Жидкие стабильные вирусные вакцины

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии и иммунологии, и может быть использовано для получения жидкой стабильной вакцины для собак. Жидкая стабильная вакцина содержит живой аттенуированный вирус собак, 10-30% (мас./об.) сахарного вспомогательного вещества и аминокислоту, где жидкая стабильная вакцина имеет значение рН от 6,0 до 8,0. Аминокислота выбрана из группы, состоящей из аргинина и метионина; если аминокислота представляет собой аргинин, то ее конечная концентрация в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,6 М. Если аминокислота представляет собой метионин, то ее конечная концентрация в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,025 до 0,3 М. Живой аттенуированный вирус собак выбран из группы, состоящей из вируса чумы собак, аденовируса собак 2 типа, парвовируса собак и вируса парагриппа собак или любой их комбинации. Использование вышеуказанного принципа стабилизации позволяет получить жидкий стабильный состав для живого аттенуированного вируса чумы собак, аденовируса собак 2 типа, парвовируса собак и вируса парагриппа собак. 11 з.п. ф-лы, 2 пр., 5 табл.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) временной заявки США с серийным номером 61/691507, поданной 21 августа 2012; и временной заявки США с серийным номером 61/777164, поданной 12 марта 2013, содержание которых полностью включено в описание в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к жидким стабильным вакцинам, которые содержат живой ослабленный вирус. Изобретение также относится к получению таких вакцин и к способам вакцинации животных-субъектов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует значительное число вирусов, которые могут инфицировать собак и/или кошек. В то время как симптомы, вызванные соответствующими вирусными инфекциями, могут включать, например, легкие простудные симптомы, другие вирусные инфекции могут быстро приводить к гибели, как в случае инфекций, вызванных вирусом чумы собак (CDV) [см., например, US 2010/0196420]. Действительно, CDV вызывает мультисистемную инфекцию, которая может вовлекать зрительную, дыхательную, пищеварительную, кожную и нервную системы. Смертность от парвовируса собак (CPV) также является относительно высокой [см., например, US 2009/0010955]. CPV является, главным образом, кишечным патогеном, который инфицирует собак, особенно молодых собак, и характеризуется острой диареей, лихорадкой и лейкопенией у собак и щенков старше 4-5 недель. Даже более молодые щенки могут страдать миокардиальным заболеванием. Вирус чумы собак и парвовирус собак представляют собой два наиболее важных вируса с точки зрения защиты щенков/взрослых собак.

Другие вирусы собак включают: вирус парагриппа собак (CPI), который является высоко контагиозным вирусом, который вызывает респираторные расстройства, участвующие в процессе заболеваний верхних дыхательных путей и инфекционного трахеобронхита; аденовирус собак 1 типа (CAV1), который вызывает инфекционный гепатит; и вирус гриппа собак (CIV), который является высококонтагиозным и может вызывать тяжелый тип респираторного заболевания. Сообщалось, что CIV способен вызывать 100% инфекцию с 80% летальности и до 5-8% летальности при тяжелых инфекциях [Crawford et al, Science 310(5747):482-485 (2005); U.S. 7959929 B2].

Также существует ряд кошачьих вирусов, которые поражают кошек, включая кошачий калицивирус (FCV), вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус лейкемии кошек (FPLV), коронавирус кошек (FCoV) и вирус ринотрахеита кошек (FVR).

В настоящее время общепризнанно, что лучшим способом профилактики заболевания, вызываемого вирусными инфекциями собак или кошек, является их вакцинация против вирусов. Действительно, вакцины против вируса чумы собак значительно снизили распространенность соответствующего заболевания. Аналогично инфекционный гепатит собак был чрезвычайно ограничен с помощью вакцин против аденовируса-2 собак (CAV2). Использование живого аттенуированного CAV2 в вакцинах вместо близкородственного CAV1 устраняет проблемы, связанные с интерстициальным нефритом и помутнением роговицы, наблюдаемыми у собак, которых прививали живым аттенуированным CAV1 [Taguchi et al., Can Vet J. 52(9):983-986 (2011)].

Кроме того, поливалентные живые ослабленные вирусные вакцины можно безопасно вводить, что ограничивает число необходимых инъекций вакцины. Соответственно, существует несколько коммерчески доступных поливалентных живых ослабленных вирусных вакцин, которые защищают от собачьей чумы, инфекционного гепатита собак, парвовируса собак и вируса парагриппа собак. Кроме того, новые поливалентные вакцины дополнительно защищают от вируса гриппа собак.

До настоящего времени аттенуированные вирусы собак и кошек были нестабильны при хранении в жидких растворах. Поэтому большинство живых аттенуированных вирусных вакцин собак или кошек лиофилизируют, т.е. подвергают сублимационной сушке перед их длительным хранением. Живой аттенуированный вирус собак или кошек обычно смешивают в виде суспензии в воде с защитным веществом, замораживают и затем дегидратируют с помощью сублимации и повторно высушивают во время процесса лиофилизации. Низкие температуры замораживания и высушивания сублимацией в сочетании с использованными низкими значениями отношения поверхности к объему могут потребовать продолжительных периодов высушивания и тем самым значительно увеличить время производства и затраты.

Кроме того, существуют внутренние противоречия в крупномасштабных промышленных процессах высушивания вследствие: невозможности регулирования стеллажной температуры во всей загрузке продукта, различных значений скорости замораживания в разных частях сушильной камеры, краевых эффектов и эффектов лучистой энергии. Повышение температуры сушки для уменьшения времени сушки часто не является решением, поскольку температура сушки должна оставаться существенно ниже температуры стеклования матрицы защитного белка. Кроме того, продолжительное несоответствующее время сушки и/или высокие температуры сушки часто приводят к повреждению структуры живых ослабленных вирусов наряду со значительным уменьшением их биологической активности.

Поэтому, чтобы учесть собственные потери эффективности, лиофилизованные вакцины собак и/или кошек, которые содержат живые ослабленные вирусы, хранят с повышенными титрами. Однако такие повышенные титры могут привести к существенным нежелательным явлениям в случае, если процесс лиофилизации приведет фактически к меньшему снижению активности, чем ожидалось. Таким образом, необходимо особое внимание для создания вакцины, которая не только содержит вирусный титр, который безопасно ниже количества, которое вызывает нежелательные явления, но которая также сохраняет достаточную эффективность с учетом уменьшения вирусного титра в результате лиофилизации и последующего хранения. Таким образом, существует потребность в новых живых аттенуированных вакцинах для собак и/или кошек, которые могут гарантированно сохранять вирусные титры на безопасном и эффективном уровне.

Цитирование любой ссылки в описании не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка предлагается как "предшествующий уровень техники" для заявки, рассматриваемой в данный момент.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для преодоления недостатков существующих вакцин настоящее изобретение относится к новым жидким стабильным живым аттенуированным вирусным вакцинам, а также их соответствующим иммуногенным композициям. В некоторых вариантах осуществления живой ослабленный вирус представляет собой живой аттенуированный вирус собак. В других вариантах осуществления живой ослабленный вирус представляет собой живой аттенуированный вирус кошек. Настоящее изобретение также относится к способам введения таких вакцин животному. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам профилактики заболевания у животного путем введения вакцины по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления животное является собакой. В других вариантах осуществления животное является кошкой.

Таким образом, настоящее изобретение относится к жидким стабильным вакцинам, которые содержат живой ослабленный вирус. В некоторых вариантах осуществления живой ослабленный вирус представляет собой рекомбинантный вирус. В частных вариантах осуществления этого типа рекомбинантный вирус используют как рекомбинантный вектор, который кодирует гетерогенный белок. В более предпочтительных вариантах осуществления этого типа гетерогенный белок является вирусным или бактериальным антигеном.

В частных вариантах осуществления вакцина содержит сахарное вспомогательное вещество и аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления этого типа вакцина содержит от 10 до 30% сахарного вспомогательного вещества. В частных вариантах осуществления вакцина содержит от 12 до 27% сахарного вспомогательного вещества. В некоторых вариантах осуществления вакцина содержит от 15 до 25% сахарного вспомогательного вещества. В родственных вариантах осуществления вакцина содержит от 15 до 20% сахарного вспомогательного вещества. В других вариантах осуществления вакцина содержит от 20 до 25% сахарного вспомогательного вещества. В более предпочтительных вариантах осуществления вакцина содержит от 16 до 18% сахарного вспомогательного вещества. В еще более предпочтительных вариантах осуществления вакцина содержит 17% сахарного вспомогательного вещества.

В частных вариантах осуществления жидких стабильных вирусных вакцин по настоящему изобретению сахарное вспомогательное вещество представляет собой сахарозу. В других вариантах осуществления сахарное вспомогательное вещество представляет собой сорбит. В других вариантах осуществления сахарное вспомогательное вещество представляет собой маннит. В других вариантах осуществления сахарное вспомогательное вещество представляет собой трегалозу. В других вариантах осуществления сахарное вспомогательное вещество представляет собой декстрозу. В частных вариантах осуществления сахарное вспомогательное вещество по существу представляет собой комбинацию двух или более сахарных вспомогательных веществ. В частном варианте осуществления этого типа сахарное вспомогательное вещество представляет собой комбинацию сахарозы и сорбита. В более предпочтительном варианте осуществления этого типа сахарное вспомогательное вещество представляет собой комбинацию 15% сахарозы и 10% сорбита.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению имеют диапазон значений pH от 6,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления диапазон значений pH составляет от 6,5 до 7,8. В конкретных вариантах осуществления диапазон значений pH составляет от 6,8 до 7,5. В более предпочтительных вариантах осуществления диапазон значений pH составляет от 7,0 до 7,4. В еще более предпочтительном варианте осуществления pH составляет 7,2.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать буфер. В конкретном варианте осуществления этого типа буфер содержит от 2,5 до 50 мМ Трис. В родственном варианте осуществления буфер содержит от 5 до 25 мМ Трис. В конкретных вариантах осуществления буфер содержит от 10 до 20 мМ Трис. В других вариантах осуществления буфер может содержать от 2,5 до 50 мМ гистидина. В частных вариантах осуществления буфер содержит от 2,5 до 50 мМ Трис и от 2,5 до 50 мМ гистидина. В более предпочтительных вариантах осуществления буфер содержит от 5 до 25 мМ Трис и от 5 до 25 мМ гистидина. В еще более предпочтительных вариантах осуществления буфер содержит от 10 до 20 мМ Трис и от 10 до 20 мМ гистидина. В других вариантах осуществления буфер содержит от 2,5 до 50 мМ фосфата. В родственном варианте осуществления буфер содержит от 5 до 25 мМ фосфата. В частных вариантах осуществления буфер содержит от 10 до 20 мМ фосфата.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению содержат аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой аргинин. В других вариантах осуществления аминокислота представляет собой метионин. В других вариантах осуществления аминокислота представляет собой глицин. В других вариантах осуществления аминокислота является глутаминовой кислотой. В родственных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат как аргинин, так и метионин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат как аргинин, так и глицин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат как глицин, так и метионин. В родственных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат как глутаминовую кислоту, так и метионин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат как глутаминовую кислоту, так и глицин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат как глутаминовую кислоту, так и аргинин. В родственных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глутаминовую кислоту и метионин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глутаминовую кислоту и глицин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глутаминовую кислоту и метионин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глицин и метионин. В других вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глицин и метионин. В конкретных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины содержат аргинин, глицин, метионин и глутаминовую кислоту.

