомолекула, предпочтительно биомаркер, комплексами, клеточными фракциями или клетками. Предпочтительно, молекула-мишень в контексте настоящего изобретения является нуклеиновой кислотой, например, молекулой ДНК или РНК, или олигонуклеотидом, таким как ДНК или РНК олигонуклеотид. Еще более предпочтительными являются молекулы-мишени, такие как пептид, полипептид или белок, фрагмент белка или полипептида или функциональный домен белка или полипептида, молекула лекарственного средства, маленькая молекула или витамин.

Молекула-мишень может быть непосредственно получена из образцов, как описано в данном документе выше. В других обстоятельствах образцы могут быть подвержены технологиям приготовления образцов, например, на основании стандартных протоколов, включая, к примеру, частичную очистку, которая делает молекулы-мишени более доступными для партнеров по связыванию, т.е. для аффинной молекулы, как определено в данном документе. К примеру, образцы крови могут быть отцентрифугированы для отделения фракций, включая целые клетки или мембраны из сыворотки, образцы экскрементов могут быть секционированы и гомогенизованы с физиологически приемлемым буфером и детергентом, образцы мокроты могут быть разжижены и фракционированы. Кроме того, антибиотики или бактерициды могут быть добавлены к образцам для предотвращения дополнительного роста любых представленных организмов. Целые клетки могут также быть удалены или могут быть лизированы для высвобождения их содержимого.

"Контейнер для образца", как это применяется в данном документе, относится к контейнеру, изготовленному из любого пригодного материала, подобного стеклу, любого прозрачного пластика или полупроводника, в которых измеряется образец. Магнитные частицы, как описано в данном документе, могут быть уже представлены в контейнере для образца, когда вводится образец, могут вводиться вместе с образцом или могут вводиться после того, как образец был введен в контейнер для образца. Контейнер для образца может дополнительно содержать сенсорную поверхность, содержащую вторую связывающую молекулу. Предпочтительно сенсорная поверхность расположена на дне контейнера для образца. Контейнер для образца может в конкретных вариантах осуществления быть расположен внутри сменного картриджа, например, в автономном компоненте отдельно от сенсорного устройства. Из-за возможного заражения образцом такой картридж может предпочтительно являться одноразовым блоком, изготовленным, например, из пластиков инжекционным прессованием. Также предусмотрены регенерируемые картриджи или регенерируемые части картриджа, например, картриджи или части картриджа, которые могут быть очищены или стерилизованы.

"Плоский сенсор", как это используется в этом документе, означает площадь, на которой происходит или детектируется фактическое сенсорное событие. Как правило, плоский сенсор расположен на дне контейнера для образца. Плоский сенсор может служить для детектирования количества связанных частиц, которое прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образцах. Примеры таких плоских сенсоров и соответствующих сенсоров, которые могут быть применены в контексте настоящего изобретения, предоставлены в Bruls et al., 2009, Lab Chip, 9, 3504-3510.

Термин "частица", как это применяется в данном документе, означает маленький, локализованный объект, которому может быть приписано физическое свойство, такое как объем или масса. В контексте настоящего изобретения частица содержит или состоит из любого пригодного материала, известного специалисту в данной области, например, частица может содержать, состоять из или по существу состоять из неорганического или органического материала. Как правило, частица может содержать, состоять из или по существу состоять из металла или сплавов металлов или органического материала или содержать, состоять из или по существу состоять из углеводных элементов. Примеры предусмотренного материала содержат агарозу, полистирол, латекс, поливиниловый спирт, диоксид кремния и ферримагнитные металлы, сплавы или композиционные материалы. Особенно предпочтительными являются магнитные или ферромагнитные металлы, сплавы или композиции. Особенно предпочтительными частицами, пригодными для настоящего изобретения, являются суперпарамагнитные частицы. Термин "суперпарамагнитный", как это применяется в данном документе, описывает форму магнетизма, которая проявляется в маленьких ферримагнитах или ферримагнитных наночастицах. В данной области известно, что в достаточно маленьких наночастицах, намагничивание может случайным образом переклачить направление под влиянием температуры. Время между двумя переключениями называется время релаксации Нееля. В отсутствии внешнего магнитного поля, когда время, используемое для измерения намагничивания наночастиц намного дольше, чем время релаксации Нееля, намагничивание оказывается в среднем равным нулю, т.е. парамагнитное состояние. В таком состоянии внешнее магнитное поле способно намагничивать наночастицы подобно парамагнетику. Однако, магнитная восприимчивость намного больше, чем восприимчивость парамагнетиков. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления материал может обладать особыми специфическими свойствами. Материал может, к примеру, являться магнитным или являться немагнитным. Материал может, в других вариантах осуществления являться гидрофобным или гидрофильным. В дополнительных специфических вариантах осуществления частица представляет собой пластиковую частицу. Примеры пластиковых частиц содержат латексные или полистироловые гранулы, например, широко используемые для очистки. В еще одном варианте осуществления частица может являться подобной клетке частицей. Термин "подобная клетке частица", как это применяется в данном документе, относится к биологической или полубиологической структуре, которая представлена в биологических системах или имеет форму и/или функцию биологических систем или части биологических систем. Предпочтительным примером подобной клетке частицы является липосома.

Термин "липосома", как это применяется в данном документе, означает везикулу, например, содержащую липидную или фосфолипидную мембрану, или слой, например, бислой. Как правило, липосомы являются полыми структурами, которые могут быть наполнены молекулами, например, молекулами лекарственного средства или фармацевтическими композициями, и быть использованы для доставки таких молекул в сайты-мишени, например, раковые клетки или инфицированные области и т.д. Липосомы могут предпочтительно являться композитными структурами, изготовленными из фосфолипидов и могут содержать маленькие количества других молекул, например, быть составлены из полученных в естественной среды фосфолипидов со смешанными липидными цепями (подобно яичному фосфатидилэтаноламину) или других поверхностно-активных веществ. Липосома может варьироваться в размере от нанометрового диапазона до микрометров. В дополнительных специфических вариантах осуществления частица может содержать, состоять по существу из или состоять из сефарозы или агарозы.

Кроме того, частица по существу действует как целый элемент с точки зрения ее транспорта и свойств. Частицы могут соответственно иметь симметричную, глобулярную, по существу глобулярную или сферическую конфигурацию или иметь неправильную, асимметричную конфигурацию или форму.

Размер частицы, предусмотренный настоящим изобретением, как правило, варьируется между 50 нм и 50 мкм. Предпочтительными являются частицы в нанометровом и микрометровом диапазоне вплоть до нескольких микрометров. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления частица диаметр составляет более 100 нм. Термин "диаметр", как это применяется в данном документе, относится к любому прямолинейному отрезку, который проходит через центр частицы и конечные точки которого расположены на поверхности частицы. В случае несферической или полусферической частицы, под диаметром подразумевается средний диаметр из самого большого и самого короткого прямолинейных отрезков, которые проходят через центр частицы и конечные точки которых расположены на поверхности частицы. Также подразумевается, что радиус частицы в соответствии с данным документом составляет половину его диаметра в соответствии с определением выше. Особенно предпочтительными являются наночастицы, например, частицы с диаметром приблизительно от 100 нм до 10 мкм, более предпочтительно от 100 нм до 3 мкм, еще более предпочтительно от 300 нм до 1000 нм, например, 300 нм, 310 нм, 320 нм, 330 нм, 340 нм, 350 нм, 360 нм, 370 нм, 380 нм, 390 нм, 400 нм, 410 нм, 420 нм, 430 нм, 440 нм, 450 нм, 460 нм, 470 нм, 480 нм, 490 нм, 500 нм, 510 нм, 520 нм, 530 нм, 540 нм, 550 нм, 560 нм, 570 нм, 580 нм, 590 нм, 600 нм, 620 нм, 650 нм, 670 нм, 700 нм, 720 нм, 750 нм, 770 нм, 800 нм, 820 нм, 850 нм, 870 нм, 900 нм, 920 нм, 950 нм, 970 нм, 1000 нм или промежуточным значением. Еще более предпочтительными являются наночастицы, имеющие диаметр приблизительно 500 нм.

Предпочтительно, частицы в соответствии с настоящим изобретением функционализированы с первой связывающей молекулой или второй связывающей молекулой. Также специфическими вариантами осуществления настоящего изобретения рассматриваются частицы, дополнительно содержащие заряженную структуру, как описано в этом документе.

В особенно предпочтительном варианте осуществления материал является магнитным материалом. В дополнительных особенно предпочтительных вариантах осуществления объект, на котором представлена поверхностная структура, как определено в данном документе ранее, или к которому присоединена первая или вторая связывающая молекула в соответствии с настоящим изобретением является магнитной наночастицей.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения материал или частица, например, наночастица может являться суперпарамагнитными частицами, которые, как правило, диспергируются в водных растворах и сохраняют небольшой заряд, например, отрицательный или положительный заряд, или обладают некоторым дзета-потенциалом для обеспечения коллоидальной устойчивости, сохраняя частицы отделенными и избегая неспецифическую кластеризацию.

Настоящим изобретением предусмотрены по меньшей мере два типа частиц, а именно, первая и вторая частица.

Термин "первая частица", как он применяется в данном документе, относится к частице, описанной в данном документе, которая функционализирована первой связывающей молекулой. Первая связывающая молекула может являться любой молекулой, способной к специфическому связыванию с молекулой-мишенью-мишенью. Первая частица, таким образом, функционирует в качестве захватывающей частицы. Первая связывающая молекула может быть присоединена к поверхности опосредованно посредством длинной и жесткой линкерной молекулы, как определено в данном документе. Поверхность первой частицы может быть дополнительно модифицирована добавочными структурами, такими как заряженная структура, как описано в этом документе.

Термин "вторая частица", как это применяется в данном документе, относится к частице, описанной в данном документе, которая функционализирована со второй связывающей молекулой. Настоящим изобретением предусмотрено, что вторая частица содержит поверхностную структуру, как описано в этом документе, содержащую вторую связывающую молекулу. Также настоящим изобретением предусмотрено, что вторая частица может связываться с первой частицей посредством связывания молекулы-мишени. Вторая частица, таким образом, способна к связыванию с молекулой-мишенью посредством связывания второй связывающей молекулы. Предусмотренное связывание первой частицы, захватившей молекулу-мишень, со второй частицей, приводит к образованию кластера частиц, который может быть детектирован, как описано в этом документе. Количество кластеров частиц, следовательно, прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

Термин "связывающая молекула", как это применяется в данном документе, относится к любой молекуле, имеющей высокую аффинность связывания по отношению ко второй молекуле, т.е. партнеру по взаимодействию. Связывающая молекула в контексте настоящего изобретения, как правило, содержит связывающие или захватывающие группы, способные к связыванию специфической молекулы-мишени в соответствии с данным документом, такие как биомолекула или биомаркер, или способный к связыванию содержащей объект-мишень, такой, как например, вирус или клетка, или клеточный фрагмент или материал, полученный из ткани.

В особенно предпочтительном варианте осуществления связывающая молекула выбрана из группы, состоящий из аптамеров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, в частности комплементарных нуклеиновых кислот и молекулярно импринтированных полимеров, лигандов или рецепторов и лектинов, где связывающая молекула предпочтительно представляет собой антитело или его фрагмент или комплементарную нуклеиновую кислоту.

"Аптамер", как это используется применительно к связывающей молекуле, может являться короткой молекулой нуклеиновой кислоты, например, молекулой РНК, ДНК или ПНК или любым другим пригодным видом нуклеиновой кислоты, известным специалисту в данной области, при этом способным к связыванию с молекулой-мишенью, как определено в данном документе, предпочтительно с молекулой-мишенью из нуклеиновой кислоты, как определено в данном документе. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает пептидные аптамеры, т.е. аптамеры, которые способны к специфическому связыванию с (a) белком(ами), полипептидом(ами) или пептидом(ами), содержащим(ими) специфическую аминокислотную последовательность(и). Как правило, (a) пептидный(ые) аптамер(ы) является/являются вариабельной(ыми) пептидной(ыми) петлей(ями), содержащими, например, от 10 до 20 аминокислот. В контексте настоящего изобретения пептидный(ые) аптамер(ы) могут в конкретных вариантах осуществления быть присоединены одним или обоими концами к остовой структуре. Остовая структура может являться любой молекулой, предпочтительно белком, например, белком, который обладает свойством хорошей растворимости. Пригодные остовые молекулы известны специалисту в данной области. Примером пригодной остовой молекулы для применения в контексте настоящего изобретения является бактериальный белок тиоредоксин-A. Пептидная петля аптамера предпочтительно может быть встроена в восстанавливающий активный сайт остовой молекулы. Альтернативно, стафилококковый белок A и его домены и производные этих доменов, такие как белок Z или липокалины, могут быть использованы в качестве остовых структур в контексте настоящего изобретения. Нуклеиновая кислота или пептидные аптамеры могут быть получены в соответствии с любым пригодным способом, известным специалисту в данной области, например, посредством ПЦР или методами молекулярного синтеза или дрожжевыми двугибридными методами.

"Пептид" состоит из аминокислотных цепей. Пептид, как это применяется в контексте связывающей молекулы, может содержать или альтернативно состоять из отрезка из от 2 до 35 аминокислот, производных аминокислот или их смеси. Пептид может быть линейным, разветвленным, циклическим или их смесью. Молекула с пептидной аффинностью может также быть присоединена к остовой структуре, как определено в данном документе выше.

"Белок" представляет собой полимер из аминокислот, связанных пептидными связями, который может содержать одну полипептидную цепь или более чем одну полипептидную цепь, составленные вместе, как правило, биологически функциональным образом. Белок, как это применяется в отношении связывающей молекулы, может содержать или альтернативно состоять из отрезка из более чем приблизительно 35 аминокислот, производных аминокислот или их смеси. Белок может иметь линейную, разветвленную, циклическую форму или быть составлен из смеси этих форм. Белковая связывающая молекула может также быть присоединена к остовой структуре, как определено в данном документе выше.

"Олигонуклеотид", как это применяется в контексте связывающей молекулы, может содержать или альтернативно состоять из отрезка из приблизительно от 5 до 120 нуклеотидов, например, отрезка из 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов, предпочтительно из приблизительно от 15 до 60 нуклеотидов. Олигонуклеотидная связывающая молекула может предпочтительно являться РНК, ДНК или ПНК молекулой или их смесью. Предусмотрены связывающие молекулы, которые являются молекулами комплементарной нуклеиновой кислоты. Термин "молекула комплементарной нуклеиновой кислоты" относится к молекуле определенной последовательности, где одиночные нити являются комплементарными друг другу. В данной области известно, что комплементарные нити двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты имеют сильную аффинность друг к другу из-за образования спаривания оснований. Также предусмотрены одноцепочечные олигонуклеотидные последовательности, которые присоединены к или интегрированы в структуру линкерной молекулы, как определено в данном документе. В особенно предпочтительных вариантах осуществления такой пригодный линкер также содержит молекулу нуклеиновой кислоты. Одноцепочечный отрезок способен к распознаванию и гибридизации с целевой последовательностью комплементарного нуклеотида с высокой аффинностью. В таком анализе молекула-мишень содержит олигонуклеотид, который комплементарен или почти комплементарен связывающей молекуле.

Термин "молекулярно импринтированный полимер", как это применяется в данном документе, относится к полимеру, который был образован в присутствии молекулы, которая впоследствии экстрагируется, при этом оставляя комплементарные полости, как правило, молекулярно импринтированный полимер демонстрирует некоторую химическую аффинность к первоначальной молекуле. Молекулярно импринтированный полимер может быть составлен из любого пригодного полимерного блока, известного специалисту в данной области. Технологии их производства содержат технологии полимеризации, такие как объемная, осадительная, эмульсионная, суспензионная, дисперсионная, полимеризация и полимеризация гелеобразованием и многоэтапная полимеризация набуханием. Особенно предпочтительными являются способы иерархического импринтинга.

