Улучшенные липосомальные составы липофильных соединений

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к липосомальному препарату для лечения рака, содержащему суспензию липосом в водной фазе, при этом указанные липосомы содержат, по меньшей мере, одну липосомальную мембрану, в которой присутствует до 5 моль%, по меньшей мере, одного терапевтически активного вещества, имеющего log Р более 1 и представляющего собой таксан, а в водной фазе присутствует, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество, причем осмолярность водной фазы внутри липосом, О_вн, выше осмолярности водной фазы снаружи липосом, О_нар, и разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм. Изобретение также относится к вариантам способа получения такого липосомального препарата и к его применению для лечения рака. Группа изобретений обеспечивает увеличение эффективности загрузки липосом активным агентом и улучшение стабильности составов. 8 н. и 31 з.п. ф-лы, 2 ил., 18 табл.,1 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к получению липосом с увеличенным объемом загрузки в отношении фармацевтических и/или диагностических активных веществ и/или косметических средств, которые, по существу, солюбилизируются липосомальными мембранами, к липосомальным дисперсиям с повышенной стабильностью в отношении высвобождения активного вещества и/или косметического вещества из липосом, получаемых данным способом, и фармацевтическим или косметическим композициям, содержащим указанные стабилизированные липосомальные дисперсии. Изготовление может включать стадии дегидратации, которая может осуществляться с помощью распылительной сушки, и регидратации липосомальных дисперсий.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Липосомы представляют собой искусственные везикулярные структуры, образованные одной или многими мембранами, заключающими в себе водную камеру. Наиболее типично, когда мембраны липосом образованы липидными бислоями, но они могут состоять также из других мономерных и полимерных амфифильных соединений, включая другие виды амфифильных соединений, полимеры и полипептиды (Antonietti and Forster 2003). Липосомы образуются спонтанно, когда липиды диспергируют в водной среде в соответствующих условиях. Большинство липосом нетоксичны, неантигенны и биоразрушаемы по свойствам, так как они имеют молекулярные характеристики мембран млекопитающих. Липофильные и амфифильные лекарственные средства могут быть включены в липосомальную мембрану, гидрофильные лекарственные средства и соединения могут быть инкапсулированы в водных ядрах липосом.

В последние годы липосомы стали важным средством фармацевтической промышленности для доставки лекарственных средств (Gregoriadis, 1995). Липосомы способны влиять на фармакокинетику путем поддержания постоянного высвобождения лекарственного средства в организм или снижать побочные эффекты посредством ограничения концентрации свободного лекарственного средства. При соединении лигандов с липосомой или придании им заряда, липосомы облегчают направленную доставку лекарственных средств в желаемое место действия. Кроме фармацевтического использования, липосомы часто используют также для косметических продуктов.

Если липосомы используют для введения активных веществ при фармацевтическом или косметическом использовании, важно регулировать и оптимизировать эффективность загрузки активного соединения в липосомальном составе и стабильность липосомального состава, нагруженного активным или косметическим соединением. Стабильность состава является решающей характеристикой во время производства, хранения и применения состава. Во многих случаях физическая или химическая стабильность липосомальных продуктов ограничена, что нужно принимать во внимание при планировании процессов производства (время промежуточного хранения), хранения и применения продукта (стабильность во время использования).

При фармацевтическом использовании липосомальные составы часто вводятся путем инъекции. Таким образом, липосомы должны присутствовать в водной фазе в условиях, подходящих для внутривенного (в/в) или внутрибрюшинного (в/б) введения.

К фармацевтическим липосомальным составам предъявляются чрезвычайно строгие критерии качества. Большинство существующих жидких липосомальных продуктов нестабильны при длительном сроке хранения, так как они могут подвергаться ряду химических и физических процессов деградации. Однако в отношении фармацевтических продуктов желательно иметь конечные составы, которые стабильны в течении по меньшей мере от шести месяцев до двух лет при комнатной температуре или при температуре холодильника. Эти факторы ограничивают использование липосом как практических носителей биологически активных соединений. Что касается липосом, были разработаны методики дегидратации, чтобы они соответствовали этим требованиям.

Длительная стабильность липосомальных составов значительно повышается, когда они дегидратируются и хранятся в виде сухих, а не жидких препаратов. Перед инъекцией сухие липосомальные продукты нужно регидратировать в соответствующей водной среде, образующей водные суспензии для введения. Так как стабильность регидратированных липосомальных составов опять может быть ограничена химическими и физическими процессами деградации, повышение стабильности при использовании указанной готовой для использования липосомальной суспензии является другой важной целью технологии изготовления фармацевтических составов.

Обычно применяемый метод стабилизации для водных липосомальных суспензий путем лиофилизации описан в патентах США № 4229360 и 4247411. При процессе лиофилизации липосомальную суспензию замораживают, а затем помещают под пониженное давление, что приводит к удалению замороженной воды путем сублимации. Обычно водная суспензия содержит вспомогательное вещество, такое как сахар, для предотвращения или сведения к минимуму образования дефектов, вызываемых замораживанием и дегидратацией. Процедура сушки дает в результате липосомы в защитном матриксе вспомогательного вещества, из которого после регидратации должен быть получен предшествующий жидкий препарат. Как описано в патенте США 4880635 липосомы могут быть защищены от повреждающего действия этапов дегидратации и регидратации путем присутствия защитного сахара не только снаружи, но также и внутри липосомы.

Метод распылительной сушки, который описан, например, в патенте США 5089181, представляет альтернативный способ получения стабильного дегидратированного липосомального состава. Данный процесс был заимствован из пищевой промышленности и адаптирован, и при нем используют распыление суспензий в мелкие капли путем пульверизации указанной суспензии и последующего испарения среды из капелек при повышенной температуре. Подобно процессу лиофильной сушки, липосомальная суспензия может содержать вспомогательное вещество, такое как сахар, для защиты липосомальных мембран. По сравнению с липофилизацией, процесс распылительной сушки имеет значительные преимущества в отношении крупномасштабного промышленного применения, так как он обеспечивает возможность более крупномасштабного производства при более низкой стоимости и с легко регулируемыми технологическими работами. Однако повышенная температура, связанная с этим способом оказывает сильное воздействие на инкапсулированное активное вещество, а также на липидные мембраны.

Для стабилизации суспензий, которые содержат водорастворимое лекарственное вещество, инкапсулированное в липосомы, при распылительной сушке в патенте США 4895719 описано уравновешивание высокой внутренней осмолярности, создаваемой высокой внутренней концентрацией растворимого лекарственного средства с помощью одинаково высокой осмолярностью окружающей среды.

Для стабилизации гидрофобных лекарственных средств в водной фазе липосом, в WO 2007/005754 описано образование комплексов таких лекарственных средств с циклодекстринами перед инкапсулированием. Гидрофобное лекарственное средство в составе комплекса сохраняется в липосоме в высокой концентрации даже при наличии трансмембранного осмотического градиента, создаваемого циклодекстрином. Однако стабилизация активных веществ, помещенных в липосомальную мембрану, не описана.

Наличие растворимых веществ, которые осмотически активны, таких как сахара или ионы, внутри или снаружи мембран липосом создает осмотические силы. Путь, по которому действует трансмембранный осмотический градиент на структуру и динамику биологических мембран, был исследован и представлен в литературе, и предложены модели для описания феномена, подобного взаимосвязи между напряжением и деформацией, и лизиса (Ertel, Marangoni et al. 1993; Hallett, Marsh et al. 1993). В кратком изложении, эксперименты данных авторов и сопровождающий анализ обращают внимание на то, что набухание липосом при данном осмотическом воздействии зависит от их размера. Определяющий момент для выхода, как описано, зависит от набухания до размера, при котором происходит лизис (истечение). Представлены условия, при которых липосомы, как предполагают, находятся в постоянно растянутом состоянии.

В отношении продукции липосом, содержащих липофильное лекарственное вещество, которые имеют повышенный срок хранения, в WO 2004/002468 описано получение липосом, которые содержат паклитаксел. Липосомы образуются в водном буфере, содержащем трегалозу, с получением в результате суспензии липосом, имеющей одинаковую осмолярность внутри и снаружи липосомы. Водную суспензию липосом затем дегидратируют. Процесс дегидратации можно осуществлять путем лиофилизации или распылительной сушки. В данной заявке описано несколько методик лиофилизации указанных липосомальных суспензий. После дегидратации липосомальный препарат может быть регидратирован путем добавления воды или водного раствора. Данный документ не предоставляет сравнительных данных по стабильности при использовании липосомальных препаратов, которые были дегидратированы путем лиофилизации или путем распылительной сушки до их регидратации.

Принимая во внимание описанное состояние в данной области, проблемой, лежащей в основе данного изобретения, было получение липосом, содержащих, по меньшей мере, одно липофильное активное вещество и/или косметическое средство с высоким отношением действующего вещества к липиду и с улучшенной стабильностью, особенно в отношении физической стабильности и высвобождения действующего вещества из липосом. В частности, данное изобретение относится к проблеме предоставления способа производства указанных липосомальных препаратов, которые имеют увеличенное время промежуточного хранения и стабильности при использовании, причем данный способ включает быструю стадию дегидратации.

Таким образом, решение представленной выше проблемы достигается в соответствии с данным изобретением путем предоставления вариантов осуществления, характеризуемых в формуле изобретения и дополнительно представленных в описании данного изобретения.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Решение представленной выше проблемы обеспечивается с помощью липосомальных препаратов, в которых растягивающее напряжение на липосомальных мембранах обеспечивается осмотическими силами, и способа получения указанных липосом.

В частности, решение обеспечивается с помощью способа получения липосомальной суспензии в водной фазе с, по меньшей мере, одним активным веществом и/или косметическим средством, присутствующим в липосомальной мембране, причем указанная суспензия содержит, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество в водной фазе, и причем осмолярность водной фазы внутри инкапсулированного в липосомах объема, О_вн, выше, чем у водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомы объема, О_нар.

Данные липосомы характеризуются наличием растягивающего напряжения на липосомальных мембранах (напряженные липосомы). Они могут быть получены непосредственно во время образования липосом или на любой стадии переработки после образования липосом.

Напряженные липосомы могут быть получены путем непосредственного воздействия на осмолярность водной фазы внутри и/или снаружи липосом или путем изменения характеристик мембраны, таких как упаковка молекул липосомальной мембраны, когда липосомы присутствуют в среде данной осмолярности.

Напряженные липосомы могут быть получены непосредственно с активным веществом и/или косметическим средством, присутствующими в мембране липосомы. Альтернативно, напряженные липосомы могут быть получены без данного вещества, которое затем добавляют в липосомы.

Один из аспектов данного изобретения относится к способу производства липосомального препарата, включающему:

а) получение первого липосомального препарата, состоящего из суспензии липосом в водной фазе, причем липосомы содержат, по меньшей мере, одну мембрану, причем данная мембрана окружает инкапсулированный в липосомы объем водной фазы, и водная фаза содержит, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество и имеет исходную общую осмолярность О₁,

b) после этого, получение осмолярного градиента в водной фазе указанного препарата, причем осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомы объема, О_нар, ниже осмолярности водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн, с получением второго (напряженного) липосомального препарата,

с) необязательно, дегидратацию второго (напряженного) липосомального препарата с получением дегидратированного препарата и

d) необязательно, регидратацию дегидратированного препарата.

Липосомальный препарат со стадии а), предпочтительно содержит по меньшей мере одно активное вещество или косметическое средство в липосомальной мембране. Альтернативно, данное вещество может быть добавлено на более поздней стадии процесса производства.

Стадия b) может быть осуществлена путем снижения исходной общей осмолярности, О₁, липосомальной суспензии, полученной на стадии а), с получением напряженного липосомального препарата с общей осмолярностью О₂, которая ниже осмолярности О₁,

Стадия b) может быть осуществлена путем разбавления липосомальной суспензии, полученной на стадии а), водной средой, имеющей осмолярность, которая ниже О₁, или путем диализа суспензии против водной среды с осмолярностью, которая ниже О₁. При наиболее простом пути липосомальную суспензию разбавляют водой.

В соответствии с общей концепцией данного изобретения осмолярный градиент может быть создан или изменен на разных стадиях во время производства липосомального препарата. Также осмолярный градиент может быть изменен один раз или много раз на нескольких стадиях процесса производства. Это, вероятно, может быть достигнуто по тем же самым или другим методам, которые описаны в следующем далее. Способ производства липосомального препарата относится ко всем стадиям, выполненным до конечного применения липосомальной суспензии.

Стадия b) способа данного изобретения может состоять из этапов:

b1) дегидратации липосомального препарата на стадии а) с получением дегидратированного липосомального препарата и

b2) регидратации указанного дегидратированного липосомального препарата в условиях для получения напряженного липосомального препарата предпочтительно в водной среде.

Предпочтительно дегидратацию выполняют путем распылительной сушки липосомальной суспензии.

Данное изобретение относится также к полученным композициям или композициям, которые можно получить по приведенному выше процессу.

А также данное изобретение относится к липосомальному препарату, содержащему, по меньшей мере, одно активное вещество или косметическое средство в липосомальной мембране, причем липосомальная мембрана находится в растягивающем напряжении.

Более конкретно данное изобретение относится к липосомальному препарату, содержащему, по меньшей мере, одно активное вещество или косметическое средство в липосомальной мембране, причем липосомы присутствуют в жидкой фазе с осмолярностью внутри инкапсулированного в липосоме объема (О_вн), которая выше осмолярности жидкой фазы снаружи инкапсулированного в липосоме объема (О_нар).

Неожиданно обнаружено, что липосомальные суспензии, содержащие липосомы, липосомальная мембрана которых находится в напряжении растяжения, обладают свойством улучшенного растворения в них липофильных соединений.

Таким образом, данное изобретение относится также к способу производства липосомального препарата, содержащего, по меньшей мере, одно липофильное лекарственное средство или косметическое соединение, включающему стадии:

i) получения напряженного липосомального препарата, состоящего из суспензии липосом в водной фазе,

ii) инкубации указанного напряженного липосомального препарата с, по меньшей мере, одним липофильным активным веществом или косметическим средством, необязательно, в несолюбилизированной форме, и

iii) необязательно, отделения несолюбилизированного вещества от липосомального препарата предпочтительно путем фильтрования или центрифугирования,

iv) необязательно, дегидратирования инкубированного липосомального препарата и

v) необязательно, регидратации дегидратированного липосомального препарата.

Напряженные липосомы могут быть получены по любой из названных выше методик. Наиболее предпочтительно когда, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество присутствует в водной фазе липосомальной суспензии, причем О_вн выше О_нар.

Названное выше активное вещество или косметическое средство предпочтительно имеет низкую растворимость в воде.

Названное выше активное вещество или косметическое средство является липофильным и предпочтительно имеет log P более 1. Более предпочтительно когда данное соединение является таксаном, наиболее предпочтительно паклитакселом или его производным.

Неожиданно обнаружено, что эффективность загрузки липофильных, плохо растворимых в воде соединений, таких как паклитаксел, в липосомальные мембраны может быть улучшена, а высвобождение таких соединений из липосомальных мембран может быть снижено, если липосомальная мембрана напряжена, в частности, если водорастворимое осмотически активное вещество содержится в инкапсулированной в липосомы водной фазе в более высокой концентрации, чем снаружи инкапсулированной в липосомы фазы. Более высокая эффективность загрузки липофильного соединения в эти липосомы по сравнению с липосомами без градиента концентрации делает возможным производство составов с более высоким молярным отношением соединение/липид и улучшение стабильности данных препаратов благодаря тому, что эта склонность к высвобождению данного соединения из липосомы снижается.

Липосомы, содержащие липофильное вещество в мембранной части менее склонны высвобождать данное вещество в водную среду, если присутствует указанный осмолярный градиент. Равновесная фракция указанного липофильного вещества в водной среде снижена. Соответственно риск того, что концентрация липофильного соединения в водной фазе превысит предел растворимости и выпадет в осадок, тоже снижается.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что пустые липосомы, содержащие описанный выше градиент, имеют более высокую способность к загрузке липофильными веществами, т.е. более высокое молярное количество липофильного вещества солюбилизируется тем же количеством липосом (что определяется молярным количеством липида) по сравнению с липосомами без такого градиента. Это может быть реализовано, например, путем выдерживания липофильного соединения с пустыми липосомами.

Также неожиданно обнаружено, что липосомальные препараты, полученные путем регидратации ранее дегидратированных липосом, имеют гомогенное распределение по размеру, что показано низким показателем полидисперсности (PI). В отношении контроля качества всегда желательно получить гомогенный продукт, особенно для фармацевтического использования. Кроме того, в липосомальных суспензиях данного изобретения проявляется показатель полидисперсности, который остается неизменным в течение продолжительного периода времени. Это показывает, что липосомы в суспензиях данного изобретения не образуют агрегаты. В частности, что касается липосомальных суспензий для внутривенного введения, агрегаты должны быть исключены, так как эти агрегаты могут блокировать кровеносные сосуды и, таким образом, приводить к эмболии.