В частных вариантах осуществления конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,6 M. В родственных вариантах осуществления конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,2 до 0,5 M. В более предпочтительных вариантах осуществления конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,25 до 0,35 M. В еще более предпочтительных вариантах осуществления конечная концентрация аргинина или глутаминовой кислоты или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет 0,3 M.

В частных вариантах осуществления конечная общая концентрация аргинина, и/или глутаминовой кислоты, и/или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,6 M. В родственных вариантах осуществления конечная общая концентрация аргинина, и/или глутаминовой кислоты, и/или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,2 до 0,5 M. В более предпочтительных вариантах осуществления конечная общая концентрация аргинина, и/или глутаминовой кислоты, и/или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,25 до 0,35 M. В еще более предпочтительных вариантах осуществления конечная общая концентрация аргинина, и/или глутаминовой кислоты, и/или глицина в жидкой стабильной вакцине составляет 0,3 M.

В частных вариантах осуществления конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,025 до 0,3 M. В родственных вариантах осуществления конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,04 до 0,15 M. В более предпочтительных вариантах осуществления конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,06 до 0,09 M. В еще более предпочтительных вариантах осуществления конечная концентрация метионина в жидкой стабильной вакцине составляет 0,07 M.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению также могут содержать белковый стабилизатор. Белковый стабилизатор может представлять собой интактный белок и/или белковый гидролизат. В частных вариантах осуществления белковый стабилизатор представляет собой желатин. В более предпочтительных вариантах осуществления белковый стабилизатор, содержащийся в жидкой стабильной вакцине по настоящему изобретению, представляет собой от 0,4 до 1,6% желатина. В альтернативных вариантах осуществления белковый стабилизатор представляет собой гидролизат цельного казеина. В частных вариантах осуществления этого типа белковый стабилизатор, содержащийся в жидкой стабильной вакцине по настоящему изобретению, представляет собой 0,5-2,0% гидролизата цельного казеина. В некоторых вариантах осуществления гидролизат цельного казеина представляет собой протеолитический гидролизат цельного казеина.

Кроме того, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению также могут дополнительно содержать спирт. В частных вариантах осуществления этого типа спирт представляет собой этанол. В более предпочтительных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 0,25 до 1,0% этанола. В родственных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению также могут содержать сульфат декстрана. В конкретных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 1 до 20 мМ сульфата декстрана. В более предпочтительных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 2,5 до 10 мМ сульфата декстрана. В еще более предпочтительных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит 5 мМ сульфата декстрана.

Кроме того, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут также дополнительно содержать хелатирующее вещество. Такие хелатирующие вещества могут включать, но без ограничения: этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), l,2-бис(o-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (BAPTA), этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), димеркаптосукциновую кислоту (DMSA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновую кислоту (DMPS). Концентрация таких хелатирующих веществ в жидких вакцинах по настоящему изобретению может изменяться приблизительно от 50 мкМ до 10 мМ.

В некоторых вариантах осуществления хелатирующее вещество представляет собой ЭДТА. В частных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 50 мкМ до 10 мМ ЭДТА. В некоторых вариантах осуществления этого типа жидкая стабильная вакцина содержит от 50 до 200 мкМ ЭДТА. В других вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 250 мкМ до 7,5 мМ ЭДТА. В других вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 0,5 мМ до 5,0 мМ ЭДТА. В других вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит от 1,0 мМ до 3,0 мМ ЭДТА. В более предпочтительных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит приблизительно 2 мМ ЭДТА.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать адъювант. В частных вариантах осуществления этого типа адъювант представляет собой фосфат алюминия. В других подобных вариантах осуществления адъювант представляет собой гидроксид алюминия. В других вариантах осуществления адъювант представляет собой адъювант на основе низкомолекулярного сополимера, который может образовывать поперечные связи в растворе и превращаться в высокомолекулярный гель. В других вариантах осуществления адъювант состоит из частиц геля акрилата натрия в воде. В других вариантах осуществления адъювант представляет собой комбинацию двух или более таких адъювантов.

В некоторых вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать поглотитель свободных радикалов и/или антиоксидант. В родственных вариантах осуществления жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению хранят в герметичных контейнерах, которые содержат инертный газ, такой как аргон, азот или гелий, над жидкостью (например, были заполнены инертным газом).

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать живой аттенуированный вирус собак. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой вирус чумы собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой аденовирус собак 2 типа. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой парвовирус собак (CPV). В одном предпочтительном варианте осуществления этого типа парвовирус собак представляет собой парвовирус собак 2 (CPV-2). В другом предпочтительном варианте осуществления этого типа парвовирус собак представляет собой парвовирус собак 2a (CPV-2a). В другом предпочтительном варианте осуществления этого типа парвовирус собак представляет собой парвовирус собак 2b (CPV-2b). В другом предпочтительном варианте осуществления этого типа парвовирус собак представляет собой парвовирус собак 2c (CPV-2c). В частном варианте осуществления этого типа CPV-2c имеет учетный номер в ATCC PTA-13492. В другом варианте осуществления парвовирус собак представляет собой рекомбинантный парвовирус собак, который сконструирован таким образом, что он содержит гетерогенный геном CPV-2c/CPV-2, т.е. участок, кодирующий капсидные белки, получен из изолята CPV-2c, и участок, кодирующий неструктурные белки, получен из изолята CPV-2. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой вирус парагриппа собак. В частных вариантах осуществления вирус парагриппа собак представляет собой рекомбинантный вектор. В более предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный вирус парагриппа собак кодирует и экспрессирует гетерогенный белок. В некоторых вариантах осуществления этого типа гетерогенный белок представляет собой антиген, не являющийся антигеном собаки. В более предпочтительных вариантах осуществления антиген представляет собой антиген вируса птиц или бактериальный антиген. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вирус парагриппа собак представляет собой рекомбинантный вирус парагриппа 5.

В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой коронавирус собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой пневмовирус собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой вирус инфекционного гепатита собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой вирус герпеса собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой вирус бешенства. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой мелкий вирус собак. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус собак представляет собой вирус гриппа собак. В альтернативных вариантах осуществления живой ослабленный вирус представляет собой вирус псевдобешенства.

Жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать живой аттенуированный вирус кошек. В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус герпеса кошек (FHV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой калицивирус кошек (FCV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой пневмовирус кошек (FPN). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой парвовирус кошек (FPV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус лейкоза кошек (FeLV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус иммунодефицита кошек (FIV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус болезни Борна (BDV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус гриппа кошек. В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус панлейкопении кошек (FPLV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой коронавирус кошек (FCoV). В других вариантах осуществления живой аттенуированный вирус кошек представляет собой вирус ринотрахеита кошек (FVR).

Кроме того, настоящее изобретение относится к жидким стабильным вакцинам, которые являются поливалентными вакцинами. В частных вариантах осуществления поливалентные вакцины по настоящему изобретению содержат только живые ослабленные вирусные вакцины. Такие поливалентные вакцины могут содержать любую комбинацию живых ослабленных вирусов. В частных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак и живой аттенуированный парвовирус собак. В родственных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак и живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный парвовирус собак и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный парвовирус собак и живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа.

В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа. В частных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак, живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа и живой аттенуированный коронавирус собак. В родственных вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак, живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа и живой аттенуированный коронавирус кошек. В частных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный вирус гриппа собак.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к жидким стабильным вакцинам, которые представляют собой поливалентную вакцину, которая содержит живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа и живой аттенуированный парвовирус собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный парвовирус собак и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В других вариантах осуществления поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа, живой аттенуированный парвовирус собак и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В частных вариантах осуществления этого типа поливалентная вакцина содержит живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный вирус гриппа собак.

Альтернативно жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать убитый вирус, и/или убитую бактерию (например, бактерин), и/или субфракцию бактерина. Соответственно любая из жидких стабильных вакцин по настоящему изобретению, которая содержит одну или более живых ослабленных вирусных вакцин, может дополнительно содержать убитый вирус, и/или убитую бактерию, и/или субфракцию бактерина. В конкретных вариантах осуществления убитый вирус представляет собой вирус гриппа собак. В других вариантах осуществления убитый вирус представляет собой пневмовирус собак. В других вариантах осуществления убитый вирус представляет собой коронавирус собак. В других вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина по настоящему изобретению может содержать два или более из указанных убитых вирусов собак.

В некоторых вариантах осуществления убитая бактерия представляет собой Bordetella bronchiseptica. В других вариантах осуществления убитая бактерия относится к виду Mycoplasma. В других вариантах осуществления убитая бактерия представляет собой Ehrlichia canis. В других вариантах осуществления убитая бактерия относится к виду Anaplasma. В других вариантах осуществления убитая бактерия представляет собой Leptospira. В одном таком варианте осуществления Leptospira является Leptospira canicola. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira grippotyphosa. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira hardjo. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira icterohaemorrhagiae. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira Pomona. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira interrogans. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira autmnalis. В другом варианте осуществления Leptospira является Leptospira Bratislava. В других вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина по настоящему изобретению может содержать две или более указанных убитых бактерий. В конкретном варианте осуществления жидкая стабильная вакцина содержит Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira Pomona и Leptospira icterohaemorrhagia.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам, способствующим защите кошки или собаки от клинического заболевания, которое обусловлено вирусной инфекцией кошек или собак, включающим введение вакцины по настоящему изобретению животному. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют через слизистые оболочки. В других вариантах осуществления введение осуществляют парентерально. В других вариантах осуществления введение осуществляют внутрикожно. В других вариантах осуществления введение осуществляют чрескожно. В более предпочтительных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят животному подкожно. В других предпочтительных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят животному внутримышечно. Настоящее изобретение также относится к применению первичных и/или бустерных вакцин.