"Антитело", как это применяется по отношению к связывающей молекуле, относится к иммуноглобулиновым молекулам и иммунологически активным участкам молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулам, которые содержат антигенсвязывающий участок, который иммуноспецифически связывает антиген. Молекулы иммуноглобулинов по изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, lgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулинов. Антитела по настоящему изобретению могут быть описаны или специфицированы посредством эпитопа(ов) или участка(ов) молекулы-мишени, например, полипептида по настоящему изобретению который они распознают или специфически связывают. Специфические эпитопы и их взаимодействие с антителами известны специалисту в данной области. Термин "специфическое связывание", как это применяется в данном документе, относится к иммуноспецифическому детектированию и связыванию антитела с антигенным эпитопом. Термин "специфическое связывание" исключает неспецифическое связывание, но не обязательно исключает перекрестную реактивность с другими антигенами, в частности с антигенами, содержащими тот же антигенный эпитоп, детектируемый антителом по изобретению.

Антитело может являться поликлональным, моноклональным, мультиспецифическим, человеческим, гуманизированным или химерным антителом, одиночной цепью антитела или составлять Fab фрагмент, Fab' фрагмент, фрагмент, выработанный посредством экспрессионной библиотеки Fab, F(ab')₂, Fv, дисульфид связанный Fv, миниантителом, диателом, scFv, sc(Fv)₂, целой молекулой иммуноглобулина, иммунофармацевтическим средством на основе модульного белка малого размера (SMIP), слитым белком: связывающий домен - иммуноглобулин, камелизированным антителом, содержащее V_HH антитело, антиидиотипическое (anti-Id) антитело любого эпитоп-связывающего(их) фрагмента(ов) любого из приведенного выше. Наиболее предпочтительно антитела являются фрагментами антитела, связывающего человеческий антиген по настоящему изобретению и содержат Fab, Fab' и F(ab')₂, Fv, одноцепочечные Fvs (scFv), sc(Fv)₂, одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fvs (sdFv) и фрагменты, содержащие или VL, или VH домен.

Антитела в соответствии с изобретением могут иметь любое животное происхождение, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно, антитела являются человеческими, мышевидными (например, мышь и крыса), ослиными, обезьяньими, кроличьими, козьими, морской свинки, верблюжьими, лошадиными или куриными антителами.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или большей мультиспецифичности. Мультиспецифичные антитела могут являться специфическими к различным эпитопам молекулы-мишени, например, полипептид в соответствии с настоящим изобретением, или могут являться специфическими к обеим молекулам-мишеням, например, полипептид в соответствии с настоящим изобретением, а также и к гетерологичному эпитопу, такому как гетерологичный полипептид или материал твердой подложки. Предпочтительными являются моноспецифические антитела.

Термин "лиганд", как это применяется в данном документе, обычно относится к веществу, которое образует комплекс с молекулой-мишенью, такой как биомолекула, и может, таким образом, специфически связываться с молекулой с высокой связывающей аффинностью. В частности, лиганд может являться запускающей сигнал молекулой, способной к связыванию с сайтом на белке-мишени. Лиганд часто связывается партнером по связыванию, часто называемому рецептор. В данной области известны системы связывания рецептор-лиганд для применения в детектировании молекул-мишеней. Как правило, связывание лиганда с рецептором изменяет химическую конформацию, т.е. пространственную конфигурацию рецепторного белка. Конформационное состояние рецепторного белка определяет функциональное состояние рецептора. Пригодные лиганды в контексте настоящего изобретения могут содержать, к примеру, субстраты фермента, ингибиторы фермента, агонисты и антагонисты рецептора, активаторы, такие как ДНК-связывающие белки или нейротрансмиттеры.

Термин "лектин", как это применяется в данном документе, относится к белку или гликопротеину, способному к специфическому распознаванию и обратимому связыванию с углеводными группами комплекса гликоконъюгатов без изменения ковалентной структуры любого из распознанных гликозильных лигандов. Примеры пригодных лектинов в контексте настоящего изобретения содержат моновалентные лектины, подобные бактериальным и растительным токсинам, которые способны к связыванию сахарных групп в клеточных стенках или мембранах. Другие пригодные лектины, как это определяется по настоящему изобретению, являются связывающими маннозу лектинами, связывающими галактозу/N-ацетилгалактозамин лектинами, связывающими N-ацетилглюкозамин лектинами, связывающими N-ацетилнейраминовую кислоту лектинами или связывающими фукозу лектинами.

Термин "первая связывающая молекула", как это применяется в данном документе, относится к связывающей молекуле, как описано в этом документе, способной к специфическому связыванию с молекулой-мишенью в образце. Первая связывающая молекула может быть присоединена к поверхности частицы любым пригодным способом или любым пригодным образом, известными специалисту в данной области, посредством длинной и жесткой линкерной молекулы, как описано в этом документе.

Термин "присоединенный к поверхности частицы или плоской сенсорной поверхности", как это применяется в данном документе, относится к ковалентному или нековалентному связыванию или объединению первой связывающей молекулы или второй связывающей молекулы с поверхностью частицы. В частности, таким объединением может, к примеру, являться ковалентное связывание, связывание посредством силы Ван-дер-Ваальса или электростатическое связывание между слоями. Присоединение к поверхности может являться обратимым или может являться прекращаемым, например, изменением pH, температуры, концентрации ионов, освещением, ферментативной деградацией или ферментативным расщеплением и т.д.

Необходимо понимать, что или первые, или вторые связывающие молекулы присоединены к поверхности частицы или поверхности плоского сенсора посредством длинной и жесткой линкерной молекулы.

Это будет означать, что обе первая и/или вторая связывающая молекулы, могут быть объединены длинными и жесткими линкерными молекулами, как определено в данном документе далее. Настоящим изобретением предусмотрено предоставление некоторого расстояния между первой частицей и второй частицей или между первой частицей и плоской поверхностью сенсора. Специалисту в данной области незамедлительно признает, что для этой цели по меньшей мере одна связывающая молекула должна быть объединена с длинным и жестким линкером для того, чтобы обеспечить предусмотренную среднюю протяженность удлинения. К примеру, если первая связывающая молекула объединена с длинной и жесткой линкерной молекулой, то вторая связывающая молекула может являться непосредственно присоединенной к поверхности второй частицы или плоской сенсорной поверхности. Если вторая связывающая молекула обеспечена длинным и жестким линкером, то первая связывающая молекула может являться непосредственно присоединенной к поверхности первой частицы. Также возможно, чтобы обе первая и вторая связывающая молекула были обеспечены длинными и жесткими линкерами для того, чтобы установить предпочтительное расстояние. В контексте настоящего изобретения необходимо понимать, что следует избегать состояние, изображенное на фиг. 12 (панель справа), где обе первая и вторая связывающая молекула не обеспечены линкерной структурой, так как такое построение приведет в результате только к минимальной средней протяженности удлинения, как определено в данном документе, которая была бы недостаточной для достижения предусмотренного увеличения кинетики связывания.

В конкретных вариантах осуществления первая связывающая молекула присоединена к поверхности частицы посредством длинной и жесткой линкерной молекулы. В дополнительном специфическом варианте осуществления вторая связывающая молекула не присоединена к поверхности частицы посредством длинной и жесткой линкерной молекулы.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения объединение, связывание или присоединение первой и/или второй связывающей молекулы к частице, например, магнитной частице или поверхности частицы или поверхности плоского сенсора, может являться прямым или непрямым связыванием.

Термин "прямое связывание", как это применяется в данном документе, означает, что первая связывающая молекула имеет непосредственное соединение с частицей, например, магнитной частицей, без наличия посредника, мостиковых или соединительных молекул или функциональных элементов.

Термин "непрямое связывание", как это применяется в данном документе, означает, что связывающая молекула не является напрямую присоединенной к поверхности частицы, например, магнитной частицы, но может являться ненапрямую связанной через дополнительные опосредующие, мостиковые или соединительные молекулы такие как, к примеру, другие связывающие молекулы, линкерные молекулы или заряженные структуры. К примеру, авидин, производные стрептавидина, (стрепт)авидин, родственные авидину белки, подобные авидину объекты, такие как тамавидин 1 и 2, брадавидин, нейтравидин и т.д., могут быть использованы в качестве соединителя между частицей, например, магнитная частица и взаимодействующая молекула, которая содержит совместимую связывающую группу, такую как биотин.

В характерном варианте осуществления частица, например, магнитная частица может быть покрыта или на нее может быть нанесен авидиновый или стрептавидиновый соединитель. Дополнительными предпочтительными примерами взаимодействующих пар, пригодных в качестве соединительных молекул являются биотин/авидин, любая пара антитело/антиген, например, антитело против FITC, FITC, антитело против техасского красного/техасский красный, анти-дигоксигенин/дигоксигенин и комплементарные нити нуклеиновой кислоты, как упомянуто в данном документе выше. Настоящим изобретением предусмотрено в частности применение комплементарных нитей нуклеиновой кислоты по причине высокой степени мультиплексирования благодаря почти неограниченным специфическим комбинациям. Специалисту в данной области следует принимать во внимание, что такие соединительные молекулы, которые состоят из или содержат последовательность нуклеиновой кислоты могут быть легко интегрированы в линкерную структуру.

"Поверхностная структура" в соответствии с настоящим изобретением может являться любой структурой, содержащей молекулы или сетчатую структуру молекул, пригодные для покрытия поверхности, такой как поверхность плоского сенсора или поверхность частицы. Предусмотренная поверхностная структура, таким образом, служит для распознавания, связывания и дальнейшего детектирования первых частиц, захвативших молекулу-мишень.

"Плоский сенсор", как это используется в этом документе, определяет площадь, на которой происходит или детектируется фактическое сенсорное событие. Как правило, плоский сенсор расположен на дне контейнера для образца. Плоский сенсор может служить для детектирования количества связанных частиц, которое прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образцах. Примеры таких плоских сенсоров и соответствующих сенсоров, которые могут быть применены в контексте настоящего изобретения, предоставлены в Bruls et al., 2009, Lab Chip, 9, 3504-3510.

Термин "вторая связывающая молекула", как это применяется в данном документе, относится к связывающей молекуле, которая включена в поверхностную структуру и которая напрямую или ненапрямую присоединена к поверхности плоского сенсора, как описано в данном документе, или поверхности второй частицы, как описано в этом документе. Вторая связывающая молекула может быть того же типа молекулы, что и первая связывающая молекула или может являться другой молекулой. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения первая и вторая связывающая молекула являются молекулами одинакового типа или класса молекул. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вторая связывающая молекула является антителом или его фрагментом, предпочтительно антителом, как определено в данном документе выше. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения второй связывающий белок способен к специфическому распознаванию и связыванию с молекулой-мишенью в образце, однако в другом сайте связывания или эпитопе молекул-мишеней, чем распознаваемый первой связывающей молекулой. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления вторая связывающая молекула может являться вторым антителом, например, антителом, как определено в данном документе выше, которое распознает первую связывающую молекулу, например, первое антитело, которое может являться антителом, как определено в данном документе выше.

Термин "указанная первая частица способна к связыванию указанной второй связывающей молекулы поверхности напрямую или ненапрямую", как это применяется в данном документе, означает, что первая частица, которая функционализирована первой связывающей молекулой, связывается со второй связывающей молекулой посредством связывания с молекулой-мишенью. В отличие от этого, считается, что любое другое связывание первой частицы с поверхностной структурой, которое не опосредовано молекулой-мишенью в соответствии с данным документом является неспецифическим связыванием.

"Прямое связывание" в этом контексте, таким образом, означает, что первая связывающая молекула, которая действует как захватывающая молекула, распознает и связывает молекулу-мишень, посредством этого образуя захватывающий комплекс, который в свою очередь связывается и распознается второй связывающей молекулой поверхностной структуры. В этом смысле "непрямое связывание" означает, что первая частица связана посредством одного или нескольких захватывающих комплексов со второй связывающей молекулой. Также возможно, чтобы несколько агрегатов или комплексов молекула-мишень - связывающая молекула опосредовали непрямое связывание первой частицы со второй связывающей молекулой поверхностной структуры, тогда как связывание все еще не считается специфическим, так как оно опосредовано молекулой-мишенью.

Термин "линкерная молекула", как описано в данном документе, может являться любой структурой, пригодной для обеспечения присоединения первой связывающей молекулы и/или второй связывающей молекулы к поверхности. Специалисту известны средства и способы для объединения линкерных молекул с поверхностью частицы или плоской поверхностью сенсора. В соответствии с дополнительным специфическим вариантом осуществления настоящего изобретения увеличенное расстояние от конца до конца, требуемое для улучшенной кинетики связывания, как описано в данном документе, может быть достигнуто обеспечением поверхностной структуры поверхности плоского сенсора линкерной молекулой, имеющей достаточно протяженное среднее удлинение.

С этой целью поверхность и/или линкерная молекула может содержать якорную группу, способную к соединению линкерной к поверхности. Под "якорной группой", как это применяется в данном документе, необходимо понимать соединитель между линкерной молекулой в соответствии с данным документом и поверхностью или одной или более поверхностных молекул напрямую на поверхности частицы. Особую значимость, таким образом, имеет любая мостиковая или соединительная молекула, как описано в этом документе. К примеру, авидин, производное стрептавидина, (стрепт)авидин, родственные авидину белки, подобные авидину объекты, такие как тамаавидин 1 и 2, брадавидин, нейтравидин и т.д., могут быть использованы для заякоривания линкерной молекулы и поверхности или поверхностной структуры, как описано в этом документе. К примеру, якорная группа может содержать биотин, тогда как поверхность являться покрытой или функционализированной стрептавидином. Средство и способы для покрытия поверхности стрептавидином известны специалисту или могут быть получены из пригодных руководств или литературных источников.

Дополнительными предпочтительными примерами взаимодействующих пар, пригодных в качестве соединительных молекул для заякоривания являются биотин/авидин, любая пара антитело/антиген, например, антитело против FITC, FITC, антитело против техасского красного/техасский красный, анти-дигоксигенин/дигоксигенин, комплементарные нити нуклеиновой кислоты, как упомянуто в данном документе выше. Якорная группа может также содержать комплементарные нити нуклеиновой кислоты по причине высокой степени мультиплексирования благодаря почти неограниченным специфическим комбинациям. Специалисту в данной области также следует иметь в виду, что такие соединительные молекулы, которые состоят из последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть легко интегрированы в линкерную структуру.

Также настоящим изобретением предусмотрены якорные группы, содержащие или состоящие из химической группы, которая может быть ковалентно связанной (например, поперечно связанной) объединяющей химической структурой с поверхностью или молекулой, связанной с поверхностью. Поперечное связывание представляет собой процесс химического соединения двух или более молекул ковалентной связью и часто называется биоконъюгация. Как правило, поперечно связывающие реагенты (или кросслинкеры) являются молекулами, которые содержат два или более реактивных конца, способных к химическому присоединению к специфическим функциональным группам белков или других молекул, таких как белковые функциональные группы, например, первичный амин (-NH2), карбоксилы (-COOH), сульфгидрилы или карбонилы (-CHO), или кросс-линкерные реактивные группы, такие как карбодиимид (например, EDC), NHS эфир, имидоэфир, PFP эфир, гидроксиметил фосфин, малеимид, галогенацетил (бром- или йод-), пиридилдисульфид, винилсульфон, гидразид, диазирин, арилазид или изоциантат.

Также настоящим изобретением предусмотрено, что линкерная молекула имеет некоторую длину, для того чтобы действовать в качестве спейсерной молекулы, т.е. для обеспечения некоторого расстояния между связывающей молекулой и поверхностью частицы. Очевидно, что предоставление такого расстояния может обеспечить несколько других преимуществ:

К примеру, некоторое расстояние может привести в результате к менее неспецифическому связыванию частиц с другими молекулам и друг с другом. Кроме того, неспецифическая кластеризация частиц, например, магнитных частиц, которая обычно происходит,about://@p0ZP0sx0NwpV0Wu0hdw0Gmpt0sI0DapP0Ex03wp20W00Dmp50sM0Ia0a0ja0bmpt0j50MapV0jd0jmmcp011 может быть минимизирована.

