Зародышевая плазма канолы, обладающая композиционными свойствами семян, которые обеспечивают увеличенную пищевую, питательную ценность канолы
Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению темных семян канолы для получения кормовой муки канолы, причем темные семена канолы выбраны из группы, состоящей из семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11697, семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11696, семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11698, и семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11699. Изобретение позволяет эффективно получать кормовую муку из темных семян канолы. 2 ил., 8 табл., 14 пр.
Испрашивание приоритета
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.C § 119(e) временной заявки США № 61/445426, поданной 22 февраля 2011 года, "ЗАРОДЫШЕВАЯ ПЛАЗМА КАНОЛЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ КОМПОЗИЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ СЕМЯН, КОТОРЫЕ ОБЕСПЕЧИВАЮТ УВЕЛИЧЕННУЮ ПИЩЕВУЮ, ПИТАТЕЛЬНУЮ ЦЕННОСТЬ КАНОЛЫ".
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к зародышевой плазме и культиварам канола. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к зародышевой плазме канолы, обладающей характерными признаками композиции кормовой муки (например, пониженными уровнями антипитательных факторов и повышенными уровнями белка), которую модифицируют независимо от окраски семенной оболочки. Конкретные варианты осуществления относятся к зародышевой плазме канолы, для которой продемонстрированы пониженные уровни антипитательных факторов (например, кислотно-детергентной клетчатки (ADF) и полифенольных соединений) и повышенные уровни белка и фосфора.
Предшествующий уровень техники
"Канола" относится к рапсу (Brassica spp.), содержание эруковой кислоты (C22:1) в котором составляет не более 2 процентов по массе (по сравнению с общим содержанием жирных кислот семян) и из которого получают (после измельчения) высушенную на воздухе кормовую муку, содержащую менее 30 микромоль (мкмоль) глюкозинолатов на грамм обезжиренной (не содержащей масел) кормовой муки. Эти типы рапса выделяют по их пригодности к потреблению в пищу по сравнению с более традиционными сортами вида. Полагают, что каноловое масло представляет собой превосходное пищевое масло вследствие низких уровней насыщенных жирных кислот в нем.
Хотя кормовая мука из рапсового жмыха обладает относительно высоким содержанием белка, высокое содержание клетчатки в ней уменьшает перевариваемость и ее ценность в качестве корма для животных. По сравнению с соевой кормовой мукой, кормовая мука из канолы и масличного рапса содержит более высокие уровни пищевой клетчатки и более низкий процент белка. Вследствие высокого содержания пищевой клетчатки в ней кормовая мука из канолы содержит приблизительно на 20% меньше обменной энергии (ME), чем соевая кормовая мука. Вследствие этого ценность кормовой муки остается низкой относительно других типов жмыховой муки, такой как соевая кормовая мука, в частности в рационе для свиней и домашней птицы. Rakow (2004a) Canola meal quality improvement through the breeding of yellow-seeded varieties-an historical perspective в AAFC Sustainable Production Systems Bulletin. Кроме того, содержание глюкозинолатов в некоторых типах кормовой муки из канолы также снижает их ценность вследствие вредных воздействий этих соединений на рост и воспроизводство домашнего скота.
Сорта канолы частично выделяют по окраске их семенной оболочки. Как правило, окраску семенной оболочки делят на два основных класса: желтый и темный (или темно-коричневый). Также наблюдают различные оттенки этих цветов, такие как красновато-коричневые и желтовато-коричневые. Часто наблюдают, что сорта канолы с более светлой окраской семенной оболочки содержат более тонкую кожицу, и таким образом, меньше клетчатки и больше масла и белка по сравнению с сортами с темной окраской семенных оболочек. Stringam et al., (1974) Chemical and morphological characteristics associated with seed coat color in rapeseed в Proceedings of the 4th International Rapeseed Congress, Giessen, Germany, pp. 99-108; Bell and Shires, (1982) Can. J. Animal Science, 62:557-65; Shirzadegan and Robbelen, (1985) Gotingen Fette Seifen Anstrichmittel 87:235-7; Simbaya et al., (1995) J. Agr. Food Chem., 43:2062-6; Rakow (2004b) Yellow-seeded Brassica napus canola for the Canadian canola Industry в AAFC Sustainable Production Systems Bulletin. Одним из возможных объяснений этого является то, что растение канолы может тратить больше энергии для продукции белков и масел, если не требуется энергия для продукции компонентов клетчатки семенной оболочки. Также опубликовано, что линии канолы с желтой окраской семян характеризуются более низким содержанием глюкозинолата по сравнению с линиями канолы с темной окраской семян. Rakow et al., (1999b) Proc. 10th Int. Rapeseed Congress, Canberra, Australia, Sep. 26-29, 1999, Poster #9. Таким образом, с исторической точки зрения развитие сортов канолы с желтой окраской семян протекало как возможный путь увеличения пищевой ценности кормовой муки из канолы. Bell, (1995) Meal and by-product utilization in animal nutrition, in Brassica oilseeds, production and utilization. Eds. Kimber and McGregor, Cab International, Wallingford, Oxon, OXIO8DE, UK, pp. 301-37; Rakow (2004b), выше, Rakow & Raney (2003).
Выявлено, что некоторые формы с желтой окраской семян видов Brassica, например близкородственные B. napus (например, B. rapa и B. juncea), содержат более низкие уровни клетчатки в семенах и последующей кормовой муке. Получением зародышевой плазмы B. napus с желтой окраской семян продемонстрировано, что содержание клетчатки в B. napus можно понижать путем интеграции генов, контролирующих пигментацию семян, от родственных видов Brassica. Однако интеграция генов, контролирующих пигментацию семян, от близкородственных видов Brassica в оцениваемых сортах масличных культур Brassica, таких как сорта канолы, является затруднительной вследствие того, что многие рецессивные аллели участвуют в наследовании желтых семенных оболочек в доступных в настоящее время линиях с желтой окраской семян. Кроме того, "курчавость стручков" также представляет собой часто встречающуюся проблему при интеграции семенной оболочки с желтой окраской от других видов Brassica, таких как juncea и carinata.
Доступно очень мало информации касательно того, насколько большая изменчивость клетчатки существует в зародышевой плазме B. napus с темной окраской семян, и не существует публикаций о выведении линий канолы с темной окраской семян, которые содержат пониженные уровни антипитательных факторов (например, волокнистых полифенольных соединений) и повышенные уровни белков.
Описание изобретения
В настоящем описании описаны перекрестноопыляющиеся культивары (Brassica napus) (CL044864, CL065620) и гибриды канолы (CL166102H, CL121460H и CL121466H), содержащие зародышевую плазму, обеспечивающую новую комбинацию изменений состава кормовой муки из канолы, для которых было продемонстрировано, что они влияют на пищевую ценность. В некоторых вариантах осуществления растения канола, содержащие зародышевую плазму по изобретению, могут продуцировать смена, например, с новыми комбинациями уровней белка, клетчатки и фосфора, таким образом, что эти компоненты семян не зависят от окраски семенной оболочки. В конкретных вариантах осуществления такие растения могут продуцировать семена с более высоким уровнем белка и более низким уровнем клетчатки по сравнению со стандартными типами канолы, а также уровни фосфора, которые являются аналогичными или более высокими, чем уровни фосфора в стандартных типах канолы. В некоторых вариантах осуществления инбредные линии и гибриды канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, могут обеспечивать повышенные с точки зрения питания свойства кормовой муки при использовании непосредственно в качестве кормового или пищевого ингредиента и/или при использовании в качестве исходного сырья для обработки изолятов и концентратов белка. Такие семена могут быть темно (например, черными, темными и пятнистыми) или светло окрашенными.
Таким образом, описываемое в настоящем описании представляет собой зародышевую плазму Brassica, которую можно использовать для получения растений канолы, обладающих желаемыми признаками компонента семян независимо от окраски семян. В некоторых вариантах осуществления растения, содержащие такую зародышевую плазму, можно использовать для получения кормовой муки из канолы с желаемыми питательными качествами. Конкретные варианты осуществления относятся к инбредным линиям канолы (и их растениям), содержащим зародышевую плазму по изобретению. Дополнительные варианты осуществления относятся к гибридным линиям канолы (и их растениям), содержащим в качестве родительской формы инбредное растение канолы, содержащее зародышевую плазму по изобретению.
Сорта канолы по изобретению включают, например и без ограничения: CL044864, CL065620, CL166102H, CL121460H и CL121466H.
Также описываемое в настоящем описании представляет собой товары растительного происхождения, получаемые из инбредных растений или гибридов канолы, содержащих зародышевую плазму по изобретению. Конкретные варианты осуществления включают кормовую муку из канолы или семена канолы, получаемые из такого инбредного растения или гибрида канолы.
Также описаны способы улучшения пищевой ценности кормовой муки из канолы. Например, описаны способы интрогрессии комбинации композиционных характеристик кормовой муки из канолы в зародышевой плазме Brassica независимо от окраски семян. В конкретных вариантах осуществления зародышевую плазму по изобретению можно комбинировать с зародышевой плазмой канолы, которая характеризуется желтой семенной оболочкой, для получения зародышевой плазмы, которая способна обеспечивать улучшенную кормовую муку из канолы с желаемыми характеристиками, передаваемыми от каждой из зародышевых плазм.
Указанное выше и другие признаки станут более понятны из подробного описания нескольких вариантов осуществления, которые предоставлены со ссылкой на прилагаемые фигуры.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 содержит изображения некоторых сортов канолы, имеющих темную окраску семенной оболочки.
Фиг. 2 содержит данные анализа состава семян определенных инбредных линий и гибридов B. napus. Образцы семян получали из повторных испытаний на территории Западной Канады. Данные состава семян теоретически рассчитывали на основе NIR, а затем верифицировали с использованием способов сравнительной химии.