Данное изобретение существенно улучшает состояние в данной области технологии путем предоставления способа стабилизации липофильных веществ в липосомальных мембранах липосомального препарата, а также сохранения размера и полидисперсности регидратированного липосомального препарата. В результате стабильность при использовании конечного препарата, содержащего липосомы с липофильным соединением, может быть продлена. А также может быть продлен срок стабильности указанных липосом во время технологического процесса получения таких препаратов.

Во многих случаях срок технологического процесса получения жидких составов во время производства (время занятости) липосомальных составов ограничен из-за риска нежелательного высвобождения вещества из липосом. Данное изобретение снижает риск высвобождения лекарственного вещества, и поэтому это делает возможным непрерывный технологический процесс во время получения липосом во время производства в отношении масштаба удлинения срока и делает возможной большую гибкость схем процесса производства.

Более конкретно данное изобретение делает возможным получение представленных выше составов путем распылительной сушки вместо лиофилизации. При лиофилизации липосомы замораживают и, таким образом, стабилизируют непосредственно после производства, поэтому риск высвобождения во время производства является низким. При распылительной сушке жидких составов сталкиваются с удлиненными сроками занятости в жидкой фазе, так как распыление данной партии может занимать несколько часов или дней. Так как данное изобретение делает возможным повышение стабильности данного состава, могут быть осуществлены более длительные сроки работы без перерыва. Поскольку распылительная сушка имеет более высокую производительность по сравнению с лиофилизацией, крупномасштабная продукция облегчается, и стоимость продукции может быть снижена, тогда как качество продукции сохраняется.

Кроме того, риск высвобождения и кристаллизации лекарственного вещества в период между добавлением растворителя к дегидратированной липосомальной композиции и введением пациенту (стабильность при использовании) снижается. Кристаллизация может вызывать образование субвизуальных частиц, которые не должны присутствовать за определенными пределами в продуктах для в/в введения. Во многих случаях обеспечивается стабильность при использовании только в несколько часов, что является препятствием в клинической практике. Поэтому достаточная стабильность при использовании имеет огромное значение для практического применения таких фармацевтических или косметических продуктов.

При получении липосом часто используются органические растворители, такие как этанол, который обычно находится в дегидратированных липосомальных продуктах и, соответственно, в регидратированных липосомальных суспензиях, получаемых из них. Это происходит, в частности, в случае липосомальных препаратов, которые были дегидратированы путем сублимационной сушки (лиофилизации). Однако для липосомальных продуктов, используемых для применения у людей, желательно, чтобы они содержали как можно меньше органического растворителя. Данное изобретение делает возможным дегидратацию путем распылительной сушки, что облегчает удаление большей части или всего органического растворителя в то же время с получением липосом с высокой стабильностью.

Наряду с тем что обеспечиваются представленные выше преимущества, данное изобретение может быть легко осуществлено на практике и не обременительно по стоимости. Оно не требует ни сложных технических устройств, ни добавления дополнительных ингредиентов к представленным выше композициям. Осмотически активные вещества, которые используются для практического осуществления данного изобретения, уже известны по липосомальным композициям, которые дегидратируются, как описано в патентах США № 4880635 или WO 2004/002468.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

«Приблизительно, около» в контексте количественных значений относится к среднему отклонению максимум +/-20%, предпочтительно +/-10% от указанного значения. Например, количество в примерно 30 мол.% катионного липида относится к 30 мол.% +/-6 мол.%, а предпочтительно 30 мол % +/-3% катионного липида по отношению ко всему липиду/амфифильной молярности.

«Активное соединение» или «активное вещество» относится к соединению или смеси соединений, обладающих особой биологической или физической активностью на основании которой оно применимо в качестве действующего вещества для диагностики, профилактики или лечения заболевания или патологического состояния у человека и животного. Терапевтические средства, такие как лекарственные вещества и диагностические средства являются важными примерами активных веществ по данному изобретению.

«Безводная плотность» липосом в настоящем изобретении означает массу всех соединений, образующих указанные липосомы, включая соединения, инкапсулированные липосомами, но исключая массу воды, содержащейся в таких липосомах, деленную на объем липосом в водной фазе на основе размера липосомальных частиц Z_средн. В самом конкретном примере безводная плотность липосом может относиться к массе DOTAP [ДОТАП; 1,2-диолеилокси-3-(триметиламино)пропан], DOPC [ДОФХ; диолеилфосфатидилхолин], паклитаксела, лимонной кислоты и трегалозы, заключенных в липосомы, деленной на объем липосом в водной фазе. Безводная плотность липосом может быть определена по методам ультрацентрифугирования, как описано в примерах.

«Водная среда», «водная жидкость» или «водная фаза» в соответствии с описанием относится к жидкому материалу, который включает воду. В некоторых воплощениях жидкий материал содержит, по меньшей мере, 50% (мас.), по меньшей мере, 70% (мас.) или, по меньшей мере, 90% (мас.) воды. В других воплощениях жидкий материал свободен от органических растворителей. Водная фаза может содержать одно или несколько соединений. Таким образом, водная дисперсия, водная суспензия и эмульсия, в которой непрерывная фаза является водной, являются также примерами водных жидкостей. Водная жидкость, которая содержит коллоидный материал, здесь далее иногда называется водной коллоидной дисперсией или водным раствором.

«Катионный» относится к веществу, которое имеет общий положительный заряд или положительный зета потенциал в соответствующих условиях окружающей среды. В данном изобретении это относится к условиям окружающей среды, где рН находится в интервале между 3 и 9, предпочтительно между 5 и 8.

«Химическая стабильность» липофильного соединения относится к значительному изменению его первоначальной химической структуры и определяется как примерно 5% изменение активности от исходного аналитического значения (первоначальное соединение), предпочтительно примерно 2% или появление специфических продуктов разложения, превышающее приемлемые для них показатели в отношении токсикологических пределов и аспектов безопасности. В отношении липофильных соединений, таких как паклитаксел, химическая стабильность может быть определена по ВЭЖХ/ЖХ МС/МС и обычно означает менее 5% продуктов разложения указанного соединения. Типичными продуктами разложения паклитаксела являются, например, баккатинIII, 7-эпитаксол и т.д. (Monography of Paclitaxel, USP26, (Jan.-Mar.2003), USPC, Inc.).

«Косметическое соединение» относится к соединению, которое оказывает воздействие на кожу и волосы человека.

«Диагностическое активное вещество» или «диагностическое средство» относится к фармацевтически приемлемому средству, которое можно использовать для визуализации биологического свойства или состояния у индивида или в образце различными методами. Визуализацию можно использовать, чтобы поставить диагноз.

«Дегидратация» или «дегидратировать» относится к процессу удаления воды из композиции. В некоторых воплощениях воду удаляют из композиции до остаточного содержания ниже примерно 10% (мас./мас.), предпочтительно ниже примерно 5% (мас.) от содержания воды, присутствующей до процедуры дегидратации.

«Инкапсулированный объем» или «инкапсулированная фаза» относится к объему, который окружен, по меньшей мере, одной липосомальной мембраной. Этот объем может быть окружен одной мембраной в однослойных липосомах или несколькими мембранами в многослойных липосомах. Таким образом, инкапсулированная фаза представляет пространство внутри липосомы, тогда как объем снаружи инкапсулированного в липосому объема или «свободная (водная) фаза» представляет пространство, окружающее липосому. В случае многослойных липосом термины «инкапсулированная» или «свободная фаза» относятся к внутреннему и внешнему объему, следующему за данной мембраной многослойной липосомы.

«Время занятости» относится к периоду времени переработки жидких препаратов во время производства липосомальных составов.

«Гомогенность по размеру» в соответствии с описанием относится к распределению по размеру совокупности частиц. Высокая гомогенность по размеру или узкое распределение по размеру характеризуется низким показателем полидисперсности.

«Липид» относится к его общепринятому значению как общего термина, охватывающего жиры, липиды, растворимые в спирте-эфире составляющие протоплазмы, которые нерастворимы в воде. Липиды обычно состоят из гидрофильной и гидрофобной части. В воде липиды могут самоорганизовываться с образованием двухслойных мембран, где гидрофильные группы (головные группы) ориентированы в направлении водной фазы, а липофильные группы (ацильные цепи) встроены в сердцевину двух слоев. Липиды могут содержать также две гидрофильные группы (бола-амфифилы). В этом случае мембраны могут быть образованы из единственного липидного слоя, а не из бислоя. Типичными примерами для липидов в настоящем контексте являются жиры, жирные масла, эфирные масла, воски, стероиды, стеролы, фосфолипиды, гликолипиды, сульфолипиды, аминолипиды, хромолипиды и жирные кислоты. Этот термин охватывает как существующие в природе так и синтетические липиды. Предпочтительными липидами в связи с данным изобретением являются: стероиды и стерол, в частности, холестерин, фосфолипиды, включая фосфатидил, фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины и сфингомиелины. Где существуют жирные кислоты, они могли бы представлять цепи длиной в 12-24 атомов углерода, содержащие до 6 двойных связей. Жирные кислоты связаны с основной цепью, которая может быть образована глицерином. Жирные кислоты в одном липиде могут быть разными (асимметричные) или могут быть представлены только 1 цепью жирной кислоты, например, лизолецитины. Смешанные препараты также возможны, в частности, когда получают не катионные липиды из природных источников, таких как очищенные лецитины, (фосфатидилхолины), выделенные из яичного желтка, бычьего сердца, мозга, печени или соевых бобов.

«Липосомы» являются искусственными, самозакрывающимися везикулярными структурами разных размеров и строения, где одна или несколько мембран инкапсулируют водное ядро. Наиболее типично, когда липосомальные мембраны образуются из липидных двухслойных мембран, где гидрофильные головные группы ориентированы в сторону водного окружения, и липидные цепи встроены в липофильную сердцевину. Липосомы могут быть образованы также другими амфифильными мономерными и полимерными молекулами, такими как полимеры, подобные блоксополимерам или полипептидам. Однослойные везикулы являются липосомами, определенными как имеющие одинарную оболочку, окружающую водное пространство. В противоположность этому, олиго- или многослойные везикулы образуются несколькими мембранами (оболочками). Обычно мембраны по грубой оценке имеют толщину 4 нм и образованы из амфифильных липидов, таких как фосфолипиды, природного или синтетического происхождения. По желанию мембрана может быть модифицирована путем включения других липидов, таких как стеролы и производные холиновых кислот. Липосомы с особенно эластичными мембранами на основе фосфолипидов с низкой температурой фазового перехода (т.е. ниже температуры тела) иногда называют трансферсомами.

«Липосомальная суспензия» относится к композиции, содержащей липосомы в водной среде.

«Липосомальный препарат» или «липосомальная композиция» относится к любой композиции, содержащей липосомы, включая липосомальную суспензию или дегидратированную композицию, полученную из указанной суспензии путем дегидратирования.

«Липофильное» относится к свойству соединения растворяться преимущественно в жироподобной (например, углеводородной) фазе, такой как фаза, по существу состоящая из липидов. Липофильное свойство соединения может быть описано с помощью коэффициента распределения (log Р). Представляющие интерес соединения в данном контексте имеют log Р более примерно 1, более предпочтительно более примерно 2, наиболее предпочтительно более примерно 3.

«Log Р» относится к коэффициенту распределения соединения между водой и октанольной фазой при 25°С. Обычно более высокое число log Р означает, что вещество лучше растворимо в октаноле. Log Р определяют как ([концентрация вещества в октаноле]/[концентрация вещества в воде]). Специалисту в данной области хорошо известно как можно экспериментально определить log Р определенного соединения.

«Низкая растворимость в воде» относится к растворимости соединения, которая ниже 0,1 мг/мл, более предпочтительно ниже 0,01 мг/мл, а более предпочтительно ниже 0,001 мг/мл в воде при физиологическом рН при 25°С в отсутствие добавок, которые облегчают растворимость.

«Общая осмолярность» липосомальной суспензии представляет общее количество осмотически активных веществ, присутствующих в некотором объеме указанной суспензии, деленное на объем суспензии. Для расчета общей осмолярности осмотически активные вещества внутри и снаружи инкапсулированного в липосомы объема суспензии рассматриваются подобным же образом. В представленном контексте аббревиатуры О₁ и О₂ относятся к общей осмолярности.

«О_вн» и «О_нар» относятся к осмолярности внутри и снаружи самозакрывающейся липосомальной мембраны. Для однослойных липосом О_нар является осмолярностью свободной водной фазы, и О_вн является осмолярностью инкапсулированного объема. Для многослойных липосом О_вн и О_нар относится к осмолярности внутри и снаружи каждой отдельной самозакрывшейся мембраны. В настоящем контексте ситуации, когда О_вн больше О_нар, имеют особое значение. Относительные различия между О_вн и О_нар могут быть исследованы с помощью методик центрифугирования, например, с помощью аналитического или препаративного центрифугирования или ультрацентрифугирования. Так как обычно осмотически активное соединение меняет плотность водной фазы, различия между О_вн и О_нар можно определить по поведению липосом при седиментации (Goormaghtight and Scarborough 1986, Huang and Charlton, 1971). Кроме того, осмолярные градиенты могут влиять на структурные параметры липосомальной мембраны, такие, которые могут быть определены методами, подобными рассеянию рентгеновских лучей или нейтронов, или по размеру липосом, таким, которые могут быть определены по рассеянию света или рентгеновских лучей.

«Осмотически активное вещество» в данном контексте относится к веществу, растворимому в воде, которое не способно существенно проникать через липосомальную мембрану. Типичными примерами являются ионы или сахара, подобные глюкозе или трегалозе, которые могут эффективно захватываться в липосомы, тогда как молекулы воды проявляют высокое проникновение, и поэтому, в настоящем контексте, воду не рассматривают как осмотически активное вещество. Селективность в отношении проникновения различных веществ является определяющим характерным свойством липосом (Bangham et al., 1965). Проникновение соединения через мембрану зависит от состава мембраны, фазового состояния и других граничных условий.

«Осмолярность» является суммой молярных концентраций растворенных веществ, присутствующих в водном растворе, включая биологически активное вещество и любые вспомогательные молекулы, такие как осмотические вспомогательные вещества, используемые для замедления скорости высвобождения активного вещества. Если растворенное вещество присутствует в диссоциированной, ионизированной или агрегированной форме, осмолярность определяется суммой молярных концентраций диссоциированной, ионизированной или агрегированной форм. Вклад в осмолярность раствора, какого-либо растворенного вещества в растворе примерно эквивалентен концентрации растворенного вещества в растворе, деленной на молекулярную массу. Таким образом, в качестве общего принципа, чем больше молекулярная масса растворенного вещества, тем меньше осмолярность растворенного вещества, и тем меньше вклад этого растворенного вещества в общую осмолярность раствора. Различия в осмолярности можно определить по изменениям различных физикохимических показателей, таких как плотность, показатель преломления или вязкость, которые могут быть определены общепринятыми в физической химии методами.

«Отрицательно заряженные липиды» относятся к липидам, которые имеют отрицательный заряд структуры.

«Фармацевтическая композиция» относится к комбинации из двух или более разных компонентов с разными фармацевтическими свойствами, которыми обладает любой из компонентов. В данном изобретении два или более компонентов относятся к липидной или коллоидной дисперсии и активному веществу, необязательно, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и/или вспомогательным веществом.

«Физическая стабильность» липосомы относится к изменению физического состояния липосомы. Липосома стабильна, когда физическое состояние сохраняется. Важным аспектом физической стабильности является выделение соединения, заключенного в липосомальную оболочку, в водную среду липосомальной суспензии. Выделение соединения является характерным признаком физической нестабильности. Высвобождение соединения из мембраны может приводить к повышенной концентрации и агрегации соединения в водной среде. В случае таксанов агрегация становится видна по образованию игл таксана. Кристаллизацию таксана можно количественно определить путем визуального исследования жидкого липосомального состава, световой микроскопии, количественной оценки блокирования света или рассеяния света. Размер липосом и/или распределение по размеру также являются характерными признаками физического состояния липосомальной суспензии.

«Полидисперсность» представляет собой широту распределения частиц по размеру в данном образце частиц, например, липосомальной суспензии. Одну из количественных оценок на полидисперсность дает показатель полидисперсности (PI), который получают по кумулятивному анализу данных фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС; PCS).

«Показатель полидисперсности» (PI) является безразмерным числом, которое получено от так называемого кумулятивного анализа результатов измерений по фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС)(Koppel 1972). Кумулятивный анализ дает возможность модели без корреляции данных ФКС, по которым получают Z_{среднее}, как меру размера частиц, и значение PI, как меру для полидисперсности. Расчеты этих показателей представлены в стандартном документе ISO 13321:1996 Е. В контексте измерений размера частиц часто термины ФКС и динамическое рассеяние света (ДРС; DLS) используют как синонимы. По этой методике количественно определяют зависимые от времени флуктуации в интенсивности рассеянного света, которые происходят из-за того, что происходит броуновское движение частиц. Анализ этих флуктуаций интенсивности делает возможным определение коэффициентов диффузии частиц, которые превращают в распределение по размеру. В рамках значения по данному изобретению PI и Z_{среднее} дано определение, которое представлено в примере 6.