Линкерные молекулы в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, могут иметь функцию соединительной молекулы и/или функцию спейсера. С этой целью эти полимерные молекулы предпочтительно имеют некоторую длину, прочность и/или жесткость для того, чтобы быть способными действовать как полимерные волокна.

Также настоящим изобретением предусматривается применение полимеров, которые собираются в волокна, например, димеризацией или мультимеризацией более высокого порядка. Предусмотренное преимущество заключается в том, что жесткость в соответствии с данным документом может быть повышена. Также предусмотрено применение "вспомогательных молекул", которые помогают установить структуру более высокого порядка, имеющую предусмотренную жесткость, которая в свою очередь приводит в результате к предусмотренной средней протяженности удлинения линкера. Одним предусмотренным примером является молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты, которая может собираться в димерную спиральную структуру, которая, в свою очередь, может собираться со вспомогательной молекулой. Другими предусмотренными примерами вспомогательных молекул являются белки, способные к связыванию нуклеиновых кислот, таких как оцДНК, дцДНК или обе (например, ДНК связывающие белки) или оцРНК, дцРНК или обе (например, РНК-связывающие белки). Связывание таких факторов или белков может предпочтительно направляться специфическими мотивами связывания, распознаваемыми связывающим белком, который может быть представлен в молекуле нуклеиновой кислоты, например, дцДНК или оцДНК или оцРНК. Так как такие факторы связывания связаны на молекуле нуклеиновой кислоты, жесткость линкера может быть увеличена и это приведет к линкерам с повышенной средней протяженностью удлинения. Такая модификация линкера может быть осуществлена перед или во время анализа. В дополнительных специфических вариантах осуществления настоящего изобретения вспомогательные молекулы, такие как РНК или ДНК связывающие белки, могут содержать домены взаимодействия белок-белок, например, SH3, PDZ, 14-3-3, SH2 домены или любой другой пригодный домен, известный специалисту в данной области. Вторичные факторы связывания, которые содержат совместимые домены распознавания или домены взаимодействия, могут быть соответственно обеспечены, позволяя сборку комплексов, содержащих нуклеиновые кислоты, связанные вспомогательными молекулами, которые в свою очередь могут быть связаны вторичными взаимодействующими молекулами. В дополнительных вариантах осуществления жесткие линкерные структуры могут быть предоставлены в форме полимерных полипептидов, например, на основании формы и/или молекулярной идентичности коллагена или подобных коллагену белков, таких как Sel1, Scl2, SclA или SclC. Эти молекулы могут дополнительно быть комбинированы с другими линкерными молекулами или функциональными группами, как определено в данном документе.

В дополнительных специфических вариантах осуществления настоящего изобретения полимерные линкерные молекулы могут являться полимерными молекулами, способными к самосборке при подходящих условиях. Соответственно, полимерные молекулы могут быть предоставлены в сочетании с частицами, приводящими к сборке полимеров на поверхности частицы. Самосборка может регулироваться пригодными параметрами, например, концентрацией мономеров или полимерных блоков, необходимых для полимеризации, концентрацией мостиковых факторов для мономеров или полимерных блоков, pH реакционной среды, температурой, наличием ионов, наличием вспомогательных факторов, таких как белки и т.д. Самособранные полимеры могут в дополнительных вариантах осуществления быть дезинтегрированы при изменении такого подходящего условия, например, изменение pH, снижение или увеличение концентрации факторов или мономеров, изменение температуры и т.д.

Также возможно, чтобы линкерная молекула содержала или состояла из заряженной структуры в соответствии с данным документом или была интегрирована в пространственную поверхностную структуру, как описано в этом документе.

В дополнительных специфических вариантах осуществления настоящего изобретения линкерные молекулы могут являться линейными, циклическими или подобными разветвленным молекулами или их смесью.

Пригодные линкерные молекулы в контексте настоящего изобретения могут являться, к примеру, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеиновыми кислотами, пептидами, полипептидами, белками, углеводами, липидами, полиэтиленгликолем, полисахаридами, дендримерами, дендронами, нанотрубками или любым пригодным производным или их комбинациями.

Молекулы нуклеиновой кислоты, как определено в данном документе ранее, могут также преимущественно быть применены в качестве "линкерных молекул из нуклеиновой кислоты". Такие линкерные молекулы могут содержать одиночные и/или двухцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы ДНК или любой тип их производного. ДНК может, к примеру, быть в форме, например, A-ДНК, B-ДНК или Z-ДНК или любой смеси этих форм. Линкерная молекула может также являться молекулой ПНК, ЦНК, ГНК, ЗНК или АНК или любой смесью или их комбинацией, или любой смесью, или комбинацией с другой линкерной молекулой, как определено в данном документе, например, с любым типом нуклеиновой кислоты, таким как ДНК или РНК.

Термин "ПНК" относится к пептидной нуклеиновой кислоте, т.е. искусственно синтезированному полимеру, подобному ДНК или РНК, который применен в биологическом исследовании и терапевтических способах лечения, но который не встречается в природе. Остов ПНК, как правило, составлен из повторяющихся N-(2-аминоэтил)-глициновых звеньев, связанных пептидными связями. Различные пуриновые и пиримидиновые основания связаны с остовом метиленкарбонильными связями. ПНК обычно изображаются как пептиды, с N-концами в первом (слева) положении и C-концом справа. В то время как ДНК и РНК имеют дезоксирибозный и рибозный сахарный остов, соответственно, ПНК-остов составлен из повторяющихся N-(2-аминоэтил)-глициновых звеньев, связанных пептидными связями. В данной области известно, что олигомеры ПНК также демонстрируют большую специфичность связывания с комплементарными ДНК. Дополнительные подробности могут быть получены из любого пригодного литературного источника или руководства, например, Nielsen PE, Egholm M (1999), An Introduction to Peptide Nucleic Acid, Curr. Issues Mol. Biol. 1 (2): 89-104.

Термин "ЦНК" относится к такой нуклеиновой кислоте, как аминоциклогексилэтановая кислота. Кроме того, термин относится к циклопентановой нуклеиновой кислоте, т.е. молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей, например, 2'-дезоксикарбагуанозин.

Термин "ГНК" относится к гекситным нуклеиновым кислотам, т.е. аналогам ДНК, которые построены из стандартных нуклеооснований и фосфорилированного 1,5-ангидрогекситного остова.

Термин "ЗНК" относится к закрытым нуклеиновым кислотам. Как правило, закрытая нуклеиновая кислота является модифицированной и таким образом является недоступным РНК нуклеотидом. Рибозная группа нуклеотида ЗНК может быть модифицирована дополнительным мостиком, соединяющим 2' и 4' атомы углерода. Такой мостик закрывает рибозу в 3'-эндо структурной конформации. Закрытая конформация рибозы улучшает укладывание оснований и предорганизацию остова. Это может значительно повысить термическую устойчивость, т.е. температуру плавления олигонуклеотида.

Термин "АНК" относится к арабиновым нуклеиновым кислотам или их производным. Предпочтительным производным АНК в контексте настоящего изобретения является 2'-дезокси-2'-фтор-бета-D-арабинонуклеозид (2'F-ANA).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкерная молекула из нуклеиновой кислоты может быть представлена в двухнитевой или дуплексной форме, т.е. содержащей цепь и комплементарную или антипараллельную противоположную нить молекулы нуклеиновой кислоты, ассоциированные спариванием оснований между нитями или смысловой или антисмысловой нитью молекулы нуклеиновой кислоты. Термин "смысловая нить", как это применяется в данном документе, относится к молекуле, содержащей последовательность, которая является такой же, как копия матричной РНК, которая является транслированной или может быть транслирована в белок. Термин, в контексте настоящего изобретения, дополнительно относится к молекулам, содержащим одну цепь дуплексной молекулы нуклеиновой кислоты, которая не идентична ее комплементарной противоположной нити. Соответственно, термин "антисмысловая нить", как это применяется в данном документе, относится к молекуле, содержащей комплементарную или противостоящую цепь по отношению к смысловой цепи, определенной выше. В дополнительных специфических вариантах осуществления линкерная молекула из нуклеиновой кислоты может быть двухцепочечной или дуплексной молекулой рибонуклеиновой кислоты. Альтернативно, линкерная молекула из нуклеиновой кислоты может содержать одноцепочечную нуклеиновую кислоту или молекулу одноцепочечной рибонуклеиновой кислоты.

В конкретных вариантах осуществления линкерная молекула является молекулой рибонуклеиновой кислоты или любой смесью рибонуклеиновой кислоты с любой другой упомянутой молекулой нуклеиновой кислоты или с любой другой линкерной молекулой, как определено в данном документе, предпочтительно с молекулой РНК или любым типом ее производного. РНК может быть в форме, например, п-РНК, т.е. пиранозил-РНК, или в структурно модифицированных формах, подобных шпилечной РНК или РНК "петля-на-стебле".

Нуклеиновая кислота, включая молекулы рибонуклеиновой кислоты, может иметь различные композиции оснований и/или длины, как определено в данном документе. Длина линкерной молекулы может являться зависимой от размера или диаметра частицы, наличия, размера или длины молекул с заряженной структурой, как определено в данном документе, предусмотренного общего специфического результирующего заряда частицы, в частности так как молекулы нуклеиновой кислоты при применении в качестве линкеров могут обеспечивать специфический результирующий заряд у частицы, любого предусмотренного расстояния между концами связывающей молекулы и поверхности частицы или любой предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкерная молекула из нуклеиновой кислоты может являться заряженной или незаряженной молекулой. Термин "незаряженная линкерная молекула из нуклеиновой кислоты", как это применяется в данном документе, относится к результирующему заряду молекулы приблизительно 0.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула представляет собой или содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из двухцепочечной или дцДНК, двухцепочечной или дцРНК, ПНК, дуплекса ПНК-ДНК и дуплекса РНК-ДНК.

Один преимущественный аспект, который также предусмотрен дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, заключается в том, что ПНК и дуплексы ПНК/ДНК или ПНК/ДНК не являются легко распознаваемыми как нуклеазой, так и протеазами, что делает их устойчивыми к ферментативной деградации.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения пригодные нуклеиновые кислоты могут также содержать или состоять из одноцепочечных молекул ДНК с различными композициями оснований и/или длинами. Одноцепочечные молекулы могут, к примеру, охватывать повторение последовательности оснований, являться полностью рандомизированными или являться полученными из природы или быть только из одного основания, например, AAA и т.д., TTT и т.д., CCC и т.д. или GGG и т.д.; или содержать отрезки из таких одноосновных участков, например, быть составленными только из A и C или С и T.

Пептиды, полипептиды или белки могут являться пригодными линкерами благодаря их форме, жесткости и конформации. Линкеры из пептидных молекул могут иметь различные аминокислотные композиции и/или длины. Длина линкера из пептидной молекулы может варьироваться от приблизительно 3 аминокислот до приблизительно 35 аминокислот. Также предусмотрены другие длины или любое значение длины в указанном диапазоне. Пептидная линкерная молекула может, к примеру, иметь длину 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или более аминокислот. Аминокислотная композиция может варьироваться между моноаминокислотными композициями, например, только одна из вырабатываемых в природе аминокислот или любое ее производное или из синтетически доступных аминокислот и полностью рандомизированных аминокислотных композиций, содержащих или выбранных из всех известных аминокислот. Также предусмотрены композиции, содержащие 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 или более различных аминокислот. Аминокислоты могут быть представлены в отрезках идентичных аминокислот или быть предоставлены в форме модели или мотивов или являться случайно распределенными.

Длина пептидных молекул в линкерной молекуле может в конкретных вариантах осуществления зависеть от размера или диаметра частицы, наличия, размера или длин молекул с заряженной структурой в соответствии с данным документом, предусмотренного специфического результирующего заряда частицы, в частности так как пептидные молекулы при применении в качестве линкеров могут обеспечивать специфический результирующий заряд частицы, любого предусмотренного расстояния между концами связывающих молекула и поверхности частицы или любой предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пептидная линкерная молекула может быть заряженной или незаряженной молекулой. Термин "незаряженная пептидная линкерная молекула", как это применяется в данном документе, относится к результирующему заряду молекулы приблизительно 0.

Белковые или полипептидные линкерные молекулы могут иметь различные аминокислотные композиции и/или длины. Длина белковой или полипептидной молекулы может варьироваться от приблизительно 35 аминокислот до приблизительно 500 аминокислот или более. Также предусмотрены другие длины или любое значение длины в указанном диапазоне. Пептидная молекула может, к примеру, иметь длину 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 140, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450 или 500 аминокислот или более.

Длина белковой или полипептидной линкерной молекулы может в конкретных вариантах осуществления зависеть от размера или диаметра частицы, наличия, размера или длины молекулы с заряженной структурой, как определено в данном документе выше, предусмотренного общего специфического результирующего заряда частицы, в частности так как белковые или полипептидные молекулы при применении в качестве линкеров могут обеспечивать специфический результирующий заряд у частицы, любого предусмотренного расстояния между концами связывающей молекулы и поверхности частицы или любой предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептидная или белковая линкерная молекула может являться заряженной или незаряженной молекулой. Термин "незаряженная полипептидная или белковая молекула", как это применяется в данном документе, относится к результирующему заряду молекулы приблизительно 0.

"Углеводные молекулы" могут являться пригодными линкерами благодаря их форме, жесткости и конформации. Такие углеводы могут иметь различные композиции и/или длины. Длина молекулы может варьироваться от приблизительно 5 атомов С до приблизительно 100 атомов С или более. Также предусмотрены другие длины или любое значение длины в указанном диапазоне. Углеводная молекула может, к примеру, иметь длину 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 атомов С или любое другое количество атомов С между указанными значениями.

Длина углеводной линкерной молекулы может в конкретных вариантах осуществления зависеть от размера или диаметра частицы, наличия, размера или длины молекул с заряженной структурой, как определено в данном документе, предусмотренного общего специфического результирующего заряда частицы, в частности так как углеводная молекула при применении в качестве линкеров может обеспечивать специфический результирующий заряд у частицы, любого предусмотренного расстояния между концами связывающей молекулы и поверхности частицы или любой предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения углеводная линкерная молекула может быть заряженной или незаряженной молекулой. Термин "незаряженная углеводная молекула", как это применяется в данном документе, относится к результирующему заряду молекулы приблизительно 0.

"Липиды" могут являться пригодными линкерными молекулами благодаря их форме, жесткости и конформации. Липиды составляют обширную группу встречающихся в природе молекул, включая, но не ограниченных этим, жиры, воски, стиролы, жирорастворимые витамины (такие как витамины A, D, E и K), моноглицериды, диглицериды, фосфолипиды. Такие липиды, как правило, построены из липидного хвоста и головной группы. Примеры пригодных липидов содержат фосфолипиды, например, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, яичный фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилэтаноламин. Особенно предпочтительными являются фосфолипиды MPPC, DPPC, DPPE-PEG2000 или Liss Rhod PE. Липиды могут иметь различные композиции и/или длины. Длина молекулы может варьироваться от приблизительно 5 атомов С до приблизительно 100 атомов С или более. Также предусмотрены другие длины или любое значение длины в указанном диапазоне. Липидная молекула может, к примеру, иметь длину приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 атомов С или любое другое количество атомов С между указанными значениями.