Способ(ы) осуществления изобретения
I. Обзор нескольких вариантов осуществления
Кормовая мука из канолы представляет собой фракцию семян канолы, остающуюся после процесса экстракции масла. Кормовая мука из канолы является источником белка и таким образом ее используют для различных применений, включая составление корма для животных и выделение высококачественных концентратов и изолятов белка. Клетчатка в семенной оболочке, семядоли и зародыш, которые попадают в кормовую муку, ограничивают процент ввода кормовой муки из канолы для видов животных с однокамерным желудком, и, таким образом, кормовая мука из канолы, как правило, не обеспечивает аналогичную пищевую ценность, как кормовая мука, получаемая из других источников (например, из соевых бобов). Выявлено, что формы с желтой окраской семян у близко родственных с B. napus видов (например, B. rapa и B. juncea) содержат низкие уровни клетчатки в своих семенах и последующей кормовой муке. Это наблюдение подтолкнуло к попыткам введения признака низкого содержания клетчатки в семени в B. napus в зависимости от желтой окраски семян. Созданием зародышевой плазмы получаемой B. napus с желтой окраской семян продемонстрировано, что таким подходом можно уменьшать содержание клетчатки в B. napus.
До настоящего изобретения не предполагалось, что для сортов канолы с темной окраской семян выявят содержание клетчатки, которое являлось таким низким, как наблюдали у сортов с желтой окраской семян. Кроме того, не описаны линии канолы с темной окраской семян, содержащие пониженные уровни антипитательных факторов (например, клетчатки и полифенольных соединений) и повышенные уровни белка и фосфора, которой являлись бы источниками улучшенной кормовой муки из канолы. В некоторых вариантах осуществления описываемые в настоящем описании зародышевые плазмы канолы обеспечивают сочетания нескольких ключевых характерных признаков композиции улучшенной кормовой муки, которые экспрессируются независимо от цвета семенной оболочки. В конкретных вариантах осуществления для кормовой муки из канолы, получаемой из семян канолы, содержащих зародышевую плазму по изобретению, можно получать более высокие проценты ввода, например, в рационах свиньи и домашней птицы.
Зародышевые плазмы по изобретению можно использовать (например, путем селекционного разведения) для получения канолы, обладающей желаемыми признаками компонента семян совместно с одним или более дополнительными желаемыми признаками (например, улучшенной композицией масла, повышенной продукцией масла, модифицированной композицией белка, увеличенным содержанием белка, устойчивостью к заболеваниям, паразитам, устойчивостью к гербицидам и т.д.). Зародышевые плазмы по изобретению можно использовать в качестве исходной зародышевой плазмы, с которой можно вводить дополнительные изменения в состав семян, таким образом, можно получать линии и гибриды канолы, которые обеспечивают кормовую муку из канолы, обладающую улучшениями описываемого в настоящем описании типа.
II. Сокращенное обозначение
ADF кислотно-детергентная клетчатка
ADL кислотный детергентный лигнин
AID наблюдаемая перевариваемость в подвздошной кишке
AME наблюдаемая обменная энергия
BSC канола с темной окраской семян
DM концентрация сухого вещества
ECM улучшенная кормовая мука из канолы по настоящему изобретению
FAME сложные метиловые эфиры жирная кислота/жирная кислота
GE валовая энергия
HT "высокотемпературная" обработка
LT "низкотемпературная" обработка
NDF нейтрально-детергентная клетчатка
ЯМР ядерный магнитный резонанс
NIR спектроскопия в ближней инфракрасной области
SAE сложный эфир синаповой кислоты
SBM соевая кормовая мука
SER растворимый экстрагируемый остаток
TAAA истинная доступность аминокислот
TDF общая пищевая клетчатка
TME истинная обменная энергия
WF белые хлопья
III. Термины
Обратное скрещивание: для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растения можно использовать способы обратного скрещивания. Для введения новых признаков в растения в течение десятилетий широко использовали способ обратного скрещивания. Jensen N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В характерном протоколе обратного скрещивания представляющий интерес исходный сорт (рекуррентный родитель) скрещивают со вторым сортом (нерекуррентным родителем), который несет представляющий интерес ген, который необходимо трансфицировать. Получаемое потомство из этого скрещивания затем скрещивают снова с рекуррентным родителем и этот способ повторяют до тех пор, пока не получат растение, где восстановлены преимущественно все желаемые морфологические и физиологические характеристики реккурентного растения в преобразованном растении в дополнение к перенесенному гену из нерекуррентного родителя.
Каноловое масло: каноловое масло относится к маслу, экстрагируемому из коммерческих сортов рапса. Для получения канолового масла семена, как правило, сортируют и перемешивают в зерновом элеваторе с получением приемлемого однородного продукта. Затем смешанные семена измельчают, и, как правило, экстрагируют масло гексаном, а затем рафинируют. Получаемое масло затем можно продавать для применения. Содержание масла, как правило, определяют как процент от целых высушенных семян, и конкретные содержания масла представляют собой характеристику различных сортов канолы. Содержание масла можно легко и общепринято определять различными аналитическими способами, например и без ограничения: ЯМР, NIR, экстракцией в аппарате Сокслета или другими широкодоступными специалистам в данной области способами. См. Bailey, Industrial Oil & Fat Products (1996), 5th Ed. Wiley Interscience Publication, New York, New York. Процент композиции общих жирных кислот, как правило, определяют, экстрагируя образец масла из семян, получая сложные метиловые эфиры жирных кислот, содержащихся в образце масла, и анализируя пропорции различных жирных кислот в образце с использованием газовой хроматографии. Композиция жирных кислот также может представлять собой отличительную характеристику конкретных сортов.
Промышленное значение: в рамках изобретения термин "промышленное значение" относится к линиям и гибридам растений, которые обладают достаточной мощностью растений и плодородностью, таким образом, что фермеры могут получать сельскохозяйственные культуры линии или гибрида растения с использованием общепринятого оборудования для сельского хозяйства. В конкретных вариантах осуществления товары растительного происхождения с желаемыми компонентами и/или свойствами можно экстрагировать из растений или растительных веществ коммерчески пригодного ряда. Например, масло, содержащее желаемые масляные компоненты, можно экстрагировать из семян коммерчески пригодной линии или гибрида растения с использованием общепринятого оборудования для измельчения и экстракции. В определенных вариантах осуществления коммерчески пригодная линия растения представляет собой инбредную линию или гибридную линию. "Хозяйственно-ценные элитные" линии и гибриды, как правило, обладают желаемыми хозяйственно-ценными признаками, например и без ограничения: улучшенной урожайностью по меньшей мере одного товара растительного происхождения, зрелостью, устойчивостью к заболеваниям и устойчивостью к полеганию.
Элитная линия: любая линия растения, которую получают в результате селекции и отбора для агрономической продуктивности высокого качества. Элитное растение представляет собой любое растение из элитной линии.
Улучшенная кормовая мука из канолы: в рамках изобретения термин "улучшенная кормовая мука из канолы" означает кормовую муку из канолы с улучшенной композицией, получаемой при обработке семян канолы, которые содержат повышенные уровни белка и пониженные уровни по меньшей мере некоторого антипитательного компонента. Улучшенная кормовая мука из канолы по настоящему изобретению может быть различным образом обозначена в настоящем описании как "ECM", "ECM канолы с темной окраской семян", "BSC ECM" или "DAS BSC ECM". Однако предполагают, что настоящее изобретение не ограничено только зародышевой плазмой ECM канолы с темной окраской семян.
По существу выводимый: в некоторых вариантах осуществления обработка растений, семян или их частей может приводить к выведению по существу выводимых сортов. В рамках изобретения термин "по существу выводимый" соответствует конвенции, установленной Международным союзом по охране новых сортов растений (UPOV):
[A] сорт следует считать по существу выводимым из другого сорта ("исходный сорт"), когда
(i) его преимущественно выводят из исходного сорта или сорта, который сам преимущественно выводят от исходного сорта, при этом сохраняя экспрессию основных признаков, которые обусловлены генотипом или комбинацией генотипов исходного сорта;
(ii) он ясно отличается от исходного сорта, и
(iii) за исключением различий, которые обусловлены процессом выведения, он соответствует исходному сорту в отношении экспрессии основных признаков, которые обусловлены генотипом или комбинацией генотипов исходного сорта.
UPOV, Sixth Meeting with International Organizations, Geneva, Oct. 30, 1992 (документ, составленный в Управлении союза).
Товар растительного происхождения: в рамках изобретения термин "товар растительного происхождения" относится к товарам, получаемым из конкретного растения или части растения (например, растения, содержащего зародышевую плазму по изобретению, и части растения, получаемого из растения, содержащего зародышевую плазму по изобретению). Товар может представлять собой, например и без ограничения: зерно, кормовую муку, фураж, белок, выделенный белок, муку, масло, измельченные или целые зерна или семена, любой пищевой продукт, содержащий любую муку, масло или измельченное или целое зерно, или силос.
Линия растения: в рамках изобретения "линия" относится к группе растений, для которых выявляют небольшую генетическую вариацию (например, отсутствие генетической вариации) между индивидуумами по меньшей мере для одного признака. Инбредные линии можно выводить посредством нескольких поколений самоопыления и селекции или, альтернативно, вегетативным размножением от одной родительской формы способами тканевого или клеточного культивирования. В рамках изобретения термины "культивар", "сорт" и "тип" являются синонимами, и эти термины относятся к линии, которую используют для коммерческой продукции.