В конкретных вариантах осуществления животное-субъект представляет собой собаку, и способ включает введение собаке жидкой стабильной вакцины по настоящему изобретению, которая содержит живой ослабленный вирус. В частных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа, живой аттенуированный парвовирус собак и живой аттенуированный вирус парагриппа собак. В некоторых вариантах осуществления этого типа жидкая стабильная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и живой аттенуированный вирус гриппа собак. В других вариантах осуществления этого типа жидкая стабильная вакцина содержит живой аттенуированный вирус чумы собак, живой аттенуированный аденовирус собак 2 типа, живой аттенуированный парвовирус собак, живой аттенуированный вирус парагриппа собак и убитый аттенуированный вирус гриппа собак.

Также изобретение относится к способам получения любой и всех жидких стабильных вакцин по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления способ включает объединение терапевтически эффективного количества живого ослабленного вируса с 10-30% сахарного вспомогательного вещества, аминокислотой и с буферным раствором, имеющим значение pH от 6,0 до pH 8,0, для получения жидкой стабильной вакцины. Аминокислота может представлять собой аргинин, глицин, глутаминовую кислоту, метионин или комбинации аргинина, глицина, глутаминовой кислоты и/или метионина. В конкретных вариантах осуществления аргинин, и/или глицин, и/или глутаминовая кислота имеют конечную концентрацию от 0,15 до 0,6 M в жидкой стабильной вакцине. В некоторых вариантах осуществления метионин имеет конечную концентрацию от 0,025 до 0,3 M в жидкой стабильной вакцине. В частных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество живого ослабленного вируса представляет собой терапевтически эффективное количество живого аттенуированного вируса собак. В частных вариантах осуществления этого типа терапевтически эффективное количество живого аттенуированного вируса собак включает терапевтически эффективные количества живого аттенуированного вируса чумы собак, живого аттенуированного аденовируса собак 2 типа, живого аттенуированного парвовируса собак и живого аттенуированного вируса парагриппа собак. Указанные и другие аспекты настоящего изобретения будут более понятны с помощью ссылки на приведенное ниже подробное описание.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В отличие от убитых вирусных вакцин жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению являются аттенуированными. До настоящего времени особое внимание необходимо было обращать при разработке такой аттенуированной живой вирусной вакцины на поддержание титра аттенуированных вирусов на уровне, который является безопасно ниже уровня, который может привести к серьезному нежелательному явлению. В действительности большинство живых аттенуированных вирусных вакцин кошек или собак являются лиофизированными, и лиофилизация может привести к существенному снижению эффективности аттенуированных живых вирусных вакцин как в результате самого процесса лиофилизации, так и с течением времени при длительном хранении.

Настоящее изобретение позволяет преодолеть указанную проблему путем предоставления жидких стабильных вакцин, которые остаются эффективными даже при хранении, без необходимости увеличения начального титра живого аттенуированного вирусного антигена выше достоверно безопасного уровня. В виде дополнительного преимущества настоящее изобретение обеспечивает средство для снижения стоимости производства предоставленных вакцин с помощью существенного уменьшения количества живых ослабленных вирусов, необходимых для создания такой безопасной и эффективной вакцины. Кроме того, живые ослабленные вирусные вакцины по настоящему изобретению более удобны в использовании, чем их лиофилизированные аналоги. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет безопасные и эффективные живые ослабленные вирусные вакцины, которые можно хранить в виде жидкостей при температурах холодильного хранения и которые остаются стабильными в течение 12-18 месяцев или даже больше.

Кроме того, удивительно, что жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению могут включать в себя вирусы собак и/или кошек любого типа. Таким образом, жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению могут содержать как оболочечные, так и безоболочечные вирусы. Кроме того, жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению могут содержать живые ослабленные вирусы, имеющие одноцепочечные РНК-геномы, одноцепочечные ДНК-геномы или двухцепочечные ДНК-геномы.

Кроме того, жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению также могут содержать рекомбинантные векторы кошек или собак, которые присутствуют или отдельно, и/или с другими такими рекомбинантными векторами, и/или с живыми аттенуированными вирусами кошек или собак, и/или в комбинации с убитыми бактериями, и/или убитыми вирусами кошек или собак. Такие рекомбинантные векторы кошек или собак могут дополнительно кодировать один или несколько гетерологичных вирусных или бактериальных антигенов. Конкретным примером такого рекомбинантного вектора является рекомбинантный вирус парагриппа собак 5, которой недавно был описан Li et al. (J. of Virology 87(10) 5985-5993 (2013); включено в описание посредством ссылки во всей полноте).

Рекомбинантные векторы для жидких стабильных живых вирусных вакцин по настоящему изобретению, такие как рекомбинантный вирус парагриппа 5, могут кодировать гетерологичный антиген вируса собак, и/или вируса кошек, и/или вируса человека, и/или вируса обезьян, и/или вируса крупного рогатого скота, и/или вируса овец, и/или вируса свиней, и/или вируса птиц (например, вирус цыплят). В конкретных вариантах осуществления жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению содержат рекомбинантный вирус парагриппа 5, который кодирует один или несколько антигенов одного или нескольких вирусов цыплят.

Удивительно, но в присутствии хелатирующего агента (например, 2 мМ ЭДТА) и/или адъюванта (например, фосфата алюминия) жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению остаются стабильными даже в том случае, когда в состав включают убитые бактерии (см. пример 2 ниже). Соответственно, жидкие стабильные живые вирусные вакцины по настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или несколько убитых вирусов и/или бактерий собак или кошек (например, бактерины), и/или субфракций бактерина.

Использование терминов единственного числа для удобства в описании ни в коей мере не предназначено для ограничения. Таким образом, например, ссылка на "сахарное вспомогательное вещество" включает ссылку на одно или несколько таких сахарных вспомогательных веществ, если не указано иное. Использование терминов множественного числа также не является ограничивающим, если не указано иное. Аналогичным образом химическое соединение, которое может упоминаться как кислота или соответствующее ей основание, если не указано иное, предназначено для обозначения любой формы соединения. Таким образом, подразумевается, что использование термина "глутаминовая кислота" включает глутамат, и наоборот.

В настоящем контексте "вакцина" представляет собой композицию, которая подходит для применения у животного (включая, в некоторых вариантах осуществления, человека), которая после введения животному вызывает иммунный ответ, достаточно сильный для минимального содействия в защите от клинического заболевания, возникающего в результате инфекции, вызванной микроорганизмом дикого типа, т.е. достаточно сильный для содействия в профилактике клинического заболевания и/или в профилактике, облегчении или лечении клинического заболевания. Если иное не указано в явной форме, использование термина "вакцина" включает поливалентные вакцины.

В настоящем контексте "поливалентная вакцина" представляет собой вакцину, которая содержит два или более различных антигенов. В конкретном варианте осуществления этого типа поливалентная вакцина стимулирует иммунную систему реципиента против двух или более различных патогенов.

В настоящем контексте "жидкая стабильная" вакцина представляет собой вакцину, сохраняемую в виде жидкости (включая жидкую поливалентную вакцину), которая остается эффективной в течение по меньшей мере одного года при хранении при 7°C или ниже (например, в обычном холодильнике и/или при 0°C-7°C). В конкретных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина остается эффективной при хранении при 7°C или ниже в течение по меньшей мере 1,5 лет. В более предпочтительных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина остается эффективной при хранении при 7°C или ниже в течение по меньшей мере 2 лет. В еще более предпочтительных вариантах осуществления жидкая стабильная вакцина остается эффективной при хранении при 7°C или ниже в течение по меньшей мере от 2,5 до 3 лет.

В настоящем контексте термины "защитить", "защита", "обеспечить защиту", "обеспечение защиты" и "помогает в защите" не требуют полной защиты от какого-либо признака инфекции. Например, "помогает в защите" может означать, что защита является достаточной, такой, что после заражения симптомы соответствующей инфекции по меньшей мере снижаются и/или что одна или несколько исходных клеточных, физиологических или биохимических причин или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшаются и/или устраняются. Следует понимать, что термин "сниженный", который используется в данном контексте, означает относительное состояния инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, а не только физиологическое состояние инфекции.

В настоящем контексте термин "терапевтически эффективное количество" представляет собой количество данного антигена, например живого ослабленного вируса, которое является достаточным для обеспечения защиты и/или помощи в защите от патогена, антиген которого вводят для защиты, когда его предоставляют с помощью однократного введения и/или, если предполагается, предоставляют в виде начального введения с одним или более последующим вторичным введением(ями).

В настоящем контексте "эффективная" вакцина содержит терапевтически эффективное количество данного антигена. В настоящем контексте термин "фармацевтически приемлемый" используется в качестве прилагательного для обозначения того, что модифицированное существительное подходит для использования в фармацевтическом продукте. Когда он используется, например, для описания вспомогательного вещества в фармацевтической вакцине, он характеризует вспомогательное вещество как совместимое с другими ингредиентами композиции и не оказывающее неблагоприятного действия на предполагаемого реципиента.

Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или наполнителю, с которым вводят соединение. Фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и/или масла, в том числе масла, получаемые из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Воду или водные солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно использовать в качестве носителей, в частности, для инъекционных растворов.

В настоящем контексте "адъювант" является веществом, которое может поддерживать или усиливать каскад иммунологических событий, приводящих, в конечном счете, к улучшению иммунологического ответа, т.е. интегрированного ответа организма на антиген. Адъювант, в целом, не является необходимым для возникновения иммунного ответа, но поддерживает или усиливает этот ответ.

В настоящем контексте "системное введение" представляет собой введение в систему кровообращения организма (включая сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), оказывая влияние, таким образом, на организм в целом, а не на конкретное место, такое как желудочно-кишечный тракт (например, путем перорального или ректального введения) и дыхательная система (например, путем интраназального введения). Системное введение можно осуществить, например, путем введения в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (внутрикожно, трансдермально или супрадермально), под кожу (подкожно), под слизистую оболочку (субмукозно), в вены (внутривенно) и т.д.

"Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, субмукозные инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и вливание.

В настоящем контексте термин "собака" включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris, если не указано иное.