Длина липидной линкерной молекулы может в конкретных вариантах осуществления зависеть от размера или диаметра частицы, наличия, размера или длины молекул с заряженной структурой, как определено в данном документе, предусмотренного общего специфического результирующего заряда частицы, в частности так как липидные молекулы при применении в качестве линкеров могут обеспечивать специфический результирующий заряд у частицы, любого предусмотренного расстояния между концами связывающей молекулы и поверхности частицы или любой предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения липидная спейсерная молекула может быть заряженной или незаряженной молекулой. Термин "незаряженная липидная молекула", как это применяется в данном документе, относится к результирующему заряду молекулы приблизительно 0.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления линкерная структура может также содержать или состоять из небиологического полимера. Термин "небиологический полимер", как это применяется в данном документе, относится к полимеру, который получен не из биологического источника (биополимер) и является химически синтезированным. Пригодные полимеры для этой цели уже были описаны в данной области (например, Ratner, B.D.; Hoffman, A.S.; Schoen, F.J.; Lemons, J.E., Biomaterials Science, 2nd Ed.; Eds.; Elsevier: London, 2004). Примерами пригодных небиологических полимеров являются биологически-разлагаемые полимеры, такие как поли(гликолевая кислота) (PGA) или поли(молочная кислота) (PLA), поли(капролактон) (PCL, поли(N-винил-2-пирролидон) (PVP, ПВП), полидиоксанон (PDS) или поли(этиленгликоль) (PEG, ПЭГ) или их сополимеры, также обозначаемые как гетерополимеры, которые получены из двух (или более) видов мономерных групп. Термин "блок-полимер", как это применяется в данном документе, относится к сополимерам, содержащим две или более гомополимерных субъединиц, связанных ковалентными связями. Блок-сополимеры с двумя или тремя различными блоками называются диблок-сополимеры и триблок-сополимеры, соответственно. Предпочтительные блок-сополимеры содержат, но не ограничены этим поли(лактид-гликолид) сополимеры (PLGA), поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид) (PEP-PPO) поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид) поли(этиленоксид) (PEP-PPO-PEO), поли(этиленоксид)-блок-поли(L-лактид) (PEG-PLLA), поли(этиленоксид)-блок-поли(капролактон) (PEG-PCL), поли(этиленгликоль)-блок-поли(α-гидроксикислота) (PEG-PHA) или Плюроник P-105.

Полиэтиленгликолевые молекулы могут в частности быть применены в качестве "полиэтиленгликолевых линкерных молекул" в контексте настоящего изобретения благодаря их форме, потенциальной жесткости и конформации. Полиэтиленгликоли, предусмотренные настоящим изобретением, могут иметь различные композиции и/или длины. Предпочтительные варианты полиэтиленгликоля (ПЭГ) содержат полидисперсные или монодисперсные молекулы ПЭГ. Особенно предпочтительным является монодисперсный ПЭГ. ПЭГ дополнительно могут являться разветвленными, например, имеющими 3-10 ПЭГ цепей, выходящих из центральной внутренней группы, являться звездообразными ПЭГ, имеющими от 10 до 100 ПЭГ цепей, выходящих из центральной внутренней группы, или являться гребневидными ПЭГ, которые имеют многочисленные ПЭГ цепи трансплантированные в другой полимер или линейный ПЭГ остов. В соответствии со средними молекулярными массами ПЭГ, предусмотренные ПЭГ могут представлять собой ПЭГ 10000, ПЭГ 12000, ПЭГ 15000, ПЭГ 20000 или ПЭГ, имеющие более высокие молекулярные массы. Особенно предпочтительным является ПЭГ больше, чем ПЭГ 10000.

Более маленькие молекулы ПЭГ такие как, к примеру, ПЭГ 400, ПЭГ 600, ПЭГ 800, ПЭГ 1000, ПЭГ 1500, ПЭГ 2000, ПЭГ 3350, ПЭГ 4000, ПЭГ 6000 или ПЭГ 8000 могут также быть применены в качестве части линкерной структуры, например, в комбинации с одной или более линкерных молекул, как определено в данном документе.

Длина полиэтиленгликолевой линкерной молекулы может в конкретных вариантах осуществления являться зависимой от размера или диаметра частицы, наличия, размера или длины молекул с заряженной структурой, как определено в данном документе, или предусмотренного специфического результирующего заряда частицы, в частности, если применяются производные полиэтиленгликолевой молекулы, которые несут электрические заряды, или любого предусмотренного расстояния между концами связывающей молекулы и поверхности частицы или любой предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полиэтиленгликолевая линкерная молекула, в частности их производное или его модифицированная версия, может быть заряженной или незаряженной молекулой. Термин "незаряженная полиэтиленгликолевая молекула", как это применяется в данном документе, относится к результирующему заряду молекулы приблизительно 0.

"Дендримеры" или "дендримерные линкерные молекулы" могут являться любыми многократно разветвленными, приблизительно сферическими крупными молекулами. Такие дендримеры могут иметь различные композиции и/или длины, и/или степень ветвления. Длина может являться зависимой от предусмотренного общего специфического результирующего заряда, предусмотренного расстояния от конца до конца цепи между связывающей молекулой и поверхностью частицы, предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы и/или предусмотренного количества заряженных молекул в расчете на частицу. Дендримеры, как предусматривается настоящим изобретением, могут содержать разновидности с низкой молекулярной массой или высокой молекулярной массой. Дендримеры в соответствии с настоящим изобретением являются предпочтительно незаряженными, т.е. молекулами, демонстрирующими результирующий заряд 0.

Также настоящим изобретением предусматривается применение дендримеров в соответствии с настоящим изобретением в качестве части линкера. Для этой цели дендримеры могут в некоторых вариантах осуществления содержать функциональные группы на молекулярной поверхности, например, гидрофильные группы или альтернативно иметь внутренние функциональные группы. Дендримеры, как предусмотрено в целях настоящего изобретения, могут являться дендримерами 1-го, 2-го, 3-го, 4-го или более высокого поколения. Предпочтительные дендримеры содержат, к примеру, дендример Ньюкома или арборол и полиамидоамин (РАМАМ). Специалисту в данной области следует иметь в виду, что дендримеры приводят к структурам, которые могут быть преимущественно использованы для обеспечения объемной и пространственной поверхностной структуры на поверхности частицы или плоской поверхности, где линкерная молекула, как описано выше в данном документе, является частью такой структуры или внедрена в нее. Дополнительные варианты для применения в контексте настоящего изобретения, также как и способы синтеза и т.д., должны быть известны специалисту в данной области или доступны в подходящих документах, таких как "Dendrimers and other dendritic polymers", Frechet and Tomalia, J. Wiley.

Термин "дендроны" или "дендронные линкерные молекулы" подразумевается как, содержащий одиночные химически доступные группы дендримеров, т.е. фокальная точка дендримера, как определено в данном документе выше. Дендроны в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно являются незаряженными, т.е. молекулы демонстрируют результирующий заряд 0. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения дендроны могут быть использованы в качестве части линкера, как определено в данном документе.

Термин "нанотрубка", как это применяется в данном документе, относится к карбоновым нанотрубкам, т.е. аллотропам углерода с цилиндрической наноструктурой. Такие нанотрубки могут являться одностенными нанотрубками или многостенными нанотрубками. Настоящее изобретение также предусматривает линкерные молекулы фуллеренового структурного семейства различных типов, форм и комплексности, например, сферические или эллипсоидные бакибольные формы, бакибольный фуллерен или комбинация нанотрубок с бакиболами и т.д. Нанотрубки в соответствии с настоящим изобретением или другие пригодные линкерные молекулы, известные специалисту в данной области, являются предпочтительно незаряженными, т.е. молекулы демонстрируют результирующий заряд 0.

Линкерная молекула в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет некоторую длину и консистенцию для того, чтобы проявлять способность повышения вероятности связывания частицы с поверхностью с получением в результате усовершенствованной кинетики связывания. В предшествующем уровне техники линкер или спейсеры рассматривались только для соединения связывающей молекулы с поверхностями и с точки зрения доступности связывающей молекулы. Однако, длина линкера, в особенности относительно максимального удлинения от частицы, не была описана ранее. Следовательно, данной заявкой предусмотрено предоставление пригодных линкерных молекул, имеющих некоторую длину, которая пригодна для отдаления точки присоединения связывающейся молекулы в соответствии с данным документом дополнительно от поверхности частицы или плоской сенсорной поверхности. Как видно на фиг.4, предусмотренный подход делает доступным увеличенное количество ориентаций, в которых частица может связываться с поверхностью.

Таким образом, также настоящим изобретением предусматривается частица, как определено в данном документе, где захватывающая или связывающая молекула присоединена к поверхности частицы посредством линкерной молекулы, имеющей некоторую среднюю протяженность удлинения, как определено в данном документе. В конкретном примере настоящего изобретения применение длинной и жесткой молекулы дцДНК в качестве линкера приводит в результате к значительному среднему удлинению связывающей молекулы от поверхности. Предусмотренный подход приводит в результате к значительному улучшению кинетики связывания частицы с плоским сенсором или поверхностью частицы, как определено в данном документе. Как можно понять по фиг.6 и 7, можно продемонстрировать, что количество связанных частиц является функцией длины линкера. В этих примерах покрытые стрептавидином 500 нм и 1000 нм частицы инкубировали с линкером из дцДНК варьирующейся длины. Каждая линкерная молекула из дцДНК содержала одну молекулу биотина на одном конце и одну молекулу техасского красного на другом конце, и поверхность плоского сенсора была покрыта антителами против техасского красного. Графики в соответствии с фиг.6 и 7 демонстрируют возрастание количества связанных частиц с возрастанием длины (п.о.) линкерной молекулы из дцДНК. Оптимальная длина более 700 п.о. для 500 нм частиц соответствует контурной длине более 240 нм и средней протяженности удлинения более 140 нм. Как можно увидеть на фиг.7, оптимальная длина линкера составляет 1000 п.о., что соответствует контурной длине 340 нм для большей частицы (например, 1000 нм) и средней протяженности удлинения приблизительно 170 нм. Оптимальная длина линкера, таким образом, зависит от размера частицы и может в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения быть приведена в соответствие с размером частицы или диаметром частицы, например, на основании экспериментальных результатов, описанных в разделе примеры в данном документе далее.

Термин "средняя протяженность удлинения", как это применяется в данном документе, определяется как корень квадрата среднего расстояния от конца до конца цепи линкера √<R²>, который может быть описан в соответствии с моделью червеобразной цепи макромолекулы как:

<R²>=2Pl[1-(P/l)(1-e^-l/P)],

в которой P является персистентной длиной полимера и l является контурной длиной линкера.

Термин "контурная длина", как это применяется в данном документе, относится к контурной длине полимерной цепи, в качестве длины при максимуме физически возможного удлинения.

Некоторые биологически существенные полимеры могут быть эффективно смоделированы в виде червеобразных цепей, включая двухнитевые ДНК и РНК, неструктурированную РНК и неструктурированные полипептиды. Модель червеобразных цепей Кратки-Порода пригодна для моделирования полугибких полимеров для того, чтобы аппроксимировать расстояния между концами и персистентные длины. Однако специалисту известны многочисленные другие теоретические модели, например, как описано в этом документе далее, для аппроксимации расстояния между концами и персистентных длин.

Термин "персистентная длина, P", как это применяется в данном документе, относится к основному механическому свойству, определяющему количественно устойчивость или жесткость полимера или нити, и определяется как длина, по которой корреляции направления касательной являются потерянными. В химии она также может быть определена как средняя сумма проекций всех связей j≥i на связь i в неограниченно длинной цепи (Flory, Paul J. (1969), Statistical Mechanics of Chain Molecules, New York: Interscience Publishers). Когда угол θ между вектором, который является касательным к полимеру в положении 0 (ноль), и касательным вектором на расстоянии L от положения 0, ожидаемое значение косинуса угла уменьшается экспоненциально с расстоянием,

<cosθ>=e^-(L/P)

где P является персистентной длиной, и угловые скобки обозначают среднее по всем начальным положениям. Гибкие полимеры, такие как ПЭГ, могут быть описаны с применением модели Флори (случайное блуждание).

Персистентная длина может также определяться с применением устойчивости при изгибе B_s, модуля Юнга E и отрезка цепи полимера, как описано в Mofrad, M.R.K, "Cytoskeletal mechanics: models and measurements", Cambridge Univ Press, 2006.

В случае жесткого и однородного стержня I может быть выражен как

где α является радиусом.

В науке о полимерах, персистентная длина может также определяться как половина длины Куна, т.е. длина гипотетических сегментов, так что цепь может считаться свободно соединенной. Персистентная длина равна средней проекции вектора от конца до конца на касательную к контуру цепи в конце цепи в пределе бесконечной длины цепи.

Как можно увидеть на фиг. 5, длина линкерной молекулы самой по себе не является достаточным критерием для того, чтобы генерировать большое конечное расстояние, т.е. положение связывающей молекулы, далекое от поверхности частицы или плоской сенсорной поверхности. Фиг. 5 иллюстративно демонстрирует схему, сравнивающую удлинение антитела, присоединенного к поверхности посредством ПЭГ линкера (слева) в сравнении с линкером из дцДНК (справа), при этом оба имеют одинаковую контурную длину. Применение молекул или полимеров, которые являются очень длинными с точки зрения контурной длины, но также гибкими, может, однако, привести в результате к сворачиванию молекулы и, в конечном счете, глобулярной структуре с незначительным удлинением. Таким образом, предусмотрено улучшенное удлинение связывающей молекулы от поверхности или увеличенное расстояние от конца до конца цепи, которое может быть достигнуто предоставлением длинного, а также жесткого линкера, как описано в этом документе. В примере, как проиллюстрировано на фиг.5, средняя протяженность удлинения 170 нм молекулы дцДНК, которая считается жесткой, как определено в данном документе, является в 10 раз большей, чем средняя протяженность удлинения молекулы ПЭГ такой же контурной длины. Однако так же возможно применение очень гибких линкеров, с большой контурной длиной, при условии что получающееся в результате среднее удлинение является достаточно большим для обеспечения предусмотренного эффекта.

Данной заявкой также предусмотрено обеспечение пригодных условий, при которых средняя протяженность удлинения в соответствии с данным документом является повышенной для того, чтобы привести в результате к улучшенной кинетике связывания. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения примерами для пригодного длинного и жесткого линкера являются молекулы на основе двухцепочечной нуклеиновой кислоты. К примеру, благодаря высокой жесткости линкер из дцДНК из 700 п.о. √<R²> будет эквивалентным приблизительно 140 нм, линкер 1000 п.о. приведет в результате к √<R²> около приблизительно 170 нм.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения линкерные молекулы могут иметь среднюю протяженность удлинения по меньшей мере приблизительно 60 нм, предпочтительно вплоть до приблизительно 500 нм, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм 95 нм или 100 нм, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 110 нм, 120 нм, 130 нм, 140 нм, 150 нм, 160 нм, 170 нм, 180 нм, 190 нм или 200 нм, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 220 нм, 250 нм, 270 нм или 300 нм, наиболее предпочтительно по меньшей мере 320 нм, 350 нм, 370 нм или 400 нм. В дополнительных вариантах осуществления средняя протяженность удлинения линкерной молекулы может также быть более 400 нм. Линкерная молекула может также иметь любую другую пригодную среднюю протяженность удлинения между указанными значениями.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения оптимальная средняя протяженность удлинения линкерной молекулы составляет по меньшей мере 1/10, предпочтительно по меньшей мере 1/9, предпочтительно 1/8, более предпочтительно по меньшей мере 1/4 и наиболее предпочтительно 2/3 диаметра частицы, как описано в этом документе.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления средняя протяженность удлинения составляет по меньшей мере 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% или 19%, более предпочтительно 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28% или 29%, еще более предпочтительно 30%, 31%, 32%, 34%, 35%, 36% 37%, 38%, 39%, наиболее предпочтительно 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% диаметра частицы, как описано в этом документе.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления частица с диаметром приблизительно 500 нм может содержать линкерные молекулы, демонстрирующие среднюю протяженность удлинения от приблизительно 25 до 30%, более предпочтительно приблизительно 27% диаметра частицы. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления частица с диаметром приблизительно 1000 нм может содержать линкерные молекулы, демонстрирующие среднюю протяженность удлинения от приблизительно 15 до 20%, более предпочтительно приблизительно 17% диаметра частицы.