Растительное вещество: в рамках изобретения термин "растительное вещество" относится к любому обрабатываемому или необрабатываемому веществу, получаемому полностью или частично из растения. Например и без ограничения, растительное вещество может представлять собой часть растения, семена, плод, листву, корень, ткань растения, тканевую культуру растения, растительный эксплант или клетку растения.
Стабильность: в рамках изобретения термин "стабильность" или "стабильный" относится к компоненту или признаку данного растения, который является наследуемым и сохраняется по существу на одном и том же уровне на протяжении многих поколений семян. Например, стабильный компонент может сохраняться на протяжении по меньшей мере трех поколений по существу на одном и том же уровне. В этом контексте термин "по существу на одном и том же" в некоторых вариантах осуществления может относиться к компоненту, сохраняемому на уровне 25% между двумя различными поколениями, на уровне 20%, на уровне 15%, на уровне 10%, на уровне 5%, на уровне 3%, на уровне 2% и/или на уровне 1%, а также к компоненту, который превосходно сохраняется между двумя различными поколениями. В некоторых вариантах осуществления стабильный компонент растения может представлять собой, например и без ограничения, масляный компонент, белковый компонент, компонент клетчатки, компонент пигмента, компонент глюкозинолата и компонент лигнина. На стабильность компонента может влиять один или более факторов окружающей среды. Например, на стабильность масляного компонента может влиять, например и без ограничения: температура, местоположение, стресс и время посадки. Предполагают, что последующие поколения растения, содержащие стабильный компонент, в полевых условиях продуцируют компонент растения аналогичным образом, например, как указано выше.
Признак или фенотип: термины "признак" и "фенотип" в настоящем описании используют взаимозаменяемо.
Сорт или культивар: термины "сорт" или "культивар" в настоящем описании относятся к линии растения, которую используют для коммерческой продукции, которая является отличной, стабильной и однородной по своим характеристикам при выращивании. В случае гибридного сорта или культивара родительские линии являются отличными, стабильными и однородными по своим характеристикам.
Если не указано иное, термины в форме единственного числа в рамках изобретения относятся по меньшей мере к единственному числу.
IV. Зародышевая плазма канолы, обеспечивающая желаемые признаки компонента семян независимо от окраски семян
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к зародышевой плазме Brassica, которую можно использовать для получения растений канолы, обладающих желаемым признаком компонента семян независимо от окраски семян. Также раскрыты конкретные примерные инбредные линии и гибриды канолы, содержащие такую зародышевую плазму.
Как правило, каноловое масло признано как очень полезное масло для потребления как человеком, так и животными. Однако компонент кормовой муки из семян канолы, которая остается после экстракции масляного компонента, уступает соевой кормовой муке, вследствие высокого содержания в нем клетчатки и пониженной пищевой ценности. В некоторых вариантах осуществления в растениях канолы, содержащих зародышевую плазму по изобретению, можно уменьшать или устранять эти недостатки, и можно получать кормовую муку из канолы в качестве высокопитательного и экономически целесообразного источника корма для животных. Кормовая мука из канолы представляет собой побочный продукт при получении канолового масла, и, таким образом, кормовая мука из канолы, предоставляемая настоящим изобретением, сохраняет ценные ресурсы, предоставляя возможность использовать этот побочный продукт в конкурентных условиях с другими видами кормовой муки.
Раньше предполагали, что канола с желтой окраской семян по существу являлась достаточной, т.к. предполагали, что она соответствует улучшенным питательным характеристикам компонента кормовой муки, получаемого после экстракции масла. В некоторых вариантах осуществления впервые может быть предоставлена зародышевая плазма для семян темной окраски (например, с черной, темной и пятнистой окраской семян) канолы с низким содержанием клетчатки, которая также обеспечивает превосходное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и низким содержанием линоленовый кислоты, которая также обеспечивает кормовую муку из канолы с улучшенными питательным характеристикам (например, улучшенными компонентами семян). В некоторых вариантах осуществления растение, содержащее зародышевую плазму по изобретению, неожиданно может дополнительно обеспечивать эти признаки в сочетании с другими ценными признаками (например и без ограничения, превосходной урожайностью, высоким содержанием белка, высоким содержанием масла и высоким качеством масла). В конкретных вариантах осуществления семена с темной окраской могут содержать значительно более тонкую семенную оболочку, чем семена, получаемые от стандартных сортов канолы с темной окраской семян. Более тонкая семенная оболочка может приводить к сниженному содержанию клетчатки в кормовой муке и к увеличению содержания масла и белка в семенах по сравнению с уровнями масла и белка в стандартном сорте с темной окраской семян. Таким образом, семена с темной окраской, продуцируемые растениями, содержащими зародышевую плазму по изобретению, могут содержать более высокие концентрации масла и белков в своих семенах по сравнению с концентрациями, наблюдаемыми для семян, продуцируемых стандартным растением канолы с темной окраской семян.
В вариантах осуществления для растения, содержащего зародышевую плазму по изобретению, не выявлено существенных агрономических и/или ограничений в отношении семян. Например, такое растение может обладать агрономическими качествами и/или качествами семян (например, всхожестью, активностью роста в течение вегетационного периода, в отношении эффекта обработки семян, сбора и лежкости семян), которые являются по меньшей мере такими же благоприятными как качества, которыми обладают стандартные сорта канолы. В конкретных вариантах осуществления растение, содержащее зародышевую плазму по изобретению, может также содержать один или более дополнительных признаков, которыми обладает уже существующая инбредная линия канолы, например и без ограничения благоприятным профилем жирных кислот.
В вариантах осуществления растение, содержащее зародышевую плазму по изобретению, может продуцировать семена, обладающие по меньшей мере одной из несколькими питательными характеристиками. В конкретных вариантах осуществления семена, продуцируемые таким растением канолы, могут обладать по меньшей мере одной питательной характеристикой, выбранной из группы, состоящей из благоприятного масляного профиля, высокого содержания белка, низкого содержания клетчатки (например, ADF и NDF (включая низкое содержание полифенолов)), (низкое содержание клетчатки и высокое содержание белка обеспечивает более высокую обменную энергию), высокого содержания фосфора и низкого содержания сложных эфиров синаповой кислоты (SAE). В определенных вариантах осуществления "высокое" или "низкое" содержание компонента относится к сравнению между семенами, продуцируемыми растением сравнения, содержащим зародышевую плазму по изобретению, и семенами, продуцируемыми стандартными сортами канолы. Таким образом, растение, продуцирующее семена с "низким" содержанием клетчатки, может продуцировать семена с более низким содержанием клетчатки по сравнению с тем, которое наблюдают в семенах, продуцируемых стандартными сортами канолы. И растение, продуцирующее семена с "высоким" содержанием белка, может продуцировать семена с более высоким содержанием белка по сравнению с тем, которое наблюдают в семенах, продуцируемых стандартными сортами канолы.
В некоторых вариантах осуществления можно получать по существу однородную совокупность семян рапса, продуцируемых растением канолы, обладающим по меньшей мере одной питательной характеристикой, выбранной из указанной выше группы. Такие семена можно использовать для получения по существу однородного поля растений рапса. Конкретные варианты осуществления относятся к семенам канолы, содержащим определенные комбинации указанных выше характеристик. Например, объединенное общее содержание масла и белка семян может представлять собой пригодную меру измерения и уникальную характеристику семян.
Некоторые варианты осуществления относятся к каноле (например, каноле с темной окраской семян), содержащей зародышевую плазму по изобретению, которая способна давать урожай канолового масла, имеющего масляный профиль типа NATREON. Масляные профили "типа NATREON" или "подобные NATREON" могут означать содержание олеиновой кислоты в диапазоне, например, 68-80%, 70-78%, 71-77% и 72-75% с содержанием альфа-линоленовой кислоты ниже, например, 3%. В конкретных вариантах осуществления семена, получаемые из растения канолы, содержащего зародышевую плазму по изобретению, могут давать масло, содержащее более 70%, более 71%, более 71,5% и/или более 72% (например, 72,4%) или 72,7%) олеиновой кислоты, при этом содержащее линоленовую кислоту менее 2,4%, менее 2%, менее 1,9% и/или менее 1,8% (например, 1,7%). Однако в дополнительных вариантах осуществления канола, содержащая зародышевую плазму по изобретению, может давать масла, например, с содержанием олеиновой кислоты более 80%. В определенных вариантах осуществления каноловое масло, получаемое из канолы, содержащей зародышевую плазму по изобретению, может обладать природной устойчивостью (например, не являться гидрогенизированный искусственным путем). Содержание жирных кислот канолового масла можно легко и общепринято определять известными способами.
Таким образом, некоторые варианты осуществления относятся к семенам канолы (например, темноокрашенные семенам канолы), содержащим масляную фракцию и фракцию кормовой муки, где содержание в масляной фракции α-линоленовой кислоты может составлять, например, 3% или менее (относительно общего содержания жирных кислот семян), и содержание олеиновой кислоты может составлять, например, 68% или более (относительно общего содержания жирных кислот семян). По определению содержание эруковой кислоты (C22:1) таких семян также может составлять менее 2% по массе (по сравнению с общим содержанием жирных кислот). В конкретных примерах масляный компонент семян канолы может содержать 48%-50% семян по массе.
Клетчатка представляет собой компонент стенок растительной клетки и содержит углеводные полимеры (например, целлюлозу (линейные полимерные цепи глюкозы глюкозы)), гемицеллюлозу (разветвленные цепи гетерополимеров, например галактозы, ксилозы, арабинозы, рамнозы с присоединенными фенольными молекулами) и пектины (водорастворимые полимеры галактуроновой кислоты, ксилозы, арабинозы с различными степенями метилирования). Клетчатка также содержит полифенольные полимеры (например, подобные лигнину полимеры и конденсированные танины). Теоретически клетчатка ADF состоит из целлюлозы и лигнина. Как правило, конденсированные танины содержатся во фракции ADF, но содержание конденсированных танинов изменяется независимо от ADF. В противоположность этому TDF представляет собой кормовую муку, из которой удалены белок, растворимые вещества и крахмал, и состоит из компонентов клеточной стенки (например, целлюлозы, гемицеллюлозы, полифенолов и лигнина).