Парвовирус собак "CPV" впервые был выделен в 1978 г. и назван CPV-2, чтобы отличить его от парвовируса, мелкого вируса собак (CMV или CPV-1). Приблизительно через год после первого выделения CPV-2 был идентифицирован генетический вариант CPV-2a. В середине 1980-х был идентифицирован второй генетический вариант CPV-2b. CPV-2a и CPV-2b вскоре полностью вытеснили CPV-2. В настоящее время CPV-2a больше не обнаруживается в Соединенных Штатах [Parrish and Kawaoka, Annu Rev. Microbiol., 59:553-586 (2005)]. Четвертый вариант CPV в данном семействе, CPV-2c, впервые был описан в 2000 г. [см. US 8227593; US 8258274; Hong et al., J. Vet. Diagn. Invest. (5):535-9 (2007)]. В предварительной заявке на патент США 61/739067, зарегистрированной 19 декабря 2013 г., содержание которой включено в описание посредством ссылки во всей полноте, описан специфический аттенуированный изолят CPV-2c (учетный номер в ATCC PTA-13492), который был впоследствии зарегистрирован 24 января 2013 г. в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, при условиях, удовлетворяющих требованиям Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Кроме того, сконструирован рекомбинантный парвовирус собак, который содержит гетерогенный геном CPV-2c/CPV-2, т.е. участок, кодирующий капсидные белки, происходит из изолята CPV-2c, и участок, кодирующий неструктурные белки, происходит из изолята CPV-2 [WO 2011107534 (A1); US 20120328652; WO 2012007589 (A1), содержание которых включено в данное описание посредством ссылки во всей их полноте]. В настоящем контексте вакцина по настоящему изобретению, которая содержит "парвовирус собак", может содержать один или несколько указанных типов/вариантов/изолятов CPV, включая недавно сконструированный рекомбинантный парвовирус собак, который содержит гетерогенный геном CPV-2c/CPV-2.

В настоящем контексте термин "кошка" относится к любому члену семейства кошачьих. Члены этого семейства включают диких, содержащихся в зоопарках, и домашних членов, таких как любой член подсемейства Felidae, например, кошки, львы, тигры, пумы, ягуары, леопарды, снежные барсы, пантеры, североамериканские горные львы, гепарды, рыси, каракалы или любые их гибриды. Кошки также включают в себя домашних кошек, чистокровных и/или беспородных кошек-компаньонов, кошек, участвующих в представлениях, лабораторных кошек, клонированных кошек и диких или одичавших кошек.

В данном контексте "сахарное вспомогательное вещество" представляет собой сахар, содержащий от 5 до 12 атомов углерода (например, сахароза, мальтоза, трегалоза, декстроза, лактоза, глюкоза, фруктоза, галактоза), или сахарный спирт/полиол (например, сорбит, маннит, арабит, инозит, мальтитол). Если не указано особо, процент (%) сахарного вспомогательного вещества предоставляется в виде веса (мас) сахарного вспомогательного вещества в объеме (об.) вакцины, (мас./об.) в вакцине.

В настоящем контексте, если не указано особо, процент (%) твердого вспомогательного вещества, например сахарного вспомогательного вещества или желатина, в вакцине основан на 1% растворе, представляющем собой 1 г твердого вспомогательного вещества/100 мл объема вакцины (мас./об.).

В настоящем контексте, если не указано особо, процент (%) жидкого вспомогательного вещества, например этанола, в вакцине основан на 1% растворе, представляющем собой 1 мл жидкого вспомогательного вещества/100 мл объема вакцины (об./об.).

В настоящем контексте, если не указано особо, предусмотренное значение pH является значением pH, установленным/измеренным при 25°C.

В настоящем контексте термин "приблизительно" используется взаимозаменяемо с термином "примерно" и означает, что значение находится в пределах двадцати пяти процентов от указанной величины, т.е. концентрация "приблизительно" 2 мМ ЭДТА может составлять от 1,5 мМ до 2,5 мМ ЭДТА.

Гидролизат цельного казеина, который можно использовать в жидких стабильных вакцинах по настоящему изобретению, можно получить с помощью ряда процедур, включая, например, кислотный гидролизат или ферментативный гидролизат. Такие гидролизаты содержат в форме смешанных аминокислот и пептидов всех аминокислот, исходно присутствующих в казеине. Один панкреатический гидролизат цельного казеина, который можно использовать в жидких стабильных вакцинах по настоящему изобретению, продается как CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC® MP Biomedicals. Сопоставимые продукты продаются под названием NZ-AMINE®, NZ-AMINE®A, NZ-AMINE®AS, и NZ-AMINE®B и триптон от Sigma-Aldrich.

Поскольку жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению предпочтительно имеют значение pH, которое изменяется в диапазоне от pH 6,0 до pH 8,0, жидкие стабильные вакцины по настоящему изобретению могут содержать буфер. Буферы, подходящие для использования в жидких стабильных вакцинах по настоящему изобретению, включают, но без ограничения: Трис-буфер, Трис-гистидиновый буфер, Бис-Трис буфер, BIS-Трис-пропановый буфер, калий- и/или натрий-фосфатный буфер, калий- и/или натрий-пирофосфатный буфер, имидазоловый буфер, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, трициновый буфер, глицил-глициновый буфер и HEPES. Буферы могут быть приведены к желаемому значению pH с помощью любого подходящего противоиона.

Вакцины по настоящему изобретению могут либо содержать адъювант, либо, наоборот, не содержать адъювант, часто в зависимости от антигена(ов), который содержит вакцина. Примеры адъювантов, подходящих для использования в вакцинах по настоящему изобретению, включают фосфат алюминия, например, REHYDROPHOS® (General Chemical, Parsippany, New Jersey) и/или гидроксид алюминия, например, REHYDROGEL®, REHYDROGEL® HPA или REHYDROGEL® LV (General Chemical, Parsippany, New Jersey), и/или адъювант на основе низкомолекулярного сополимера, который может образовывать поперечные связи в растворе с превращением в высокомолекулярный гель, например, POLYGEN™ (MVP Laboratories, Omaha), и/или адъювант, состоящий из частиц геля акрилата натрия в воде, например, MONTANIDE™ PET GEL A™ (Seppic, Paris France). Если добавляют адъювант, его количество в вакцине обычно составляет приблизительно от 1% до 20% (об./об.). В конкретных вариантах осуществления количество адъюванта составляет приблизительно от 2% до 10% (об./об.). В примере 2, представленном ниже, адъювант составляет приблизительно 5% (об./об.).

Вакцины по настоящему изобретению также могут содержать хелатор. Примеры подходящих хелаторов включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), 1,2-бис(o-аминофенокси)этан-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусную кислоту (BAPTA), этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), димеркаптосукциновую кислоту (DMSA) и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), 2,3-димеркапто-1-пропансульфоновую кислоту (DMPS).

Поливалентные вакцины. Настоящее изобретение относится к жидким стабильным поливалентным вакцинам. Жидкая стабильная поливалентная вакцина для собак по настоящему изобретению, например, может содержать два или несколько из перечисленных вирусов: вирус чумы собак, аденовирус собак 2 типа, парвовирус собак, вирус парагриппа собак, вирус гриппа собак, пневмовирус собак, коронавирус собак, вирус герпеса собак, вирус инфекционного гепатита собак, мелкий вирус собак, вирус бешенства и вирус псевдобешенства. Такие жидкие стабильные вакцины также можно объединить с одним или несколькими аттенуированными или убитыми антигенами, такими как вирус гриппа собак, коронавирус собак, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma species, Ehrlichia canis, Anaplasma species, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira interrogans, Leptospira autmnalis и Leptospira Bratislava, и хранить или, альтернативно, можно объединить перед введением.

Кроме того, жидкая стабильная поливалентная вакцина для кошек по настоящему изобретению может содержать один или несколько из следующих кошачьих патогенов: вирус герпеса кошек, калицивирус кошек, пневмовирус кошек, парвовирус кошек, вирус лейкоза кошек, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус иммунодефицита кошек, вирус болезни Борна, вирус кошачьего гриппа и вирус птичьего гриппа. Такие жидкие стабильные вакцины можно затем объединить с аттенуированными или убитыми Chlamydophila felis и/или Bartonella spp. (например, B. henselae) и хранить или, альтернативно, можно объединить перед введением.

Вакцины по настоящему изобретению также могут содержать антибактериальное средство, такое как антибиотик. Примеры таких антибиотиков могут включать: 10-100 мкг/мл гентамицина, 0,5-5,0 мкг/мл амфотерицина B, 10-100 мкг/мл тетрациклина, 10-100 ед/мл нистатина (микостатина), 10-100 ед/мл пенициллина, 10-100 мкг стрептомицина, 10-100 мкг полимиксина B и 10-100 мкг неомицина.

Введение вакцины. Жидкие стабильные вирусные вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым обычным способом, например, путем системного введения, в том числе путем парентерального введения, таким как, без ограничения, подкожное или внутримышечное введение. Жидкие стабильные вирусные вакцины по настоящему изобретению также можно вводить путем введения через слизистую оболочку, например, путем интраназального, перорального, ректального и/или глазного введения. Альтернативно, вакцины можно вводить с помощью кожного пластыря, скарификации или местного введения. Предполагается, что жидкую стабильную вирусную вакцину по настоящему изобретению также можно вводить с питьевой водой и/или пищей животных-субъектов, принимающих препарат. Кроме того, предполагается, что такие вакцины можно вводить в виде лакомства или с помощью игрушки.

Вакцины (включая поливалентные вакцины) по настоящему изобретению также можно вводить как часть комбинированной терапии, т.е. терапии, которая включает, в дополнение к самой вакцине, введение одного или более дополнительных активных агентов, лекарственных средств и т.д. В таком случае следует понимать, что количество вакцины, которое составляет "терапевтически эффективное" количество, может быть больше или меньше, чем количество вакцины, которое составляло бы "терапевтически эффективное" количество, если бы вводили только одну вакцину. Другие лекарственные средства могут включать средства, известные в данной области, такие как, например, анальгетики, жаропонижающие препараты, отхаркивающие средства, противовоспалительные препараты, антигистаминные препараты и/или введение жидкостей.

Уровень иммуногенности можно определить экспериментально с помощью методов исследования с титрованием разрешающей дозы, общеизвестных в данной области. Такие методы обычно включают вакцинацию нескольких животных-субъектов вакциной в разных дозах и затем заражение животных вирулентным вирусом для определения минимальной защитной дозы.

Факторы, влияющие на предпочтительный режим дозирования, могут включать, например, вид или породу (например, собаки или кошки), возраст, вес, пол, диету, активность, объем легких и состояние субъекта; способ введения; эффективность, безопасность и профили продолжительности иммунитета конкретной используемой вакцины; используется ли система доставки; и вводят ли вакцину как часть лекарства и/или как комбинацию вакцин. Таким образом, фактически используемая дозировка может различаться в зависимости от животных и поэтому может отличаться от типичных доз, указанных выше. Определение таких изменений доз обычно входит в компетенцию специалистов в области создания вакцин, использующих общепринятые способы.

Аналогичным образом, объем, в котором можно ввести такую дозу, как правило, составляет от 0,1 мл (обычно при интрадермальном или трансдермальном применении) до 5,0 мл. Типичный диапазон вводимого объема составляет от 0,2 до 2,0 мл и приблизительно от 1,0 до 2,0 мл при внутримышечном или подкожном введении.