Также настоящим изобретением предусматривается предоставление условий детектирования или изменений в условиях детектирования, таких как pH сдвиг или температурный сдвиг, приводящих к конформационному изменению линкерной молекулы и/или изменению характеристики жесткости линкерной молекулы. К примеру, линкерная молекула с высокой контурной длиной, но низкой жесткостью, которая является свернутой, может быть удлинена предусмотренным подходом. Также возможно добавить дополнительно соединение, композицию, молекулу, растворитель и/или ион, который может взаимодействовать и реагировать с линкерной молекулой так, чтобы в результате была получена повышенная жесткость линкерной молекулы и увеличенное среднее удлинение линкерной молекулы, как определено в данном документе выше.

Также возможно вызывать повышенное удлинение посредством увеличения поверхностной плотности линкерной молекулы. Необходимо иметь в виду, что хотя средняя протяженность удлинения гибких полимеров снижена из-за образования глобулярных структур, увеличение плотности линкерной молекулы на частице или поверхности плоского сенсора может привести в результате к наложению молекул так, что линкерные молекулы могут стабилизировать друг друга как можно увидеть на фиг. 8. Результаты, показанные на фиг. 9, однако демонстрируют, что гибкость линкера является существенным аспектом, вносящим вклад в улучшенную кинетику связывания. Диаграммы на фиг. 9 демонстрируют, что кинетика связывания снижена в результате сниженной подвижности при перегрузке поверхности большим количеством дцДНК молекул. Таким образом, предусмотрена длинная и жесткая линкерная молекула, которая может все еще сохранять некоторую подвижность, достаточную для достижения различных ориентаций линкерной молекулы для того, чтобы достичь предусмотренное увеличение кинетики связывания. Количество и/или длина линкерных молекул может соответственно быть приведена в соответствие со свойствами частицы, в частности с размером частицы.

Как это применяется в данном документе "жесткость" или "жесткий", также обозначаемые как "устойчивость", определяют свойство твердого тела сопротивляться деформации. Необходимо иметь в виду, что жесткость линкерной молекулы вносит существенный вклад в среднюю протяженность удлинения. "Гибкий", как это применяется в данном документе, таким образом, относится к свойству твердого тела, которое может быть легко деформировано. В контексте настоящего изобретения гибкая молекула, полимер или линкер, таким образом, имеют низкую жесткость в соответствии с данным документом, что может привести в результате к изгибанию и сворачиванию молекулы.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения жесткость линкерной молекулы определяется через корень из квадрата среднего расстояния от конца до конца цепи линкера √<R²>, как определено выше. В некоторых вариантах осуществления жесткость может быть соответственно измерена исходя из корня из квадрата среднего расстояния от конца до конца цепи линкера или средней протяженности удлинения по сравнению с его контурной длиной, как определено в данном документе. Таким образом, к примеру, контурная длина линкерной молекулы, которая является по существу идентичной средней протяженности удлинения линкерной молекулы, указывает на высокую жесткость линкерной молекулы. С другой стороны, контурная длина линкерной молекулы, которая значительно больше, чем средняя протяженность удлинения указанного линкера, указывает на низкую жесткость линкерной молекулы.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения жесткость и длина линкерной молекулы выбраны так, чтобы корень из квадрата среднего расстояния от конца до конца цепи линкера √<R²> составлял по меньшей мере приблизительно 5%, 10% или 15%, предпочтительно приблизительно 20%, 25% или 30%, 35%, еще более предпочтительно приблизительно 40%, 45% или 50%, наиболее предпочтительно приблизительно 55%, 60%, 65%, 70% или 75% по отношению к диаметру частицы.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения жесткость и длина указанной линкерной молекулы выбраны так, чтобы корень из квадрата среднего расстояния от конца до конца цепи линкера √<R²> составлял по меньшей мере приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% или 19%, более предпочтительно 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28% или 29%, еще более предпочтительно 30%, 31%, 32%, 34%, 35%, 36% 37%, 38%, 39%, наиболее предпочтительно 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% по отношению к диаметру частицы.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения большее увеличение чувствительности и кинетики связывания может быть достигнуто, когда обе из поверхностных структур, а именно поверхность частицы и поверхность плоского сенсора содержат длинный и жесткий линкер, как описано в данном документе выше.

Также данной заявкой предусмотрено, что на частице обеспечен линкер перед анализом, который осуществляется перед захватом молекулы-мишени. Фиг.10 демонстрирует частицы, которые предварительно загружены связывающими молекулами, присоединенными к поверхности посредством длинной и жесткой линкерной молекулы, как определено в данном документе выше.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения поверхностная структура поверхности плоского сенсора образована после того, как вторая связывающая молекула, которая присоединена к длинному линкеру, распознает молекулу-мишень, имеющую связанную первую связывающую молекулу. Как проиллюстрировано на фиг. 11, вторая связывающая молекула присоединена к линкерной молекуле. Другой конец линкерной молекулы содержит молекулу для заякоривания линкерной молекулы на поверхности. Иллюстративной молекулой для этой цели является, к примеру, биотин, который способен связывать стрептавидин на плоской сенсорной поверхности. Предусмотренный эффект этого подхода показан на фиг. 12, где специфическое связывание может происходить только посредством связывания второй связывающей молекулы с длинным линкером, приводя увеличению расстояния от конца до конца частицы и плоской сенсорной поверхности.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения первая и/или вторая частица в соответствии с данным документом может дополнительно содержать отталкивающую поверхностную структуру. Термин "отталкивающая поверхностная структура", как это применяется в данном документе, относится к структуре, которая может являться напрямую или ненапрямую, присоединенной к поверхности частицы, как описано в этом документе. Отталкивающая поверхностная структура, как это определяется в данном изобретении, содержит молекулы, полимеры и/или сетчатую структуру молекул, способных к предоставлению отталкивающей силы. Термин "отталкивающая сила", как это применяется в данном документе, относится к силам, которые ведут к отталкиванию молекул или частиц. Настоящим изобретением предпочтительно предусмотрено отталкивание магнитных частиц. В целом, отталкивающая сила между частицами может являться результатом межчастичных сил, таких как отталкивание вследствие исключенного объема, электростатического отталкивания, энтропийных сил или пространственных сил между покрытыми полимером поверхностями. Термин "отталкивание вследствие исключенного объема" означает невозможность любого перекрывания между твердыми частицами или, где возможно, между твердыми частицами, включающими поверхностные структуры, представленные на частицах. "Электростатическое отталкивание" между частицами наблюдается, когда частицы несут результирующий электрический заряд. Если две частицы несут одинаковый результирующий заряд, т.е. или положительный, или отрицательный заряд, они отталкивают друг друга. Термин "энтропийные силы" относится к силами, которые основаны на втором законе термодинамики, описывающем стремление системы переходить в состояние, в котором энтропия максимальна. Это может привести в результате к эффективным отталкивающим силам между твердыми сферами, например, магнитными частицами. Термин "пространственная отталкивающая сила" основан на пространственном эффекте. Необходимо понимать, что на атомном уровне пространственные эффекты возникают из того факта, что каждый атом в молекуле занимает некоторое пространство. Если атомы приводятся близко друг к другу, то совместные затраты энергии являются высокими из-за перекрывания электронных облаков (отталкивание Паули или Борна) и могут воздействовать на предпочтительную конфигурацию или конформацию и реактивность молекулы. Поэтому пространственное затруднение или пространственные эффекты могут проявляться в виде отталкивания между электронными облаками отдельных атомов и могут в принципе быть определены как результат электростатического отталкивания на атомном уровне.

Формулировка "в котором указанная отталкивающая поверхностная структура переносит вытесняющий эффект на указанные частицы по направлению к указанной сенсорной поверхности", как это применяется в данном документе, означает, что весь ансамбль частиц вытесняется по направлению к сенсорной поверхности. Этот общий вытесняющий эффект основан на или вызван электростатическими вытесняющими эффектами отталкивающих поверхностных структур частицы, например, электростатическим вытесняющим эффектом между двумя или более частиц или пространственными вытесняющими эффектами отталкивающих поверхностных структур частицы, например, пространственный вытесняющий эффект между двумя или более частиц или комбинация как электростатического отталкивающего эффекта, так и пространственного отталкивающего эффекта частицы, например, между двумя или более частиц. Общий вытесняющий эффект может, к примеру, зависеть от количества частиц в анализе, количества частиц вблизи от сенсорной поверхности, общего заряда двух или более частиц, соотношения между электростатическим и пространственным вытеснением и дополнительного параметра, известного специалисту в данной области. Эти параметры могут быть скорректированы и/или модифицированы в соответствии в специфическими требованиями и потребностями вариантов осуществления устройства или анализами, осуществленными как описано в этом документе.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения общий отталкивающий эффект, как определено в данном документе ранее, определяется измерением увеличения поверхностного взаимодействия. Термин "увеличение поверхностного взаимодействия", как это применяется в данном документе, относится к увеличению количества или числа частиц, представленных в или находящихся близко к сенсорной поверхности с результатом в виде сил отталкивания между частицами, например, магнитными частицами, в соответствии с настоящим изобретением. Другими словами увеличение поверхностного взаимодействия, таким образом, означает увеличение взаимодействия частиц с поверхностью сенсора. Увеличение поверхностного взаимодействия может быть измерено через количество времени, которое частицы проводят в непосредственном контакте с поверхностью сенсора. Термин "непосредственный контакт" означает, что частицы находятся близко или на поверхности, для того чтобы генерировать сигнал, когда они будут достаточно близко к поверхности сенсора, например, световой сигнал, с применением подходящих способов количественного определения. Пригодные способы для количественного определения частиц вблизи от или на поверхности сенсора известны специалисту и уже были описаны, например, в Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения увеличение поверхностного взаимодействия определяется измерением амплитуды сигнала во время анализа. Одним предусмотренным примером определения увеличения поверхностного взаимодействия, без ограничения им, является количественное определение амплитуды сигнала с помощью нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR), как описано в этом документе. Полученная в результате FTIR амплитуда сигнала при этом соответствует количеству частиц, представленных в рассеянном поле.

Увеличение поверхностного взаимодействия рассчитывается из амплитуды сигнала, полученной из количественного определения с применением частиц, например, магнитных частиц, функционализированных отталкивающей поверхностной структурой, как определено в данном документе ранее, по отношению к амплитуде сигнала, получающейся в результате количественного определения с применением нефункционализированных частиц, например, магнитных частиц, т.е. частиц без какой-либо отталкивающей поверхностной структуры. К примеру, если увеличение поверхностного контакта увеличено в два раза, т.е. амплитуда сигнала при применении магнитных частиц, функционализированных отталкивающей поверхностной структурой, является удвоенной амплитудой сигнала нефункционализированных частиц, например, магнитных частиц, то увеличение поверхностного взаимодействия составляет 100%.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения увеличение поверхностного взаимодействия между частицами и поверхностью сенсора, может составлять по меньшей мере приблизительно 1%. Увеличение поверхностного взаимодействия может, к примеру, составлять 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 220%, 240%, 260%, 280%, 300%, 320%, 340%, 360%, 380%, 400%, 420%, 440%, 460%, 480%, 500% или более 500%.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения отталкивающая поверхностная структура может являться заряженной структурой или стерическое покрытие, представленным на частице, например, магнитной частице.

"Пространственное покрытие", как это применяется в данном документе, относится к поверхностной структуре, которая может быть представлена на частице в форме покрытия и которая предоставляет отталкивание между частицами. Один существенный эффект, предусмотренный настоящим изобретением, заключается в том, что наличие такого пространственного покрытия приведет в результате к увеличенному взаимному отталкиванию частиц, отталкивание которых в свою очередь приводит к формированию вытесняющей силы, таким образом, приводя в результате к вытеснению частиц по направлению к плоскому сенсору без необходимости повышения концентрации частиц, как описано в данной области (вытесняющий эффект). Предусмотренный подход, таким образом, имеет такой эффект, что поверхностный контакт частиц возрастает с отталкивающей силой частиц, таким образом, приводя к повышению скорости реакции и в конечном счете к увеличенным изменениям сигнала в конце анализа.

Настоящее изобретение описывает один путь для того, как этот эффект может быть достигнут, а именно предоставлением сети молекул на поверхности частиц пространственного покрытия или барьера для предотвращения неспецифического связывания не имеющих отношения молекул, или который поддерживает другие молекулы или частицы на некотором расстоянии. Специалисту следует иметь в виду, что частицы, имеющие такое пространственное покрытие, например, в виде покрытия, содержащего сетчатую структуру молекул, могут проявлять некоторое пространственное отталкивание.

Покрытие частиц может быть таким, что они образуют сетчатую структуру или сеть молекул. Вследствие этого, слой покрытия в соответствии с настоящим изобретением может быть составлен из маленьких звеньев или объектов, которые имеют идентичные или подобные химические, физические и/или биологические свойства. Предпочтительно, слой покрытия, как описано в данном документе, может содержать биологические или химические молекулы, способные к образованию полимеров некоторой длины. Пригодными полимерами являются, к примеру, углеводы, липиды, полиэтиленгликоль, полисахариды, дендримеры, дендроны, нанотрубки или их смесь. Предпочтительно, такие полимерные объекты составлены в линкерные или спейсерные молекулы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения покрытие может быть составлено из одиночного поверхностного слоя или структуры с многослойной оболочкой.

Термин "спейсерные молекулы", как это применяется в данном документе, относится к молекулам, которые первоначально имеют функцию спейсера. С этой целью, эти полимерные молекулы имеют некоторую длину и прочность для того, чтобы иметь возможность действовать в качестве полимерных волокон.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения спейсерные молекулы могут иметь длину вплоть до приблизительно 500 нм, например, вплоть до приблизительно 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нм.

В дополнительных специфических вариантах осуществления настоящего изобретения спейсерные молекулы могут быть линейными, циклическими или подобными разветвленным молекулами или их смесью. Если они являются разветвленными, то они могут быть разветвленными с различными степенями, например, демонстрируют 2, 3, 4, 4 или большие иерархический уровни. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает комбинацию различных типов, например, линейных и разветвленных, различных степеней ветвления, различных длин спейсера и т.д. спейсерных молекул в сетчатой структуре, слое или оболочечной структуре. В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения спейсерная молекула или смесь спейсерных молекул обеспечивает однородную сеть или сетчатую структуру, т.е. равномерно расположенную сеть или сетчатую структуру с разрывами по существу такого же размера. Также предусмотрено, что сеть будет обеспечена разрывами. В частности предпочтительно, если сеть является настолько однородной, что функциональные свойства сети относительно достижимости молекул и степени подвижности молекул являются однородными. Эти параметры может быть отрегулированы длинами, степенью ветвления и т.д. спейсерных молекул.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления линкерная молекула длиннее, чем поверхностная структура. Термин "длиннее", как это применяется в данном документе, означает, что средняя протяженность удлинения линкерной молекулы больше средней протяженности удлинения поверхностной структуры. Различие средней протяженности удлинения может составлять 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000% или более.

В дополнительных специфических вариантах осуществления настоящего изобретения спейсерные молекулы могут быть напрямую или ненапрямую взаимосвязаны, для того чтобы образовать пространственную сеть молекул. Такая взаимосвязь может быть на основании функциональных групп на концах молекулы или расположенных в центре молекулы, например, в случае, если предусмотрено ветвление. Регулирование взаимосвязи, ее степени и т.д. может быть реализовано в соответствии с принципами и способами, известными специалисту в данной области, например, из соответствующего руководства, такого как "Bioconjugate techniques", Hermanson, 2nd Ed. Academic Press, Elsevier or "Dendrimers and other dendritic polymers" Frechet and Tomalia, J. Wiley.

Пригодные спейсерные молекулы в контексте настоящего изобретения могут являться, к примеру, углеводами, липидами, полиэтиленгликолем (ПЭГ), полисахаридами, дендримерами, дендронами или нанотрубками, как определено в данном документе, или любым пригодным производным или их комбинациями. Группа спейсерных молекул может дополнительно содержать основанные на углеводородах поверхностно-активные вещества, холестерин, гликолипиды, желчные кислоты, сапонины, жирные кислоты, синтетические амфипатические блок-сополимеры, природные продукты, подобные фосфолипидам яичного желтка.