В конкретных вариантах осуществления семена растения канолы (например, темноокрашенные семена растения канолы), содержащие зародышевую плазму по изобретению, могут содержать пониженный уровень ADF по сравнению с сортом канолы. В конкретных примерах содержимое клетчатки кормовой муки из канолы (целые семена с удаленным маслом, по массе сухого вещества) может содержать, например и без ограничения: менее приблизительно 18% ADF (например, приблизительно 18% ADF, приблизительно 17% ADF приблизительно 16% ADF, приблизительно 15% ADF, приблизительно 14% ADF, приблизительно 13% ADF, приблизительно 12% ADF, приблизительно 11% ADF, и приблизительно 10% ADF, и/или менее приблизительно 22% NDF (например, приблизительно 22,0% NDF, приблизительно 21% NDF, приблизительно 20% NDF, приблизительно 19% NDF, приблизительно 18% NDF и приблизительно 17% NDF).
В конкретных вариантах осуществления семена растения канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, могут иметь повышенное содержание белка по сравнению со стандартным сортом канолы с темноокрашенными семенами. В конкретных примерах содержание белка в кормовой муке из канолы (целые семена с удаленным маслом, по массе сухого вещества) может составлять, например и без ограничения, более приблизительно 45% (например, приблизительно 45%, приблизительно 46%, приблизительно 47%, приблизительно 48%, приблизительно 49%, приблизительно 50%, приблизительно 51%, приблизительно 52%, приблизительно 53%, приблизительно 54%, приблизительно 55%, приблизительно 56%, приблизительно 57%, и приблизительно 58%) сырого белка. Различные сорта канолы характеризуются конкретным содержанием белка. Содержание белка (% азота ×6,25) можно определять различными хорошо известными и общепринятыми аналитическими способами, например NIR и по Кьельдалю.
В некоторых вариантах осуществления также можно использовать содержание фосфора для определения семян, растений и линий сортов канолы. Из таких сортов канолы можно получать кормовую муку из канолы (целые семена с удаленным маслом, по массе сухого вещества), в которой содержание фосфора является увеличенным по сравнению с кормовой мукой, получаемой из стандартных сортов канолы. Например, содержание фосфора в кормовой муке из канолы по изобретению может составлять более 1,2%, более 1,3%, более 1,4%, более 1,5%, более 1,6%, более 1,7% и/или более 1,8%.
Различные комбинации указанных выше признаков также можно идентифицировать и привести в качестве примера инбредные линии и гибриды канолы, предоставленные в нескольких примерах. Эти линии демонстрируют, что зародышевую плазму по изобретению можно использовать для обеспечения и получения различных новых комбинаций широкого спектра предпочтительных характеристик и/или признаков канолы. Например, инбредную линию канолы, содержащую зародышевую плазму по изобретению, можно скрещивать с другой линией канолы, которая обладает желаемой характеристикой и/или признаком, для введения желаемых характеристик компонента семян инбредный линии канолы, содержащей зародышевую плазму по изобретению. Расчеты компонентов семян (например, содержания клетчатки, содержания глюкозинолата, содержания масла и т.д.) и других признаков растения можно проводить способами, которые являются известными в данной области и применимыми в промышленности. Отбирая и размножая потомственные растения при скрещивании, которые содержат желаемые характеристики и/или признаки родительских сортов, можно выводить новые сорта, которые содержат желаемую комбинацию характеристик и/или признаков.
V. Кормовая мука из канолы, обладающая улучшенными питательными характеристиками
Некоторые варианты осуществления относятся к кормовой муке, содержащей семена канолы, где характеристики масла и кормовой муки из семян канолы являются такими, как указано выше. Например, некоторые варианты осуществления содержат экстрагируемую гексаном высушенную на воздухе кормовую муку из канолы (белые хлопья или WF), содержащую новую комбинацию характеристик (например, компонентов семян), как указано выше. Конкретные варианты осуществления содержат кормовую муку, содержащую семена канолы, получаемые из растений, содержащих зародышевую плазму по изобретению, и кормовую муку, содержащую семена потомства растения, содержащего зародышевую плазму по изобретению.
Инбредные линии и гибриды канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, в некоторых вариантах осуществления могут обеспечивать увеличенные с точки зрения питательной ценности свойства кормовой муки при использовании непосредственно в качестве корма или пищевого ингредиента и/или при использовании в качестве исходного сырья для обработки изолятов и концентратов белка. Например, такие инбредные линии и гибриды канолы могут обеспечивать продуктивность корма для животных, превосходящую кормовую муку из жмыха семян стандартной канолы. В некоторых вариантах осуществления компоненты кормовой муки из канолы (и содержащих ее кормов для животных) можно использовать для обеспечения хорошего питания животного с однокамерным желудком (например, свиньи и домашней птицы).
В некоторых вариантах осуществления компоненты кормовой муки из канолы (и содержащих ее кормов для животных) можно использовать для обеспечения хорошего питания жвачного животного (например, крупного рогатого скота, овцы, коз и других животных подотряда Ruminantia). Кормление жвачных животных представляет собой конкретные проблемы и конкретные возможности. Конкретные возможности возникают из способности жвачных животных использовать нерастворимое целлюлозное волокно, которое могут разрушать определенные микроорганизмы в рубце таких животных, но, которое, как правило, является не перевариваемой млекопитающими с однокамерным желудком, такими как свиньи. Конкретные проблемы возникают из способности определенных кормов ингибировать переваривание клетчатки в рубце и из способности рубца ограничивать использование некоторых из компонентов определенных кормов, таких как жир и белок.
Семена Brassica, из которых экстрагировали масло, представляют собой потенциальный источник высококачественного белка, который можно использовать в корме для животных. После экстракции масла продукт кормовой муки из канолы содержит приблизительно 37% белка по сравнению приблизительно с 44-48% в соевой кормовой муке, которая в настоящее время является наиболее предпочтительной для корма и пищевых целей. Содержащиеся в каноле белки богаты метионином и содержат подходящие количества лизина, которые оба представляют собой лимитирующие аминокислоты в белках большинства злаковых и масличных культур. Однако использование кормовой муки из канолы в качестве источника белка являлось в некоторой степени ограниченной в определенных кормах для животных, т.к. она содержит нежелательные компоненты, такие как клетчатка, глюкозинолаты и фенольные соединения.
Одним из аспектов питательной ценности рапса, из которого выводят канолу, является высокий уровень в них (30-55 мкмоль/г) глюкозинолатов, соединения на основе серы. При измельчении листвы или семян канолы под действием мирозиназы на глюкозинолаты получают сложные изотиоцианатные эфиры. Эти продукты ингибируют синтез тироксина щитовидной железой и обладают другими антиметаболическими эффектами. Paul et al., (1986) Theor. Appl. Genet., 72:706-9. Таким образом, для применения в пищу человеком содержание глюкозинолатов, например белков, выделяемых из кормовой мука из рапсового жмыха, необходимо понижать или устранять для обеспечения безопасности продукта.
Улучшенные семена канолы, например с подходящим масляным профилем и содержанием масла и низким содержанием глюкозинолатов в семенах, значительно бы уменьшили необходимость гидрирования. Например, более высокое содержание олеиновой кислоты и более низкое содержание α-линоленовой кислоты такого масла могут обеспечивать повышенную устойчивость к окислению, таким образом уменьшая потребность в гидрировании и продукцию транс-жирных кислот. Уменьшение глюкозинолатов в семенах значительно снизит остаточное содержание серы в масле. Сера отравляет никелевый катализатор, широко используемый для гидрирования. Koseoglu et al., глава 8 в Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Ed. Shahidi, Van Nostrand Reinhold, N.Y., 1990, pp. 123-48. Кроме того, масло из сорта канолы с низким содержанием глюкозинолатов в семенах будет менее дорогостоящим для гидрирования.
Фенольные соединения в кормовой муке из канолы придают горький вкус, и предполагают, что они обязательно ассоциированы с темной окраской в конечных белковых продуктах. Шелуха семян, которая содержится в больших количествах в стандартной кормовой муке из канолы, не переваривается людьми и другими животными с однокамерным желудком, а также представляет собой не имеющий товарного вида гетерогенный продукт.
Компонент кормовой муки семян, продуцируемых растением канолы, содержащим зародышевую плазму по изобретению, может содержать, например и без ограничения: высокий уровень белка, низкий уровень клетчатки, более высокий уровень фосфора и/или низкий уровень SAE. Нерастворимая клетчатка и полифенольные соединения являются антипитательными и ухудшают переваривание белков и аминокислот. Таким образом, для некоторых применений желательными могут являться кормовая мука из канолы и корма для животных, содержащие кормовую муку из канолы, обладающие по меньшей мере одной характеристикой компонента семян, выбранной из группы, состоящей из сниженного содержания клетчатки, повышенного содержания белка, сниженного содержания полифенольных соединений и повышенного содержания фосфора.
В конкретных примерах содержание белка в кормовой муке из канолы (не содержащей масла, в сухом веществе) может составлять по меньшей мере приблизительно 45% (например, приблизительно 45%, приблизительно 46%, приблизительно 47%, приблизительно 48%, приблизительно 49%, приблизительно 50%, приблизительно 51%, приблизительно 52%, приблизительно 53%, приблизительно 54%, приблизительно 55%, приблизительно 56%, приблизительно 57% и приблизительно 58%).