Предполагается, что вакцину можно ввести реципиенту вакцины один раз или, альтернативно, два или несколько раз в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят по меньшей мере два раза. В определенных таких вариантах осуществления, например, вакцину вводят два раза, при этом вторую дозу (например, ревакцинирующую дозу) вводят по меньшей мере через 2 недели после введения первой дозы. В конкретных вариантах осуществления вакцину вводят два раза, при этом вторую дозу вводят не позднее чем через 8 недель после введения первой дозы. В других вариантах осуществления вторую дозу вводят спустя от 1 недели до 2 лет после введения первой дозы, от 1,5 недель до 8 недель после введения первой дозы или от 2 до 4 недель после введения первой дозы. В других вариантах осуществления вторую дозу вводят приблизительно через 3 недели после введения первой дозы.

В приведенных выше вариантах осуществления первая и последующие дозы могут варьировать как по количеству, так и/или по форме. Однако часто дозы являются одинаковыми по количеству и форме. Если вводят только одну дозу, количество вакцины в указанной дозе в чистом виде обычно составляет терапевтически эффективное количество вакцины. Однако, если вводят больше чем одну дозу, количества вакцины в указанных дозах в совокупности могут составлять терапевтически эффективное количество. Кроме того, вначале можно ввести вакцину и затем можно ввести ревакцинирующую дозу, например, от 2 до 12 недель позднее. Однако последующие введения вакцины могут быть проведены на годовой (1 год) или двухгодовой (2 года) основе, независимо от того, вводилась ли ревакцинирующая доза или нет.

Настоящее изобретение можно лучше понять со ссылкой на следующие неограничивающие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации настоящего изобретения. Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать варианты осуществления изобретения. Однако их не следует истолковывать как ограничивающие широкий объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Устойчивость жидких вирусных вакцин для собак

Материалы и методы

Материалы. Сахарозу и сорбит со степенью чистоты, подходящей для культивирования клеток, приобретают в Fisher Scientific. Высокой степени чистоты L-аргинин гидрохлорид, L-метионин, L-гистидин и хлорид натрия со степенью чистоты более 98% приобретают в Sigma. Декстран сульфат со средней молекулярной массой 10000 и степенью чистоты >95% приобретают в Sigma. Этанол высокой степени чистоты (>99%), растворы TWEEN 80, TWEEN 20, 1,0 M Трис (pH 8,0) и ЭДТА (pH 8,0) приобретают в Sigma. 20% раствор желатина марки 250 bloom и 7,61% раствор NZ Amine AS готовят из лучших представленных на рынке реагентов.

Получение основных растворов антигенов. Следующие растворы получают и стерилизуют с помощью 0,2 мкм фильтра: 80% сахароза, 70% сорбит, 1,0 M L-аргинин (pH 7,2), 5% L-метионин, 5 мМ декстран сульфат. Растворы антигенов CDV, CAV2, CPV и CPI с титрами от 6,5 до 9,5 замораживают при -80°C, чтобы разморозить непосредственно перед смешиванием.

Смешивание и розлив жидких вакцин. Процедура получения смеси для жидких вакцин CDV, CAV2, CPV и CPI (1,0 мл на дозу) заключается в следующем: антигены в количестве одной дозы смешивают в различных составах, как показано в таблице 1 ниже, с заданными титрами от 5,0 до 7,5 (Log10 TCID50) для вирусных антигенов. Подготавливают и подписывают 200 мл стерилизованный контейнер и затем добавляют каждый компонент стабилизатора и вспомогательного вещества в контейнер в соответствии с рассчитанным количеством, исходя из конечной концентрации каждого компонента, как показано в таблице 1 ниже.

Доводят объем дважды дистиллированной водой (ddH2О) до заданного объема стабилизаторов и вспомогательных веществ. Смешивают на платформе для перемешивания в течение по меньшей мере 10 мин до полного растворения всех компонентов. Охлаждают и хранят раствор стабилизаторов при 4°C до того, как будут подготовлены антигены.

Нагревают замороженный антиген на водяной бане при 37°C с периодическим встряхиванием до полного растаивания льда. Некоторые антигены имеют в растворе видимый клеточный дебрис, поэтому антигены необходимо тщательно перемешать перед пипетированием. Размороженный антиген следует хранить при 2-8°C в течение не более 8 часов перед использованием. Добавляют соответствующее количество CDV, CAV2, CPV и CPI в подписанный контейнер с растворами стабилизаторов. Перемешивают на платформе для перемешивания до образования гомогенной смеси антигенов и стабилизаторов. Стараются избегать образования пузырьков и пены во время указанной стадии перемешивания. Измеряют значение pH при 25°C и доводят значение pH с помощью 1 M HCl или 1 M NaOH до заданного показателя pH, если значение pH не находится в диапазоне 7,2±0,1. Хранят смесь вакцины при 2-8°C до дозированного разливания в тот же день или аликвотируют в небольшом объеме и замораживают при <-70°C для последующего использования. Вносят смесь вакцины в 2 мл стеклянные ампульные флаконы по 1 мл на флакон. Добавляют аргон в ампульный флакон после заполнения для предотвращения окисления во время хранения и затем термически запечатывают ампульный флакон. Наносят на ампулу этикетку, где указано название образца, номер лота, температура хранения, дата, и затем переносят в ящики и хранят при различной температуре в соответствии с протоколом исследования.

Испытания на стабильность, ускоренные под воздействием температуры и в режиме реального времени. Жидкие образцы хранят при 25°C±1°C и 4°C±1°C соответственно в подходящих инкубаторах. Образцы, хранившиеся при 25°C, используют для проведения ускоренного испытания на стабильность в целях скрининга, тогда как образцы, хранившиеся при 4°C, являются образцами для испытания на стабильность в режиме реального времени. В заданный момент времени извлекают 3 флакона каждой композиции, измеряют титр каждого антигена методом титрования в культуре клеток и описывают результат в виде средней инфекционной дозы в тканевой культуре (TCID50) и/или в виде инфекционной дозы 50%, установленной с помощью флуоресцентно-меченных антител (FAID50).

Аналитические методы

Активность CPI. Разведения образцов вируса засевают на клетки почки собаки (DK). Через 4-6 дней монослои фиксируют и окрашивают антисывороткой CPI, конъюгированной с флуоресцеином, и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера [Cunningham, C.H. A Laboratory Guide in Virology, 7th edition, Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN. (1973); Kaplan, M.M. and Koprowski, H., Laboratory Techniques in Rabies, World Health Organization, Switzerland (1973)].

Активность CDV. Разведения образцов вируса засевают на клетки Vero. Через 5-7 дней монослои проверяют на наличие цитопатического эффекта и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера, как приведено выше.

Активность CAV2. Разведения образцов вируса засевают на клетки DK. Через 7 дней монослои проверяют на наличие цитопатического эффекта и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера, как приведено выше.

Активность CPV. Разведения образцов вируса засевают на клетки DK. Через 3 дня монослои окрашивают антисывороткой CPV, конъюгированной с флуоресцеином, и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера, как приведено выше.

Результаты

Ускоренные испытания на стабильность при 25°C. Проводят два исследования для скрининга жидких композиций. Первое исследование включает композиции с L-001 по L-008, и второе исследование включает композиции с L-009 по L-026 (подробное описание композиций см. в таблице 1). Жидкие образцы, хранившиеся в герметично закрытых стеклянных ампульных флаконах в составе 1 мл на флакон на дозу, тестируют в различные моменты времени после хранения при 25°C или 4°C. Для образцов, хранившихся при 25°C, результаты испытания на стабильность для CDV, CAV2 и CPI представлены в таблице 2. CPV не проверяют на устойчивость при хранении при 25°C, поскольку жидкий препарат CPV считается наиболее стабильной фракцией среди четырех вирусов. Что касается образцов исследования 1, которые инкубировали при 25°C (с L-001 по L-008), результаты, полученные в день 0, неделю 6 и неделю 8, используют для сравнения различных композиций. Что касается образцов исследования 2, которые инкубировали при 25°C (с L-009 по L-026), образцы, взятые в день 0, неделю 6 и неделю 12, используют для проведения скрининга композиций. Тестирование проводили в дополнительные моменты времени в промежутках между указанными моментами времени, и характер изменений являлся таким же.

На основании хода деградации вручную дают оценку относительной стабильности каждой композиции, как показано в таблице 2, при этом пять "+" обозначает наиболее стабильный препарат, и один "+" обозначает наименее стабильный препарат. Каждой вирусной фракции дают оценку индивидуально и затем в обобщенной оценке учитывают все 3 вируса. На основании оценки и сравнения установили несколько закономерностей. Соответственно, среди трех тестированных сахаридов (сахароза, сорбит и глицерин) стабилизирующее действие сахарозы и сорбита было значительно выше, чем действие глицерина. Также существует явное преимущество при использовании более высокой концентрации сахара, при этом композиции с общим содержанием сахара 17%-25% действуют лучше, чем композиции с содержанием сахара менее 10%. Среди стабилизаторов, состоящих из белков или аминокислот, наибольший вклад в стабильность вносит 0,3 M L-аргинин, за которым следуют 1% метионин, 0,8% желатин и 1% NZ Amine. Из других стабилизаторов декстран сульфат и поглотители свободных радикалов (FRS), по-видимому, способствуют стабильности жидких композиций CPV, CDV, CAV2 и CPI, и хотя их присутствие существенно не изменяет профиль стабильности, они также не оказывают отрицательных эффектов на стабильность. Таким образом, в некоторых случаях предпочтительно было бы включить декстран сульфат и/или FRS в конечный препарат жидкой живой вирусной вакцины для собак или кошек для стабильности при продолжительном хранении при 25°C. С другой стороны, обнаружили, что TWEEN 80 и TWEEN 20 оказывали неблагоприятное действие на стабильность вирусных композиций.

Испытание на стабильность в режиме реального времени при 4°C. Также осуществляли контроль стабильности при продолжительном хранении жидких живых вакцин CPV, CDV, CAV2 и CPI при 4°C, и результаты представлены в таблице 3. Прогнозируемый вирусный титр в 24 месяца при 4°C экстраполируют на основании данных, полученных в моменты времени 12 месяцев и 18 месяцев для композиций с L-001 по L-008, и 6 месяцев и 12 месяцев для композиций с L-009 по L-026 (см. таблицу 3 ниже). Требование к минимальному титру дозы для каждого вируса при истечении срока годности представлено в конце таблицы 3 ниже и используется для определения, какой препарат может обеспечить стабильный продукт при хранении при 4°C. Имеется десять композиций (L-009, L-011, L-012, L-014, L-15, L-016, L-018, L-019, L-025 и L-026), которые с высокой вероятностью позволяют получить стабильный продукт, тогда как композиции L-003 и L-007 имеют большой потенциал для получения стабильного продукта со сроком хранения 2 года при 4°C. Из четырех рассмотренных вирусов CDV представляется самым неустойчивым. Все десять композиций представляются способными обеспечить стабильность в течение более чем 3-х лет при хранении при 0-8°C в случае CAV2, CPV и CPI и по меньшей мере в течение 2 лет при хранении при 0-8°C в случае CDV.