«Фотонная корреляционная спектроскопия» является методикой, по которой количественно оценивают зависимые от времени флуктуации интенсивности рассеянного света, которые происходят в результате броуновского движения частиц. Анализ этих флуктуаций интенсивности делает возможным определение коэффициентов диффузии частиц, которые превращают в распределение по размеру. В контексте определений размера частиц ФКС и ДРС используют как синонимы.

«Положительно заряженные липиды» используют как синоним катионных липидов (в отношении определения см. определение «катионные липиды»). В соответствии с данным описанием он относится к среде, где рН находится в интервале между 3 и 9, предпочтительно между 5 и 8.

«Стабильность» может относиться к физической стабильности липосом и к химической стабильности отдельных составляющих (например, липидов и активного соединения), содержащихся в липосоме.

«Напряженные липосомы» или «напряженные липосомальные препараты» относятся к липосомам, у которых липосомальная мембрана находится в напряжении растяжения, и к препаратам, содержащим такие липосомы.

На «напряжение растяжения» липосомальной мембраны в настоящем контексте может влиять применение градиента концентрации осмотически активного соединения между водной фазой внутри и снаружи инкапсулированного в липосомы объема. Если внутренняя осмолярность О_вн выше наружной осмолярности О_нар, это неизбежно приводит к повышению градиента давления, ΔР, между инкапсулированным и свободным объемом посредством осмотических сил. Избыточное давление уравновешивается поверхностным натяжением, γ, на мембране липосомы, где корреляция между градиентом давления и поверхностным натяжением обеспечивается хорошо известным равенством Young-Laplace (Evans and Wennerstrom, 1994).

(Формула 1)

Что касается данных липосомальных систем нужно принять во внимание, что проявляющееся поверхностное натяжение приводит к растяжению поверхности мембраны липосом, которое может приводить к изменениям радиуса, инкапсулированного объема, и в результате, к изменениям осмолярности этого инкапсулированного объема. Увеличение площади, ΔА, как функция поверхностного натяжения зависит от показателя эластичности мембраны, к, и получают по уравнению Young, в виде

(Формула 2)

Формула 1 делает ясным, что отношение между поверхностным натяжением и давлением зависит от радиуса. При условии градиента давления поверхностное натяжение повышается с увеличением радиуса. Увеличение площади и соответствующее увеличение размера липосом больше у больших липосом, чем у липосом меньшего размера. Для систем с данным поверхностным натяжением, таких как мыльные пузыри, градиент давления р_внутри-р_{снаружи} повышается со снижением радиуса или, другими словами, с повышением кривизны.

«Терапевтически активное вещество» или «терапевтическое средство» относится к действующему веществу, которое предотвращает или снижает степень патологического состояния у животного, в частности млекопитающего, предпочтительно у людей.

«Низкомолекулярное» (малая молекула) относится к молекуле с молекулярной массой менее примерно 2000 Да.

«Зета потенциал» относится к измеренному электростатическому потенциалу коллоидной частицы в водной среде, определенному с помощью такого прибора, как Zetasizer 3000 с использованием микроэлектрофореза с лазерной доплеровской индикацией в примерно 0,05 мМ растворе KCl при примерно рН 7,5. Зета потенциал описывает потенциал на границе между основным раствором и областью гидродинамического сдвига или диффузным слоем. Данный термин является синонимом «электрокинетического потенциала», так как он представляет потенциал частиц, которые действует внешне и ответственен за электрокинетическое поведение частиц.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ производства липосомального препарата данного изобретения может быть осуществлен по следующим стадиям:

а) получение первого липосомального препарата, содержащего суспензию липосом в водной фазе, причем липосомы имеют, по меньшей мере, однослойную оболочку, причем мембрана окружает инкапсулированный в липосому объем водной фазы, и водная фаза содержит, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество и имеет первичную общую осмолярность, О₁, и затем

b) создание осмолярного градиента в водной фазе указанного препарата, причем осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомы объема, О_нар, ниже осмолярности водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн, с получением второго (напряженного) липосомального препарата,

с) необязательно, дегидратирование второго (напряженного) липосомального препарата с получением дегидратированного препарата, и

d) необязательно, регидратирование дегидратированного препарата.

Липосомальный препарат со стадии а) предпочтительно содержит по меньшей мере одно липофильное вещество, присутствующее в липосомальной мембране. Липофильные вещества, однако, можно также добавлять на более поздних стадиях процесса производства.

Стадию b) можно осуществить путем снижения первичной общей осмолярности, О₁, липосомального препарата, получаемого на стадии a), с получением напряженного липосомального препарата с общей осмолярностью, О₂, которая ниже осмолярности О₁.

В контексте данного изобретения снижение общей осмолярности О₁ относится к процессу, при котором первоначальная осмолярность водной среды снаружи инкапсулированного в липосомы объема, О_нар, снижена. Если принять, что первоначально концентрация одинакова во всех отделах, О₁=О_нар=О_вн, разбавление действует в первую очередь только на свободную водную фазу, О_нар, приводя к О_нар<О_вн. Затем создается осмотический градиент между средой внутри и снаружи инкапсулированного в липосомы объема. Вполне понятно, что при наличии осмотического градиента липосомы могут набухать, так как мембраны являются проницаемыми для молекул воды. Поэтому в качестве второго эффекта разбавления может быть снижена до некоторой степени также осмолярность инкапсулированной водной среды, О₂. Абсолютные изменения осмолярности зависят от различных факторов, подобных фракции инкапсулированного объема, размера липосом, эластичности мембраны (модуль Янга) и т.д. Таким образом, отношение между О₁ и О₂ не обязательно идентично отношению О_вн и О_нар после разбавления.

Однако снижение осмолярности в свободной, не инкапсулированной водной фазе будет приводить к повышению градиента осмолярности О_вн-О_нар между внешней и внутренней инкапсулированной фазой. Если набухание в ответ на осмотический стресс происходит свыше некоторого значения показателя, могут формироваться дефекты мембраны, позволяющие выделяться растворимому веществу из фазы с более высокой осмолярностью в фазу с более низкой осмолярностью. Это будет снижать осмолярный градиент и осмолярный стресс. Эти мембраны могут снова герметизироваться в условиях максимального стресса растяжения и максимального критического предела осмотического градиента в отношении формирования пор. Поэтому данную систему можно рассматривать как самостабилизирующуюся в том смысле, что если применяется избыточный градиент, безотносительно от детальных состояний, данная система будет принимать состояние максимального осмотического градиента. Такой эффект можно считать благоприятным для обеспечения воспроизводимых условий во время производства.

Липосомы, используемые в контексте данного изобретения могут содержать нейтральные, анионные и/или катионные липиды. Нейтральные и анионные липиды могут быть выбраны из стеролов или липидов, таких как холестерин, фосфолипиды, лизолипиды, лизофосфолипиды, сфинголипиды или пэгилированные липиды с нейтральным или отрицательным зарядом структуры. Применимые нейтральные и анионные липиды, таким образом, включают: фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, фосфатидилинозитол (не ограниченные конкретным сахаром), жирные кислоты, стеролы, содержащие группу карбоновой кислоты, например, холестерин, 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, включая, но без ограничения этим, 1,2-диолеилфосфоэтаноламин (ДОФЭ; DOPE), 1,2-дигексадецилфосфоэтаноламин (ДГФЭ; DHPE), 1,2-диацилглицеро-3-фосфохолины, 1,2-дистеарилфосфосфатидилхолин (ДСФХ; DSPC), 1,2-дипальмитилфосфосфатидилхолин (ДПФХ; DPPC), 1,2-димиристилфосфосфатидилхолин (ДМФХ; DMPC), фосфатидилхолин, предпочтительно яичный ФХ, соевый ФХ и сфингомиелин. Жирные кислоты, связанные с цепью глицерина не ограничены конкретной длиной или числом двойных связей. Фосфолипиды могут также иметь две различные жирных кислоты. Предпочтительно дополнительные липиды находятся в жидком кристаллическом состоянии при комнатной температуре, и они являются смешиваемыми (т.е. может образовываться однородная фаза, и не происходит разделения фаз или образования доменов) с используемым катионным липидом, в соотношении, в котором они применяются. В предпочтительном воплощении нейтральным липидом является 1,2-диолеилфосфосфатидилхолин (ДОФХ; DOPC).

Предпочтительными катионными липидами для данного липосомального препарата являются соли N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония, например, метилсульфатная соль. Предпочтительными представителями семейства липидов ТАР (триметиламмония метилсульфат) являются DOTAP (диолеил-), DMTAP (димиристоил-), DPTAP (дипальмитоил-) или DSTAP (дистеароил-). Другие применимые липиды по данному изобретению могут включать: (DDAB) ДДАБ, диметилдиоктадециламмония бромид; 1,2-диацилокси-3-триметиламмонийпропаны (включая, но без ограничения этим: диолеоил, димиристоил, дилауроил, дипальмитоил и дистеароил; а также две разных ацильных цепи могут быть связаны с цепью глицерина); N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N-диметиламин (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмонийпропаны (включая, но без ограничения этим: диолеоил, димиристил, дилаурил, дипальмитил и дистеарил; а также две разных ацильных цепи могут быть связаны с цепью глицерина); N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA; ДОТМА); 1,2-диалкилокси-3-диметиламмонийпропаны (включая, но без ограничения этим: диолеил, димиристоил, дилауроил, дипальмитоил и дистеароил; а также две разных ацильных цепи могут быть связаны с цепью глицерина); диоктадециламидоглицилспермин (DOGS); 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol); 2,3-диолеилокси-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметил-1-пропанаминиумтрифторацетат (DOSPA); β-аланилхолестерин; цетилтриметиламмония бромид (CTAB; ЦТАБ); ди-С14-амидин; N-трет-бутил-N'-тетрадецил-3-тетрадециламинопропионамидин; 14Dea2; N-(альфа-триметиламмониоацетил)дидодецил-D-глютамата хлорид (TMAG; ТМАГ); О,О'-дитетрадеканоил-N-(триметиламмониоацетил)диэтаноламина хлорид; 1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксиспермил)пропиламид (DOSPER); N,N,N',N'-тетраметил-N,N'-бис(2-гидроксиэтил)-2,3-диолеоилокси-1,4-бутандиаммония иодид; производные 1-[2-(ацилокси)этил]-2-алкил(алкенил)-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорида, которые описаны Solodin et al. (Solodin et al. 1995), такие как 1-[2-(9(Z)-октадеценоилокси)этил]-2-(8(Z)-гептадеценил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорид (DOTIM); 1-[2-(гексадеканоилокси)этил]-2-пентадецил-3-(2-гидроксиэтил)имидазолиния хлорид (DPTIM), производные соединения 2,3-диалкилоксипропил-четвертичного аммония, содержащие гидроксиалкильную группу у четвертичного амина, которые описаны, например, Felgner et al. (Felgner et al., 1994), такие как: 1,2-диолеоил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DORI); 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DORIE); 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксипропиламмония бромид (DORIE-HP); 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксибутиламмония бромид (DORIE-HB), 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксипентиламмония бромид (DORIE-Hpe), 1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DMRIE), 1,2-дипальмитилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DPRIE), 1,2-дистерилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DSRIE), катионные сложные эфиры ацилкарнитинов, о которых сообщали Santaniello et al. (US 5498633); катионные триэфиры фосфатидилхолина, т.е. 1,2-диацил-sn-глицерол-3-этилфосфохолины, где углеводородные цепи могут быть насыщенными или ненасыщенными и разветвленными или неразветвленными с цепью длиной от С₁₂ до С₂₄, причем две ацильных цепи необязательно идентичны.

Липосомы могут иметь разные размеры, число слоев оболочки и структуру. Предпочтительно липосомы имеют средний диаметр Z_{среднее} от примерно 50 нм до примерно 500 нм. Наиболее предпочтительным является размер Z_{среднее} от примерно 100 до примерно 200 нм. Липосомы могут быть одно-, олиго- или многослойными липосомами. Предпочтительно липосомы являются однослойными липосомами.

Активное вещество или косметическое средство, используемое при различных воплощениях соединения по данному изобретению, предпочтительно имеет log P более 1, более предпочтительно более примерно 2, наиболее предпочтительно более примерно 3.

Активное вещество или косметическое средство, применяемое в разных воплощениях данного изобретения, предпочтительно имеет низкую растворимость в воде. Предпочтительно данное соединение имеет растворимость ниже 0,1 мг/мл, более предпочтительно ниже 0,01 мг/мл и наиболее предпочтительно ниже 0,001 мг/мл в воде при физиологическом рН при комнатной температуре.

Предпочтительно активное вещество содержащееся в липосомах данного изобретения, является терапевтическим или диагностическим активным веществом. Наиболее предпочтительно данное соединение является терапевтически активным.

Предпочтительно активное вещество или косметическое средство имеет молекулу с молекулярнй массой менее 2000 Да, более предпочтительно менее 1000 Да.

В одном из аспектов активное вещество может быть выбрано из группы, включающей абареликс, алтретамин, анастрозол, апрепитант, бикалутамид, камптотецины, капецитабин, хлоротрианизен, конъюгированные эстрогены, циклоспорин, дактиномицин, диэтилстильбестрол, доцетаксел, доласетрон, дромостанолон, эпирубицин, эпотилоны, например, эпотилон В, эпотилон D или эпотилоновые производные, например, которые описаны в WO2004048372, WO2004007492, WO2005051947 и WO2005030767 (содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки), сиберлотиниб, этинилэстрадиол, экземестан, фентанил, флавопиридол, флуоксиместерон, фулвестран, гефитиниб, гранисетрон, гесперетин, гидроморфон, иринотекан, кетоконазол лапатиниб, летрозол, леупролид, ломустин, лукантон, маринол, мазопрокол, мегестрол, набилон, нилутамид, палоносетрон, порфимер, квинестрол, тамоксифен, таксаны, темсиролимус, тестолактон, топотекан, торемифен, триметрексат, валрубицин, винбластин, витамин Е и производные этих соединений. Предпочтительно данным соединением является таксан, наиболее предпочтительно паклитаксел или его производное.

В некотором аспекте данного изобретения активное вещество не является молекулой нуклеотида или полинуклеотида, подобной молекуле ДНК или РНК.

В другом аспекте в объем данного изобретения не включены активные вещества, которые ионизируются во время изготовления состава и/или активные вещества, которые являются веществами с высокой растворимостью в воде, как например, адриамицин.

Предпочтительно липосомы по данному изобретению содержат паклитаксел в количестве между примерно 2,5 мол.% и 4,5 мол.% в липосомальных мембранах. Таким образом, паклитаксел может предпочтительно быть представлен в количестве между примерно 2,5 мол.% и 4,5 мол.% от количества всех молекул, присутствующих в мембранах, таких как липиды и родственные молекулы, и паклитаксел. Более предпочтительно когда эти липосомы проявляют затрудненное высвобождение лекарственного вещества в суспензии и/или после регидратации, и/или по существу не образуют кристаллов во время хранения, как определено в настоящем описании ниже.

В особенно предпочтительном воплощении данного изобретения липосомы являются катионными липосомами, например, катионные липосомы, содержащие DOTAP, DOPC и паклитаксел в молярном отношении примерно 50:47:3. Составы этой композиции известны в данной области как MBT-0206 или EndoTAG-1. Производство новых липосомальных препаратов, содержащих DOTAP, DOPC и паклитаксел, описано в WO 2004/002468, содержание которого включено в настоящее описание в виде ссылки.

В общем, липосомы могут быть получены методами, которые хорошо известны специалисту в данной области. Различные методы получения липосом описаны New et al. (1990).

Предпочтительно липосомы, используемые по данному изобретению, получают путем этанольной инжекции.

В конкретном воплощении данного изобретения липосомы имеют положительный зета-потенциал, более предпочтительно зета-потенциал более примерно +30 мВ.

Осмотически активное соединение, используемое по способу данного изобретения или содержащееся в композициях по данному изобретению, является растворимым веществом, которое не способно существенно проникать через липидный бислой. Предпочтительно осмотически активное вещество присутствует внутри и снаружи липосом.

Осмотически активное вещество может быть представлено органической молекулой, подобной сахариду, например, моно-, ди-, олиго- или полисахаридом, сахаро-спиртом, аминокислотой, пептидом, белком, водорастворимым полимером, органической или неорганической солью, ионом или их комбинацией.

Используемые сахариды включают сахар и сахаро-спирты, олигосахариды, водорастворимые полисахариды и их производные. Предпочтительные сахариды по данному изобретению включают глюкозу, фруктозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, галактозу, мальтотриозу, мальтопентозу, раффинозу, декстрин, декстран, инулин, маннит, сорбит, ксилит, хитозан, а наиболее предпочтительно трегалозу.

Примерами водорастворимых полимеров являются полиэтиленгликоли, поливиниловый спирт, полиакрилаты или поливинилпирролидон.