Предпочтительным примером спейсерной молекулы, пригодной для пространственных покрытий, является полиэтиленгликолевая (ПЭГ) молекула. Полиэтиленгликолевые молекулы способны к образованию плотной и объемной сети молекул на поверхности. Также специалисту следует иметь в виду, что ПЭГ молекулы могут являться взаимосвязанными с образованием пригодного пространственного покрытия, как описано в данном документе выше. Пригодными молекулами для взаимосвязи ПЭГ молекул являются соединительные молекулы, как описано в этом документе. Длина может являться зависимой от предусмотренной общей толщины получающегося в результате покрывающего слоя, предусмотренной длины линкерной молекулы, предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы и/или предусмотренного количества структурных молекул в расчете на частицу.

Также настоящим изобретением предусматривается количество полиэтиленгликолевых молекул, прикрепленных к частице. Необходимо иметь в виду, что чем больше молекул присоединено к частице, тем выше плотность и толщина покрывающего слоя, что приводит к отталкиванию между частицами посредством пространственного эффекта. Таким образом, ясно, что пространственное отталкивание частиц зависит от толщины покрывающего слоя, который зависит от количества ПЭГ молекул на магнитных частицах, длины ПЭГ молекулы и количества связей между ПЭГ молекулами. Количество молекул в расчете на частицу может быть по меньшей мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100, 150, 200, 250, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 300, 350, 400 или 450 и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 500 или 1000.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения количество полиэтиленгликолевых молекул, как определено в данном документе выше, присоединенных к частице, можно варьировать. В конкретных вариантах осуществления может быть установлено количество полиэтиленгликолевых молекул в расчете на частицу приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, более предпочтительно приблизительно 100, 150, 200, 250, еще более предпочтительно приблизительно 300, 350, 400 или 450 и наиболее предпочтительно приблизительно 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000. В дополнительных вариантах осуществления может быть установлено количество полиэтиленгликолевых молекул в расчете на частицу приблизительно 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000 или более. Количество полиэтиленгликолевых молекул в расчете на частицу может дополнительно являться зависимым от размера или диаметра частицы, площади, на которой возможно или применимо присоединение, соотношения между размером или диаметром частицы и длиной частицы, молекулярной идентичности полиэтиленгликолевых молекул или любого другого пригодного параметра, известного специалисту в данной области.

В дополнительных вариантах осуществления покрывание поверхности частицы полиэтиленгликолевыми молекулами может составлять приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% общей поверхности частицы или любое значение между этими значениями.

В дополнительных вариантах осуществления пространственного покрытия в соответствии с данным документом гидродинамический радиус частицы в соответствии с настоящим изобретением составляет по меньшей мере приблизительно 105% радиуса частицы, как определено в данном документе. Термин "гидродинамический радиус частицы", как это применяется в данном документе, относится к эффективному радиусу гидратизированной частицы, содержащей пространственное покрытие в растворе или наблюдаемому размеру частицы, содержащей пространственное покрытие в растворе. Предпочтительно, пространственное покрытие относится к множеству, например, всем, из молекул, вносящих вклад в пространственный эффект, как описано в этом документе. Гидродинамический радиус частицы, содержащей пространственное покрытие в соответствии с данным документом, может составлять по меньшей мере приблизительно 105% радиуса частицы, как определено в данном документе, в частности радиуса частицы, которая не содержит такое пространственное покрытие. Гидродинамический радиус частицы, содержащей пространственное покрытие в соответствии с данным документом, может составлять, к примеру, приблизительно 105%, 110%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250% или любое значение между этими значениями или более от радиуса частицы, как определено в данном документе, например, магнитной частицы, в частности частицы, которая не содержит такое пространственное покрытие.

В других особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы могут содержать заряженную структуру для того, чтобы генерировать отталкивающую силу между частицами. Термин "заряженная структура", как это применяется в данном документе, относится к объекту, который вносит вклад в результирующий заряд частицы в соответствии с настоящим изобретением. Заряженные структуры в соответствии с настоящим изобретением могут иметь результирующий заряд, который может являться как положительным, так и отрицательным. Необходимо иметь в виду, что заряженная структура не ограничивается специфическим типом или формой молекулы. Заряженная структура может, к примеру, содержать полимер одного типа молекул или двух или более различных типов молекул, комплекс различных молекул или структур или соединение, содержащее несколько молекул, имеющих различные заряды, например, различные положительные заряды, различные отрицательные заряды или (различные) положительные и отрицательные заряды, приводя в результате к положительному или отрицательному общему результирующему заряду. Средства и способы для расчета заряда известны специалисту, например, из Dewar, M.J.S., The Molecular Orbital Theory of Organic Chemistry McGraw-Hill и Inc., 1969; или Stewart, R., The Proton: Applications to Organic Chemistry, Academic Press, Inc., 1985, 72.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения заряженная структура может быть присоединена к частице напрямую или ненапрямую так, чтобы в результате был получен специфический результирующий заряд частицы. Специфический результирующий заряд может являться или положительным, или отрицательным. Также возможно, чтобы различные заряженные структуры были прикреплены к одной частице с получением в результате смеси заряженных структур. В контексте настоящего изобретения заряженная структура может покрывать поверхность частицы, для того чтобы обеспечить в общем заряженную молекулу, имеющую специфический результирующий заряд. Специалисту известно, что результирующий заряд наночастицы может быть определен, к примеру, измерением дзета-потенциала.

Одно предусмотренное преимущество заключается в том, что повышение отталкивания благодаря наличию повышенных зарядов на частице, предпочтительно магнитной частице, приводит к повышенному электростатическому отталкиванию, которое в свою очередь минимизирует неспецифическую кластеризацию частиц. Уменьшение неспецифической кластеризации может способствовать снижению уровня фона без применения поверхностно-активного вещества, таким образом приводя к увеличению холостого уровня в анализах оптомагнитного детектирования, как описано в данном документе, и таким образом улучшает предел детектирования. Другой существенный эффект, предусмотренный настоящим изобретением, заключается в том, что наличие повышенного заряда частицы, являющегося или отрицательным, или положительным зарядом, приводит в результате к повышению взаимного электростатического отталкивания частиц, что в свою очередь приводит к формированию электростатической "вытесняющей" силы, таким образом приводя в результате к вытеснению частиц к плоскому сенсору без необходимости повышать концентрацию частиц, как описано в данной области. Предусмотренный подход имеет эффект, заключающийся в том, что поверхностный контакт частиц может возрастать с зарядом частиц, таким образом приводя к повышению скорости реакции и в конечном счете к повышенному сигналу изменения в конце анализа.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления увеличенное присутствие заряда на частицах может быть достигнуто как предоставлением линкерной молекулы, как описано в этом документе, содержащей или состоящей из заряженной структуры, так и предоставлением заряженной структуры, присоединенной к частицам в добавок к линкерной молекуле.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения заряженные структуры могут покрывать всю поверхность частицы так, чтобы обеспечивать общую заряженную молекулу, имеющую специфический результирующий заряд. В альтернативных вариантах осуществления заряженные структуры могут покрывать только участки, площади или сектора частицы, например, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% или менее общей поверхности частицы или любое значение между этими значениями.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения количество молекул с заряженной структурой, присоединенных к частице может варьироваться, например, в соответствии с предусмотренным общим результирующим зарядом частицы. Необходимо иметь в виду, что общий результирующий заряд частицы варьируется, например, возрастает или снижается с количеством заряженных молекул, присоединенных к частице. Дзета-потенциал (мВ) может соответственно увеличиваться (отрицательно) с увеличением количества частиц, а также с увеличением длин молекул. Таким образом, возможно, чтобы сумма зарядов, представленных на частице, вносила вклад в общий результирующий заряд. Дополнительно следует иметь в виду, что общий результирующий заряд частицы является среди прочего функцией количества молекул, представленных на магнитной частице, и длины молекулы, их положительного или отрицательного заряда и т.д. В конкретных вариантах осуществления может быть установлено количество молекул с заряженной структурой в расчете на частицу приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000 или более. Количество молекул с заряженной структурой в расчете на частицу может быть различным или быть зависимым от размера или диаметра частицы, площади, на которой возможно или вероятно присоединение, соотношения между размером или диаметром частицы и длиной частицы, молекулярной или химической идентичности молекул с заряженной структурой, предусмотренного применения, например, анализ, или любого другого пригодного параметра, известного специалисту в данной области.

Пригодные заряженные структуры для того, чтобы получить этот электростатический отталкивающий эффект, как описано в данном документе, могут содержать биологическую или химическую структуру или соединение, способное вносить вклад в специфический результирующий заряд, такое как нуклеиновая кислота, рибонуклеиновая кислота, пептид, полипептид или белок, углевод, липид или полисахарид или любое пригодное производное или их комбинации. Также предусмотрены гидрогелевые и полимерные заряженные структуры. Предпочтительным является применение молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты.

"Молекулы с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты" могут являться любыми молекулами нуклеиновой кислоты или их производным или аналогом. Такие молекулы с заряженной структурой могут, к примеру, содержать одиночные и/или двухцепочечные ДНК или РНК молекулы или любой тип их производного. Такие молекулы с заряженной структурой могут дополнительно содержать или состоять из молекулы ПНК, ЦНК, ГНК, ЗНК или АНК, как определено в данном документе ранее, или их любой смеси или комбинации, например, комбинация любого из ДНК, РНК, ПНК, ЦНК, ГНК, ЗНК и АНК или смеси нуклеотидов ЗНК с основаниями ДНК или РНК, или любой смеси или комбинации с любой другой молекулой с заряженной структурой, как определено в данном документе. В случае заряженных структур на основе нуклеиновых кислот или их аналогов, они могут дополнительно быть обеспечены химическими группами или звеньями, которые несут заряд. К примеру, фосфатные группы, заряженные азотные производные или заряженные серные производные могут быть включены в состав или добавлены. Кроме того, заряды могут быть накоплены предоставлением дуплексных молекул, из которых по меньшей мере одна молекула несет заряды, например, дуплекс, содержащий ДНК.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы, например, магнитные частицы, могут быть функционализированы с заряженными структурами, например, одноцепочечная или двухцепочечная нуклеиновая кислота, в частности дцДНК, которая может иметь варьирующуюся длину. Заряд на частицах может соответственно быть измерен через их дзета-потенциал. Настоящим изобретением предусмотрено, что поверхностный контакт частиц возрастает с зарядом частиц, таким образом, приводя к повышенной скорости реакции и, в конечном счете, к повышенному сигналу изменения в конце анализа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения заряженная структура, такая как нуклеиновая кислота, может быть представлена в двухнитевой или дуплексной форме, т.е. содержащей нить и комплементарную ил антипараллельную противоположную нить молекулы нуклеиновой кислоты, ассоциированные спариванием оснований между нитями или смысловой или антисмысловой нитью молекулы нуклеиновой кислоты. Альтернативно заряженная структура может содержать однонитевую нуклеиновую кислоту или одноцепочечную молекулу рибонуклеиновой кислоты.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения заряженная структура содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из двухцепочечной или дцДНК, двухцепочечной или дцРНК, ПНК, дуплекса ПНК-ДНК и дуплекса РНК-ДНК. Один преимущественный аспект, который также предусмотрен дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения, заключается в том, что ПНК и дуплексы ПНК/ДНК или ПНК/ДНК не являются легко распознаваемыми как нуклеазой, так и протеазами, что делает их устойчивыми к ферментативной деградации.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения пригодные молекулы с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты могут также содержать или состоять из одноцепочечных молекул ДНК с различными композициями оснований и/или длинами. Одноцепочечные молекулы могут, к примеру, содержать повторение последовательности оснований, являться полностью рандомными или являться полученными из природы или состоять только из одного основания.

Молекулы с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты или их комбинации, как определено в данном документе ранее, могут иметь различные композиции оснований и/или длины. Длина молекулы может варьироваться от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 5000 нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 50 нуклеотидов до приблизительно 3000 нуклеотидов, еще более предпочтительно от приблизительно 100 нуклеотидов до приблизительно 2000 нуклеотидов, наиболее предпочтительно от приблизительно 400 нуклеотидов до приблизительно 1000 нуклеотидов. Также предусмотрены другие длины или любое значение длины в указанном диапазоне. Молекула может, к примеру, иметь длину приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 нуклеотидов или более или любое количество нуклеотидов между упомянутыми значениями.

Длина молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты может зависеть от предусмотренного общего специфического результирующего заряда, предусмотренной длины линкерной молекулы, предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы и/или предусмотренного количества молекул с заряженной структурой в расчете на частицу. Пригодные способы расчета результирующих зарядов должны быть известны специалисту в данной области или могут быть получены из пригодных литературных источников.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения количество молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты, как определено в данном документе выше, присоединенных к частице может варьироваться, например, в соответствии с предусмотренным общим результирующим зарядом частицы. Необходимо иметь в виду, что общий результирующий заряд частицы варьируется, например, возрастает или снижается с количеством молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты, присоединенных к частице. В конкретных вариантах осуществления может быть установлено количество молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты в расчете на частицу приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, более предпочтительно приблизительно 100, 150, 200, 250, еще более предпочтительно приблизительно 300, 350, 400 или 450 и наиболее предпочтительно приблизительно 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000. В дополнительных вариантах осуществления может быть установлено количество молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты в расчете на частицу приблизительно 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000 или 150000. Количество молекул с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты в расчете на частицу может дополнительно зависеть от размера или диаметра частицы, площади, на которой возможно или вероятно присоединение, соотношения между размером или диаметром частицы и длиной частицы, молекулярной идентичности молекулы с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты или любого другого пригодного параметра, известного специалисту в данной области. В дополнительных вариантах осуществления поверхность покрывания частицы молекулами с заряженной структурой на основе нуклеиновой кислоты может составлять приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% от общей поверхности частицы или любое значение между этими значениями.

Пептидные молекулы, полипептидные молекулы или белковые молекулы, например, как определено в данном документе выше, могут также являться или содержать пригодные заряженные структуры благодаря наличию заряженных объектов в аминокислотах. В данной области описано, что аминовая и карбоксильная функциональные группы в аминокислотах позволяют им иметь амфотерные свойства. Карбоксильные группы (-CO₂H) могут быть депротонированы с превращением в отрицательный карбоксилаты (-CO₂^-), и альфа аминогруппы (NH₂^-) могут быть протонированными с превращением в положительные альфа-аммониевые группы (⁺NH₃^-). Специалисту также известно, что при значениях pH выше pKa карбоксильной группы отрицательный карбоксилат ион является преобладающим. При значениях pH ниже pKa альфа-аммониевой группы азот является преимущественно протонированным в виде положительно заряженной альфа-амониевой группы. Специалист дополнительно осведомлен о том, что результирующий заряд аминокислоты зависит от pH и значения pKa. Средства и способы для расчета результирующего заряда аминокислот, пептидов, полипептидов или белков должны быть известны специалисту в данной области или могут быть, получены из подходящей справочной литературы, как например, средство для расчета pI/Mw, которое позволяет расчет теоретической pI (изоэлектрическая точка) и Mw (молекулярная масса) для объектов списка данных UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot или TrEMBL) или для введенных пользователем последовательностей (Gasteiger E., et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). Такие пептидные, полипептидные или белковые заряженные структуры могут иметь различные аминокислотные композиции и/или длины. Длина может зависеть от предусмотренного общего специфического результирующего заряда, предусмотренной длины линкерной молекулы, предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы и/или предусмотренного количества молекул с заряженной структурой в расчете на частицу. Необходимо иметь в виду, что общий результирующий заряд частицы является функцией количества белковых или пептидных молекул на частице, например, магнитной частице, и длины молекулы.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения количество заряженных пептидных, полипептидных или белковых молекул, как определено в данном документе выше, присоединенных к частице, может варьироваться, например, в соответствии с предусмотренным общим результирующим зарядом частицы. В конкретных вариантах осуществления может быть установлено количество заряженных пептидных, полипептидных или белковых молекул в расчете на частицу приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, более предпочтительно приблизительно 100, 150, 200, 250, еще более предпочтительно приблизительно 300, 350, 400 или 450 и наиболее предпочтительно приблизительно 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000. В дополнительных вариантах осуществления может быть установлено количество заряженных пептидных, полипептидных или белковых молекул в расчете на частицу до приблизительно 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000 или более. Количество заряженных пептидных, полипептидных или белковых молекул в расчете на частицу может дополнительно зависеть от размера или диаметра частицы, площади, на которой присоединение возможно или вероятно, соотношения между размером или диаметром частицы и длиной частицы, молекулярной идентичности заряженных полипептидных или белковых молекул или любого другого пригодного параметра, известного специалисту в данной области. В дополнительных вариантах осуществления поверхность покрывания частицы заряженными пептидными, полипептидными или белковыми молекулами может составлять приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% общей поверхности частицы или любое значение между этими значениями.