Таблица 1
Композиции жидких живых вирусных вакцин для собак
Наименование композиции Детали композиции
L-001 25% сорбит, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-002 15% сорбит, 10% сахароза, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-003 10% сорбит, 15% сахароза, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-004 15% сорбит, 10% сахароза, 0,01% Tween 20, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-005 75 мМ NaCl, 5% сахароза, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% этанол, 0,02% Tween 80, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-006 75 мМ NaCl, 5% сахароза, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% этанол, 0,02% Tween 80, 0,3 M L-аргинин, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-007 17% сахароза, 0,8% желатин, 1,0% NZ Amine, 0,3 М L-аргинин, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-008 3,8% сахароза, 0,8% желатин, 1,0% NZ Amine, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-009 25% сахароза, 1,6% желатин, 2,0% NZ Amine, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% этанол, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-010 25% сахароза,0,8% желатин, 1,0% NZ Amine, 0,01% Tween 80, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-011 25% сахароза,0,3 M аргинин, 50 мкМ декстран сульфат, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-012 25% сахароза, 1% метионин, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2

L-013 15% сахароза, 10% сорбит, 1,6% желатин, 2,0% NZ Amine, 0,01% Tween 80, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-014 15% сахароза, 10% сорбит, 0,8% желатин, 1,0% NZ Amine, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% этанол, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-015 15% сахароза, 10% сорбит, 0,3 M аргинин, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-016 15% сахароза, 10% сорбит, 1% метионин, 50 мкМ декстран сульфат, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-017 17% сахароза, 0,3M L-аргинин, 1,6% желатин, 2,0% NZ Amine, 50 мкМ декстран сульфат, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-018 17% сахароза, 0,3 M L-аргинин, 0,8% желатин, 1,0% NZ Amine, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-019 17% сахароза, 0,3 М L-аргинин, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% этанол, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-020 17% сахароза, 0,3 М L-аргинин, 1% метионин, 0,01% Tween 80, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-021 40% глицерин, 1,6% желатин, 2,0% NZ Amine, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-022 40% глицерин, 0,8% желатин, 1,0% NZ Amine, 50 мкМ декстран сульфат, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
L-023 40% глицерин, 0,3 М аргинин, 0,01% Tween 80, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2

L-024 40% глицерин, 1% метионин, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% этанол, 10 мМ Трис, 10 мМ гистидин, pH 7,2
Единицы измерения концентрации: сахароза (мас./об.), сорбит (мас./об.), глицерин (об./об.), желатин (мас./об.), NZ Amine (мас./об.), L-аргинин (M), метионин (мас/об.), TWEEN (об./об.), декстран сульфат (мкM), этанол (об./об.), ЭДТА (мМ), гистидин (мМ), Трис (мМ), NaCl (M).

Таблица 2
Ускоренное испытание на стабильность композиций жидких вирусных вакцин для собак
Титр (Log10 TCID50) каждой вирусной фракции во время хранения при 25°C (недели)
CDV CAV CPI 25°C
итоговая оценка
0 6 8 Оценка 0 2 8 Оценка 0 6 8 Оценка
L-001 5,47 3,94 3,67 +++++ 5,33 5,95 6,50 +++++ 7,09 6,00 6,11 ++++ ++++
L-002 5,47 3,56 3,83 +++++ 5,33 6,06 6,33 +++++ 7,09 6,67 6,61 +++++ ++++
L-003 5,47 3,89 3,78 +++++ 5,33 5,83 6,39 +++++ 7,09 6,50 6,72 +++++ ++++
L-004 5,47 3,06 3,40 ++++ 5,33 6,28 6,28 +++++ 7,09 6,33 6,06 ++++ ++++
L-005 5,47 1,50 + 5,33 6,17 + 7,09 1,50 +
L-006 5,47 1,56 + 5,33 5,33 + 7,09 1,72 +
L-007 5,47 3,67 3,89 +++++ 5,33 5,78 5,94 +++++ 7,09 5,72 6,72 +++++ +++++
L-008 5,47 1,56 1,50 + 5,33 6,78 7,11 +++++ 7,09 6,17 6,33 ++++ +
0 4 9 Оценка 0 6 12 Оценка 0 6 12 Оценка
L-009 5,56 4,50 3,00 ++ 5,72 5,78 5,92 +++++ 7,44 5,83 5,84 +++ ++
L-010 5,63 2,00 1,50 + 5,75 1,50 1,50 + 7,27 1,50 1,50 + +
L-011 5,83 5,11 3,92 ++++ 5,95 5,11 5,25 ++++ 7,17 6,67 7,17 +++++ ++++
L-012 5,63 4,39 4,09 ++++ 5,75 5,33 5,75 +++++ 7,27 6,50 6,00 +++ ++++

L-013 5,63 2,00 1,50 + 5,75 1,50 1,50 + 7,27 1,50 1,50 + +
L-014 5,63 4,72 3,34 ++ 5,75 5,39 5,92 +++++ 7,27 6,00 5,84 +++ ++
L-015 5,61 4,72 4,25 +++++ 5,39 5,39 5,42 +++++ 7,34 6,61 6,75 ++++ +++++
L-016 5,63 4,89 4,09 ++++ 5,75 5,72 5,67 +++++ 7,27 6,06 6,42 ++++ ++++
L-017 5,63 4,83 3,59 +++ 5,75 5,61 5,67 +++++ 7,27 6,17 5,92 +++ +++
L-018 5,72 4,78 4,00 ++++ 5,67 5,33 5,50 +++++ 7,61 6,11 6,75 ++++ ++++
L-019 5,63 4,67 4,09 ++++ 5,75 5,00 5,67 +++++ 7,27 6,39 7,00 +++++ ++++
L-020 5,22 1,78 1,50 + 5,78 1,50 1,50 + 7,39 1,50 1,50 + +
L-021 5,63 4,50 3,09 ++ 5,75 5,28 5,67 +++++ 7,27 5,33 4,83 ++ ++
L-022 5,63 4,00 1,92 + 5,75 5,17 5,34 ++++ 7,27 5,44 5,17 +++ +
L-023 5,63 1,95 1,50 + 5,75 1,50 1,50 + 7,27 1,50 1,50 + +
L-024 5,67 4,17 1,83 + 5,94 5,17 5,75 +++++ 6,94 5,17 4,67 ++ +
L-025 5,78 4,72 3,92 ++++ 5,83 5,39 5,84 +++++ 7,00 6,39 7,00 +++++ ++++
L-026 5,63 4,45 3,92 ++++ 5,75 5,28 5,59 +++++ 7,27 6,50 6,59 ++++ ++++
1) Исследование 1: композиции с L001 по L008; исследование 2: композиции с L-009 по L-026. Указанные исследования осуществляли в различные моменты времени.
2) Вирус CPV не включен в ускоренное испытание на стабильность при 25°C, поскольку показано, что он является относительно стабильным.
3) Оценку определяют с помощью кривой относительной деградации, экстраполированной на основании данных, полученных для указанных трех моментов времени, при этом пять "+" обозначают лучший результат и один "+" обозначает худший результат. В общей оценке учитывают оценку для отдельного вируса и определяют ее по наименее устойчивой фракции.

Таблица 3
Стабильность в режиме реального времени композиций жидкой вирусной вакцины собак при 4°C
Титр (Log10 TCID50) каждой вирусной фракции во время хранения при 4°C (месяцы)
CDV CAV CPI CPV Общая оценка
0 12 18 24* 0 12 18 24* 0 12 18 24* 0 12 18 24*
L-001 5,47 3,72 2,67 1,61 5,33 5,67 5,39 5,11 7,09 6,11 5,22 4,33 6,00 6,28 6,39 6,19 +
L-002 5,47 3,56 3,00 2,44 5,33 5,67 5,66 5,66 7,09 6,67 5,83 5,00 6,00 6,55 6,51 6,46 +
L-003 5,47 3,78 3,39 2,99 5,33 5,78 5,78 5,78 7,09 6,72 6,45 6,17 6,00 6,33 6,33 6,33 +++
L-004 5,47 2,83 3,00 2,80 5,33 5,83 5,89 5,69 7,09 6,67 5,99 5,31 6,00 6,39 6,39 6,39 +++
L-007 5,47 3,83 3,17 2,50 5,33 5,78 5,83 5,63 7,09 6,78 6,83 6,63 6,00 5,11 4,78 4,45 +++
L-008 5,47 2,56 1,72 0,88 5,33 6,22 5,94 5,66 7,09 6,22 6,11 6,00 6,00 5,95 6,28 6,08 +
0 6 12 24* 0 6 12 24* 0 6 12 24* 0 6 12 24*
L-009 5,56 3,72 4,06 3,86 5,72 6,28 6,22 6,16 7,44 6,50 6,22 5,94 6,00 4,72 4,89 4,69 +++++
L-011 5,83 4,33 4,39 4,19 5,95 5,61 5,83 5,63 7,17 7,28 7,16 7,05 6,00 6,06 5,61 5,17 +++++
L-012 5,63 4,33 4,50 4,30 5,75 6,22 5,78 5,34 7,27 7,28 6,89 6,50 6,00 6,50 6,67 6,47 +++++
L-014 5,63 3,94 3,94 3,94 5,75 6,17 6,00 5,83 7,27 7,00 6,67 6,34 6,00 6,06 5,94 5,83 +++++
L-015 5,61 4,06 4,39 4,19 5,39 6,11 5,89 5,67 7,34 7,33 7,33 7,13 6,00 6,22 6,05 5,88 +++++
L-016 5,63 3,95 4,00 3,80 5,75 5,89 5,83 5,77 7,27 7,00 6,94 6,88 6,00 6,61 5,83 5,05 +++++
L-017 5,63 4,22 4,06 3,89 5,75 6,22 6,17 6,11 7,27 7,39 7,00 6,62 6,00 5,06 4,56 4,06 +++
L-018 5,72 4,17 4,33 4,13 5,67 6,22 5,89 5,55 7,61 7,00 7,11 6,91 6,00 5,33 5,17 5,00 +++++
L-019 5,63 4,33 4,11 3,89 5,75 5,89 6,06 5,86 7,27 7,17 7,22 7,02 6,00 6,16 6,39 6,19 +++++
L-021 5,63 1,50 1,50 1,50 5,75 1,50 1,50 1,50 7,27 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d +
L-022 5,63 1,50 1,50 1,50 5,75 1,50 1,50 1,50 7,27 n/d n/d n/d n/d n/d n/d n/d +
L-025 5,78 4,17 4,72 4,52 5,83 6,33 6,00 5,67 7,00 7,22 6,83 6,44 6,00 5,33 5,17 5,00 +++++
L-026 5,63 4,00 4,95 4,75 5,75 6,22 6,39 6,19 7,27 7,17 7,05 6,94 6,00 5,44 5,11 4,78 +++++

Минимальный титр при истечении срока годности 3,70 4,80 5,10 4,30
1) n/d, не определяли;
2) Минимальный титр при истечении срока годности представляет собой спецификацию препарата для препарата вакцины в конце 2-летнего срока хранения при 4°C.
3) Обозначенный выше как 24* титр в 24 месяца при 4°C экстраполирован на основании данных, полученных для трех предыдущих моментов времени, т.е. расчетный титр вируса в 24 месяца при хранении при 4°C, экстраполированный на основании данных, полученных в моменты времени "0", 12 месяцев и 18 месяцев для композиций с L-001 по L-008; и в моменты времени "0", 6 месяцев и 12 месяцев для композиций с L-009 по L-026.
4) Титр в момент времени "0" получают для смеси непосредственно после смешивания и создания смеси вакцины.

