Способ диагностики врожденной миопатии центрального стержня



Владельцы патента RU 2641038:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано в диагностике в миопатии центрального стержня. Проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV: готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания, и затем наносят вторичные флуоресцентные антитела и фотозащитный реагент с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа. Осуществление изобретения позволяет повысить надежность диагностики миопатии центрального стержня за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах. 2 ил.,1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано для диагностики миопатии центрального стержня.

Миопатия центрального стержня - один из вариантов врожденной непрогрессирующей миопатии, ассоциированный с появлением зон сниженной энзиматической активности в мышечных волокнах. Дифференциальный диагноз миопатии центрального стержня следует проводить с другими болезнями и синдромами, при которых наблюдается феномен возникновения подобных зон. (Dubowitz V., Sewry С.А., Oldfors A. Muscle biopsy. Saunders Elsevier, 2013, pp. 361-371).

Изменения типичные для данной болезни не могут быть установлены при гематоксилин-эозиновой окраске фиксированного в формалине и залитого в парафин материала.

Известен способ морфологического выявления миопатии центрального стержня посредством трансмиссионной электронной микроскопии (Шаталов П.А., Сухоруков B.C., Харламов Д.А., Брыдун А.В., Глинкина В.В., Влодавец Д.В., Виноградская И.С., Суслов В.Б., Лихачева Л.М. Электронно-микроскопические критерии дифференциальной диагностики врожденной миопатии центрального стержня у человека / Вестник РГМУ, 2012, №5, с. 66-70). Срезы толщиной около 80 нм из блоков мышечных биоптатов, залитых в аралдит, готовят на ультратоме как в поперечном, так и в продольном направлении. Анализ изображения проводят с помощью электронного микроскопа JEOL 1200ЕХ или аналогичного ему с гониометром и вращающимся держателем образцов. Признаком миопатии центрального стержня служит обнаружение продольных и поперечных срезов мышечных волокон, характеризующихся наличием очагов атрофии и расщепления миофиламентов, вакуолизацией и деструкцией митохондрий. Однако этот способ имеет недостатки: трудоемкость метода электронной микроскопии, низкая специфичность, повышенная частота как ложно-отрицательных, так и ложно-положительных ответов из-за малого поля зрения.

Таким образом, морфологическая диагностика, обладающая значительно большей чувствительностью, чем молекулярно-генетическое исследование, тем не менее, остается чрезвычайно трудоемким и капризным методом выявления признаков миопатии центрального стержня. В связи с этим чрезвычайно актуально расширение спектра морфологических методов, способных выявлять маркеры центральностержневой миопатии.

Наиболее близким аналогом к патентуемому (прототипом) является способ выявления центральных стержней с помощью метода с нитро-СТ для выявления сукцинатдегидрогеназы (по Нахласу и др., 1957) (Э. Пирс. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. Издательство иностранной литературы, Москва, 1962, стр. 844). В соответствии с этим методом срезы из свежезамороженной ткани, изготовленные в криостате и заключенные под покровные стекла, инкубируют при 37°С на воздухе в течение 5-20 минут в среде, включающей в себя 10 мл основного раствора сукцината и 10 мл водного раствора нитро-СТ (1 мг/мл). После чего промывают солевым раствором и фиксируют в 10% формалин-солевом растворе в течение 10 минут. Затем промывают в 15% спирте в течение 5 минут и заключают в глицерин-желатин. В результате синий осадок формазана отлагается в структурах, обладающих сукцинатдегидрогеназной активностью.

Недостатком этого метода является необходимость использования только свежезамороженных срезов непосредственно после взятия мышечной биопсии, а также относительно низкая специфичность и большая вероятность получения ложно-положительных результатов.

Задачей изобретения является создание надежного и чувствительного морфологического метода диагностики врожденной миопатии центрального стержня.

Техническим результатом является повышение надежности диагностики миопатии центрального стержня за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для диагностики миопатии центрального стержня у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани. Проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV. Для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют с моноклональными антителами мыши к белку наружной митохондриальной мембраны. После промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела. После промывки наносят моноклональные антитела к митохондриальному комплексу IV и вновь промывают. После чего наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела. После промывки покрывают фотозащитным реагентом и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. При выявлении в центре мышечного волокна локусов округлой и/или овальной формы, характеризующихся отсутствием окраски митохондриального комплекса IV при сохранении в указанных зонах окраски маркера наружной митохондриальной мембраны, диагностируют миопатию центрального стержня.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного с признаками врожденной миопатии с целью дифференциальной диагностики проводят иммуногистохимическое выявление двух митохондриальных маркеров - маркера наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV. Для этого после взятия мышечной биопсии проводят химическую фиксацию материала в 10% нейтральном (рН-7,4) забуференном формалине в течение 24 часов, после чего материал обезвоживают с использованием ксилола и заливают в парафин. С парафиновых блоков получают срезы толщиной 4 мкм, которые наносят на высокоадгезивные стекла, а затем высушивают в течение 24 часов при температуре 48°С.