В некотором аспекте при использовании осмотически активного вещества по методу или композициям данного изобретения исключается использование комплексообразующих веществ, которые облегчают солюбилизацию соединений, которые имеют низкую растворимость в воде. Примерами таких комплексообразующих веществ являются циклодекстрины, которые описаны Zhang et al. в WO 2007/005754 или MacLachlan et al. WO 2007/012191.

Водная среда или фаза, используемая в контексте данного изобретения, может включать один компонент или более составляющих, которые, по меньшей мере, частично, смешиваются с водой, таких как спирты (например, С_1-4 спирты, такие как этанол) или кетоны (например, С_1-4 кетоны, такие как ацетон). В предпочтительном воплощении данного изобретения водная фаза содержит этанол.

Водная фаза может дополнительно содержать буферное вещество или другие стабилизирующие вещества. Подходящие буферные вещества выбирают из, например, уксусной кислоты, ТРИС, БИС, фосфорной кислоты, молочной кислоты и тому подобного, предпочтительна лимонная кислота. Буферное вещество может создавать рН водной среды между примерно 3 и 7, предпочтительно между примерно 4 и примерно 5.

Предпочтительно липосомальный препарат со стадии а) производится путем смешивания органического раствора (например, этанольного), содержащего липиды и, необязательно, активное вещество или косметическое средство, с водной средой, содержащей, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество, характеризуемое общей осмолярностью О₁.

Предпочтительный интервал осмотических градиентов, О_вн-О_нар находится в интервале между 10 мОсм и 2000 мОсм, более конкретно между 50 мОсм и 1000 мОсм, еще конкретнее между 100 мОсм и 1000 мОсм.

Осмотические градиенты могут также быть показаны по разнице концентрации/веса между концентрацией/весом осмотически активного вещества внутри инкапсулированного в липосомы объема и концентрации/веса осмотически активного вещества снаружи инкапсулированного в липосомы объема. Предпочтительный интервал осмотических градиентов представлен разницей концентрации/веса в интервале между 5% и 30% по массе, т.е. градиентом между 0% и 30% по массе осмотически активного вещества снаружи инкапсулированного объема и между 10% и 40% по массе вещества внутри инкапсулированного объема.

Липосомальный препарат, полученный на стадии а), может подвергаться стадии гомогенизации, которая может выполняться путем экструзии, фильтрации через мембранные фильтры, гомогенизации под высоким давлением и/или высокоскоростной гомогенизации, и наиболее предпочтительно путем экструзии через мембрану, например, с размером пор в примерно 200 нм под давлением. Также можно использовать мембраны с другими размерами пор, таким как 50 нм, 100 нм, 150 нм, 400 нм, хорошо известные специалистам в данной области. Фильтрование через мембранные фильтры может быть выполнено путем фильтрования через мембраны, состоящие из PVDF, PES, нейлоновые фильтры, а также можно использовать другие материалы, если определено, что они пригодны. Размер пор мембран предпочтительно находится в интервале от примерно 200 нм до 450 нм, но размер пор не ограничивается указанными размерами. Можно комбинировать различные материалы и разные размеры пор для того, чтобы получить раствор, который можно обрабатывать путем стерилизующего фильтрования. В предпочтительном воплощении липосомы, полученные на стадии а), подвергают гомогенизации перед тем, как создается осмолярный градиент.

Так как стерильность является обязательным требованием к фармацевтическим продуктам, липосомальные суспензии, применяемые при способе данного изобретения, могут быть стерилизованы на какой-либо стадии во время процесса. Предпочтительно суспензии стерилизуют путем фильтрования через стерилизующую мембрану марки для стерилизации (0,22 пм). В предпочтительном воплощении липосомальные суспензии стерилизуют путем фильтрования после того, как создают осмолярный градиент в соответствии со стадией b) данного изобретения.

В соответствии с общей концепцией данного изобретения осмотический градиент между инкапсулированным и свободным объемом может быть создан или изменен однажды или несколько раз на разных стадиях во время процесса производства липосомального препарата. Это, вероятно, может быть достигнуто путем одной и той же или разных процедур, которые описаны в следующем далее.

В предпочтительном воплощении данного изобретения стадия b) процесса данного изобретения может включать стадии:

b1) дегидратирования липосомального препарата, полученного на стадии а), с получением дегидратированного липосомального препарата и

b2) регидратирования указанного дегидратированного липосомального препарата предпочтительно в водной среде в условиях, при которых получается напряженный липосомальный препарат.

В рамках значения по данному изобретению «липосомальный препарат, полученный на стадии а)» относится к липосомальному препарату, полученному на стадии а), или липосомальному препарату, который может быть получен из липосомального препарата, полученного на стадии а), на различных стадиях процесса обработки. Эти стадии переработки могут, например, включать гомогенизацию и/или стерилизацию, которые описаны выше.

В предпочтительном воплощении создание или изменение осмолярного градиента выполняют, по меньшей мере, один раз после изготовления первого липосомального препарата на стадии а) и перед дегидратацией указанного липосомального препарата, полученного на стадии а). Предпочтительно создание или изменение осмолярного градиента выполняют после стадии экструзии и/или после стерилизующей фильтрации. Как упомянуто выше, осмолярный градиент повышает стабильность липосомальной суспензии, проходящей стадии переработки.

Предпочтительно дегидратацию выполняют при температуре выше комнатной температуры.

В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения дегидратацию на стадии b1) выполняют путем распылительной сушки липосомальной суспензии. При процессе распылительной сушки липосомальную суспензию сначала распыляют в мелкие капельки путем пульверизации указанной суспензии. Затем липосомы сушат путем испарения среды из капелек при повышенной температуре. Высушивание липосом после образования капелек может быть достигнуто путем контакта капелек с подаваемым сухим, возможно нагретым, газовым потоком с получением твердых частиц. Возможный газообразный поток может быть инертным газом или воздухом. Осушающий газ может предпочтительно быть газом с низким содержанием кислорода, содержащим менее 0,1 об.%, предпочтительно менее 0,05 об.% кислорода или бескислородным газом. Инертные газы повышают безопасность нагретых систем для сушки, которые содержат высоко воспламеняемые растворы, при закачивании азота, диоксида углерода, гелия, неона, аргона, криптона, ксенона и радона или какого-то другого инертного газа, для замены кислорода. Действие этих систем состоит или в полном удалении кислорода, или в снижении его содержания до незначительного уровня. В предпочтительном воплощении в качестве инертного газа используют азот. В другом воплощении данного изобретения инертный газ защищает активные ингредиенты и вспомогательные вещества, содержащиеся в составе. Предпочтительно лиофилизацию выполняют в подходящем устройстве для распылительной сушки. Дегидратированные липосомы выделяют из газового потока и собирают. Распылительную сушку можно выполнять при избыточном давлении, нормальном давлении или частичном вакуумировании. Может существовать благоприятный для процесса интервал давления, если порошок, соответствующий описанию, образуется с помощью осушающего газа при максимальной допустимой для системы температуре и при максимальной пропускной способности. Для выбора условий сушки нужно принимать во внимание комбинацию параметров, подобных скорости подачи жидкости, скорости осушающего газа, температура осушающего газа, термодинамическим параметрам вспомогательных веществ и пределам стабильности соединений. Важными показателями являются температура на входе осушающего газа Т_вх и температура на выходе Т_вых, которая существует внутри распылительной сушилки. Т_вых существенно ниже, чем Т_вх из-за адиабатического охлаждения при испарении. Фактическая температура поверхности частиц может быть значительно ниже Т_вых в зависимости от локальной скорости испарения. Поэтому не могут быть определены общие параметры распылительной сушки. Для сушки липосом температура внутри камеры для процесса сушки может находиться в интервале между 10°С и 200°С. Более типично, когда суспензию сушат по методу данного изобретения при температуре от 30°С до 150°С, и более предпочтительно от примерно 60°С до примерно 120°С.

Оборудование для процесса распылительной сушки может быть получено от Buchi (Flawil, Switzerland) или GEA Niro (Soeborg, Denmark) или изготовлено по заказу. Специалист в данной области способен выбрать условия процесса сушки, например, скорость подачи и температуры в зависимости от суспензии, которую нужно сушить, используемое оборудование и желаемые технические характеристики.

В частности, условия стадии дегидратации могут быть выбраны для получения дегидратированной липосомальной композиции с очень низким количеством органического растворителя. Дегидратирование путем распылительной сушки особенно подходит для получения низких остаточных количеств органического растворителя.

А также дегидратирование путем распылительной сушки, которое описано в настоящем описании, приводит к дегидратированной липосомальной композиции в форме текучего порошка. Такие порошки обладают улучшенными свойствами манипуляций с ними, например, в отношении наполнения сосудов такими дегидратированными композициями по сравнению с дегидратированными композициями, полученными лиофилизацией, которые имеют строение, подобное спекшемуся веществу.

В одном из аспектов данного изобретения дегидратация по существу не влияет на отношение между инкапсулированным и свободным осмотически активным соединением при сравнении отношения в липосомальной суспензии, которую подвергали распылительной сушке, и отношения в препарате, полученном распылительной сушкой, после регидратации в воде.

В определенном аспекте данного изобретения дегидратация с помощью лиофилизации, сублимационной сушки, при которой липосомальную суспензию замораживают, а затем помещают под пониженное давление для удаления молекул воды, не включена в объем данного изобретения.

Дегидратированной композицией, например, которая получена на стадии b1) или с), можно заполнять подходящие контейнеры, и ее можно хранить в течение определенного периода времени. Предпочтительно заполнение композицией и хранение производят в условиях стерильности. Время хранения может составлять от нескольких дней до нескольких месяцев или даже лет. Композицию можно хранить при комнатной температуре, при температурах между 2°С и 8°С или ниже 0°С.

Перед тем как использовать дегидратированную липосомальную композицию, например, перед введением пациенту в случае липосомальной композиции, используемой в качестве фармацевтической композиции, или дополнительно обработанную, дегидратированную композицию регидратируют в соответствии со стадией b2 или с). С этой целью дегидратированную композицию, полученную, как описано выше, смешивают с водной средой. Чтобы усилить регидратирование, смесь перемешивают или заставляют вращаться.

Осмолярность водной среды, используемой для регидратирования, ниже общей осмолярности О₁ суспензии, которую подвергали стадии дегидратации. Предпочтительно водная среда, используемая для регидратации, по существу не содержит осмотически активных веществ. Наиболее предпочтительно для регидратации используют воду фармацевтического качества для инъекций.

При некоторых воплощениях объем водной среды, используемой для регидратации, может быть больше, чем объем липосомальной суспензии, которая была дегидратирована, с получением соответствующего количества дегидратированной липосомальной композиции.

В соответствии с данным изобретением осмолярность водной среды, применяемая для регидратации, и объем среды, используемый для регидратации, выбирают в сочетании для получения регидратированной суспензии, которая имеет общую осмолярность О₂ ниже осмолярности О₁ суспензии, которая проходила стадию дегидратации.

В другом аспекте данного изобретения стадию b) осуществляют путем разбавления липосомальной суспензии, полученной на стадии а), с получением водной среды, имеющей общую осмолярность О₂, которая ниже О₁.

Липосомальную суспензию разбавляют водной средой, как описано выше. В предпочтительном воплощении липосомальную суспензию разбавляют водой. В одном из воплощений водная среда, используемая для разбавления липосомальной суспензии, не содержит активного вещества, в частности, активного вещества, которое нужно инкапсулировать в липосомы.

В предпочтительном воплощении данного изобретения О₂, по меньшей мере, на 10 мОсм ниже О₁, более предпочтительно О₂, по меньшей мере, на 50 мОсм ниже О₁, и еще предпочтительнее О₂, по меньшей мере, на 100 мОсм ниже О₁.

В другом аспекте данного изобретения стадию b) осуществляют путем диализа липосомальной суспензии, полученной на стадии а), против водной среды, имеющей общую осмолярность, которая ниже О₁.

Предпочтительно диализ осуществляют в условиях для получения осмотического градиента между О₁ и осмолярностью водной среды, против которой осуществляют диализ, в по меньшей мере, 10 мОсм, более предпочтительно, по меньшей мере, 50 мОСМ и еще предпочтительнее, по меньшей мере, 100 мОсм.

Альтернативно, стадию b) можно осуществлять другими подходящими способами. Например, концентрацию осмотически активного вещества можно снижать подходящими хроматографическими методами, такими как ионообменная или аффинная хроматография.

В дополнительном аспекте данного изобретения напряженная липосомальная суспензия, полученная в соответствии со стадией b) данного способа, как описано выше, может быть дегидратирована. Дегидратация указанной напряженной суспензии может быть осуществлена любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Подходящими методами сушки являются, например, лиофилизация, распылительная лиофилизация или распылительная сушка. В предпочтительном воплощении дегидратацию путем распылительной сушки можно осуществлять, как описано выше для стадии b₁). В дополнительном аспекте данного изобретения получаемый дегидратированный липосомальный препарат регидратируют, как описано выше.

В конкретном воплощении данное изобретение относится к способу, при котором первичную липосомальную суспензию, предпочтительно содержащую катионные липосомы, содержащие DOTAP и, необязательно, DOPC в качестве липидов, и дополнительно содержащую липофильное активное вещество, предпочтительно паклитаксел, в липосомальной мембране, получают в водной содержащей трегалозу фазе. Концентрация составляющих в липосомальной суспензии представлена примерно трехкратной концентрацией по сравнению с липосомальной суспензией, получаемой данным способом, которую окончательно используют, например, вводят человеку. Предпочтительно первичная липосомальная суспензия имеет концентрацию примерно 30 мМ липидов и примерно 30 мг/мл, более предпочтительно 29,4 мг/мл трегалозы. Первичную липосомальную суспензию, необязательно, гомогенизируют путем экструзии через мембрану на следующей стадии. Затем общую осмолярность липосомальной суспензии снижают предпочтительно с коэффициентом 1,5 предпочтительно путем разбавления объема липосомальной суспензии водой, например, до 1,5-кратного объема. Затем липосомальную суспензию, необязательно, стерилизуют предпочтительно фильтрованием. На следующей стадии липосомальную суспнезию дегидратируют предпочтительно путем распылительной сушки, с получением дегидратированной липосомальной суспензии. Дегидратированную липосомальную суспензию, в конечном счете, регидратируют, с получением липосомальной суспензии, которую используют для соответствующей ей цели, такой как введение человеку. Последняя липосомальная суспензия предпочтительно имеет концентрацию липидов примерно 10 мМ липидов и примерно 10 мг/мл, предпочтительно 9,79 мг/мл трегалозы.

В еще одном аспекте, данное изобретение относится к способу производства липосомального препарата, включающему:

i) получение липосомальной суспензии, причем, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество содержится в водной фазе суспензии, причем осмолярность внутри инкапсулированного в липосомы объема более высокая, чем снаружи инкапсулированного в липосомы объема,

ii) инкубацию указанной липосомальной суспензии с липофильным соединением, необязательно, в несолюбилизированной форме,

iii) необязательно, отделение какого-либо нерастворенного соединения от липосомальной суспензии, например, путем фильтрования, центрифугирования или других подходящих методов,

iv) необязательно, дегидратирование липосомального препарата,

v) необязательно, регидратирование дегидратированного липосомального препарата.

Предпочтительно осмотический градиент между внутренним и наружным инкапсулированным в липосомы объемом находится в интервале между 10 мОсм и 2000 мОсм, более конкретно между 50 мОсм и 1000 мОсм, и еще конкретнее между 100 мОсм и 1000 мОсм.

В предпочтительном воплощении данного изобретения липосомальная суспензия со стадии i) не содержит активного вещества или косметического средства.

Липосомы, содержащие осмотический градиент со стадии i) могут быть получены, как описано выше. В предпочтительном воплощении данного изобретения не добавляют активное вещество или косметическое средство при производстве липосомальной суспензии на стадии i). Несолюбилизированная форма активного вещества или косметического средства может быть, например, кристаллической формой, например, разной морфологии и размера, или порошковой формой.

В одном из воплощений данного изобретения несолюбилизированное вещество отделяют от дисперсии после инкубации. В предпочтительном воплощении нерастворенное соединение отделяют путем центрифугирования или фильтрования. Фильтрование можно выполнять в шприцевом фильтре.

В другом аспекте данное изобретение относится к липосомальному препарату, полученному или к тому, которое можно получить, по способам, описанным выше. Данный препарат может быть в дегидратированной форме или в форме водной суспензии.