ПРИМЕР 2

Устойчивость жидких вакцин, состоящих из живых вирусов собак и убитых бактерий

Материалы и методы

Материалы

Сахарозу и сорбит со степенью чистоты, подходящей для культивирования клеток, приобретают в Fisher Scientific. Высокой степени чистоты L-аргинин гидрохлорид, L-метионин, L-гистидин, хлорид натрия со степенью чистоты более 98% приобретают в Sigma. Декстран сульфат со средней молекулярной массой 10000 и степенью чистоты >95% приобретают в Sigma. Этанол высокой степени чистоты (>99%), растворы TWEEN 80, TWEEN 20, 1,0 M Трис (pH 8,0) и ЭДТА (pH 8,0), гентамицин (50 мг/мл), амфотерицин B (25 мг/мл) приобретают в Sigma. Раствор 20% желатина марки bloom 250 и раствор 7,61% NZ Amine AS готовят самостоятельно.

Получение основных растворов антигенов. Следующие растворы получают и стерилизуют с помощью 0,2 мкм фильтра: 80% сахароза, 70% сорбит, 1,0 M L-аргинин (pH 7,2), 5% L-метионин, 5 мМ декстран сульфат.

Антигены DA2PPv в объеме CDV, CAV2, CPV и CPI получают в титрах 6,7, 7,8, 8,0 и 9,2 соответственно. Антигены в объеме замораживают при -80°C и размораживают непосредственно перед смешиванием.

Антигены Leptospira в объеме получают с концентрацией приблизительно 2×1010 бактерий в миллилитре. Антигены Leptospira в объеме хранят при 4°C.

Смешивание и розлив жидких вакцин. Процедура получения смеси для жидкой вакцины DA2PPv (1,0 мл на дозу) заключается в следующем: антигены в количестве одной дозы смешивают в различных составах, как показано в таблице 4, с заданными титрами 5,5, 6,1, 6,0 и 7,0 для вирусов CDV, CAV2, CPV и CPI соответственно в соответствии со стандартными процедурами для поливалентного продукта CDV, CAV2, CPI и CPV (DA2PPv). Для композиций с четырьмя антигенами Leptospira заданная концентрация каждой фракции Leptospira составляет приблизительно 1×109 клеток на миллилитр. Готовят и подписывают 200 мл стерилизованный контейнер и затем компонент каждого стабилизатора и вспомогательного вещества добавляют в контейнер в соответствии с рассчитанным количеством, исходя из конечной концентрации каждого компонента, как указано в таблице 4 ниже.

Доводят объем дважды дистиллированной водой (ddH2О) до заданного объема стабилизаторов и вспомогательных веществ. Смешивают на платформе для перемешивания в течение по меньшей мере 10 мин до полного растворения всех компонентов. Охлаждают и хранят раствор стабилизаторов при 4°C до того, как будут подготовлены антигены. Нагревают замороженный антиген DA2PPv на водяной бане при 37°C с периодическим встряхиванием до полного растаивания льда. Некоторые антигены имеют в растворе видимый клеточный дебрис, поэтому антигены необходимо тщательно перемешать перед пипетированием. Размороженный антиген следует хранить при 2-8°C в течение не более 8 часов перед использованием. Добавляют соответствующее количество CDV, CAV2, CPV и CPI в подписанный контейнер с растворами стабилизаторов. Добавляют аликвоту, содержащую соответствующее количество общего раствора 4 антигенов Leptospira (Lepto) к смеси вакцины. Перемешивают на платформе для перемешивания до образования гомогенной смеси антигенов и стабилизаторов. Стараются избегать образования пузырьков и пены во время указанной стадии перемешивания. Измеряют значение pH при 25°C и доводят значение pH с помощью 1 M HCl или 1 M NaOH до заданного показателя pH, если значение pH не находится в диапазоне 7,2±0,1. Хранят смесь вакцины при 2-8°C до дозированного разливания в тот же день или аликвотируют в небольшой объем и замораживают при <-70°C для последующего использования. Вносят смесь вакцины в 2 мл стеклянные ампульные флаконы по 1 мл на флакон. Добавляют аргон в ампульный флакон после заполнения для предотвращения окисления во время хранения и затем термически запечатывают ампульный флакон. Наносят на ампулу этикетку, где указано название образца, номер лота, температура хранения, дата, и затем переносят в ящики и хранят при различной температуре в соответствии с протоколом исследования.

Испытания на стабильность, ускоренные под воздействием температуры, и в режиме реального времени.

Образцы жидких вакцин DA2PPv или DA2PPv-Lepto 4 хранят в инкубаторе при температуре 25±1°C. Хранение при 25°C используют для проведения ускоренного испытания на стабильность в целях скрининга. В запланированные моменты времени извлекают по 3 флакона каждой композиции и измеряют титр каждого антигена с помощью культуры клеток на основе TCID50 или FAID50.

Аналитические методы

Активность CPI

Определяют титр вируса CPI в вакцине DA2PPv. Вкратце, разведения вируса засевают на клетки почки собаки (клетки DK). Через 4-6 дней монослои фиксируют и окрашивают антисывороткой CPI, конъюгированной с флуоресцеином, и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера (см. пример 1 выше).

Активность CDV. Определяют титр вируса CDV в вакцине DA2PPv. Вкратце, разведения вируса засевают на клетки Vero. Через 5-7 дней монослои проверяют на наличие цитопатического эффекта и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера.

Активность CAV2. Определяют титр вируса CAV-2 в вакцине DA2PPv. Вкратце, разведения вируса засевают на клетки DK. Через 7 дней монослои проверяют на наличие цитопатического эффекта и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера.

Активность CPV. Определяют титр вируса CPV в вакцине DA2PPv. Вкратце, разведения вируса засевают на клетки DK. Через 3 дня монослои окрашивают антисывороткой CPV, конъюгированной с флуоресцеином, и рассчитывают титр вируса по методу Спирмена-Кербера.

Результаты и заключения

Ускоренные испытания на стабильность при 25°C

Вакцины, указанные в описании таблицы 4, смешивают, как описано в разделе Методы выше. Композиция L-037 является такой же, как ранее идентифицированная композиция L-015 выше (см. таблицу 1), за исключением того, что она содержит гентамицин и амфотерицин B. Композиции L-040, L-043 и L-045 содержат как четыре фракции живых вирусов собак, т.е. DA2PPv, так и четыре убитых антигена Leptospira (Canicola, Grippo, Pomona и Ictero). Образцы жидких вакцин хранят в запечатанных стеклянных ампульных флаконах с использованием 1 мл на флакон на дозу. Их тестируют в различные моменты времени после хранения при 25°C. Результаты испытания на стабильность для CDV, CAV2 и CPI представлены в таблице 5. CPV не тестируют на устойчивость при хранении при 25°C, поскольку жидкая композиция CPV считается наиболее устойчивой фракцией среди четырех живых вирусов. На основании результатов испытания на стабильность, представленных в таблице 5, установили следующее.

1) Антибиотики в качестве консервантов не оказывают отрицательного действия на стабильность вирусов DA2PPv в композиции L-015.

2) Наличие четырех убитых антигенов Leptospira снижает стабильность живых аттенуированных вирусов CDV и CPI в жидкой композиции.

3) Добавление 2 мМ ЭДТА к композиции L-040 обеспечивает стабильную композицию DA2PPv даже в присутствии четырех убитых антигенов Leptospira.

4) Указанную жидкую стабильную композицию также можно использовать для DA2PPv combo вместе с четырьмя убитыми антигенами Leptospira в присутствии адъювантов REHYDROPHOS.

Таблица 4
Таблица композиций жидкой стабильной комбинированной вакцины DA2PPv и Lepto 4
Название композиции Антигены Вспомогательные вещества и стабилизаторы
Вирусы DA2PPv Бактерии Lepto 4 Сахароза (мас./об.) Сорбит (мас./об.) L-Arg ЭДТА Стабилизаторы вакцины
L-037 DA2PPv - 15% 10% 0,3 M Гентамицин, Амфотерицин
L-040 DA2PPv Lepto 4 15% 10% 0,3 M Гентамицин, Амфотерицин
L-043 DA2PPv Lepto 4 15% 10% 0,3 M 2 мM Гентамицин, Амфотерицин
L-045 DA2PPV Lepto 4 + адъювант 15% 10% 0,3 M Гентамицин, Амфотерицин
Замечания
Конечный объем составляет 1 мл на дозу для каждой композиции.
Концентрация сахарозы и сорбита является массообъемной концентрацией (мас./об.). Концентрация аргинина (L-Arg) представляет собой молярную концентрацию. Концентрация ЭДТА представлена в миллимолях.
Все смеси содержат 10 мМ гистидина и 10 мМ Трис в качестве буфера. Конечное значение pH смеси доводят до заданного значения pH 7,2.
Все композиции содержат антибиотики в качестве консервантов 24 мкг/мл гентамицина и 0,4 мкг/мл амфотерицина B.
Все композиции содержат вирусные антигены DA2PPv, в том числе вирусы CDV, CAV2, CPV-2c и CPI.
Lepto 4 содержит четыре штамма Leptospira (Canicola, Grippo, Pomona и Ictero) с 10 миллионами убитых бактерий каждого штамма в одной дозе.
В случае L-045 вначале Lepto 4 смешивали с адъювантом REHYDROPHOS, инкубировали в течение >20 мин при комнатной температуре и затем смешивали с другими вирусными фракциями.