Срезы депарафинируют поочередно в трех порциях ксилола по 5 минут в каждом, регидрируют трехкратно в 96% спиртовых растворах по 5 минут в каждом, промывают в дистиллированной воде 3 раза по 5 минут. Затем на 30 минут на образцы наносят усилитель флуоресцентного сигнала (Image-iT FX signal enhancer, Thermo Fisher Scientific), с последующей промывкой в фосфатном буфере (PBS).

На следующем этапе на срезы на 30 минут наносят белок-блокатор (Novocastra Protein Block, Leica) для уменьшения фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют во влажной камере в течение 60 минут при комнатной температуре с моноклональными антителами мыши к белку наружной митохондриальной мембраны (Thermo Fisher Scientific, США; разведение 1:1000). После чего срезы промывают в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут и на 60 минут на них наносят соответствующие вторичные флуоресцентные антитела (антитела к моноклональным антителам мыши) (Антитела козы к IgG мыши (Alexa Fluor 488) Thermo Fisher Scientific, США, Разведение 1:2000). Затем срезы промывают в фосфатном буферном растворе 3 раза по 5 минут, после чего инкубируют во влажной камере в течение 60 минут при комнатной температуре с моноклональными антителами мыши к митохондриальному комплексу IV (Thermo Fisher Scientific, США; разведение 1:1000). После чего срезы промывают в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут и на 60 минут на них наносят соответствующие вторичные флуоресцентные антитела (антитела к моноклональным антителам мыши) (Антитела козы к IgG мыши (Alexa Fluor 555) Thermo Fisher Scientific, США, Разведение 1:2000). Затем срезы промывают в фосфатном буферном растворе 3 раза по 5 минут и покрывают фотозащитным реагентом ProLong Gold (страна производитель США) и заключают под покровные стекла.

При последующем анализе с помощью люминесцентного микроскопа при миопатии центрального стержня в центральных участках мышечных волокон определяются округлые или овальные локусы отсутствия флуоресценции маркера митохондриального комплекса IV при наличии флуоресценции маркера наружной митохондриальной мембраны. При других формах врожденных миопатий подобный феномен не обнаруживается.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Клинический пример 1.

Пациенту 9 лет с клиникой врожденной миопатии проведено исследование скелетной мышечной ткани по предлагаемому способу. Приводим описание микрофотографии. Скелетная мышечная ткань, увеличение х400. Иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера наружной митохондриальной мембраны (зеленый) (Фиг. 1). Определяются выраженные округлые скопления маркера наружной митохондриальной мембраны в центре мышечного волокна (стрелка). На этом же срезе было исследовано иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера митохондриального комплекса IV (красный) (Фиг. 2). Увеличение х400. Определяются зоны отсутствия флуоресценции данного маркера (стрелка). Диагностирована миопатия центрального стержня. При исследовании биоптата скелетных мышц, окрашенного по методу с нитро-СТ для выявления сукцинатдегидрогеназы, диагноз верифицирован.

Способ диагностики миопатии центрального стержня, при котором у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани, проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV, для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор для уменьшения фонового неспецифического окрашивания, затем срезы инкубируют с моноклональными антителами мыши к наружной митохондриальной мембране, после промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, после чего инкубируют с моноклональными антителами мыши к митохондриальному комплексу IV, промывают и наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, промывают, покрывают фотозащитным реагентом и проводят люминесцентную микроскопию, а при выявлении в центре мышечного волокна локусов округлой и/или овальной формы, характеризующихся отсутствием флуоресценции маркера митохондриального комплекса IV при сохранении в указанных зонах флуоресценции маркера наружной митохондриальной мембраны, диагностируют миопатию центрального стержня.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии. Предложен способ морфологической диагностики тяжести преэклампсии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к бис-Met-гистонам, и может быть использовано в медицине. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим гистоном H1.
Изобретение используют в медицине, педиатрии, инфекционных болезнях и касается способа оценки активности инфекции, вызванной вирусами герпеса 4, 5, 6 типа у детей. Сущность способа: у детей с подозрением на герпесвирусную инфекцию (ГВИ) 4, 5, 6 типа определяют количество ДНК вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соскобе из эпителия ротоглотки и при количестве ДНК более 1000 копий на 105 клеток для 4 типа ГВИ, и более 10000 копий на 105 клеток для 5 и 6 типа ГВИ, определяют активную стадию инфекции.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено гуманизированное антитело, специфичное к STEAP-1, и его антигенсвязывающий фрагмент.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложены антитело и его фрагмент, которые связываются с фосфо-эпитопом на белке Тау, а также кодирующие их полинуклеотиды; линии клеток, продуцирующие антитела; вектор, содержащая его клетка-хозяин и способ получения антитела и его функционального фрагмента.