Липосомальный препарат данного изобретения предпочтительно используют в медицине, например, при лечении людей или в ветеринарной медицине. Данный препарат предпочтительно вводят внутривенно. Более предпочтительно данный препарат используют для лечения рака, такого как рак мочевого пузыря, рак молочных желез, рак толстого кишечника-прямой кишки, рак эндометрия, лейкемия, рак легких, лимфомы, меланома, не мелкоклеточный рак легких, рак яичников, рак простаты и рак у детей, такой как глиома ствола мозга, астроцитома мозжечка, астроцитома головного мозга, эпендимома, саркома Эвинга/совокупность опухолей, эмбрионально-клеточная опухоль, экстракраниальная, болезнь Ходжкина, лейкемия, острая лифобластная лейкемия, острая миелоидная лейкемия, рак печени, медуллобластома, нейробластома, лимфома не Ходжкина, остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома кости, ретинобластома, рабдомиосаркома, саркома мягких тканей, супратинториальные примитивные нейроэктодермальные и эпифизарные опухоли, необычные виды рака у детей, глиома зрительного пути и гипоталамическая глиома, опухоль Вильма и другие опухоли почек у детей и менее обычные виды рака, включая острую лимфоцитную лейкемию, острую миелоидную лейкемию взрослых, лимфому не Ходжкина у взрослых, опухоль головного мозга, рак шейки матки, детский рак, детскую саркому, хроническая лимфоцитную лейкемию, хроническую миелоидную лейкемию, эзофагеальный рак, лейкемию волосистых клеток, рак почек, рак печени, множественную миелому, нейробластому, рак полости рта, первичную лимфому центральной нервной системы, рак кожи, мелкоклеточный рак легких, рак головы и шеи, рак желчного пузыря и желчного протока, рак желудка, желудочнокишечный рак, саркому Капоши, уротелиальноклеточную карциному, карциному щитовидной железы, карциному мужских половых клеток, карциному влагалища, ангиосаркому, саркому мягких тканей, мезотелиому и гепатоклеточную карциному. В частности, рак может быть метастазирующим раком и/или раком, резистентным к стандартной (химио)терапии. Введение композиции данного изобретения может замедлять или останавливать прогрессирование заболевания или может приводить к частичной или полной ремиссии у людей. Наиболее предпочтительно лечить рак поджелудочной железы или молочных желез, в частности рак молочных желез? негативный по трем рецепторам. Липосомальный препарат данного изобретения можно вводить в стандартной дозе от примерно 11 мг/м² паклитаксела до примерно 44 мг/м², предпочтительно в стандартной дозе примерно 22 мг/м² паклитаксела. Предпочтительно данные препараты вводят один раз или два раза в неделю. Липосомальные препараты можно применять, как описано в WO2005/039533, WO2006/117220 и WO2007/107305.

Кроме того, липосомальный препарат данного изобретения можно использовать как диагностический или косметический препарат.

Кроме того, данное изобретение относится к липосомальной суспензии, содержащей активное или косметическое соединение в липосомальных оболочках, причем липосомы инкапсулируют водную среду с осмолярностью, которая выше осмолярности водной среды снаружи инкапсулированного в липосомы объема. Водная среда суспензии содержит, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество. Различие между осмолярностью среды внутри липосомы и снаружи липосомы предпочтительно составляет, по меньшей мере, 10 мОсм, предпочтительно, по меньшей мере, 50 мОсм.

Различие осмолярности внутри и снаружи липосомы вызывает градиент осмотического давления, которое приводит к усилию растяжения на мембране липосомы, как описано у Hallet et al., 1993. Соответственно, данное изобретение относится к липосомальной суспензии, содержащей активное или косметическое соединение в липосомальной мембране, причем липосомальная мембрана находится под напряжением растяжения.

Липосомы, у которых липосомальная мембрана находится в напряжении растяжения, могут быть получены путем применения осмотических ингредиентов, как описано выше.

Несколько методов определения физико-химических характеристик могут применяться для определения осмолярных градиентов и напряжения растяжения в липосомальных препаратах. Во многих случаях растворы осмотически активных компонентов имеют более высокую плотность, чем плотность воды, и плотность измененяется единообразно с концентрацией данных соединений. Если осмолярность инкапсулированного в липосомы объема выше, чем осмолярность свободного объема, это влияет на плотность липосомы. Для трегалозы в концентрации 5% (150 мОсм) в воде плотность примерно на 0,02 г/л выше, чем плотность чистой воды (Handbook of chemistry and Physics, CRC press, Boca Raton, Florida). Следовательно, различие в осмолярности внутри и снаружи липосомы приводит к различной плотности среды внутри инкапсулированного в липосомы объема и среды снаружи инкапсулированного в липосомы объема.

Таким образом, в дополнительном аспекте данного изобретения раскрыты липосомальные суспензии, в которых в инкапсулированном в липосомы объеме плотность выше, чем в среде снаружи инкапсулированного в липосомы объема. Различие плотности дано по предпочтительному осмолярному градиенту и плотности раствора соответствующего осмотически активного соединения. Плотность коллоидных частиц, таких как липосомы, может быть определена, например, с помощью методов ультрацентрифугирования.

В особенно предпочтительном воплощении липосомальные суспензии данного изобретения, имеющие осмолярный градиент, являются липосомальными суспензиями, содержащими липосомы, включающие DOTAP, DOPC и паклитаксел, предпочтительно, в молярном отношении 50:47:3, при общей концентрации липидов примерно 10 мМ, трегалозу и, необязательно, лимонную кислоту, суспендированными в водной фазе, содержащей примерно 10 мг/мл, в частности, 9,79 мг/мл трегалозы и, необязательно, примерно 0,011 мг/мл лимонной кислоты, причем указанные липосомы имеют плотность в безводном состоянии, по меньшей мере, примерно 1,1 г/мл, в частности, по меньшей мере, примерно 1,15 г/мл, по меньшей мере, примерно 1,17 г/мл или, по меньшей мере, примерно 1,17 г/мл. Предпочтительно указанные липосомы имеют z_{среднее} примерно 140 нм.

Описанный выше способ делает возможным получение липосомальных суспензий, содержащих липосомы, которые описаны выше, которые, кроме того, отличаются регулируемым распределением частиц по размеру, где широта профиля распределения по размеру по существу не увеличивается при процессе производства, что характеризуется, например, изменениями показателя полидисперсности (PI). Предпочтительно PI липосомальной суспензии данного изобретения, имеющей осмолярный градиент, не повышается более чем на 0,2, более предпочтительно не повышается более, чем на 0,1 при создании осмолярного градиента.

В дополнительном аспекте данного изобретения активное или косметическое соединение по существу содержится только в мембранной части липосом в липосомальных препаратах данного изобретения. Таким образом, по меньшей мере, примерно 98%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 99% молярного количества активного или косметического соединения, присутствующего в препарате, помещается в липидной фазе липосомальных мембран. Только остаточное количество может быть солюбилизировано в водной фазе препарата или может присутствовать в форме кристаллического активного или косметического соединения.

Суспензии, описанные в настоящем описании, которые могут быть получены по описанному процессу, более стабильны в отношении высвобождения лекарственного средства, чем сравниваемые обычные липосомальные суспензии, которые получают без осмотического градиента. Стабильность по времени в отношении высвобождения лекарственного средства из липосом выше, и состав меньше предрасположен к высвобождению лекарственного вещества, когда подвергается механическому воздействию и/или другому сильному воздействию. Предпочтительно высвобождение лекарственного вещества может задерживаться, по меньшей мере, на 6 часов, предпочтительно, по меньшей мере, на 12 часов, по меньшей мере, на 24 часа, по меньшей мере, на 2 дня, по меньшей мере, на 7 дней или, по меньшей мере, на 14 дней или более при 25°С по сравнению с суспензией без осмотического градиента. Определение высвобождения лекарственного средства зависит от вида лекарственного средства. Что касается нагруженных паклитакселом липосом, высвобождение лекарственного вещества можно точно контролировать путем определения частичек лекарственного вещества (кристаллов), которые образуются после высвобождения. Частицы могут быть определены, например, путем измерений рентгеновской дифракции или методами светового рассеяния.

В одном из воплощений данного изобретения, по меньшей мере, примерно 90%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95%, наиболее предпочтительно 99% количества активного или косметического соединения, солюбилизированного посредством липосомальных мембран, сохраняется в липосомах через, по меньшей мере, 24 часа при комнатной температуре, и не высвобождается в водную фазу суспензий. Хотя высвобождение липофильных активных или косметических соединений, которые имеют низкую растворимость в указанной водной фазе, может приводить к образованию кристаллов, суспензии данного изобретения по существу не образуют кристаллов до количества, соответствующего более примерно 10%, предпочтительно более примерно 5%, наиболее предпочтительно более примерно 1% солюбилизированного вещества через 24 часа при 25°С.

А также липосомальные суспензии данного изобретения, полученные путем регидратации дегидратированной липосомальной композиции, которая описана выше, не образуют агрегаты за период, по меньшей мере, за 24 часа при 25°С. Образование агрегатов можно определить по изменению показателей Z_{среднее} и PI при фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС; PCS). Суспензии данного изобретения характеризуются изменениями Z_{среднее} не более чем с коэффициентом примерно 1,5, предпочтительно не более 1,25, и изменения значения PI с коэффициентом не более примерно 2, предпочтительно не более примерно 1,5, наиболее предпочтительно не более примерно 1,25 за 24 часа. Предпочтительно липосомальные суспензии с этими свойствами получают в результате регидратации дегидратированной липосомальной композиции.

Так как органические растворители часто используют при получении липосом, например, как описано выше для метода с этанольной инжекцией, остаточный органический растворитель, такой как этанол, обычно обнаруживают в дегидратированном липосомальном продукте, и соответственно, в регидратированной липосомальной суспензии, полученной из него. Это, в частности, происходит в случае липосомальных препаратов, которые были дегидратированы путем сублимационной сушки (лиофилизации). Однако для липосомального продукта, используемого для применения у людей, желательно, чтобы он содержал как можно меньше органического растворителя. Данное изобретение делает возможной дегидратацию путем распылительной сушки, что облегчает удаление большинства или всего остаточного органического растворителя, в то же время с получением липосом с высокой стабильностью. Соответственно, в другом аспекте данного изобретения раскрыты дегидратированные липосомальные препараты, как описано выше, которые содержат примерно менее 1 мас.%, более предпочтительно менее 0,5 мас.%, наиболее предпочтительно примерно менее 0,1 мас.% органического растворителя от веса дегидратированного препарата в целом. Путем регидратации этих дегидратированных липосомальных препаратов получают липосомальные суспензии, которые содержат примерно менее 1 мг/мл, более предпочтительно примерно менее 0,5 мг/мл, наиболее предпочтительно примерно менее 0,1 мг/мл, органического растворителя. Предпочтительно органическим растворителем является этанол.

Кроме того, липосомальные суспензии данного изобретения, которые получают путем регидратации дегидратированной липосомальной композиции, как описано выше, имеют очень сходный показатель распределения частиц по размеру по сравнению с первоначальными липосомальными суспензиями, которые были дегидратированы, как описано выше. Более конкретно размер липосом хорошо сохраняется, и не происходит значительного образования липидных агрегатов при определении путем оценки по ФКС. В одном из воплощений данного изобретения липосомальную суспензию подвергают дегидратации, и липосомальные суспензии, полученные путем регидратации, как описано выше, характеризуются Z_{среднее}, которое отличается с коэффициентом менее 1,5, а значением PI, которое отличается менее чем с коэффициентом 2 (количественные оценки по ФКС). PI регидратированной липосомальной суспензии через 1 час после воспроизведения предпочтительно равен менее 0,4, более предпочтительно менее 0,3, наиболее предпочтительно менее 0,25. Предпочтительно PI указанных суспензий только слегка изменяется за 24 часа при 25°С, как описано выше.

В конкретном воплощении данное изобретение относится к регидратированной водной липосомальной суспензии, содержащей катионные липосомы, включающие до примерно 5 мол.%, предпочтительно до примерно 3 мол.% паклитаксела в липосомальных мембранах, причем PI липосомальной суспензии через 1 час после воспроизведения равен менее 0,4, более предпочтительно менее 0,3, наиболее предпочтительно менее 0,25, и кроме того, характеризуется изменениями Z_{среднее} не более чем с коэффициентом примерно 1,5, предпочтительно не более 1,25, и изменениями значения PI с коэффициентом не более примерно 2, предпочтительно не более примерно 1,5, наиболее предпочтительно не более примерно 1,25 за 24 часа при 25°С.

Предпочтительно липосомы описанной выше регидратированной липосомальной суспензии высвобождают не более примерно 2% по массе, предпочтительно не более примерно 1% по массе паклитаксела (от общей массы паклитаксела) из липосомальных мембран в водную среду через 24 часа при 25°С.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1: Количество паклитаксела, солюбилизированное липосомальными препаратами с концентрацией липидов 10 мМ и общей концентрацией трегалозы 10 мас.%. Липосомы получали из концентрированных препаратов-предшественников путем разбавления водой. По абсциссе показана первичная концентрация, т.е. данные по 10% трегалозе получали по суспензии, которая не разбавлена, а данные по 40% трегалозе были получены по неразбавленной суспензии, которая первоначально была 40% (мас) по трегалозе и 40 мМ по липиду, и которую разбавляли 1 + 3 водой.

Фиг. 2: Скорость счета по 10 мМ DOTAP/DOPC суспензии липосом, полученной из концентрированного состава с содержанием 30 мМ липида в 30% (мас) растворе трегалозы. Раствор разбавляли смесями воды/трегалозы до разных общих концентраций трегалозы между 30% и 10% (мас). Все препараты имели одну и ту же конечную концентрацию липида в 10 мМ, а градиент концентрации трегалозы между инкапсулированной и свободной водной фазой был таким, как показано по оси х.

Примеры

1. Загрузка паклитаксела в липосомы с разными градиентами трегалозы

1.1 Краткое описание

Исследовали действие осмолярных градиентов на распределение паклитаксела в липосомах при равновесии с насыщенной водной фазой. Получали липосомы с различными осмолярными градиентами и инкубировали с кристаллами паклитаксела. Все препараты имели одну и ту же композицию; более точно, концентрация липидов и концентрация трегалозы составляли с_липид=10 мМ и с_{трегалозы}=10% (мас). Некоторые из препаратов были получены и экструдированы при высокой концентрации липидов и трегалозы, и разбавляли водой после экструзии до конечной концентрации. Таким образом, свободная водная фаза разбавлялась, но инкапсулированная водная фаза не разбавлялась (пренебрегая эффектами набухания и обмена растворимыми веществами через дефекты). Устанавливался осмолярный градиент между инкапсулированной и свободной водной фазой, который увеличивался с повышением разбавления. Образованные таким образом липосомы инкубировали с сухим паклитакселом и определяли количество паклитаксела, который был солюбилизирован липосомами. Было обнаружено монотонное повышение уровня солюбилизированного паклитаксела с повышением разбавления (градиент концентрации). Результаты показывают, что количество паклитаксела, который распределяется в липосомальной мембране при равновесии повышается с повышением осмолярного градиента.

Материалы

Паклитаксел, серия 06/150	Cedarburg Pharmaceuticals
DOTAP, серия MBA 113	Merck Eprova
DOPC, серия G181PC49	Avanti Polar Lipids
Вода, Milli-Q-Synthesis	Millipore
Трегалозы дигидрат, высокой чистоты	Senn Chemicals
Хлороформ, ч.д.а.	Merck
Ацетонитрил, марки для ВЭЖХ (АЦН)	Merck
Тетрагидрофуран, марки для ВЭЖХ (ТГФ)	Merck
Ацетат аммония, ч.д.а.	Merck
Трифторуксусная кислота, ч.д.а.	Merck
Шприцевой фильтр, Minisart размер пор 0,2 мкм, диаметр 25 мм	Sartorius
Мембрана: целлюлозы ацетат Система для ВЭЖХ 1100	Agilent
Дегазатор (G1379A)
Бинарный насос (G1312A)
Термостатированный автодозатор (Автоинжектор G1329A, термостат G1330B)
Термостатированный блок для колонки (G1316A)
Диодно-матричный детектор (G1315B) или детектор с переменной длиной волны (G1314A)
ChemStation для ЖХ, 3D, Rev. A.09.01
Экструдер, 10 мл	Nothern Lipids
Zetasizer 3000	Malvern Instruments

1.2 Методы

Получение пустых липосом

Составы DOTAP/DOPC (в отношении 1:1) или составы, содержащие только DOTAP или DOPC, получали пленочным методом. Необходимые количества липидов отвешивали в круглодонную колбу и растворяли в хлороформе. Растворитель выпаривали досуха в роторном испарителе (Heidolph, Германия) при давлении примерно 150 мбар при температуре примерно 40°С в течение примерно 15 минут. Пленку сушили при 10 мбар в течение 60 минут, а затем гидрировали в растворе трегалозы в воде путем легкого взбалтывания колбы. Количества липидов, концентрацию трегалозы и объем раствора трегалозы выбирали так, чтобы получить в результате суспензии, содержащие липиды в концентрациях между 10 мМ и 40 мМ и трегалозу в концентрации между 9,8% и 39,2% (мас./об) для препаратов DOTAP/DOPC и концентрацию липидов между 10 мМ и 30 мМ и концентрации трегалозы между 9,8% и 29,4% (мас./об) для препаратов с только DOTAP или DOPC. Получаемые в результате суспензии многослойных липосом экструдировали пять раз через поликарбонатную мембрану с размером пор в 200 нм при давлении примерно 5 бар. После экструзии суспензии разбавляли водой с получением суспензий с концентрациями липидов 10 нМ и общей концентрацией трегалозы в 9,8% (мас./об).