Таблица 5
Стабильность вакцины DAPPv при 25°C в жидких композициях
Композиции Вирусный титр (log10 TCID50) при 25°C
CDV CAV2 CPI
Время 0 Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3 Время 0 Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3 Время 0 Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3
L-037 5,19 5,38 5,19 5,04 5,13 5,50 5,53 5,00 6,26 6,14 6,39 6,14
L-040 5,57 5,57 4,47 4,07 5,38 5,66 5,78 5,32 6,57 6,17 5,70 5,48
L-043 5,82 5,82 5,16 4,91 5,32 5,57 5,35 5,60 6,51 6,10 5,82 5,89
L-045 5,57 5,50 5,13 4,82 5,50 5,66 5,60 5,63 6,51 5,98 5,73 5,60
Замечания
Вводимое количество антигена для всех 4 композиций является одинаковым. Титр в момент времени 0 теоретически должен быть одинаковым. Варьирование вирусного титра в момент времени 0 может быть результатом погрешности метода измерения в сочетании с различием композиций.
Титр CPV не представлен, поскольку показано, что CPV является относительно стабильным в большинстве указанных композиций. Измеряют только титры CDV, CAV2 и CPI во время указанного ускоренного исследования на стабильность при 25°C.

1. Жидкая стабильная вакцина, которая содержит живой аттенуированный вирус собак, 10-30% (мас./об.) сахарного вспомогательного вещества и аминокислоту; где жидкая стабильная вакцина имеет значение рН от 6,0 до 8,0; и где аминокислота выбрана из группы, состоящей из аргинина и метионина; причем, если аминокислота представляет собой аргинин, ее конечная концентрация в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,6 М; и причем, если аминокислота представляет собой метионин, ее конечная концентрация в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,025 до 0,3 М; и где живой аттенуированный вирус собак выбран из группы, состоящей из вируса чумы собак, аденовируса собак 2 типа, парвовируса собак и вируса парагриппа собак или любой их комбинации.

2. Жидкая стабильная вакцина по п. 1, где парвовирус собак (CPV) выбран из группы, состоящей из CPV-2, CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c и рекомбинантного CPV, содержащего гетерогенный геном CPV-2C/CPV-2.

3. Жидкая стабильная вакцина по п. 2, в которой CPV-2C имеет учетный номер АТСС РТА-13492.

4. Жидкая стабильная вакцина по п. 1, в которой вирус парагриппа собак представляет собой рекомбинантный вектор, который кодирует и экспрессирует гетерогенный антиген.

5. Жидкая стабильная вакцина по п. 1, которая дополнительно содержит компонент, выбранный из группы, состоящей из 0,4-1,6% (мас./об.) желатина, 0,5-2,0% (мас./об.) протеолитического гидролизата цельного казеина, 0,25-1,0% (об./об.) этанола, хелатора, буфера, антибиотика, адъюванта или любой их комбинации.

6. Жидкая стабильная вакцина по п. 5, в которой буфер выбран из группы, состоящей из 2,5-50 мМ Трис и 2,5-50 мМ Трис с 2,5-50 мМ гистидина.

7. Жидкая стабильная вакцина по п. 1, в которой сахарное вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из сахарозы, сорбита и комбинации сахара и сорбита.

8. Жидкая стабильная вакцина по п. 1, в которой вакцина дополнительно содержит антиген, выбранный из группы, состоящей из убитого вируса, убитой бактерии и убитого вируса вместе с убитой бактерией.

9. Жидкая стабильная вакцина по п. 8, где убитый вирус выбран из группы, состоящей из вируса гриппа собак, пневмовируса собак, коронавируса собак или любой их комбинации.

10. Жидкая стабильная вакцина по п. 8, где убитая бактерия выбрана из группы, состоящей из Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma species, Ehrlichia canis, Anaplasma species, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira interrogans, Leptospira autmnalis, Leptospira Bratislava или любой их комбинации.

11. Жидкая стабильная вакцина по п. 2, в которой сахарное вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из сахарозы, сорбита и комбинации сахара и сорбита.

12. Жидкая стабильная вакцина по п. 11, в которой вакцина дополнительно содержит антиген, выбранный из группы, состоящей из убитого вируса, убитой бактерии и убитого вируса вместе с убитой бактерией.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к новому соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или его дейтерированному производному. Соединения обладают свойствами ингибитора нерепторной тирозинкиназы Tyk2 и селективным ингибирующим действием в отношении Янус киназ JAK1, JAK2, JAK3.

Изобретение относится к химии органических гетероциклических соединений, а именно к новой четвертичной аммониевой соли, содержащей фрагмент производного витамина В6 формулы I, проявляющей антибактериальные, антимикотические, противовирусные и антипротозойные свойства.

Изобретение относится к cпособe получения супрамолекулярных гидрогелей, включающему смешение водного раствора L-цистеина с водным раствором ацетата серебра так, чтобы концентрация L-цистеина в смеси составляла от 1,0 до 6,0 мМ, а отношение молярных концентраций ацетата серебра к L-цистеину в смеси находилось в диапазоне от 1,23 до 1,33, где далее смесь оставляют в защищенном от света месте при комнатной температуре на 4 часа для формирования L-цистеин-серебряного раствора, затем смешивают созревший L-цистеин-серебряный раствор с водным раствором сульфата с катионом из ряда Na+, K+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Zn2+, Al3+, Ni2+, Co2+, Mn2+, при концентрации сульфата в смеси в пределах 0,075-0,750 ммоль, через определенное время, зависящее от концентрации сульфата и типа катиона, после чего жидкая система превращается в гель.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к бис-Met-гистонам, и может быть использовано в медицине. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим гистоном H1.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к составу местного применения для лечения инфекций кожи и слизистой оболочки, включающему глицерин в количестве от 30 до 99,99% об./об.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения средства, обладающего противомикробной активностью. Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью, заключающийся в том, что высушенные листья яблони лесной объединяют с жомом плодов яблони лесной, полученным после механического отжима сока и последующей сушки, измельчают, экстрагируют этанолом, фильтруют, остаток экстрагируют 95% этанолом, настаивают, фильтруют и объединяют полученные извлечения, при определенных условиях.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для лечения или профилактики синдрома WHIM у человека, у которого диагностирован синдром WHIM. Для этого указанному человеку вводят антагонист CXCR4 в количестве, эффективном для лечения или профилактики синдрома WHIM.

Объектом изобретения являются пиразоло[3,4-c]пиридины формулы I, включая их стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры и фармацевтически приемлемые соли, где R1 и R2 имеют значения, раскрытые в формуле изобретения.

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается вакцины для птиц и может быть использована для профилактики инфекций, вызываемых Salmonella. Композиция вакцины по изобретению включает в качестве активного ингредиента структуру, содержащую О-антиген, полученный от Salmonella, при условии, что указанная структура не содержит целую клетку, причем указанная структура, содержащая О-антиген, представляет собой липополисахарид, содержащий Липид А.

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I) и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим свойствами агониста TLR7. Соединения могут найти применение при лечении заболевания опосредуемого TLR7.
Изобретения относятся к полностью жидкой комбинированной вакцине, включающей смесь антигенов для защиты от заболеваний, таких как дифтерия (D), столбняк (Т), ацеллюлярный коклюш (аР), Haemophilus influenzae (Hib), гепатит (Hep) и полиовирус (IPV), а также способу ее получения и применения для индукции иммунологического ответа.

Изобретения касаются вакцинных композиций, содержащих вакцину против PRRSV (вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней) и вторую вакцину против вируса свиней, которые, по существу, не оказывают иммуноингибирования в отношении друг друга.

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены рекомбинантный вирусный вектор из герпесвируса индейки (HVT), содержащий гетерологичный кодон-оптимизированный полинуклеотид, кодирующий полипептид F вируса болезни Ньюкасл (NDV-F), функционально связанный с промотором SV40, а также иммунологические композиции, для индукции иммунного ответа в животном, и способы индуцирования иммуногенной реакции и вакцинации животных против птичьих патогенов.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены поливалентная иммуногенная композиция, содержащая комбинацию растворимой части цельноклеточного препарата Mycoplasma hyopneumoniae (M.
Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для защиты жвачных животных от пневмонии, вызываемой P. Multocida.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для профилактики и/или лечения заболевания ВИЧ у человека, которому это необходимо. Пероральная фармацевтическая композиция включает смесь крупнодисперсного антигена, который содержит один или несколько эпитопов из белков ВИЧ - Gag и/или Pol, и непатогенную не являющуюся рекомбинантной бактерию, выбранную из группы, состоящей из бактерии рода Lactobacillus и BCG.
Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для достижения длительной клинической ремиссии хронической ВПЧ-инфекции, проявляющейся остроконечными кондиломами аногенитальной области.

Представленная группа изобретений касается способа получения антигенной композиции, содержащей цирковирус свиней типа 2 (PCV-2), антигенной композиции, иммуногенной композиции, способа уменьшения симптомов вызываемой PCV-2 инфекции у животного и способа повышения иммуногенности иммуногенной композиции.

Настоящие изобретения относятся к области ветеринарных вакцин, в частности к области векторных вакцин для домашних птиц, основанных на рекомбинантном непатогенном вирусе болезни Марека (npMDV).

Bvdv-вакцина // 2578943
Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV. Комбинированная вакцина содержит первый BVDV, принадлежащий к первому типу и несущий ген Е2 BVDV указанного первого типа, второй BVDV, принадлежащий к первому типу, где этот ген Е2 BVDV, принадлежащего к указанному первому типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащего ко второму типу, и фармацевтически приемлемый носитель.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. Описаны новые аденовирусные штаммы с улучшенной серопревалентностью.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии и иммунологии, и может быть использовано для получения жидкой стабильной вакцины для собак. Жидкая стабильная вакцина содержит живой аттенуированный вирус собак, 10-30 сахарного вспомогательного вещества и аминокислоту, где жидкая стабильная вакцина имеет значение рН от 6,0 до 8,0. Аминокислота выбрана из группы, состоящей из аргинина и метионина; если аминокислота представляет собой аргинин, то ее конечная концентрация в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,15 до 0,6 М. Если аминокислота представляет собой метионин, то ее конечная концентрация в жидкой стабильной вакцине составляет от 0,025 до 0,3 М. Живой аттенуированный вирус собак выбран из группы, состоящей из вируса чумы собак, аденовируса собак 2 типа, парвовируса собак и вируса парагриппа собак или любой их комбинации. Использование вышеуказанного принципа стабилизации позволяет получить жидкий стабильный состав для живого аттенуированного вируса чумы собак, аденовируса собак 2 типа, парвовируса собак и вируса парагриппа собак. 11 з.п. ф-лы, 2 пр., 5 табл.

Наверх