Способ определения стадии грибовидного микоза относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может быть использован для определения стадии грибовидного микоза - наиболее часто встречаемой нозологической разновидности первичных кожных лимфом.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, перинатологии и клинической иммунологии, и предназначено для прогнозирования эффективности стандартного лечения задержки роста плода.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и онкогематологии, и может быть использовано для контроля качества исследуемого образца при мониторинге минимальной резидуальной болезни при множественной миеломе методом проточной цитофлуориметрии аспирата костного мозга.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для визуализации биологических объектов. Для этого осуществляют мечение анализируемых клеточных компонент, клеток, тканей или органов флуоресцентными зондами.

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии и эндокринологии, и представляет собой способ диагностики степени тяжести гиперандрогении, включающий определение индекса свободного тестостерона (ИСТ) на основе глобулина, связывающего половые стероиды, и тестостерона крови, отличающийся тем, что ИСТ рассчитывают по формуле где Тобщий – уровень общего тестостерона, нмоль/л, ГСПС – уровень глобулина, связывающего половые стероиды, нмоль/л, и при величине ИСТ от 31 до 36 и наличии клинических проблем, выбранных из гирсутизма, дермопатии и нарушений менструального цикла, диагностируют легкую степень тяжести заболевания, при величине ИСТ от 36 до 100 диагностируют среднюю степень тяжести заболевания, а при величине ИСТ более 100 диагностируют тяжелую степень тяжести заболевания.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения степени индивидуального генетического риска атеросклероза, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда. Изобретение основано на измерении степени гетероплазмии мтДНК по мутациям 652ins/delG, A750G, A1555G, С3256Т, Т3336С, С5178А, 8516insА/С/АС, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A и A15326G. Измеренные показатели гетероплазмии используют в качестве переменных величин в формуле, по которой рассчитывают степень суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома. При превышении порогового значения данного показателя, принятого равным 40,3 балла, диагностируют наличие атеросклероза и индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложены способ диагностики рака предстательной железы и способ мониторинга реакции на терапию рака предстательной железы, включающие контактирование раковых клеток эпителиального происхождения с анти-STEAP-l антителом, которое специфически связывается с простата-специфическим маркером STEAP-1 с KD≤1000 нМ, где анти-STEAP-1 антитело представляет собой антитело 15А5, продуцированное клеткой гибридомы, имеющей номер депонирования микроорганизмов РТА-12259. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные способы диагностики и мониторинга рака предстательной железы. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к средствам исследования и диагностики с помощью биочипов. Способ селективного анализа на основе иммунологических реакций с использованием биочипов включает подготовку пробы, смешение антигенов пробы с суперпарамагнитными частицами, соединенными с антителами к указанным антигенам пробы, транспортировку смеси в зону селективного детектирования по имуннологическим реакциям через капилляры и воздействие на смесь магнитным полем. При этом воздействие магнитным полем осуществляют во время прохождения смеси через капилляры, перемещая его вдоль капилляров по направлению от входа в них смеси до выхода, причем используют изменяющееся во времени и в пространстве неоднородное магнитное поле. После прохождения по капиллярам смесь последовательно перемещают магнитным полем через все зоны селективного детектирования по имуннологическим реакциям. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности. 1 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к средствам исследования и диагностики с помощью биочипов. Способ селективного анализа на основе иммунологических реакций с использованием биочипов включает подготовку пробы, смешение антигенов пробы с суперпарамагнитными частицами, соединенными с антителами к указанным антигенам пробы, транспортировку смеси в зону селективного детектирования по имуннологическим реакциям через капилляры и воздействие на смесь магнитным полем. При этом воздействие магнитным полем осуществляют во время прохождения смеси через капилляры, перемещая его вдоль капилляров по направлению от входа в них смеси до выхода, причем используют изменяющееся во времени и в пространстве неоднородное магнитное поле. После прохождения по капиллярам смесь последовательно перемещают магнитным полем через все зоны селективного детектирования по имуннологическим реакциям. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности. 1 ил.