Загрузка паклитакселом

По 5 мл суспензий, содержащих пустые липосомы, полученные, как описано выше, добавляли к 2,6 мг сухого паклитаксела (соответствующие теоретической концентрации паклитаксела в 600 мкМ) в 15 мл пробирках Фалькона. Партии перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре (магнитная мешалка).

После перемешивания не связанный липосомами паклитаксел отделяли фильтрованием 2 мл каждой партии через шприцевой фильтр (Sartorius Minisart, 0,2 мкм, целлюлозоацетатная мембрана). Концентрацию паклитаксела и липида в полученных фильтратах затем анализировали с помощью ВЭЖХ.

Аналитические методы

Определение содержания паклитаксела

Образцы разбавляли в АЦН/ТГФ/2 мМ ацетатом аммония 48/18/34 (о/о/о).

Стационарная фаза:	LiChroCART® 250-4; LiChrospher 60, RP-select B, длиной 250 мм, ВД: 4 мм, размер частиц 5 мкм
Подвижная фаза:	АЦН/ТГФ/2 мМ ацетат аммония 32/12/56 (о/о/о)
Скорость потока:	1 мл/мин
Температура колоночного блока:	35°С
Детектор длины волны:	229 нм
Впрыскиваемый объем:	10 мкл
Время цикла:	40 мин

Определение содержания липидов

Содержание липидов в партиях до и после фильтрования анализировали по ВЭЖХ для контроля потенциальной потери липосомального материала при процессе фильтрования. Образцы разбавляли в АЦН/воде 50/50.

Стационарная фаза:	Phenomenex Luna 5 мк С8(2) 100 Å, 150 мм × 2 мм
Мобильная фаза:	Ацетонитрил с 0,1% ТФА, вода с 0,1% ТФА

Определение липидного градиента:

Время (мин)	АЦН (%)
0	50
4,12	50
7,06	75
14,13	100
21,20	100
23,56	50
30,00	50

Скорость потока: 0,4 мл/мин

Температура колоночного блока: 45°С

Детектор длины волны: 205 нм

Впрыскиваемый объем: 5 мкл

Время цикла: 30 мин

1.3 Результаты

Составы DOTAP/DOPC

На фиг. 1 показано количество паклитаксела, которое было солюбилизировано путем инкубации с разными липосомальными составами DOTAP/DOPC. Все составы содержали одно и то же количество липида (липосом) и трегалозы. Они были получены из разных более концентрированных составов путем разбавления водой. За исключением абсолютной концентрации, все производные составы были эквивалентны и их обрабатывали одинаково. По абсциссе представлена исходная концентрация трегалозы до разбавления. Так как во всех случаях конечная общая концентрация трегалозы составляла 10%, градиент трегалозы повышается с повышением значений на абсциссе. Как можно видеть, количество паклитаксела, которое солюбилизировано липосомами, монотонно повышалось с градиентом трегалозы (разбавление). Способность липосом к загрузке повышалась с повышением градиента трегалозы.

Составы DOTAP и DOPC

В таблице 1 показано количество паклитаксела, солюбилизированного составами липосом с DOTAP и DOPC (в качестве единственного компонента) в зависимости от исходной концентрации трегалозы, использованной для получения:

Таблица 1 Составы с DOTAP и DOPC
С0 трегалозы (%)	Концентрация паклитаксела (мкМ)
DOTAP	DOPC
9,8	163	159
12,3	192	167
14,7	225	192
17,2	297	224
19,6	289	217
24,5	297	289
29,4	339	221

А также для липосом из чистого липида обнаружена явная зависимость от способности к солюбилизации от градиента трегалозы. Для составов с DOTAP наблюдали повышение способности к загрузке паклитакселом с повышением разницы концентрации трегалозы внутри и снаружи липосомы по сравнению с результатами для составов с DOTAP/DOPC. Этот эффект был менее выражен у липосом, на 100% состоящих из DOPC.

2. Загрузка паклитакселом липосом с разными градиентами трегалозы после распылительной сушки

2.1. Краткое описание

Целью этого примера было испытание того, есть ли положительный эффект у осмотического градиента на загрузку липосом паклитакселом, если липосомы сушат распылительной сушкой между образованием и корректировкой градиента трегалозы. Липосомы с DOTAP/DOPC получали с двумя разными концентрациями, а именно, 10 мМ липида в 10% (мас.) растворе трегалозы и 20 мМ липида в 20% (мас.) раствора трегалозы. Оба состава сушили распылительной сушкой при соответствующей концентрации. Высушенные распылительной сушкой порошки восстанавливали в жидкий препарат водой до концентрации липида 10 мМ и соответствующей концентрации трегалозы 10% (мас.). Жидкие составы выдерживали с палитакселом, как описано выше, и определяли количество солюбилизированного паклитаксела. Было обнаружено, что состав, который высушили распылительной сушкой состава в двойной концентрации (20 мМ липида/20% (мас.) трегалозы) солюбилизировал больше паклитаксела, чем состав, который высушен распылительной сушкой из состояния с одинарной концентрацией (10 мМ липида, 10% (мас.) трегалозы).

Результаты показывают, что на распределение трегалозы внутри/снаружи липосом распылительная сушка при выбранных условиях не влияла. После восстановления в жидкость первоначально продукта с двойной концентрацией, были получены липосомы с градиентом концентрации трегалозы в соответствии с эффектом прямого разбавления жидкого состава.

2.2. МЕТОДЫ

Получение липосом

Составы получали путем этанольной инжекции. Соответствующие количества раствора липида в этаноле (200 мМ DOTAP-CI, 188 мМ DOPC) инжектировали при перемешивании в раствор трегалозы в воде. Концентрация трегалозы составляла 20% (мас.) для 20 мМ липосом и 10% (мас.) для 10 мМ липосом. Необходимое количество липидного раствора в этаноле составляло примерно 2,5 мл/л для 10 мМ состава и 5 мл для 20 мМ состава.

Получаемые полидисперсные составы липосом экструдировали пять раз через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм при давлении примерно 5 бар.

Распылительная сушка

Распылительную сушку производили с помощью микрораспылительной сушилки Niro SD с использованием двухлоточной форсунки. Условия распыления были следующими: температура на выходе=100°С, температура на входе=145°С, скорость подачи (расход) = 340 г/час, расход распыляющего газа 2,3 кг/час, расход осушающего газа 30 кг/час.

Восстановление жидкого препарата

Сухие порошки как прежде 10 мМ, так и прежде 20 мМ состава восстанавливали в жидкость с помощью воды до концентрации липида 10 мМ.

Анализ загрузки паклитакселом

Выполняли загрузку липосом паклитакселом.

2.3. Результаты

Результаты, которые получены по загрузке паклитакселом в восстановленных в жидкость порошках показаны в таблице 2. Как можно видеть, состав, который сушили распылительной сушкой при концентрации липида 20 мМ, солюбилизировал значительно больше паклитаксела, чем состав с исходной концентрацией липида 10 мМ. Сделано заключение, что повышенная загрузка паклитакселом первоначально 20 мМ состава происходила благодаря осмолярному градиенту между инкапсулированной и свободной водной фазой, который не присутствовал в первоначально 10 мМ составе. Распылительная сушка и восстановление сухого порошка не приводило к уравновешиванию трегалозы между внутренней и наружной водной фазой, и поэтому осмолярность инкапсулированной водной фазы была выше в случае первоначально 20 мМ состава.

Таблица 2 Солюбилизация паклитаксела составами, полученными путем восстановления в жидкость порошков, высушенных распылительной сушкой. Концентрация липида и трегалозы были идентичными в обоих случаях (10 мМ липида, 10% мас. трегалозы), но перед распылительной сушкой один состав представлял 10 мМ липид, 10% трегалозу, а другой состав представлял 20 мМ липид, 20% трегалозу
Первоначальная липидная концентрация состава	Концентрация солюбилизированного паклитаксела
10 мМ (PD_L_07030)	164 (мкМ)
20 мМ (PD_L_07031)	340 (мкМ)

3. Стабильность загруженных липосом

3.1. Краткое описание

Чтобы получить ответ на вопрос, обладают ли липосомальные препараты с градиентом трегалозы внутри/снаружи не только более высокой способностью загрузки, но также большей стабильностью в отношении высвобождения паклитаксела, высвобождение паклитаксела из липосом прослеживали как функцию времени. Получали составы с относительно высокой фракцией паклитаксела, а именно 5 мол.%, и с разными градиентами трегалозы в интервале между 0% и 20% (мас). У липосом, содержащих градиент трегалозы, не показано какого-либо существенного высвобождения паклитаксела в пределах испытанного периода в 21 день, тогда как у липосом без градиента трегалозы остаточная фракция паклитаксела снижалась до менее 1%.

3.2. Метод

Составы с DOTAP/DOPC

Липосомы с DOTAP/DOPC, содержащие примерно 5 мол.% паклитаксела (в отношении точных значений см. таблицу), 10-30 мМ липидов и 9,8%-29,4% (мас./об) трегалозы получали по описанному выше пленочному методу путем добавления соответствующего количества липидов и паклитаксела в хлороформный раствор. Затем 30 мМ партии разбавляли до концентрации липида в 10 мМ (общая концентрация трегалозы 9,8% мас./об) водой.

Образцы хранили при 4°С, и содержание паклитаксела в липосомах определяли через 0, 1, 5, 14 и 21 день описанным выше способом с использованием фильтрования и анализа ВЭЖХ.

3.3. Результаты

Результаты сведены в таблице 3. Показана концентрация паклитаксела (мкм), оставшегося в липосомах. Концентрация липида составляла 10 мМ, поэтому концентрация паклитаксела в 100 мкМ соответствует молярной концентрации в отношении липида в 1%.

В составе без градиента трегалозы остаточная фракция трегалозы монотонно снижалась до значения менее 100 мкМ (менее 1 мол.% в отношении к липиду) через 21 день. В противоположность этому с помощью градиента трегалозы сохраняющееся количество паклитаксела не падало ниже 400 мкМ. В этом случае не наблюдалось монотонного снижения, другими словами, очевидно, что значение в примерно 400 мкМ представляет физически стабильное состояние паклитаксела в липосомах.

Таблица 3 Сохранность паклитаксела в липосомах DOTAP/DOPC
	Градиент концентрации трегалозы
	0	10%	20%
	Сохраненный в липосомах паклитаксел (мкМ)
Перед фильтрованием	470	444	425
T (день) после фильтрования
0	453	446	411
1	438	428	407
5	391	429	420
14	90	427	412
21	79	409	400

Конечные фракции сохранившегося паклитаксела сходны со значениями, которые получены от анализа загрузки для эквивалентно обработанных липосом. Поэтому данные по анализу загрузки могут быть взяты как прогностические для предела стабильности загруженных липосом. Если не происходит других эффектов, числа из анализа загрузки дадут информацию по количеству паклитаксела, которое сохраняется в липосомах при данных условиях. В качестве дополнительного заключения из данных примеров видно, что градиент трегалозы и улучшенная стабильность полностью сохраняются в течение нескольких дней. В представленном случае эффект сохранялся в течение 21 дня.

4. Методы определения градиентов трегалозы в липосомальных составах in situ

4.1. Краткое описание

Изготавливали концентрированные липосомальные составы в растворе трегалозы при концентрации с₁ и разбавляли или водой или раствором трегалозы в разных отношениях с получением среды с концентрацией трегалозы с₂, причем с₂≤с₁. Все составы имели одну и ту же конечную концентрацию липида, равную 10 мМ. Препараты анализировали по локальным изменениям оптических свойств (показатель преломления). Скорость счета при измерениях динамического рассеяния света использовали для демонстрации изменений интенсивности рассеяния. С повышением градиента трегалозы С₁–С₂ скорость счета при измерениях динамического рассеяния света (PCS) монотонно повышается.

4.2. Метод

Динамическое рассеяние света измеряли с помощью гониометра BI-200SM от Brookhaven Instruments (Holtsville USA). Измерения выполняли с помощью 30 мВ лазера при длине волны 641 нм при угле 90°С. Для анализа данных выполняли обратную трансформацию Лапласа с применением методов оптимальной регуляризации.

4.3. Образцы

Липосомы DOTAP/DOPC (молярное отношение 1:1) с общей концентрацией липида 30 мМ изготавливали в 30% растворе трегалозы. Липосомальный препарат с 30 мМ липида и в 30% растворе трегалозы экструдировали через мембраны для экструзии 200. Затем липосомы разбавляли водой, 30% раствором трегалозы или их смесями в соотношении, которые показаны в таблице 4.

А: 30 мМ липосом в 30% растворе трегалозы

В: 30% раствор трегалозы в воде

С: Вода

Таблица 4 Методика разбавления для 10 мМ липидных составов в водной фазе с трегалозой в концентрациях между 10% и 30% (мас).
№	Объем А	Объем В	Объем С	Конечная композиция
1	1	2	-	10 мМ липосомы в 30% трегалозе
2	1	1,5	0,5	10 мМ липосомы в 25% трегалозе
3	1	1	1	10 мМ липосомы в 20% трегалозе
4	1	0,5	1,5	10 мМ липосомы в 15% трегалозе
5	1	-	2	10 мМ липосомы в 10% трегалозе

Концентрация липида в конечном препарате всегда составляла 10 мМ, но общая концентрация трегалозы колебалась между 10% (разбавление водой) и 30% (разбавление 30% раствором трегалозы). При исходной концентрации трегалозы в 30% это приводило к числовому значению градиента концентрации трегалозы между 0% (общая концентрация = 30%) и 20% (общая концентрация = 10%). Через один час после разбавления выполняли измерение динамического рассеяния света.

4.4. Результаты

На фиг. 2 показаны результаты измерений динамического рассеяния света. Скорость счета представлена как функция градиента трегалозы. Скорость счета монотонно повышалась с увеличением градиента трегалозы. Это может быть скоррелировано с повышением градиента показателя преломления и эффектами набухания при повышении градиента трегалозы. Хорошо известно, что липосомы могут действовать как идеальные осмометры, и осмолярные градиенты можно определить по рассеянию света и свойствам поглощения света в соответствующих условиях (de Gier 1993; Cabral, Hennies et al., 2003). Кроме интенсивности в результате квазигибкого рассеяния света можно также использовать другие методики на основе рассеяния света, а также измерений поглощения или мутности. Данные наблюдения показывают, что анализ скорости счета при измерении динамического рассеяния света можно использовать как средство контроля успешности создания градиента трегалозы для данного состава. Кроме того, эти данные подтверждают, что изменение осмолярности водной среды липосомальной суспензии придает определенные физические свойства липосомам.

5. Влияние градиента трегалозы на физическую стабильность жидких липосомальных DOTAP/DOPC составов паклитаксела

5.1. Краткое описание

В этом примере дополнительно исследовано стабилизирующее действие градиентов трегалозы на DOTAP/DOPC липосомальные составы паклитаксела, которые представлены в примере 3. Липосомы изготавливали в концентрации 30 мМ (в 32% по массе растворе трегалозы), разбавляли различными растворами трегалозы/водой, и определяли высвобождение паклитаксела после механического воздействия.

Обнаружено, что физическая стабильность повышалась с повышением градиента трегалозы. Эти данные подтверждали стабилизирующее действие градиентов трегалозы на содержащие паклитаксел липосомы также и в отношении переработки на экспериментальном уровне.

5.2. Методы и материалы

Производство липосом

Липосомы получали по методу этанольной инжекции. В кратком изложении, раствор 200 мМ DOTAP и 188 мМ DOPC (общая концентрация липида 388 мМ) инжектировали при перемешивании при температуре 2-8°С в водную фазу (8,11 мл раствора липида в этаноле для 100 мл водной фазы) с получением полидисперсных липосом при концентрации липида примерно 30 мМ. Для водной фазы был выбран раствор 32,1% мас. дигидрата трегалозы с 184,5 мкМ лимонной кислоты.

Экструзию выполняли, как указано, при давлении 3 бар с помощью поликарбонатных мембран с размером пор 220 нм. Стерилизующее фильтрование выполняли как указано, с использованием стерильных фильтров milipak 20 или мембран durapore (Millipore, Molsheim, Франция).

Градиенты концентрации

Исходные составы 30 мМ липосом в 30% (мас) растворе трегалозы (PD-L-09111) разбавляли водой до различных конечных концентраций липида и трегалозы.

Таблица 5 Разбавление испытуемых образцов
Наименование	PD-L-09111 (мл)	Вода (мл)	Слипида (мМ)	Стрегалозы (% мас)	ΔС трегалозы (% мас)
PD-L-09111	100	0	30	30	0
PD-L-09112	70	70	15	15	15
PD-L-09113	90	54	18,8	18,8	11,2
PD-L-09114	100	0	30	30	0
PD-L-09115	80	64	16,7	16,7	13,3
PD-L-09116	100	40	21,4	21,4	8,6
PD-L-09119	100	24	25	25	5

Испытание на стабильность

Образцы помещали на качалку и взбалтывали при 150 об/мин при 25°С или при 2-8°С, соответственно. Через 24 и 48 часов образцы анализировали и определяли количество паклитаксела, оставшееся в липосомах.