Сорта канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, могут обладать хорошей урожайностью и продуцировать семена, содержащие значительно меньше кислотно-детергентной клетчатки (ADF) по сравнению с эталонной линией канолы. В некоторых вариантах осуществления для определения растений, семян и масла из сорта растения можно использовать любые эмпирические значения, определяемые для компонента семян, продуцируемых сортом растения, содержащим зародышевую плазму по изобретению. В некоторых таких примерах в качестве конечных точек можно использовать конкретные числа для определения диапазонов выше, ниже или между любой из определяемых величин. Иллюстративные диапазоны для характеристик масла и других компонентов семян указаны выше. Линии растений и их семена также можно определять по комбинациям таких диапазонов. Например, указанные выше характеристики масла совместно с характерными уровнями клетчатки, уровнями полифенольных соединений, уровнями глюкозинолатов, уровнями белка и уровнями фосфора, например, можно использовать для определения конкретных линий и их семян.
Не все указанные выше характеристики (например, характеристики компонента семян) являются необходимыми для определения линий и семян некоторых вариантов осуществления, и можно использовать дополнительные характеристики для определения таких линий и семян (например и без ограничения, обменную энергию, перевариваемую энергию, биологическую энергию и нетто-энергию).
VI. Растения, содержащие зародышевую плазму, обеспечивающую желаемые признаки компонента семян, независимо от окраски семян
Желаемые признаки конкретных инбредных линий и гибридов канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, можно переносить в другие типы Brassica (посредством общепринятой селекции и т.п.), например, B. rapa и B. juncea, с получением растений, продуцирующих семена с желаемыми характеристиками (например, характеристиками компонента семени), экспрессируемыми независимо от окраски семян. Таким образом, сорт Brassica, в который перенесли один или более желаемых признаков конкретной инбредной линии или гибрида канолы, содержащей зародышевую плазму по изобретению, может продуцировать семена с желаемыми характеристиками, которые являются с желтой окраской или с темной окраской. Кормовая мука и семена таких новых или модифицированных сортов Brassica могут содержать желаемый уровень клетчатки в семенах, повышенный уровень белка, повышенный уровень фосфора и/или пониженный уровень полифенольных соединений.
Некоторые варианты осуществления содержат не только желтые и темные семена канолы, содержащие зародышевую плазму, как описано и указано в примерах в настоящем описании, а также растения, выращиваемые или иным образом получаемые из таких семян, и тканевые культуры регенерируемых клеток растений канолы, являющихся объектом изобретения. Приводимые в примерах линии и гибриды получали без использования генной инженерии и мутагенеза, таким образом, демонстрируя полезность зародышевой плазмы при получении новых и модифицированных сортов канолы.
Некоторые конкретные варианты осуществления относятся к конкретным иллюстративным инбредным линиям и гибридам канолы. В рамках этого изобретения по меньшей мере 2500 семян каждого из CL065620, CL044864, CL121460H, CL166102H и CL121466H депонировали и обеспечивали доступ для общественности, делили объектом патентных прав, но в иных случаях без ограничения (за исключением таких ограничений, которые явно разрешены 37 C.F.R. 
1,808(b)), в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Rockville, Md. 20852. Эти депозиты обозначали как депозит АТСС №РТА-11697, РТА-11696, РТА-11698, РТА- и РТА-11699 соответственно с датой заявки 22 февраля 2011 года для РТА11696-РТА11699 и 21 февраля 2012 года для РТА-12570. Депозиты хранят, как указано выше, в депозитарии АТСС, который является открытым депозитарием, в течение 30 лет или пяти лет после последнего запроса, или в течение срока действия патента, какой бы то ни было продолжительности, и депозит заменяют, если он становится нежизнеспособным в течение этого периода.
Некоторые варианты осуществления содержат семена любого из описываемых в настоящем описании сортов Brassica napus. Некоторые варианты осуществления также содержат растения Brassica napus, получаемые из таких семян, а также тканевые культуры регенерируемых клеток таких растений. Также включено растение Brassica napus, регенерируемые из такой тканевой культуры. В конкретных вариантах осуществления такое растение может быть способным экспрессировать все морфологические и физиологические свойства иллюстративного сорта. Растения Brassica napus конкретных вариантов осуществления могут обладать определяющими физиологическими и/или морфологическими характеристиками растения, выращенного из депонированных семян.
Также предоставлены способы проведения скрещивания с использованием зародышевой плазмы по изобретению (например, как выявлено в иллюстративных инбредных линиях и гибридах канолы, предоставленных в настоящем описании) по меньшей мере в одном родителе потомства описанных выше семян. Например, некоторые варианты осуществления содержат гибрид F1 растения B. napus, имеющего в качестве одного или обоих родителей любое из растений, приводимых в примерах в настоящем описании. Дополнительные варианты осуществления содержат семена B. napus, получаемые от такого гибрида F1. В конкретных вариантах осуществления способ получения семян гибрида F1 B. napus включает скрещиванием иллюстративного растения с отличным инбредным родительским растением канолы и сбор урожая получаемых гибридных семян. Растения канолы по изобретению (например, родительское растение канолы и растение канолы, получаемое таким способом для получения гибрида F1) могут представлять собой растение женского или мужского пола.
Характеристики растений канолы в некоторых вариантах осуществления (например, уровни масла и белка и/или масляные и белковые профили) можно дополнительно модифицировать и/или улучшать путем скрещивания растения по изобретению с другой линией, обладающей модифицированной характеристикой (например, высокими уровнями масла и белка). Таким образом, можно улучшать другие характеристики путем тщательного изучения родительского растения. Линии канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, могут быть целесообразными для скрещивания их желаемых характеристик компонента семян в других линиях рапса или канолы независимо от окраски семян. Зародышевые плазмы по изобретению обеспечивают возможность переноса этих признаков в другие растения внутри одних и тех же сортов общепринятыми способами селекции растений, включая перекрестное опыление и отбор потомства. В некоторых вариантах осуществления желаемые признаки можно переносить между видами общепринятыми способами селекции растений, включающими перенос пыльцы и отбор. См., например, Brassica crops and wild allies biology and breeding, Eds. Tsunada et al., Japan Scientific Press, Tokyo (1980), Physiological Potentials for Yield Improvement of Annual Oil and Protein Crops, Eds. Diepenbrock and Becker, Blackwell Wissenschafts-Verlag Berlin, Vienna (1995), Canola and Rapeseed, Ed. Shahidi, Van Nostrand Reinhold, N.Y. (1990) и Breeding Oilseed Brassicas, Eds. Labana et al., Narosa Publishing House, New Dehli (1993).
В некоторых вариантах осуществления способ переноса по меньшей мере одной желаемой характеристики компонента семян независимо от окраски семян включает проведение межвидового скрещивания самоопыляющихся членов поколения F1 с получением семян F2. Затем можно проводить обратное скрещивание с получением линий, обладающих желаемой характеристикой(ами) компонента семян. Дополнительно, для переноса признаков от одного вида в другой можно использовать способы слияния протопластов и трансплантации ядра. См., например, Ruesink, "Fusion of Higher Plant Protoplasts", Methods in Enzymology, Vol. LVIII, Eds. Jakoby and Pastan, Academic Press, Inc., New York, N.Y. (1979) и цитируемые в них ссылки, и Carlson et al., (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69:2292.
Получая и продуцируя иллюстративные линии канолы, содержащие зародышевую плазму по изобретению, темную окраску семенной оболочки теперь можно легко переносить совместно с желаемыми характеристиками компонента семян в другие виды Brassica общепринятыми способами селекции растений, как указано выше. Например, темную окраску семенной оболочки теперь можно легко переносить совместно с желаемыми характеристиками компонента семян в коммерчески доступные сорта B. rapa, например и без ограничения, Tobin, Horizon и Colt. Следует понимать, что темную окраску семян не следует переносить наряду с другими характеристиками семян.
Принимая один из иллюстративных сортов в качестве начальной точки, специалист в данной области в ряде способов может манипулировать конкретными преимуществами, обеспечиваемыми сортом, не выходя за рамки объема настоящего изобретения. Например, масляный профиль семян, представленный в иллюстративном сорте, можно переносить в другой желаемый хозяйственно-ценный сорт B. napus общепринятыми способами селекции растений, включая перекрестное опыление и отбор потомства, например, где зародышевую плазму иллюстративного сорта вводят в другой желаемый хозяйственно-ценный сорт.
Конкретные варианты осуществления могут содержать иллюстративные сорта B. napus, а также по существу выводимые сорта, которые по существу вывели из по меньшей мере одного из иллюстративных сортов. Кроме того, варианты осуществления изобретения могут содержать растение по меньшей мере одного из иллюстративных сортов, растение такого по существу выведенного сорта и/или растение рапса, регенерируемое из растений или ткани (включая пыльцу, семена и клетки), получаемых из них.
Можно выбирать растительные вещества, которые способны к регенерации, например семена, микроспоры, семяпочки, пыльцу, вегетативные части и микроспоры. В основном, такие растительные клетки можно выбирать из любого сорта Brassica, включая сорта, обладающие желаемыми хозяйственно-ценными признаками.
Способы регенерации известны в данной области. Сначала можно отбирать клетки, способные регенерировать (например, семена, микроспоры, семяпочки, пыльцу и вегетативные части), из отобранного растения или сорта. Эти клетки можно необязательно подвергать мутагенезу. Затем можно выводить растение из клеток с использованием регенерации, оплодотворения и/или способами выращивания на основе типа клеток (и где их подвергают мутагенезу). Манипуляции с растениями или семенами, или их частями могут приводить к получению по существу выводимых сортов.