Изобретение относится к биохимии. Предложены способы обнаружения человеческого антитела изотипа IgE против омализумаба. Также рассмотрены наборы, способы идентификации пациента, имеющего риск анафилактической реакции на омализумаб, и способ лечения пациента, имеющего IgE-опосредованное нарушение. Данное изобретение позволяет своевременно обнаруживать аллергические реакции на омализумаб и может найти применение в терапии и предупреждении развития анафилаксии. 9 н. и 43 з.п. ф-лы, 27 ил., 7 табл., 7 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ количественной оценки и характеризации агрегатов А-бета, включающий следующие стадии, на которых: а) осуществляют иммобилизацию захватывающих молекул на субстрате, б) наносят предназначенный для тестирования образец и внутренний стандарт на субстрат, в) добавляют меченые с целью детекции зонды, которые метят агрегаты А-бета посредством специфического связывания с ними, и г) определяют количество и размер маркированных агрегатов А-бета с пространственным разрешением в каждом случае по сравнению с соответствующим фоном, при этом стадию б) можно осуществлять до осуществления стадии в). Также представлен набор для осуществления описанного способа, содержащий стандарт и один или несколько из следующих компонентов: стеклянный субстрат с нанесенным покрытием из гидрофобной субстанции; захватывающую молекулу; зонд; субстрат с захватывающей молекулой; растворы; и буфер. Также представлен способ определения эффективности действующих веществ и/или терапий, предназначенных для лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что а) осуществляют иммобилизацию захватывающих молекул на субстрате, б) наносят предназначенный для тестирования образец и внутренний стандарт на субстрат, в) добавляют меченые с целью детекции зонды, которые метят агрегаты А-бета посредством специфического связывания с ними, и г) определяют количество и размер маркированных агрегатов А-бета с пространственным разрешением в каждом случае по сравнению с соответствующим фоном, при этом стадию б) можно осуществлять до осуществления стадии в), д) сравнивают результаты, полученные на образцах, которые представляют собой образцы биологической жидкости организма, взятые до или в различные моменты времени после введения действующих веществ и/или применения терапии, с результатами, полученными для контроля, который не обрабатывали действующим веществом и/или не подвергали терапии, и на основе полученных результатов отбирают действующие вещества и/или терапии, после применения которых наблюдалось снижение количества агрегатов А-бета. Изобретение расширяет арсенал средств, предназначенный для определения эффективности лечения болезни Альцгеймера. 3 н. и 40 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описано антитело для снижения концентрации антигена в плазме, содержащее антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, активность связывания антигена которого отличается в двух различных условиях концентрации кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция, где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ, а высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ, где указанное антитело содержит по крайней мере четыре аминокислоты, выбранные из группы, включающей аминокислоты в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 в соответствии с нумерацией по Kabat в легкой цепи, которые обладают хелатирующей активностью в отношении металла. А также описана фармацевтическая композиция, содержащая данное антитело. Изобретение может быть использовано для ускорения захвата антигенсвязывающими молекулами антигена в клетки, увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой, ускорения снижения концентрации антигена в плазме и увеличения удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме, а также антигенсвязывающих молекул. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 56 ил., 28 табл., 25 пр.

Изобретение относится к соединению формулы (I) ,где R1 и R2 вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С3-С10-циклоалкил; R3 представляет собой Н или С1-С12-алкил; R4 представляет собой Н; W представляет собой связь; А представляет собой фенил, замещенный R8, R9 и R10; В представляет собой фенил, замещенный R11, R12 и R13; R8 R9 R10 независимо выбраны из Н, галоген-С1-С12-алкила, галогена; R11, R12 и R13 независимо выбраны из Н, галогена; или их фармацевтически приемлемые соли. Также предложены фармацевтическая композиция, применение соединения формулы (I) и способ лечения и профилактики сахарного диабета 2 типа, атеросклероза, рака, хронической почечной недостаточности и неалкогольного стеатогепатита. Соединение формулы (I) ингибирует активность белков FABP4 и FABP5 и может применяться для лечения и профилактики указанных выше заболеваний. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 17 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска преждевременных родов. Способ прогнозирования преждевременных родов у беременных с ретрохориальной гематомой (РХГ) характеризуется тем, что в срок от 11 недель до 13 недель и 6 дней анализируют уровень β-субъединицы плацентарного гормона ХГЧ и белка РАРР-А, выраженных в МоМ, при этом у беременных с РХГ объемом более 1 см3 и уровнем РАРР-А менее 0,7 МоМ риск развития преждевременных родов возрастает в 9,5 раз, а при РХГ того же объема и уровнем β-субъединицы ХГЧ менее 0,4 МоМ риск развития преждевременных родов возрастает в 5,5 раз. 4 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области медицины и лабораторных методов диагностики и представляет собой способ дифференциальной диагностики тремора головы и верхних конечностей, заключающийся в том, что в сыворотке крови определяют концентрацию серотонина и при его значении 200 нг/мл и выше определяют дистонический тремор при цервикальной дистонии, ниже 200 нг/мл - тремор при болезни Паркинсона. Результатом осуществления изобретения является объективизация и стандартизация способа диагностики. 4 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано в диагностике в миопатии центрального стержня. Проводят иммуногистохимическое выявление маркеров наружной митохондриальной мембраны и митохондриального комплекса IV: готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания, и затем наносят вторичные флуоресцентные антитела и фотозащитный реагент с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа. Осуществление изобретения позволяет повысить надежность диагностики миопатии центрального стержня за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах. 2 ил.,1 пр.

Наверх