Заряженная структура может в дополнительных вариантах осуществления также являться или содержать углеводную молекулу, например, как определено в данном документе выше, которая содержит заряженный объект, способный вносить вклад в общий результирующий заряд на частице. Такие углеводы могут иметь различные композиции и/или длины. Длина может зависеть от предусмотренного общего специфического результирующего заряда, предусмотренной длины линкерной молекулы, предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы и/или предусмотренного количества молекул с заряженной структурой в расчете на частицу.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения количество заряженных углеводных молекул, как определено в данном документе выше, присоединенных к частице, может варьироваться, например, в соответствии с предусмотренным общим результирующим зарядом частицы. В конкретных вариантах осуществления может быть установлено количество заряженных углеводных молекул в расчете на частицу приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, более предпочтительно приблизительно 100, 150, 200, 250, еще более предпочтительно приблизительно 300, 350, 400 или 450 и наиболее предпочтительно приблизительно 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000. В дополнительных вариантах осуществления может быть установлено количество заряженных углеводных молекул в расчете на частицу приблизительно 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000,60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000 или более. Количество заряженных углеводных молекул в расчете на частицу может дополнительно зависеть от размера или диаметра частицы, площади, на которой присоединение возможно или вероятно, соотношения между размером или диаметром частицы и длиной частицы, молекулярной идентичности заряженных углеводных молекул или любого другого пригодного параметра, известного специалисту в данной области. В дополнительных вариантах осуществления поверхность покрывания частиц заряженными углеводными молекулами может составлять приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% общей поверхности частицы или любое значение между этими значениями.

Дополнительно пригодная заряженная структура может являться любой липидной молекулой, например, как определено в данном документе выше, которая содержит заряженный объект, способный вносить вклад в общий результирующий заряд на частице. Заряд в липидах, особенно в фосфолипидах, как правило, определяется зарядом головной группы. Предпочтительными примерами пригодных головных групп, способных к предоставлению результирующего заряда липидной молекуле, являются головные группы, выбранные из группы, состоящей из фосфатидилхолина (PC), фосфатидилсерина (PS), фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилглицерина (PG) или любой их комбинации.

Такие липиды могут иметь различные композиции и/или длины. Длина может зависеть от предусмотренного общего специфического результирующего заряда, предусмотренной длины линкерной молекулы, предусмотренной гибкости, жесткости или устойчивости линкерной молекулы и/или предусмотренного количества молекул с заряженной структурой в расчете на частицу.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения количество заряженных липидных молекул, как определено в данном документе выше, присоединенных к частице, может варьироваться, например, в соответствии с предусмотренным общим результирующим зарядом частицы. В конкретных вариантах осуществления может быть установлено количество заряженных липидных молекул в расчете на частицу приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90, более предпочтительно приблизительно 100, 150, 200, 250, еще более предпочтительно приблизительно 300, 350, 400 или 450 и наиболее предпочтительно приблизительно 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000. В дополнительных вариантах осуществления может быть установлено количество заряженных липидных молекул в расчете на частицу приблизительно 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200,4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 110000, 120000, 150000 или более. Количество заряженных липидных молекул в расчете на частицу может дополнительно зависеть от размера или диаметра частицы, площади, на которой присоединение возможно или вероятно, соотношения между размером или диаметром частицы и длиной частицы, молекулярной идентичности заряженных липидных молекул или любого другого пригодного параметра, известного специалисту в данной области. В дополнительных вариантах осуществления поверхность покрывания частиц заряженными липидными молекулами может составлять приблизительно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% общей поверхности частицы или любое значение между этими значениями.

Термин "гидрогель", содержащий заряженную структуру, относится к пространственной сетчатой структуре полимерных цепей, которые являются гидрофильным, иногда являющимся коллоидальным, гелем, в котором вода является дисперсионной средой. Как правило, гидрогели являются сильно абсорбирующими т.е. они могут содержать более 99,9% воды, природными или синтетическими полимерами и способны удерживать большие количества воды с сохранением сетчатой структуры. Гидрогели могут также иметь степень гибкости очень схожую с природной тканью, благодаря их значительному содержанию воды. В результате высокого содержания воды гидрогели обычно считаются биосовместимыми материалами, что делает их особенно интересными для биомедицинских и фармацевтических приложений. Общеизвестные компоненты гидрогелей могут содержать, к примеру, поливиниловый спирт, полиакрилат натрия, акрилатные полимеры и акрилатные сополимеры с множеством гидрофильных групп. Также предусмотрены натуральные гидрогелевые материалы, такие как материалы, включающие агарозу, метилцеллюлозу, гиалуронан и другие полученные в естественной среде полимеры. Особенно предпочтительно, чтобы гидрогели дополнительно содержали или состояли из заряженных элементов, таких как заряженные полимеры или любые другие заряженные молекулы, или функциональных групп, которые могут быть применены в качестве заряженного покрытия поверхности частицы. Гомогенная гидрогелевая структура может преимущественно вносить вклад в общий результирующий заряд частицы, приводя к электростатическому отталкиванию частиц. В характерном варианте осуществления линкерные молекулы и другие компоненты покрытия или поверхностной структуры могут быть внедрены в каркасные системы из водного гидрогеля, которые могут дополнительно предоставлять некоторую устойчивость молекулам. Специалисту должно быть известно, как выбрать пригодные заряженные полимеры для того, чтобы получить гидрогель с общим результирующим зарядом. Кроме того средства и способы для продуцирования пригодных гидрогелей и их присоединения на поверхность частицы известны в данной области. Гидрогели, как описано выше в данном документе, могут также содержать полимерную заряженную молекулу, как описано в этом документе.

Заряженная структура может в дополнительных вариантах осуществления также являться "полимерной заряженной молекулой". Термин "полимерная заряженная молекула" или "заряженный полимер", как это применяется в данном документе, относится к полимеру или сополимеру, содержащему множество повторяющихся звеньев, выбранных из отрицательно или положительно заряженных повторяющихся блоков. Такой полимер или сополимер, таким образом, действует как полиэлектролит. Необходимо иметь в виду, что заряд может быть получен из отрицательно или положительно заряженных групп в повторяющемся блоке. Особенно предпочтительными является положительно заряженная группа, выбранная из группы, состоящей из четвертичной аммониевой группы, первичной аминогруппы, вторичной аминогруппы, третичной аминогруппы, четвертичной фосфониевой группы, третичной фосфониевой группы, амидной группы, группы гетероароматического азота и сульфониевой группы.

Получающиеся в результате положительно заряженные полимеры также обозначаются катионные полимеры. Положительный заряд полимерной заряженной молекулы преимущественно предотвращает образование спиралевидных полимеров. Это позволяет им вносить больший вклад в вязкость в их растянутом состоянии, из-за того, что растянутый полимер занимает больше пространства.

Предпочтительные отрицательно заряженные полимеры содержат, но не ограничены этим, группу сульфатного эфира, группу карбоксилатного эфира, группу фосфатного эфира, сульфоновую группу, сульфидную группу, дисульфидную группу, ортоэфирную группу, ангидридную группу и бета-кетосульфоновую группу или любую их комбинацию.

Полиэлектролиты были использованы в образовании новых типов материалов, известных как полиэлектролитные полислои (PEM). Эти тонкие пленки сконструированы с применением технологии нанесения слой за слоем (LbL). Во время LbL нанесения пригодный субстрат для наращивания (обычно заряженный) погружается попеременно в ванны для разбавления положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитных растворов. Во время каждого погружения маленькое количество полиэлектролита адсорбируется, и поверхностный заряд меняется на противоположный, что позволяет постепенное и контролируемое наращивание электростатически поперечно связанных пленок слоев поликатион-полианион. Необходимо иметь в виду, что такие полиэлектролитные полислои пригодны для обеспечения частиц по настоящему изобретению с общим положительным или отрицательным результирующим зарядом.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула, как определено в данном документе, и/или отталкивающая поверхностная структура в соответствии с данным документом не расщепляется ДНКазой. В дополнительных специфических вариантах осуществления настоящего изобретения линкерная молекула в соответствии с данным документом и/или отталкивающая поверхностная структура в соответствии с данным документом не расщепляется РНКазой. Дополнительно или альтернативно линкерная молекула, как определено в данном документе, и/или отталкивающая поверхностная структура в соответствии с данным документом могут не расщепляться рестрикционным ферментом, способным к разрезанию двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты. Такая нерасщепляемость ДНКазой, РНКазой или рестрикционным ферментом может быть достигнута предоставлением линкерных молекул или отталкивающих поверхностных структур, которые не представляют субстрат или мотив распознавании для фермента ДНКаза. Как правило, эффект может быть достигнут посредством применения аналогов ДНК, таких как молекулы ПНК, ЦНК, ГНК, ЗНК или АНК, как определено в данном документе, или посредством применения полимерных молекул, таких как ПЭГ.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкерная молекула в соответствии с данным документом дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер. Соответственно настоящим изобретением предусмотрено, что линкерные структуры, как определено в данном документе, предпочтительно длинные и жесткие линкеры, как определено в данном документе, несут на одном или обоих концах короткий гибкий спейсер. Предпочтительная конструкция линкера показана на фиг. 13. Необходимо иметь в виду, что некоторая гибкость благодаря наличию такого гибкого спейсера, добавляется к жесткой линкерной молекуле. Гибкие спейсерные структуры могут таким образом служить в качестве гибкого сочленения, которое вносит вклад в подвижность линкерной молекулы при сохранении при этом общей жесткости. Как показано на фиг. 4, количество возможных ориентаций повышено или облегчено посредством такого гибкого спейсера. Гибкий спейсер может являться любой пригодной гибкой молекулой, например, полимерной молекулой, пептидом, химической группой и т.д.

В особенно предпочтительном варианте осуществления короткий гибкий спейсер содержит одноцепочечную нуклеиновую кислоту, например, одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, как определено в данном документе, или любую форму другой одноцепочечной нуклеиновой кислоты в соответствии с данным документом или известную специалисту в данной области.

Настоящее изобретение в дополнительном аспекте относится к способу детектирования наличия или количества молекул-мишеней в образце, содержащему стадии:

(a) приведения образца в контакт с первой связывающей молекулой, присоединенной с первой частице в устройстве, как описано в данном документе выше, и

(b) приведения образца в контакт с

(i) второй связывающей молекулой, способной к присоединению к плоской поверхности или ко второй частице, в котором первая связывающая молекула и/или вторая связывающая молекула способны к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью, и необязательно

(ii) аналогом молекулы-мишени, присоединенным к плоской поверхности или ко второй частице; где молекула-мишень способна препятствовать связыванию первой связывающей молекулы с аналогом молекулы-мишени; и

(c) детектирования количества первой частицы, связанной с плоской поверхностью или второй частицей,

где количество кластеров частиц или связанных частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

Настоящим изобретением предусмотрены форматы анализа, которые могут являться или типичными конкурентными, или неконкурентными анализами для детектирования наличия и/или количества молекулы-мишени. Специалисту в данной области будет очевидно, что устройство, как описано в данном документе, а также способ в соответствии с настоящим изобретением пригодны для осуществления такого анализа.

В предусмотренном формате неконкурентного анализа как первая, так и вторая связывающая молекула способны к специфическому связыванию с молекулой-мишенью. Возможно, чтобы на первой стадии первая связывающая молекула, представленная на первой частице, могла распознать и связать мишень. На второй стадии первая частица, имеющая связанную молекулу-мишень, может быть направлена посредством диффузии или магнитным приведением в движение ко второй связывающей молекуле, представленной на второй частице или на плоской сенсорной поверхности. Связывание с поверхностью как второй частицы, так и плоского сенсора опосредовано связыванием второй связывающей молекулы с мишенью. Также предусмотрены одна или более стадий промывки, где неспецифически связанные частицы удаляются с поверхности. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения такие стадии промывки происходят посредством пульсирующего магнитного приведения в движение. Количество связанных частиц впоследствии детектируется или через количество кластеров частиц, или через количество связанных частиц с поверхностью плоского сенсора, как определено в данном документе выше. Определенное количество связанных частиц напрямую согласуется с количеством молекул-мишеней в образцах.

Также предусмотрены виды анализа на основании конкурентных анализов, для которых, как правило, требуется наличие конкурента или аналога мишени. Термин "аналог молекулы-мишени", как это применяется в данном документе, относится к любой молекуле, которая конкурирует с молекулой-мишенью за связывание с первой связывающей молекулой, как определено в данном документе. В таком случае молекула-мишень может препятствовать связыванию первой связывающей молекулы с аналогом молекулы-мишени, настоящим изобретением предусмотрены конкурентный или ингибиторные форматы анализа, где первый связывающий белок может связывать аналог молекулы-мишени, закрепленный на поверхности плоской поверхности или частицы, как определено в данном документе выше. Это связывание может быть предотвращено, если молекула-мишень, как описано в данном документе, представлена в образце и если эта молекула-мишень связывается антителом первой. К примеру, маленькая молекула лекарственного средства может быть детектирована с применением предусмотренного способа, если аналог молекулы лекарственного средства, например, иммобилизирован на плоской сенсорной поверхности. Если в образце не представлена молекула лекарственного средства, то все частицы со связывающей молекулой, распознающей молекулу-мишень, могут связаться с аналогом молекулы-мишени на поверхности. Однако при наличии молекулы лекарственного средства (мишень), которая препятствует этому связыванию, связывающие молекулы против лекарственного средства не могут связать или связываются меньше с аналогом мишени на поверхности. В таком случае количество частиц на поверхности обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней.

Дополнительно настоящим изобретением предусмотрено специфическое применение магнитных частиц, как определено в данном документе выше, которые могут быть приведены в движение применением магнитного поля так, что аналитическая процедура может быть ускорена. Также настоящим изобретением предусмотрено, что применение магнитного поля может снижать фоновый сигнал благодаря удалению неспецифически связанных частиц. Иллюстративная оптомагнитная система, пригодная для способа детектирования в соответствии с настоящим изобретением, проиллюстрирована на фиг. 1.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сила магнитного поля применяется для приведения частиц в непосредственную близость с плоской поверхностью или друг с другом, для того чтобы облегчить кластеризацию частиц.