Определение сохранения паклитаксела в липосомальных препаратах и высвобождения из них

Сохранение паклитаксела в липосомах исследовали путем фильтрования липосомальных препаратов для удаления кристаллов паклитаксела из липосомального продукта (как описано в примере 3). Остаточный паклитаксел определяли количественно по анализу ВЭЖХ. Кроме того, использовали оптическую микроскопию для исследования образцов на кристаллы паклитаксела.

5.3. Результаты

Результаты представлены в таблицах 6-12. Для простоты исходную концентрацию трегалозы аппроксимируют как 30% (мас.). Градиенты концентрации, которые представлены, рассчитывали по исходной концентрации трегалозы и показателю разбавления. Фактические градиенты концентрации между инкапсулированной и свободной водной фазой имеют ту же самую тенденцию, но абсолютные значения могут слегка отличаться от градиентов, представленных в таблицах.

Как можно видеть, стабильность повышается с повышением градиента трегалозы. Количество сохранившегося в липосомах паклитаксела повышается и наблюдается меньше кристаллов паклитаксела. Стабильность выше при 5°С по сравнению с 25°С.

Таблица 6 Стабильность при 0% градиента трегалозы
Число частиц	Темп (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопи
>1 мкМ	>1 мкМ	>25 мкМ
PD-L-09111	30	0	5	24	<5	Нет
PD-L-09111	30	0	5	24	8	Да
PD-L-09111	30	0	5	48	8	Да
PD-L-09111	30	0	5	48	19	Да
PD-L-09111	30	0	25	24	86	Да
PD-L-09111	30	0	25	24	86	Да
PD-L-09111	30	0	25	48	85	Да
PD-L-09111	30	0	25	48	85	Да

Таблица 7 Стабильность при 5% градиенте трегалозы
Образец	Слипида (мМ)	ΔСтрег. (% мас.)	Темп. (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопии
PD-L-09119	25	5	5	24	<5	Нет
PD-L-09119	25	5	5	24	<5	Нет
PD-L-09119	25	5	5	48	<5	Нет
PD-L-09119	25	5	5	48	<5	Нет
PD-L-09119	25	5	25	24	29	Да
PD-L-09119	25	5	25	24	44	Да
PD-L-09119	25	5	25	48	70	Да
PD-L-09119	25	5	25	48	69	Да

Таблица 8 Стабильность при 8,6% градиенте трегалозы
Образец	Слипида (мМ)	ΔСтрег. (% мас.)	Темп. (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопии
PD-L-09116	21,4	8,6	5	24	<5	Нет
PD-L-09116	21,4	8,6	5	24	<5	Нет
PD-L-09116	21,4	8,6	5	48	<5	Нет
PD-L-09116	21,4	8,6	5	48	<5	Нет
PD-L-09116	21,4	8,6	40	24	<5	Нет
PD-L-09116	21,4	8,6	40	24	<5	Нет
PD-L-09116	21,4	8,6	40	48	<5	Да
PD-L-09116	21,4	8,6	40	48	<5	Да

Таблица 9 Стабильность при 11,2% градиенте трегалозы
Образец	Слипида (мМ)	ΔСтрег. (% мас.)	Темп. (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопии
PD-L-09113	18,8	11,2	5	24	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	5	24	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	5	48	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	5	48	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	40	24	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	40	24	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	40	48	<5	Нет
PD-L-09113	18,8	11,2	40	48	<5	Нет

Таблица 10 Стабильность при 13,3% градиенте трегалозы
Образец	Слипида (мМ)	ΔСтрег. (% мас.)	Темп. (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопии
PD-L-09115	16,7	13,3	5	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	5	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	5	48	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	5	48	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	48	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	48	<5	Нет

Таблица 11 Стабильность при 13,3% градиенте трегалозы
Образец	Слипида (мМ)	ΔСтрег. (% мас.)	Темп. (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопии
PD-L-09115	16,7	13,3	5	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	5	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	5	48	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	5	48	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	24	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	48	<5	Нет
PD-L-09115	16,7	13,3	40	48	<5	Нет

Таблица 12 Стабильность при 15% градиенте трегалозы
Образец	Слипида (мМ)	ΔСтрег. (% мас.)	Темп. (°С)	Время (час)	Потеря ПТЛ при фильтрации (%)	Кристаллы при микроскопии
PD-L-09112	15	15	5	24	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	5	24	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	5	48	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	5	48	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	40	24	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	40	24	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	40	48	<5	Нет
PD-L-09112	15	15	40	48	<5	Нет

6. Стабильность высушенных распылительной сушкой загруженных паклитакселом липосом

6.1. Методы и материалы

Использовали материалы, которые описаны в предыдущих примерах.

Липосомы, состоящие из DOTAP, DOPC и паклитаксела (молярное отношение 50/47/3) формировали по методу этанольной инжекции, как описано выше. Паклитаксел солюбилизировали с помощью липидов в этанольном растворе. Получали липосомы при концентрации 20 мМ липида в 20% (вес.) трегалозе (партия PD-L-09031) и 10 мМ липида в 10% трегалозе (партии MDG09.108-08-001 и PD-L-090032). Эти липосомы экструдировали пять раз через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм и стерилизовали фильтрованием, как описано выше.

После получения липосомальных суспензий липосомы дегидратировали. Партии PD-L-09031 и PD-L-09031 сушили распылительной сушкой в распылительной сушилке Niro SD-Micro с параметрами распылительной сушки, которые описаны в примере 2.

Партию MDG09.108-08-001 дегидратировали лиофилизацией, используя установку для лиофильной сушки Epsilon 2-12D (Christ). Липосомальную суспензию выдерживали при 4°С в течение 1 часа и замораживали при -40°С в течение примерно 5 часов. После замораживания температуру повышали до -16°С и выполняли первичную сушку при давлении 0,1 бар в течение 90 часов. Для вторичной сушки температуру повышали до 20°С, тогда как давление снижали до 0,01 бар.

Сухие порошки восстанавливали в жидкость водой до концентрации липида 10 мМ в 10,5% (мас.) трегалозе. Получаемые жидкие липосомальные продукты исследовали через один час после восстановления и через 24 часа после восстановления измерением динамического рассеяния света с использованием Malvern Zetasizer 1000HSA, серия DTS5101 (установки: анализ = мономодальный, расширение = 1,2; порядок аппроксимации = 3; выбор точки, первая = 18; выбор последней точки = под номером 22; точка взвешивания = quatric; аттенюатор = х16; вязкость 1200 сп; показатель преломления = 1,348; число измерений = 3; интервал между измерениями = 0; продолжительность измерения = авто) для определения Z_средн. и PI. Перед измерением образцы разбавляли в десять раз 10,5% (мас.) раствором дегидрата трегалозы.

6.2. Результаты

Результаты показаны в таблице 13.

Данные по составу, который высушен распылительной сушкой при той же самой концентрации липида и трегалозы, что и в регидратированном продукте, существенно отличались от результатов для продукта, который распыляли из подаваемой жидкости с двойной концентрацией и создавали градиент трегалозы при регидратации. У состава без градиента концентрации проявлялись значительно более высокие значения Z_средн. и PI, и повышенные через 24 часа после восстановления в жидкость, тогда как у состава с градиентом концентрации не показано такого повышения. Повышение Z_средн. и PI рассматривают как связанное с высвобождением паклитаксела из состава без градиента концентрации, который менее стабилен. Эти данные находятся в соответствии с результатами из примера 2, где больше паклитаксела могло быть загружено в липосомы, которые были получены после распылительной сушки при двойной концентрации и последующем создании градиента трегалозы. Распылительная сушка липосомальных составов паклитаксела при более высоких концентрациях трегалозы и последующее создание градиента трегалозы улучшает стабильность состава после восстановления в жидкость.

В сравнении с образцами после распылительной сушки лиофилизированный состав проявлял значительно более высокий PI уже после восстановления в жидкость.

Таблица 13 Сравнение методов дегидратации и регидратации.
Партия	ΔСтрегалозы	1 час	24 часа
Zсредн (нм)	PI	Zсредн (нм)	PI
MDG09.108-08-001	0%	170,3	0,480	175,4	0,493
PD-L-09032	0%	167	0,331	260	0,65
PD-L-09031	10%	160,8	0,203	160,5	0,199

7. Крупномасштабные производство и распылительная сушка

7.1. Материал

7.1.1. Основной материал

- USP Полусинтетический паклитаксел API, Phyton Biotech, партия CP209N0014

- DOTAP-CI, Merck Eprova AG, серия MBA-020

- DOPC, Avanti Polar Lipids Inc., серия GN181PC-12

- α,α-Трегалозы дигидрат высокой чистоты (низкий уровень эндотоксина), Ferro Pfanstiehl, серия 33205A

- Абсолютный спирт ЕР, Nova Laboratories Art.-Nr.A4478B

- Моногидрат лимонной кислоты ЕР/USP, Nova Laboratories Art.-Nr. V290

- Вода для инъекций, Nova Laboratories Art.-Nr.15210С

7.1.2. Оборудование

- Капилляр для инжекции, внутр. диаметр: 2 мм

- Катридж фильтра Memtrex PC 0,2 рм от GE, изделие № MPC92O5FHV, серия 60240937

- Стерилизующий фильтр Opticap XL4 c Duraporemembrane 0,22 пм от Millipore, изделие Nr. KVGLAO4TT3 серия: COCA1 0972

- Сосуд для состава (Nova Laboratories Ltd.)

- Сосуд для экструзии (Nova Laboratories Ltd.)

- Сосуд снижения бионагрузки (Nova Laboratories Ltd.)

- Сосуд для хранения (Nova Laboratories Ltd.)

- Перистальтический насос (Nova Laboratories Ltd.)

- 20-литровый сосуд для работы под давлением с напорной трубой (Nova Laboratories Ltd.)

- Мотыльковые воздушные клапаны (Nova Laboratories Ltd.)

- Асептическая распылительная сушилка ASD-1 (GEA Niro S/A, Copenhagen Denmark)

7.2. МЕТОДЫ

7.2.1. Производство жидкого состава

7.2.1.1. Получение органического раствора

Для партии 001 349,3 г DOTAP-CL растворяли в 700 г абсолютного спирта и перемешивали в течение примерно 4 часов. 369,5 г DOPC растворяли в 700 г абсолютного спирта и перемешивали в течение примерно 3 часов. Затем два раствора липидов соединяли и добавляли 25,617 г паклитаксела. Полученный органический раствор перемешивали в течение примерно 2 часов и, в заключение, доводили до общего веса 2122,5 г добавлением абсолютного спирта. Соответственно получали партии 002-004.

7.2.1.2. Получение водного раствора

Для партии 001 10819 г дегидрата трегалозы добавляли до примерно 20 кг воды для инъекций в сосуде для получения состава и перемешивали при 700 об/мин в течение 90 мин. Затем добавляли 1,258 г моногидрата лимонной кислоты и перемешивали до полного растворения. Конечный объем водного раствора доводили до 34,53 кг и перемешивали в течение еще 10 мин. Соответственно получали партии 002-004.

7.2.1.3. Этанольная инжекция

Для партии 001 органический раствор инжектировали в водный раствор с помошью перистальтического насоса при скорости инжекции примерно 250 г/мин. Во время инжекции раствор перемешивали до примерно 500 об/мин. После того, как инжекция заканчивалась, раствор перемешивали в течение 2 мин при 600 об/мин, а затем в течение 1 мин при 700 об/мин. Во время всего процесса инжекции температуру поддерживали на уровне ниже 8°С. Партии 002-004 перемешивали при 550 об/мин во время инжекции с последующим дополнительным перемешиванием.

7.2.1.4. Экструзия

Выполняли 8 экструзий через 5” картридж фильтра с поликарбонатной мембраной 0,2 пм. Картридж фильтра продували воздухом при 0,4-0,5 бар каждый, и экструзию выполняли при давлении 3,0 бар. Температуру поддерживали ниже 8°С.

7.2.1.5. Разбавление

После 8-ой экструзии определяли массу состава. На основе плотности состава в 1,106 г/мл рассчитывали количество воды, которое необходимо для получения 20 мМ состава (по общей концентрации липида), что соответствует разбавлению 1:1,5. Для партии 001 необходимое количество воды для инъекций добавляли со скоростью 1,66 л/мин с помощью перистальтического насоса через капилляр с внутренним диаметром 2 мм при перемешивании раствора при примерно 500 об/мин. Добавляемая вода для инъекций была охлаждена до ниже 8°С перед добавлением к составу. Для партий 002-004 разбавление выполняли при расходе 0,62 л/мин - 0,83 л/мин при скорости перемешивания примерно 600 об/мин.

7.2.1.6. Снижение бионагрузки

Перед снижением бионагрузки (1-е стерилизующее фильтрование) фильтр OpticapXL4 промывали 20 л воды для инъекций при давлении примерно 0,5 бар. Заполнение и продувку фильтра выполняли гравиметрически. Фильтрование выполняли при давлении 2,5 бар, причем давление создавалось быстро. Температуру препарата поддерживали ниже 8°С.

7.2.1.7. Стерилизующее фильтрование

Перед стерилизующим фильтрованием фильтр OpticapXL4 промывали 20 л воды для инъекций при давлении примерно 0,5 бар. Продувку фильтра выполняли при 0,5 бар. Фильтрование выполняли при давлении 2,5 бар, причем давление создавали быстро. Температуру препарата поддерживали ниже 8°С.

7.2.2. Распылительная сушка

Липосомальный состав сушили распылительной сушкой в асептической распылительной сушилке ASD-2 (GEA Niro S/A, Копенгаген, Дания). Партию 001 сушили как единственную партию (цикл 1), тогда как партии 002-004 распыляли одну за другой непрерывным образом (цикл 2). Для распылительной сушки использовали двухлоточную форсунку, азот в качестве осушающего газа и следующие параметры.

Таблица 14 Установки при распылительной сушке
Параметр	Задаваемое значение
Расход осушающего газа	80 кг/час
Давление распыляющего газа	3 бар
Расход распыляющего газа	3 кг/час
Температура на выходе	95°С
Скорость подачи	2 л/час
Температура подачи	0°С-30°С

7.3. Стабильность липосом

7.3.1. Метод

Дегидратированные липосомальные композиции с цикла 1 регидратировали водой для инъекций до общей концентрации липида в 10 мМ, таким образом, условия восстановления в жидкость дополнительно повышают осмолярный градиент препарата, который был 20 мМ до дегидратации. Для сравнения соответствующая липосомальная композиция (эталонная партия), которая была получена без разбавления и была дегидратирована лиофилизацией (как в примере, описанном в WO 2004/002468). Количество паклитаксела (включая продукты разложения паклитаксела), остающегося в липосомах определяют по методу, описанному в примере 1.3 после восстановления липосом в жидкость и после 24 часа при 25°С. Процент сохраненного паклитаксела и отфильтрованного (кристаллического) паклитаксела рассчитывали от общего количества паклитаксела, присутствующего в препаратах.

7.3.2. Результаты

Результаты показаны в таблице 15.

Таблица 15 Высвобождение паклитаксела из продуктов
Препарат	Т0	Через 24 часа при 25°С
Время	Сохраняемый в липосомах паклитаксел [%]	Фильтруемый паклитаксел [%]	Сохраняемый в липосомах паклитаксел [%]	Фильтруемый паклитаксел [%]
Цикл 1	99,56	0,44	99,89	0,11
	99,93	0,07	100,09	-0,09
99,67	0,33	99,87	0,13
Эталонная партия	99,63	0,37	98,88	1,12
	99,48	0,52	98,68	1,32
99,72	0,28	99,16	0,84

Данные показывают, что липосомальные препараты, полученные в отсутствие осмолярного градиента высвобождают паклитаксел быстрее. Это можно наблюдать уже после относительно короткого промежутка времени в 24 часа.

7.4. Анализ размера и полидисперсности частиц

7.4.1. Методы

Размер частиц (Z_{среднее}) и показатель полидисперсности (PI) определяли с помощью ФКС (диффракция 173°), используя Zetasizer Nano ZS (Malvern Instuments). В кратком изложении образцы из цикла 1 (соответствующего партии 1) и цикла 2 (соответствующего циклам 2-4) и образец из эталонной партии (см. выше) суспендировали в воде до общей концентрации липида 10 мМ. Для измерений образцы разбавляли в десять раз 10,5% (мас.) раствором дегидрата трегалозы. Образцы хранили в течение 24 часов и 25°С и снова производили измерения.