В некоторых вариантах осуществления желаемые характеристики компонента семян, которые выявляют у растений, содержащих зародышевую плазму по изобретению, можно вводить в растение, содержащее ряд дополнительных желаемых признаков независимо от окраски семени, для получения растения с желаемыми характеристиками компонента семян и рядом желаемых признаков. Способ введения желаемых характеристик компонента семян в растение, содержащее один или более желаемых признаков независимо от окраски семян, называют "стэкингом" этих признаков. В некоторых примерах стэкинг желаемых характеристик компонента семян с рядом желаемых признаков может приводить к дополнительным улучшениям характеристик компонента семян. В некоторых примерах стэкинг желаемых характеристик компонента семян с рядом желаемых признаков может приводить к растению канолы, обладающему желаемыми характеристиками компонента семян в дополнение к одному или более (например, всем) из ряда желаемых признаков.
Примеры признаков, которые могут являться желательными для комбинации с желаемыми характеристиками компонента семян включают, например и без ограничения: гены устойчивости к заболеваниям растений (см., например, Jones et al., (1994) Science, 266:789 (ген томата Cf-9 для устойчивости к Cladosporium fulvum), Martin et al., (1993) Science, 262:1432 (ген томата Pto для устойчивости к Pseudomonas syringae) и Mindrinos et al., (1994) Cell, 78:1089 (ген RSP2 для устойчивости к Pseudomonas syringae)), ген, придающий устойчивость к вредителям, белок Bacillus thuringiensis, его производное или синтетически смоделированный на его основе полипептид (см., например, Geiser et al., (1986) Gene, 48:109 (ген Bt δ-эндотоксина, молекулы ДНК, кодирующие гены δ-эндотоксина, можно приобретать от Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA), например, под номером доступа ATCC 40098, 67136, 31995 и 31998)), лектин (см., например, Van Damme et al., (1994) Plant Molec. Biol., 24:25 (гены манноза-связывающего лектина Clivia miniata)), витамин-связывающий белок, например авидин (см. международную публикацию PCT US93/06487 (использование авидина и гомологов авидина в качестве ларвицидов против насекомых-вредителей)), ингибитор фермента, ингибитор протеазы или протеиназы (см., например, Abe et al., (1987) J. Biol. Chem., 262:16793 (ингибитор цистеиновой протеиназы риса), Huub et al., (1993) Plant Molec. Biol., 21:985 (ингибитор I табачной протеиназы и патент США № 5494813), ингибитор амилазы (см. Sumitani et al., (1993) Biosci. Biotech. Biochem., 57:1243 (ингибитор альфа-амилазы Streptomyces nitrosporeus)), специфический в отношении насекомых гормон или феромон, например экдистероид или ювенильный гормон, его варианты, миметик на его основе или его антагонист или агонист (см., например, Hammock et al., (1990) Nature, 344:458 (инактиватор ювенильного гормона)), специфический в отношении насекомых пептид или нейропептид, который нарушает физиологию поражаемого вредителя (см., например, Regan, (1994) J. Biol. Chem., 269:9 (рецептор диуретического гормона насекомого), Pratt et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm., 163:1243 (аллостатин из Diploptera puntata), патент США № 5266317 (специфические в отношении насекомых паралитические нейротоксины)), специфический в отношении насекомых яд, вырабатываемый в природе змеей, осой или другим организмом (см., например, Pang et al., (1992) Gene, 116:165 (токсичный для насекомых пептид скорпиона)), фермент, ответственный за гипераккумуляцию монотерпена, сесквитерпена, стероида, гидроксамовой кислоты, производного фенилпропаноида или дугой небелковой молекулы с инсектицидной активностью, фермент, участвующий в модификации, включая посттрансляционную модификацию биологически активной молекулы, например, гликолитический фермент, протеолитический фермент, липолитический фермент, нуклеаза, циклаза, трансаминаза, эстераза, гидролаза, фосфатаза, киназа, фосфорилаза, полимераза, эластаза, хитиназа или глюканаза, природный или синтетический (см. международную публикацию PCT WO 93/02197 (ген каллазы), молекулы ДНК, которые содержат кодирующие хитиназу последовательности (например, из ATCC номер доступа 39637 и 67152), Kramer et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol., 23:691 (хитиназу табачного бражника) и Kawalleck et al., (1993) Plant Molec. Biol., 21:673 (ген ubi4-2 полиубиквитина петрушки), молекула, которая стимулирует передачу сигнала (см., например, Botella et al., (1994) Plant Molec. Biol., 24:757 (кальмодулин) и Griess et al., (1994) Plant Physiol., 104:1467 (кальмодулин кукурузы), гидрофобный влияющий пептид (см., например, международную публикацию PCT WO 95/16776 (пептидные производные тахиплезина, который ингибирует грибковые патогены растения) и международную публикацию PCT WO 95/18855 (синтетические противомикробные пептиды, которые придают устойчивость к заболеваниям)), мембранную пермеазу, образователь или блокатор каналов (см., например, Jaynes et al., (1993) Plant Sci., 89:43 (аналог литического пептида цекропина-β для придания трансгенным растениям устойчивости к Pseudomonas solanacearum), вирусный инвазивный белок или получаемый из него сложный токсин (см., например, Beachy et al., (1990) Ann. rev. Phytopathol., 28:451 (опосредованная белком оболочки устойчивость против вируса мозаики люцерны, вируса мозаики огурца, streak вируса полосатости табака, вируса X картофеля, вируса Y картофеля, вируса гравировки табака, вируса погремковости табака и вируса табачной мозаики)), специфическое к насекомому антитело или получаемый из него иммунотоксин (см., например, Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int’l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994) (ферментативная инактивация путем получения одноцепочечных фрагментов антител), специфическое к вирусу антитело (см., например, Tavladoraki et al., (1993) Nature, 366:469 (гены рекомбинантного антитела для защиты от атаки вируса)), останавливающий развитие белок, продуцируемый в природе патогеном или паразитом (см., например, Lamb et al., (1992) Bio/Technology, 10:1436 (грибковые эндо-α-1,4-D-полигалактуроназы способствуют колонизации грибками и высвобождению питательных веществ из растения посредством растворения стенки растительной клетки гомо-α-1,4-D-галактуроназы, Toubart et al., (1992) Plant J., 2:367 (ингибирующий эндополигалактуроназу белок)) и останавливающий развитие белок, продуцируемый в природе растением (см., например, Logemann et al., (1992) Bio/Technology, 10:305 (инактивирующий рибосомы ячменя ген, придающий повышенную устойчивость к грибковому заболеванию)).
Дополнительные примеры признаков, которые могут являться желательными для комбинации с желаемыми характеристиками компонента семян, включают, например и без ограничения: гены, которые придают устойчивость к гербициду (Lee et al., (1988) EMBO J., 7:1241 (мутантный фермент ALS), Miki et al., (1990) Theor. Appl. Genet., 80:449 (мутантный фермент AHAS), патенты США №№ 4940835 и 6248876 (гены мутантной 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтетазы (EPSP), придающие устойчивость к глифосату), патент США № 4769061 и номер доступа ATCC 39256 (гены aroA), гены ацетилтрансферазы глифосата (устойчивость к глифосату), другие фосфоно-соединения из вида Streptomyces, включая Streptomyces hygroscopicus и Streptomyces viridichromogenes), такие как соединения, описанные в европейской заявке № 0242246 и у DeGreef et al., (1989) Bio/Technology, 7:61 (гены фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) глуфосината, придающие устойчивость к глифосату), пиридинокси- или феноксипроприоновые кислоты и циклогексоны (устойчивость к глифосату), европейской патентной заявке № 0333033 и патенте США № 4975374 (гены глутаминсинтетазы, придающие устойчивость к гербицидам, таким как L-фосфинотрицин), Marshall et al., (1992) Theor. Appl. Genet., 83:435 (гены Acc1-S1, Acc1-S2 и Acc1-S3, придающие устойчивость к феноксипроприоновым кислотам и циклогексонам, таким как сетоксидим и галоксифоп), WO 2005012515 (гены GAT, придающие устойчивость к глифосату), WO 2005107437 (гены, придающие устойчивость к гербицидам 2,4-D, Fop и пиридилоксиауксин), и гербициду, который ингибирует фотосинтез, такому как триазин (гены psbA и gs+) или бензонитрил (ген нитролазы) (см., например, Przibila et al., (1991) Plant Cell, 3:169 (мутантные гены psbA), нуклеотидные последовательности генов нитрилазы, описанные в патенте США № 4810648, и молекулы ДНК, содержащие эти гены, доступные под номером доступа ATCC 53435, 67441 и 67442, и Hayes et al., (1992) Biochem. J., 285:173 (глутатион-S-трансферазу)).
Дополнительные примеры признаков, которые могут являться желательными для комбинации с желаемыми характеристиками компонента семян, включают, например и без ограничения, гены, которые придают устойчивость или способствуют добавлению стоимости признака, например модифицированного метаболизма жирных кислот (см., например, Knultzon et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:2624 (антисмысловой ген стеарил-ACP-десатуразы для увеличения содержания стеариновой кислоты в растении)), сниженного содержания фитата (см., например, Van Hartingsveldt et al., (1993) Gene, 127:87 (ген фитазы Aspergillus niger увеличивает деградацию фитата, добавляя больше свободного фосфата в трансформированное растение) и Raboy et al., (1990) Maydica, 35:383 (клонирование и обратное введение ДНК, ассоциированной с аллелем, ответственным за мутантов кукурузы, содержащих низкие уровни фитиновой кислоты)) и модифицированного углеводного состава, осуществляемого, например, трансформацией растений геном, кодирующим фермент, который изменяет разветвленную структуру крахмала (см., например, Shiroza et al., (1988) J. Bacteol., 170:810 (мутантный ген фруктозилтрансферазы Streptococcus), Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genet., 20:220 (ген левансахаразы), Pen et al., (1992) Bio/Technology, 10:292 (α-амилаза), Elliot et al., (1993) Plant Molec. Biol., 21:515 (гены инвертазы томата), Sogaard et al., (1993) J. Biol. Chem., 268:22480 (ген α-амилазы ячменя) и Fisher et al., (1993) Plant Physiol., 102:1045 (фермент II ветвления крахмала эндосперма кукурузы)).