Термин "способный к присоединению к плоской поверхности или второй частице" означает, что вторая связывающая молекула необязательно постоянно связана с плоской поверхностью или второй частицей или прикреплена предварительно установленным образом, что означает, присоединена к поверхности уже в начале анализа. Необходимо понимать, что присоединение второй связывающей молекулы к поверхности или напрямую, или посредством линкерной молекулы, как определено в данном документе ранее, может происходить в любой момент времени во время анализа. Специалисту очевидно, что в данной области селективный момент времени присоединения предоставляет широкий спектр возможностей проведения анализа. Таким образом, настоящим изобретением предусмотрен комплекс вторая связывающая молекула-линкер, который может действовать в качестве отдельного модуля независимо от его связывания с поверхностью. Такой комплекс, к примеру, изображен на фиг. 11. Специалисту будет совершенно очевидно, что комплекс вторая связывающая молекула - линкер, который не является постоянно зафиксированным или прикрепленным к плоской поверхности, может также иметь несколько преимуществ. Одно предусмотренное преимущество заключается в том, что незакрепленный комплекс вторая связывающая молекула - линкер может свободно и быстро диффундировать, таким образом увеличивая связывание захватывающего комплекса посредством связывания с молекулой-мишенью. Термин "захватывающий комплекс" описывает состояние, где первая связывающая молекула или захватывающая молекула, которая напрямую или ненапрямую присоединена к первой частице, захватившей молекулу-мишень. В этом примере связывание второго связывающего модуля молекула/линкер с молекулой-мишенью, которая была захвачена первой связывающей молекулой, может происходить независимо от времени, т.е. происходить перед его присоединением к поверхности.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления присоединение указанной второй связывающей молекулы к плоской поверхности или второй частице происходит перед или после связывания второй связывающей молекулы с молекулой-мишенью. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения второй связывающей молекуле предоставляется возможность присоединиться к поверхности, предпочтительно посредством линкерной молекулы, как определено в данном документе, в первом этапе анализа или перед началом анализа, который является моментом времени, когда добавляется образец, как определено в данном документе ранее. В таком случае сперва формируется захватывающий комплекс, и в дальнейшем этапе связывается с заранее сформированной поверхностной структурой, содержащей вторую связывающую молекулу, присоединенную к поверхности.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения модуль вторая связывающая молекула - линкер сперва связывается с захватывающим комплексом посредством его специфического связывания с молекулой-мишенью, и целый комплекс захватывающая - вторая связывающая молекула - линкер впоследствии направляется к плоской поверхности или поверхности второй частицы, для того чтобы связать захватывающий комплекс с поверхностью. Предусмотренная концепция проиллюстрирована на фиг. 11. В этом примере имеющее преимущество расстояние генерируется длинным линкером, присоединенным ко второму антителу, тогда как первая связывающая молекула присоединена к поверхности первой частицы напрямую. Другими словами вторая связывающая молекула с прикрепленным длинным и жестким линкером генерирует эффект, приводя к улучшенной кинетике связывания. Этот специфический пример демонстрирует, что скорость распознавания захватывающего комплекса второй связывающей молекулой может быть максимизирована благодаря подобному модульному присоединению, как описано в данном документе выше. Что важно, преимущество по сравнению с уровнем техники заключается в том, что наличие длинного и жесткого линкера, как описано выше в данном документе, приводит к расстоянию, требуемому для улучшения кинетики связывания. Пример, таким образом, демонстрирует, что принцип длинного и жесткого линкера для получения улучшенной кинетики связывания никоим образом не ограничен линкером для присоединения первой связывающей молекулы к первой частице.

Однако также возможно, чтобы обе связывающие молекулы были объединены с длинным линкером для того, чтобы дополнительно увеличить или добавить обеспечивающее преимущество расстояние между первой частицей и плоской поверхностью или поверхностью второй связывающей молекулы.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения детектирование связанных частиц, например, магнитных частиц, происходит с помощью нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR) или с помощью измерения рассеянного света от указанных связанных частиц рядом с поверхностью или посредством оптического детектирования кластерообразования.

Особенно предпочтительными являются устройства обнаружения на основании оптического детектирования частиц, особенно магнитных частиц. Соответствующие подробности могут быть получены из иллюстративного устройства, продемонстрированного на фиг. 1, которое содержит источник света и систему детектирования света и составляет специфический вариант осуществления в соответствии с настоящим изобретением. Оптические способы, применяемые для детектирования, как правило, измеряют изменение светового сигнала, что означает различие в свете, отраженном от магнитных частиц, и которое может быть детектировано оптическим средством. К примеру, такие способы могут содержать технологии, такие как детектирование рассеянного света или детектирование на основании полного внутреннего отражения (TIR) или нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR). Предпочтительно, изменение светового сигнала относится только к тем магнитным частицам, которые связаны посредством связывания второй связывающей молекулы с поверхностью сенсора. Подробности должны быть известны специалисту в данной области или могут быть получены из пригодных источников, таких как Bruls et al., Lab Chip, 2009, 9. 2504-3510.

В применяемом в данном документе значении термин "полное внутреннее отражение" описывает условие, представленное в некоторых материалах, когда свет проникает в один материал из другого материала с более высоким показателем преломления под углом падения большим, чем характерный угол. Характерный угол, при котором это происходит, зависит от показателей преломления обоих материалов, также называется критический угол и может быть рассчитан математически (закон Снеллиуса, преломления). В отсутствии частиц, например, магнитных частиц, не происходит преломления, и световой пучок из источника света является полностью отраженным. Если частица, например, магнитная частица, находится близко к поверхности или в контакте с поверхностью, то световые лучи, как говорят, являются фрустрированными частицей и отражение при этом больше не является полным.

Сигнал, который может быть определен как снижение полного внутреннего отраженного сигнала, может быть рассчитан. Сигнал почти линейно зависит от концентрации частиц на поверхности (поверхностная плотность ñ). Сигнал может быть выражен как:

где S является измеренным изменением сигнала в %, и β является коэффициентом перевода поверхностной плотности в изменение сигнала.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения детектирование связанных частиц, например, магнитных частиц, происходит с помощью нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR) или с помощью измерения рассеянного света от указанных связанных частиц рядом с поверхностью.

Также предусмотрены способы на основании количественного определения кластеров частиц, как описано в Bruls et al., 2009, Lab Chip, 9, 3504-3510. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения детектирование может быть осуществлено посредством детектирования кластеров, содержащих по меньшей мере две частицы, например, магнитные частицы, и по меньшей мере одну молекулу-мишень. К примеру, частица, например, магнитная частица, как определено в данном документе ранее, может образовывать кластеры дополнительно c по меньшей мере одной дополнительной частицей, например, магнитной частицей, при наличии по меньшей мере одной молекулы-мишени, которая должна быть детектирована, которая способна соединять мостиком или объединять обе частицы. В конкретных вариантах осуществления кластер частиц содержит первую и вторую частицу, как описано в этом документе. В особенно предпочтительном варианте осуществления детектирование может быть осуществлено в оптомагнитной системе, в которой указанные частицы являются магнитными частицами, которые приведены в движение магнитом и оптически детектированы в стационарном образце жидкости, со следующими этапами: (i) захват молекулы-мишени, например, как определено в данном документе выше, (ii) магнитное приведение в движение и (iii) детектирование.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению частицы, как определено в данном документе, например, магнитной частицы, для детектирования молекулы-мишени в образце, например, образец, как определено в данном документе выше.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула-мишень, как упомянуто в контексте устройства, способа или применения, как описано выше в данном документе, представляет собой сердечный тропонин I (cTnI), NT-proBNP или паратиреоидный гормон. Настоящее изобретение также нацелено на детектирование дополнительных молекул-мишеней или классов молекул-мишеней. Особенно предпочтительным является сердечный тропонин I (cTnI).

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Применение длинной дцДНК в качестве линкера

Длина (удлинение) линкера анализировали в серии экспериментов. С этой целью длинную дцДНК, которая является очень жесткой молекулой и, следовательно, также приводит в результате к значительному удлинению от поверхности, применяли в качестве линкера. В частности, покрытые стрептавидином 500 нм частицы инкубировали с дцДНК варьирующейся длины. Каждая молекула ДНК содержала одну группу биотина на одном конце молекулы ДНК, молекулу техасского красного на другом конце молекулы. Раствор, содержащий частицы и ДНК, вводили в картридж и связывали с поверхностью сенсора, покрытой антителами против техасского красного с применением магнитного притяжения. После этапа магнитного промывания, в котором удаляли несвязанные частицы с поверхности, определяли количество частиц, связанных поверхностью.

Было обнаружено, что кинетика связывания частицы с поверхностью была значительно улучшена. К примеру, для магнитных наночастиц со средним диаметром приблизительно 500 нм, наблюдали оптимальную длину дцДНК приблизительно 700 пар оснований (п.о.), соответствующую контурной длине приблизительно 240 нм и среднему удлинению приблизительно 140 нм (смотрите фиг. 6).

Схожий эксперимент осуществляли с покрытыми стрептавидином 1000 нм частицами. Как можно увидеть на фиг. 7, оптимальная длина линкера из 1000 п.о. (соответствующего контурной длине приблизительно 340 нм) также была примерно в два раза больше. Исходя из этих измерений оптимальная контурная длина ДНК, по-видимому, составляет примерно 2/3 радиуса частицы.

Пример 2 - Эффект поверхностной плотности линкера на кинетику связывания

Эффект поверхностной плотности линкера на кинетику связывания испытывали в формате анализа с применением 500 нм частицы, покрытой стрептавидином, которая связана с одиночной "молекулой-мишенью", цепью дцДНК с биотином на одном конце и молекулой техасского красного, присоединенной к другому концу (смотрите фиг. 9, панель слева, ромб), которая доступна для связывания с поверхностью сенсора, покрытой антителами против техасского красного. Впоследствии, различные количества нефункциональной дцДНК такой же длины (но без молекулы техасского красного) связывали с частицей, а также сравнивали способность частиц связываться с поверхностью сенсора.

В дополнительном эксперименте частицу нагружали дцДНК из 1999 п.о. фиг. 9, средняя панель, демонстрирует относительное количество частиц, связывающихся при нагрузке нефункциональной ДНК по сравнению с частицей только с одной "функциональной" молекулой ДНК.

В дополнительном эксперименте частицу нагружали дцДНК из 497 п.о. фиг. 9, нижняя панель, демонстрирует относительное количество частиц, связывающихся при нагрузке нефункциональной ДНК, по сравнению с частицей только с одной "функциональной" молекулой ДНК.

1. Устройство для детектирования молекулы-мишени в образце, содержащее:

(a) контейнер для образцов для количественного определения молекулы-мишени в образце,

(b) по меньшей мере одну первую частицу, где указанная первая частица функционализирована первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью, и

(c) поверхностную структуру, содержащую вторую связывающую молекулу, где указанная поверхностная структура покрывает плоскую поверхность или присутствует на по меньшей мере одной второй частице,

где указанная первая частица, образовавшая захватывающий комплекс с молекулой-мишенью, способна к связыванию указанной второй связывающей молекулы поверхностной структуры напрямую или ненапрямую; где каждая указанная первая и/или вторая связывающая молекула присоединена к поверхности частицы одной из указанных первой и/или второй частиц и/или указанной плоской поверхности посредством длинной и жесткой линкерной молекулы; где длина указанной линкерной молекулы выбрана так, чтобы в результате была получена средняя протяженность удлинения указанного линкера более 60 нм; и где количество кластеров первых и/или вторых частиц, связанных друг с другом, или связанных первых и/или вторых частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

2. Устройство по п. 1, где диаметр указанной первой и/или второй частицы составляет по меньшей мере приблизительно 100 нм и где указанная средняя протяженность удлинения составляет по меньшей мере 10% диаметра при условии, что она составляет более 60 нм.

3. Устройство по п. 1, где жесткая линкерная молекула имеет среднюю протяженность удлинения по меньшей мере 20% от контурной длины указанной линкерной молекулы.

4. Устройство по п. 1, где диаметр указанной первой и/или второй частицы составляет по меньшей мере приблизительно 100 нм и где жесткая линкерная молекула имеет среднюю протяженность удлинения по меньшей мере 20% от контурной длины указанной линкерной молекулы.

5. Устройство по любому из пп. 1-4, где указанная первая связывающая молекула представляет собой антитело или его фрагмент, аптамер, лиганд или комплементарную нуклеиновую кислоту.

6. Устройство по любому из пп. 1-4, где указанная линкерная молекула представляет собой или содержит молекулу нуклеиновой кислоты или небиологический полимер, при этом предпочтительно указанная линкерная молекула представляет собой или содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцДНК, ПНК, дуплекс ПНК-ДНК и дуплекс РНК-ДНК.

7. Устройство по любому из пп. 1-4, где указанная первая частица дополнительно содержит отталкивающую поверхностную структуру, где указанная отталкивающая поверхностная структура покрывает поверхность первой частицы так, чтобы в результате были получены специфический ненулевой результирующий электрический заряд и/или стерическое отталкивание так, что указанная отталкивающая поверхностная структура переносит отталкивающий эффект на указанные первые частицы к указанной сенсорной поверхности, где предпочтительно средняя протяженность удлинения указанной линкерной молекулы длиннее средней протяженности удлинения указанной отталкивающей поверхностной структуры.

8. Устройство по п. 7, где указанная отталкивающая поверхностная структура представляет собой заряженную структуру, предпочтительно содержащую

молекулу, выбранную из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, такой как дцДНК, ПНК, дуплекс ПНК-ДНК, дуплекс РНК-ДНК; или

заряженный гидрогель, полимер или стерическое покрытие.

9. Устройство по п. 7, где указанная линкерная молекула и/или указанная отталкивающая поверхностная структура не расщепляются ДНКазой и/или рестрикционным ферментом, способным к разрезанию двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.

10. Устройство по п. 8, где указанная линкерная молекула и/или указанная отталкивающая поверхностная структура не расщепляются ДНКазой и/или рестрикционным ферментом, способным к разрезанию двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.

11. Устройство по любому из пп. 1-4, где указанная линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер, предпочтительно короткий гибкий спейсер, содержащий одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

12. Устройство по п. 5, где указанная линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер, предпочтительно короткий гибкий спейсер, содержащий одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

13. Устройство по п. 6, где указанная линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер, предпочтительно короткий гибкий спейсер, содержащий одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

14. Устройство по п. 7, где указанная линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер, предпочтительно короткий гибкий спейсер, содержащий одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

15. Устройство по п. 8, где указанная линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер, предпочтительно короткий гибкий спейсер, содержащий одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

16. Устройство по п. 9, где указанная линкерная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один короткий гибкий спейсер, предпочтительно короткий гибкий спейсер, содержащий одноцепочечную нуклеиновую кислоту.

17. Устройство по любому из пп. 1-4, где указанная первая и/или вторая частица представляет собой магнитную частицу.

18. Устройство по п. 5, где указанная первая и/или вторая частица представляет собой магнитную частицу.

19. Устройство по п. 6, где указанная первая и/или вторая частица представляет собой магнитную частицу.

20. Устройство по п. 7, где указанная первая и/или вторая частица представляет собой магнитную частицу.

21. Устройство по любому из пп. 1-4, где указанная молекула-мишень представляет собой сердечный тропонин I (cTnI).

22. Способ детектирования наличия или количества молекулы-мишени в образце, содержащий стадии:

(a) приведения образца в контакт с по меньшей мере одной первой связывающей молекулой, способной к специфическому связыванию с указанной молекулой-мишенью и присоединенной к первой частице в устройстве по любому из пп. 1-4, и

(b) приведения образца в контакт с

i) по меньшей мере одной второй связывающей молекулой, способной к присоединению к плоской поверхности или второй частице, и необязательно

ii) аналогом молекулы-мишени, присоединенным к плоской поверхности или второй частице; где указанная молекула-мишень способна препятствовать связыванию первой связывающей молекулы с указанным аналогом молекулы-мишени; и

(c) детектирования количества первой частицы, связанной с указанной плоской поверхностью или указанной второй частицей,

где количество кластеров частиц, связанных друг с другом, или связанных первых и/или вторых частиц прямо или обратно пропорционально соотносится с количеством молекул-мишеней, представленных в образце.

23. Способ по п. 22, где сила магнитного поля применяется для приведения частиц в непосредственную близость с указанной плоской поверхностью или друг с другом, для того чтобы облегчить кластеризацию частиц.

24. Способ по п. 22, где присоединение указанной второй связывающей молекулы к плоской поверхности или второй частице происходит до или после связывания указанной второй связывающей молекулы с молекулой-мишенью.