Следующие установки использовали для измерений и анализа данных. Тип измерения = размер; образец: материал = полистирольный латекс; RI: 1,590; поглощение: 0,01; диспергирующая среда = 10,5% раствор трегалозы, температура: 25°С, вязкость 1200 сП RI: 1,342; общие показатели = параметры Марка-Хоувинка; температура = 25°С, время уравновешивания: 5 минут; ячейка = DTS0012 - одноразовая кювета для измерений; измерения: число циклов = 15; продолжительность цикла (секунды) = 100; число измерений = 3; интервал между измерениями; опорная = базисная точка в положении 4,65; аттенюатор 6; параметры анализа: способ анализа = общий; кумулянтный анализ: порядок аппроксимации = 3; схема весов = квадратичная; выбор кумулянтной точки: автоматическая первая точка = да; метод выбора последней точки = выключение; дробность сигнала = 0,1; расширение = 1,2; диапазон устройства индикации: нижний предел = 0,6; верхний предел = 10000; фильтрование: фактор фильтра = 75; полимодальный анализ: трансформация результата = Mie; использование трансформации результата = да; схема весов = квадратичная; разрешение = нормальное; полимодальное - выбор точек; автоматическая первая точка = да; метод выбора последней точки = отсекаемая часть сигнала = 0,01; расширение = 1,2; классы размера: число размерных классов = 70; нижний предел = 0,4; верхний предел = 10000; пороги: нижний порог = 0,05; верхний порог = 0,01; коэффициент ослабления фильтра = по умолчанию.

7.4.2. Результаты

Результаты показаны в таблице 16:

Таблица 16
Образец	Zсреднее (нм)	PI
Эталонная партия	133	0,337
Цикл 1	Партия 1	143	0,16
Цикл 2	Партия 2	138	0,15
	Партия 3	143	0,17
Партия 4	144	0,19

У препаратов, изготовленных с помощью осмотического градиента и дегидратированных распылительной сушкой (циклы 1 и 2) проявлялось очень сходное Zсреднее, но значительно более низкие значения PI по сравнению с эталонным образцом, произведенным без осмотического градиента и дегидратированным лиофилизацией. Таким образом, продукт, получены по способу, описанному выше, является более гомогенным, чем продукт, производимый обычным способом.

7.5. Определение характеристик ультрацентрифугированием

7.5.1. Метод

Анализ ультрацентрифугированием выполняли с помощью Nanolytics (Потсдам, Германия).

Каждый образец восстанавливали в Н₂О, и смеси 1:1 Н₂О:D₂O до концентрации липида 10 мМ и уравновешивали в течение одного часа при комнатной температуре. Затем образцы разбавляли 1:1 соответствующим растворителем. После еще одного часа уравновешивания образцы подвергали ультрацентрифугированию. 400 мкл соответствующей липосомальной дисперсии подвергали ультрацентрифугированию в титановой кювете с длиной оптического пути 12 мм. Образцы центрифугировали в аналитической ультрацентрифуге Optima XL-I (Beckman-Coulter, Palo Alto), используя 8-миместный ротор An50TI, оборудованный интерференционной оптической системой Rayleigh, при 20000 об/мин и при 25°С. Во время центрифугирования профиль концентрации по радиальной координате представляли с помощью градиента преломляющей способности в растворе. Измерения производили у образцов в двух повторностях.

7.5.2. Данные анализа

7.5.2.1. Определение коэффициента седиментации

Главным показателем при аналитическом ультрацентрифугировании является коэффициент седиментации, определяемый следующим образом:

где u является скоростью оседания частицы, m - масса частицы, υ является удельным объемом, ƒ является показателем трения и ρ представляет плотность растворителя.

Определение коэффициента седиментации

Коэффициент седиментации рассчитывают непосредственно по данным измерений без дополнительных допущений по:

где r является расстоянием до оси вращения и r_m представляет мениск. Интеграл времени пробега определяют с помощью измерительного оборудования.

7.5.2.3. Распределение коэффициента седиментации

Вместо одного коэффициента седиментации при конкретном радиусе, вся ось r может быть трансформирована в ось s. Сдвиг интерференционных полос в соответствующем положении пропорционален концентрации массы присутствующего там вида частиц, так что амплитуда измерений может быть взята в виде y-координаты. Однако необходимо корректировать у координату в отношении радиального разбавления. Путем включения элемента коррекции получают следующую функцию g(s), дающую концентрацию массы вида частиц, оседающих со скоростью s:

Концентрация с, соответственно с₀, дана в единицах сдвига интерференционных полос, где интерференционная полоса соответствует полной фазе, таким образом светлой и темной линии интерференционной картины. Размер прямо пропорционален концентрации, представленной в г/л, в случае увеличения показателя преломления может быть принят как одинаковый для всех видов частиц, что справедливо в отношении данных образцов, которые являются химически однородным материалом, который просто представлен в полидисперсном распределении:

где φ является концентрацией в единицах сдвига интерференционных полос, λ является длиной волны лазера, I является шириной кюветы, и dn/dc является приростом показателя преломления растворенного вещества в данном растворителе. Благодаря этой пропорциональности, концентрация в уравнении (3) может быть представлена непосредственно как концентрация массы.

g(s) (или его интегрированная форма G(s)) может, в принципе, быть рассчитанной разверткой по координатному преобразованию развертки, и расчету у-координаты по равенству (3); общий результат получают путем усреднения, главным образом, сканирований, которые в основном являются статистически неопределенными. Таким образом, разумно, выполнить общую аппроксимацию данных по всем сканнированиям. Тем самым временной и пространственный шум отделяются, и кроме того, распределяется флуктуационный шум с получением наилучшего g(s), который получают по данным всего измерения. Для аппроксимации использовали программное обеспечение SedFit v12.4. от Peter Schuck.

7.5.2.4. Интерпретация распределения коэффициента седиментации

Распределение коэффициента седиментации в форме функции g(s) уже дает информацию по форме распределения; обычно желательно трансформировать первичный параметр измерения в диаметр или массу частицы. Коэффициент седиментации связан с молярной массой по равенству Сведберга

через коэффициент диффузии. Для круглых объектов, что относится к представленным липосомам, коэффициент диффузии может быть заменен диаметром сферы, причем нужно принимать во внимание, что липосома заполнена водой, что не способствует седиментации, но способствует трению.

Если коэффициент диффузии в равенстве 5 заменяется равенством Стокс-Эйнштейна

и принимается во внимание диаметр d=2Rh для сферы и фракция объема воды Φ; равенство Сведберга становится

где η является вязкостью растворителя, а ρ_s является плотностью раствора.

Для превращения распределения коэффициента седиментации в распределение по размеру, необходимо, чтобы набухание и плотность липосом оставались постоянными, или представлены в виде распределения, зависящего от коэффициента седиментации. Таким образом, плотность определяют экспериментально.

7.5.2.5. Анализ изменения плотности

Плотность оседающих частиц может быть определена путем аналитического ультрацентрифугирования в двух растворителях с различной плотностью. В растворителях, имеющих более низкую плотность, частица в норме проявляет меньшее значение s-частица оседает медленнее, если отличие в плотности по отношению к окружающему растворителю снижается. Оба значения s, которые описывают одну и ту же частицу, удовлетворяют равенству (7) с параметрами для соответствующего растворителя. Для двух растворителей (показатели 1 и 2) применимо следующее

Плотность безводной частицы ρ_s и показатель набухания Φ в обеих сторонах равенства являются идентичными, так как они относятся к одному и тому же объекту. Идентичные частицы определяются как элементы распределения по коэффициенту седиментации с идентичной у-координатой G(s).

Таким образом, равенство (8) может быть преобразовано и упрощено с получением плотности в безводном состоянии:

Диаметр может быть получен в соответствии со следующим равенством:

Чтобы решить уравнение (10), необходима независимая информация, такая как диаметр частиц, который может быть определен путем экспериментов динамического рассеяния света, как описано выше.

7.5.3. Результаты

Результаты показаны в таблице 17.

Таблица 17 Плотность безводного липосомального препарата
Производственный цикл	Образец	Плотность в безводном состоянии (г/мл)
Цикл 1	Образец 1	1,183
Цикл 2	Образец 1	1,174
	Образец 2	1,154
Образец 3	1,223

Источники

1. Способ производства липосомального препарата, включающий:

a) получение первого липосомального препарата, содержащего суспензию липосом в водной фазе, причем липосомы содержат, по меньшей мере, одну мембрану, причем мембрана ограничивает инкапсулированный в липосомы объем водной фазы и водная фаза содержит, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество и имеет исходную общую осмолярность O₁, причем первый липосомальный препарат содержит, по меньшей мере, одно активное вещество в липосомальной мембране, и

b) после этого получение осмолярного градиента в водной фазе указанного препарата, причем осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомы объема, О_нар, ниже осмолярности водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн, с получением второго липосомального препарата, и причем, по меньшей мере, одно активное вещество включено в липосомальную мембрану второго липосомального препарата,

где указанное активное вещество имеет log Р более 1, и при этом указанное активное вещество представляет собой таксан, который содержится в липосомальной мембране в количестве до 5 мол. %, и где разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что дополнительно включает:

c) дегидратацию второго липосомального препарата с получением дегидратированного препарата.

3. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что дополнительно включает:

d) регидратацию дегидратированного препарата.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что стадию b) осуществляют путем снижения первоначальной общей осмолярности O₁ водной фазы липосомального препарата на стадии а) с получением липосомального препарата, находящегося в напряжении растяжения, с общей осмолярностью O₂, которая ниже, чем осмолярность O₁.

5. Способ по п. 1 или 4, характеризующийся тем, что стадию b) осуществляют путем разбавления липосомального препарата со стадии а) водной средой, имеющей осмолярность, которая ниже O₁.

6. Способ по п. 1 или 4, характеризующийся тем, что стадию b) осуществляют путем диализа препарата со стадии а) против водной среды с осмолярностью, которая ниже O₁.

7. Способ по п. 1 или 4, характеризующийся тем, что стадию b) осуществляют путем:

b1) дегидратации липосомального препарата со стадии а) с получением дегидратированного липосомального препарата и

b2) регидратации указанного дегидратированного липосомального препарата в условиях для получения липосомального препарата, находящегося в напряжении растяжения предпочтительно в водной среде.

8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что объем водной среды, используемый для регидратации, больше объема липосомального препарата, который был дегидратирован, с получением соответствующего количества дегидратированной липосомальной композиции.

9. Способ по п. 4, причем О₂, по меньшей мере, на 10 мОсм ниже O₁, более предпочтительно когда О₂, по меньшей мере, на 50 мОсм ниже O₁, и еще предпочтительнее когда О₂, по меньшей мере, на 100 мОсм ниже О₁.

10. Способ по п. 1 или 4, характеризующийся тем, что осмотический градиент между водной фазой снаружи инкапсулированного в липосомы объема и водной фазой внутри инкапсулированного в липосомы объема изменяют один или несколько раз на разных стадиях процесса производства липосомального препарата.

11. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что дегидратацию осуществляют при температуре выше комнатной температуры.

12. Способ по п. 2, причем дегидратацию осуществляют путем распылительной сушки.

13. Способ производства липосомального препарата, содержащего, по меньшей мере, одно липофильное активное вещество, которое представляет собой таксан, включающий:

i) получение липосомального препарата, находящегося в напряжении растяжения, присутствующего в водной фазе, и

ii) инкубацию указанного липосомального препарата, находящегося в напряжении растяжения, с, по меньшей мере, одним липофильным активным веществом, с получением тем самым липосомального препарата, находящегося в напряжении растяжения, с, по меньшей мере, одним липофильным активным веществом, включенным в липосомальную мембрану,

причем стадию i) осуществляют путем получения липосомального препарата, в котором, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество содержится в водной фазе препарата, причем осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомы объема, О_нар, ниже осмолярности водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн,

где указанное активное вещество имеет log Р более 1, при этом указанное активное вещество представляет собой таксан, который содержится в липосомальной мембране в количестве до 5 мол. %, и где разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

14. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что дополнительно включает:

iii) отделение несолюбилизированного вещества от липосомального препарата предпочтительно путем фильтрования или центрифугирования.

15. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество присутствует внутри и снаружи липосом.

16. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что осмотически активное вещество выбрано из группы, состоящей из органических и неорганических молекул, таких как сахариды, сахаро-спирты, аминокислоты, пептиды, белки, водорастворимые полимеры, органические или неорганические соли, ионы, и их сочетаний.

17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что сахарид выбирают из моно-, ди-, олиго- или полисахаридов, предпочтительно он является трегалозой.

18. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что активное вещество имеет log Р более 2, наиболее предпочтительно более 3.

19. Способ по п. 13, характеризующийся тем, что активное вещество имеет растворимость ниже 0,1 мг/мл, более предпочтительно ниже 0,01 мг/мл, а наиболее предпочтительно ниже 0,001 мг/мл в воде при 25°С.

20. Способ по п. 13, причем активное вещество является паклитакселом или его производным.

21. Способ по любому из пп. 13-20, характеризующийся тем, что активное вещество по существу присутствует исключительно в мембранной части липосом.

22. Применение липосомального препарата, полученного по способу в соответствии с любым из предшествующих пунктов, для лечения рака.

23. Применение липосомального препарата по п. 22, характеризующееся тем, что липосомальный препарат находится в дегидратированной форме или в форме водной суспензии.

24. Применение по п. 23, характеризующееся тем, что липосомальный препарат является текучим порошком.

25. Липосомальный препарат для лечения рака, содержащий суспензию липосом в водной фазе, причем липосомы содержат, по меньшей мере, одну мембрану, причем в липосомальной мембране присутствует, по меньшей мере, одно терапевтически активное вещество, и в водной фазе присутствует, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество, причем осмолярность водной фазы внутри липосом, О_вн, выше осмолярности водной фазы снаружи липосом, О_нар,

где указанное активное вещество имеет log Р более 1, и при этом указанное активное вещество представляет собой таксан, который содержится в липосомальной мембране в количестве до 5 мол. %, и где разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

26. Липосомальный препарат по п. 25, характеризующийся тем, что разница между О_вн и О_нар составляет, по меньшей мере, 10 мОсм, предпочтительно, по меньшей мере, 50 мОсм и до 2000 мОсм.

27. Применение липосомального препарата по п. 25 или 26 для лечения рака.

28. Применение липосомального препарата, содержащего суспензию липосом, включающих таксан, имеющий log Р более 1 в водном растворе, полученного регидратацией дегидратированного липосомального препарата, для лечения рака, где препарат характеризуется средним диаметром (Z_средн), который отличается с коэффициентом меньше 1,5, и показателем полидисперсности (PI), который отличается меньше, чем с коэффициентом, равным двум, от показателей липосомального препарата, подвергаемого дегидратации с получением указанного дегидратированного липосомального препарата, в котором осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомах объема, О_нар, ниже, чем осмолярность водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн,

где указанный таксан представляет собой паклитаксел в количестве до 5 мол. % и где разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

29. Применение по п. 28, причем PI через 1 час после восстановления в жидкость составляет предпочтительно менее 0,4, более предпочтительно менее 0,3, наиболее предпочтительно менее 0,25.

30. Применение липосомального препарата, содержащего суспензию липосом, включающих таксан, имеющий log Р более 1 в водной фазе, полученного регидратацией дегидратированного липосомального препарата, для лечения рака, где препарат отличается изменениями среднего диаметра (Z_средн) с коэффициентом не более 1,5 и изменениями показателя полидисперсности (PI) с коэффициентом не более 2 за 24 часа при 25°С, в котором осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомах объема, О_нар, ниже, чем осмолярность водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн,

где указанный таксан представляет собой паклитаксел в количестве до 5 мол. % и где разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

31. Применение по п. 30, характеризующееся тем, что препарат отличается изменениями показателя полидисперсности (PI) с коэффициентом не более 1,5 за 24 часа при 25°С.

32. Применение по п. 31, характеризующееся тем, что препарат отличается изменениями показателя полидисперсности (PI) с коэффициентом не более 1,25 за 24 часа при 25°С.

33. Применение по п. 30, характеризующееся тем, что липосомы содержат до 3 мол. % паклитаксела в липосомальных мембранах.

34. Применение по п. 30 или 33, причем липосомы содержат DOTAP, DOPC и паклитаксел предпочтительно в молярном отношении 50:47:3.

35. Применение липосомального препарата, содержащего липосомальную суспензию, содержащую липосомы, содержащие DOTAP, DOPC при общей концентрации липида 10 мМ и паклитаксел в количестве до 5 мол. % в липосомальной мембране, и трегалозу, суспендированные в водной фазе, содержащей 10 мг/мл трегалозы, в медицине или в качестве косметического препарата, причем указанные липосомы характеризуются плотностью в безводном состоянии, по меньшей мере, 1,1 г/мл, в котором осмолярность водной фазы снаружи инкапсулированного в липосомах объема, О_нар, ниже, чем осмолярность водной фазы внутри инкапсулированного в липосомы объема, О_вн, причем разница между О_нар и О_вн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

36. Применение по п. 35, характеризующееся тем, что липосомальный препарат содержит 9,79 мг/мл трегалозы, суспендированной в водной фазе.

37. Применение по п. 35, причем DOTAP, DOPC и паклитаксел содержатся в молярном отношении 50:47:3.

38. Применение по любому из пп. 35-37, характеризующееся тем, что липосомальная суспензия содержит лимонную кислоту.

39. Применение по любому из пп. 35-37, характеризующееся тем, что указанные липосомы имеют Z_средн 140 нм.