Все ссылки, включая публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, таким образом, включены посредством ссылки в такой степени, что они не являются несовместимыми с явным описанием настоящего описания, и, таким образом, включены в той же степени, как если бы отдельно и конкретно указывали для каждой ссылки, что она включена посредством ссылки и указана полностью в настоящем описании. Описываемые в настоящем описании ссылки предоставлены только для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не следует расценивать как допущение, что авторы изобретения не имеют права датировать такое описание посредством предшествующего изобретения.
Следующие ниже примеры приведены для иллюстрации определенных конкретных признаков и/или аспектов описываемого в заявке изобретения. Эти примеры не следует расценивать как ограничивающие описание конкретными описываемыми признаками или аспектами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Усредненный состав питательных веществ и питательную ценность улучшенной кормовой мука из канолы (ECM) и общепринятой кормовой муки из канолы.
В период 2009-2012 гг. проводили несколько аналитических и функциональных исследований для оценки состава питательных веществ и питательной ценности ECM линий и гибридов по настоящему изобретению. Тестирование проводили на целых необработанных семенах, частично обработанной кормовой муке и полностью обработанной кормовой муке для учета возможных эффектов обработки на состав питательных веществ и питательную ценность. Образцы анализировали в университетах Иллинойса, Миссури, Джорджии и Манитобы. Эту информацию о составе использовали для оценки энергетической ценности улучшенной кормовой муки из канолы в сравнении с общепринятой кормовой мукой из канолы с использованием стандартного уравнения прогноза. Биологическую оценку образцов в отношении перевариваемой энергии и перевариваемости аминокислот у домашней птицы проводили в университетах Иллинойса и Джорджии. Биологическую оценку образцов в отношении перевариваемой энергии и перевариваемости аминокислот у свиней проводили в университете Иллинойса. Подробное описание различий состава питательных веществ ECM линий (диапазоны или средние) и общепринятой кормовой муки из канолы приведены в таблице 1. Подробное описание соответствующих способов и исследований приведено в последующих примерах.
| Таблица 1 Усредненный состав питательных веществ ECM и общепринятой кормовой муки из канолы |
||
| Питательно вещество как есть (88% сухого вещества, 3% масла) | ECM | Общепринятая кормовая мука из канолы |
| Сухое вещество, % | 88 | 88 |
| Белок, % | 43-44 (44) | 37 |
| Жир, % | 3 | 3 |
| Зола, % | 7,2 | 6,7 |
| Фосфор, % | 1,1-1,4 (1,3) | 1,0 |
| Перевариваемый фосфор, % | 0,43 | 0,33 |
| ADF, % | 12-15 (14) | 19 |
| Лигнин/полифенолы,% | 3-5 (4) | 6 |
| Целлюлоза, % | 4-5 | 5-6 |
| NDF % | 17-22 | 25 |
| Сахара, % | 7 | 7 |
| Лизин, % | 2,46 | 2,07 |
| Лизин, % от сырого белка | 5,6 | 5,6 |
| Доступность лизина для домашней птицы, TAAA % | 84 | 82 |
| Перевариваемость лизина у свиней, SID % | 76 | 72 |
| ME** у домашней птицы, ккал/кг | 2200 | 2000 |
| NE** у свиней, ккал/кг | 1800 | 1600 |
| * Число в скобках представляет собой среднее значение ** Теоретически рассчитанное из состава питательных веществ |
Для ECM линий продемонстрировано несколько определенных улучшений в составе питательных веществ, которые обеспечивают ценность корма для животных. Как проиллюстрировано в таблице 1, ECM содержит приблизительно на 7% больше белка, чем общепринятая кормовая мука из канолы. Кроме того, баланс незаменимых аминокислот (в виде процента от белка) сохраняется при более высоких уровнях белка. Перевариваемость аминокислот ECM у домашней птицы и свиньи по меньшей мере является такой же хорошей как в общепринятой кормовой муке из канолы, и вероятно, ключевая аминокислота лизин характеризуется немного более высокой перевариваемостью. Для ECM линий были продемонстрированы более низкие уровни компонентов клетчатки, которые выявляют в клеточных стенках и шелухе, в частности приблизительно на 2% более низкие уровни лигнина/полифенолов, на 1% более низкие уровни целлюлозы, на 3% более низкие уровни остатка ADF (3%) и на 5% более низкие уровни ADF.
Более высокие уровни белка и более низкие уровни компонентов клетчатки соответствуют увеличенной приблизительно на 10% биологической энергии в линиях ECM. Для этих линий также были продемонстрированы более высокие уровни фосфора, который представляет собой дорогостоящее питательное вещество для добавления в корма для животных. Таблица 1.
Пример 2: POS белые хлопья (WF), LT и HT обработки кормовой муки
Семена ECM и семена общепринятой канолы обрабатывали в POS Pilot Plant в Саскатуне, CA следующими ниже способами:
Вещества
Приблизительно 1,5 Мт семян канолы ECM тестовой линии (CL44864) получали в POS 2 августа 2011 года. Приблизительно 3,0 Мт продукта контрольных семян канолы получали в POS 3 августа 2011 года. Источники основных веществ являются такими, как указано ниже.
Гексан/изогексан: Univar, Saskatoon, SK.
Вспомогательный материал для образования фильтрующего слоя Hyflo Super-cel: Manville Products Corp., Denver, CO.
Азот: Air Liquide, Saskatoon, SK.
Ткань для фильтрования, моноволокно: Porritts and Spensor, Pointe Claire, PQ.
Фильтровальная бумага, 55 фунтов темного цвета 1138-55: Porritts and Spensor, Pointe Claire, PQ.
Способы - опытная обработка
Между каждым сортом канолы все оборудование "первичный" обработки пылесосили или очищали. Воспламеняющийся экстрактор не выключали между испытаниями. Однако цепь экстрактора, шнековую систему Schnecken и систему регенерации растворителя сохраняли в работающем состоянии для очистки оборудования между сортами канолы. Вакуум не отключали, таким образом, все пары направляли в конденсатор, конденсировали и выливали в настольную ванную с растворителем. Это предотвращало конденсацию воды в шнеке Schnecken и забивание конвейера. Образцы канола отжимали/экстрагировали в следующем порядке:
1. Контрольная HT
2. Контрольная LT
3. ECM тестовая линия (CL44864) LT
Получение хлопьев
Получение хлопьев проводят для разрушения маслосодержащих клеток и получения тонких хлопьев с большой площадью поверхности для пропаривания/предварительного прессования, пропуская семена через установку гладких вальцов. Толщину и влажность хлопьев подбирали для минимизации количества получаемого мелкодисперсного вещества. Высокие уровни мелкодисперсного вещества приводят к фильтр-прессному осадку со слабыми свойствами фильтрации растворителя.
Семена канолы перерабатывали в хлопья при минимальной величине зазора между вальцами. Диапазон толщины хлопьев для каждой партии являлся таким, как указано ниже:
1. Контрольная HT 0,21-0,23 мм
2. Контрольная LT 0,19-0,23 мм
3. ECM тестовая линия (CL44864) LT 0,21-0,23 мм
Скорость подачи регулировалась скоростью прессования и составляла приблизительно 133-150 кг/час.
Плющильный станок для получения хлопьев: 14" диаметр ×28" ширина плющильный станок Lauhoff Flakmaster модель S-28, серийный номер 7801, выпускаемый Lauhoff Corporation.
Пропаривание (кондиционирование)
Пропаривание проводят для дополнительного разрушения маслосодержащих клеток, приведения хлопьев в более гибкое состояние и повышения эффективности экспеллера посредством понижения вязкости содержащегося масла. Пропаривание также проводят для деактивации ферментов в семенах. Перед началом каждого испытания устройство для тепловой обработки предварительно нагревали. При проведении испытания давления паров регулировали для поддержания желаемой температуры хлопьев.
Температуры в противнях для партии контрольной HT являлись следующими:
Верхний противень 60±5°C
Нижний противень 97±3°C
Температуры в противнях для партии контрольной LT плюс партия LT ECM тестовой линии (CL44864) являлись следующими:
Верхний противень 60±5°C
Нижний противень 93±2°C
Устройство для тепловой обработки: использовали устройства для тепловой обработки Simon-Rosedown с двумя противнями. Каждый отдел являлся 36 см в высоту (рабочая высота 21 см) и 91 см в диаметре, и являлся оборудованным вращающейся четкой для перемешивания вещества. Пар использовали в паровой рубашке для сухой сушки, а также острый пар можно добавлять к содержимому сосуда. Устройство для тепловой обработки устанавливали под винтовым прессом для прямой подачи.
Прессование
Прессованием удаляют приблизительно 2/3 масла и получают жмых, подходящий для экстракции растворителем. Жмых должен обладать сопротивлением к сжатию для того, чтобы удерживаться в экстракторе, и пористостью для хорошего массопереноса и дренажа. Переработанные в хлопья и пропаренные семена прессовали с использованием пресса для предварительного прессования Simon-Rosedown.
Сырое прессовое масло собирали в танк.
Пресса для предварительного прессования: винтовой пресс Simon-Rosedown 9,5 см диаметром, 94 см длиной. Использовали рабочую скорость вращения шнека 17 об./мин.
Экстракция растворителем и удаление растворителя
Экстракция растворителем представляет собой контактирование фильтр-прессного осадка с гексаном для извлечения масла из массы фильтрованного осадка. Использовали два механизма: выщелачивание масла в растворитель и промывание выжимки (гексан-твердые вещества) мисцеллой с постепенно понижающейся концентрацией (гексан-масло). Как правило, экстракция представляет собой непрерывный противоточный способ.
Фильтр-прессный осадок канолы контрольной HT экстрагировали изогексаном/гексаном при общей продолжительности обработки приблизительно 90 минут (закрытая система в форме стальной петли), с использованием отношения растворителя к твердому веществу приблизительно 2,5:1 (масс.:масс.) и температуры мисцеллы 52±5ºC.
(Скорость подачи фильтр-прессного осадка канолы составляла приблизительно 90 кг/час при времени удержания 90 минут, и скорость потока растворителя составляла 220±10 кг/час.)
Образец продукта белых хлопьев (WF) канолы удаляли перед удалением растворителя и сушили на воздухе.
Из сырого масла удаляли растворитель в выпарном аппарате с восходящей пленкой и отгонкой с паром.
Удаление растворителя из выжимки (гексан-твердые вещества) проводили в шнеке с паровой рубашкой Schnecken и устройстве для удаления растворителя - тостере с 2 противнями. Верхний противень DT орошали паром. Целевые температуры в противнях являлись следующими:
на выходе из шнека Schnecken: <60°C
в противне устройства для удаления растворителя: 102±3°C
в противне тостера: 102±3°C
Фильтр-прессный осадок канолы контрольной LT и партии LT ECM тестовой линии (CL44864) экстрагировали изогексаном/гексаном при общей продолжительности обработки приблизительно 110 минут (закрытая система в форме стальной петли), с использованием отношения растворителя к твердому веществу приблизительно 2,5:1 (масс.:масс.) и температуры мисцеллы 52±5°C (Скорость подачи фильтр-прессного осадка канолы составляла приблизительно 80 кг/час при времени удержания 110 минут, и скорость потока растворителя составляла 220±10 кг/час).
Образец белых хлопьев (WF) ECM тестовой линии удаляли перед удалением растворителя и сушили на воздухе.
Из сырого масла удаляли растворитель в выпарном аппарате с восходящей пленкой и отгонкой с паром.
Удаление растворителя из выжимки (гексан-твердые вещества) проводили в шнеке с паровой рубашкой Schnecken и устройстве для удаления растворителя - тостере с 2 противнями. Верхний противень DT орошали паром. Целевые температуры в противнях являлись следующими:
на выходе из шнека Schnecken: <60°C
в противне устройства для удаления растворителя: 93±2°C
в противне тостера: 93±2ºC
Экстрактор: все петлевые экстракторы из нержавеющей стали Crown Iron Works (типа II). Экстрагируемый слой составлял 20,3 см в ширину×12,7 см в глубину и 680 см в длину. Кроме того, установка включала удаление растворителя мисцеллы с использованием выпарного аппарата с восходящей пленкой и отгонку с паром, и удаление растворителя из выжимки (твердые вещества плюс растворитель) проводили с использованием шнека с паровой рубашкой Schnecken и устройства для удаления растворителя - тостера с 2 противнями. Регенерированный растворитель собирали и повторно использовали.
Вакуумная сушка
Вакуумную сушку проводили для сушки обезжиренной LT кормовой муки из канолы до влажности <12%.
Только партия обезжиренной кормовой муки из канолы, для которой необходима сушка, представляла собой партию контрольную LT. Приблизительно 225 кг обезжиренной кормовой муки загружали в сушилку-реактор Littleford. Затем кормовую муку нагревали до 75±2°C в вакууме 254-381 мм рт. ст. Отбор проб кормовой муки для анализа влажности начинали при ~60°C и проводили каждые 15 минут до тех пор, пока влажность не составляла <12%. Затем кормовую муку помещали в объемный мешок. Указанную выше процедуру повторяли до тех пор, пока вся кормовая мука не высыхала.
Вакуумная сушилка: реактор Littleford на 600 литров модель FKM600-D (2Z), серийный № 5132, Littleford Day, Florence, KY.
Измельчение с использованием молотковой мельницы
Для получения частиц однородного размера проводили измельчение с использованием молотковой мельницы.
Сухую кормовую муку измельчали на молотковой мельнице с использованием сита 8/64". Молотковую мельницу чистили пылесосом между каждой партией кормовой муки. Кормовую муку упаковывали в фибровый барабан и хранили при температуре окружающей среды до транспортировки.
Порядок, в котором кормовую муку из канолы измельчали на молотковой мельнице, являлся следующим:
1. Контрольная HT.
2. LT ECM тестовая линия (CL44864).
3. Контрольная LT.
Молотковая мельница: Prater Industries, модель G5HFSI, серийный №5075, Chicago, IL.
Пример 3: Способ получения белых хлопьев Индианаполис
Семена канолы по настоящему изобретению можно обрабатывать с получением белых хлопьев канолы способом, первоначально описанным в Bailey’s Industrial Oil & Fat Products (1996), 5th Ed., Chapter 2, Wiley Interscience Publication, New York, New York.
Для экстракции масла из семян канолы сначала семена канолы перерабатывали в хлопья машиной для измельчения кофе и подвергали тепловой обработке в печи до 85ºC±10°C в течение по меньшей мере 20 минут. После тепловой обработки измельченные семена прессовали с использованием пресса Taby Press Type-20A (Taby Skeppsta, Orebro, Sweden). Получаемый жмых от пресса Taby экстрагировали растворителем для удаления любого сохранившегося остаточного масла.
Затем жмых от этапа прессования масличных семян экстрагировали растворителем для удаления и сбора любого сохранившегося остаточного масла. Жмых помещают в чаши из нержавеющей стали, которые помещают в изготовленный по заказу экстрактор Soxhlet™ от LaSalle Glassware (Guelph, ON). В качестве растворителя для экстракции можно использовать гексан, и систему экстракции Soxhlet™ оставляют функционировать в течение 9-10 часов. Затем экстрагированный растворителем жмых извлекают из чаш и распределяют на противне с толщиной слоя менее одного дюйма. Перед измельчением экстрагированный растворителем жмых оставляют на воздухе для удаления растворителя в течение 24 часов. Затем белые хлопья с удаленным растворителем измельчают с использованием, например, Robot Coupe R2N Ultra B (Jackson, MS).
Пример 4: Анализ образцов
Химические анализы и анализы питательных веществ образцов ECM и общепринятой канолы можно различным образом проводить способами, как описано ниже. В образцах кормовой муки из канолы анализировали сухое вещество (способом 930.15, AOAC International. 2007. Official Methods. Of Analysis of AOAC Int. 18th ed. Rev. 2. W. Hortwitz and G.W. Latimer Jr., eds. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Gaithersburg. MD. (ниже в настоящем описании "AOAC Int., 2007")), золу (способом 942.05, AOAC Int.) и GE посредством калориметрической бомбы (модель 6300, Parr Instruments, Moline, IL). AOAC International (2007) Official Methods of Analysis of AOAC Int., 18th ed. Rev. 2., Hortwitz and Latimer, eds. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Gaithersburg. MD. Гидролизованный кислотой простой эфир (AEE) определяли кислотным гидролизом с использованием 3н. HCl (Sanderson) с последующей экстракцией сырого жира петролейным эфиром (способ 954.02, AOAC Int.) на автоматическом анализаторе Soxtec 2050 (FOSS North America, Eden Prairie, MN). Sanderson (1986), "A new method of analysis of feeding stuffs for the determination of crude oils and fats", стр. 77-81 в Recent Advances in Animal Nutrition, Haresign and Cole, eds. Butterworths, London, U.K. Содержание сырого белка измеряли путем сжигания (способ 990.03, AOAC Int.) на анализаторе белка/азота Elementar Rapid N-cube (Elementar Americas Inc., Mt. Laurel, NJ), аминокислоты способом 982.30 E (A, B и C) [AOAC Int.], сырую клетчатку способом 978,10 (AOAC Int.), ADF и лигнин способом 973.18 (AOAC Int.) и NDF согласно Holst (Holst D.O., 1973. Holst filtration apparatus for Van Soest detergent fiber analysis. J. AOAC. 56:1352-1356). Состав сахаров (глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу, мальтозу) согласно Churms (Churms, 1982, Churms, 1982, Carbohydrates in Handbook of Chromatography. Zweig and Sherma, eds. CRC Press, Boca Raton, FL) и Kakehi and Honda (1989, Silyl ethers of carbohydrates. Стр. 43-85 в Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. C.J. Biermann and G.D. McGinnis, eds. CRC Press, Boca Raton, FL). Олигосахариды (рафинозу, стахиозу, вербаскозу) анализировали по Churms, минералы (Ca, P, Fe, Mg, Mn, Cu, Na, K, S, Mo, Zn, Se, Co, Cr) оптической эмиссионной спектроскопией с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES) [способ 985.01 (A, B и C), AOAC Int.] и фитат согласно Ellis et al. (1977, Quantitative determination of phytate in the presence of high inorganic phosphate. Anal. Biochem. 77:536-539).
Пример 5: Базовые аналитические результаты образцов ECM белых хлопьев Индианаполис и общепринятой кормовой муки из канолы
Состав питательных веществ получаемой поджаренной ECM опытного растения и общепринятой кормовой муки из канолы. Несколько линий ECM обрабатывали (44864, 121460, 121466 и 65620) в лаборатории Dow AgroSciences в Индианаполисе способом, аналогичным обработке коммерческой кормовой муки из канолы, но без заключительного этапа удаления растворителя/поджаривания после экстракции растворителем масла из семян. Этот способ и получаемые образцы обозначают как "белые хлопья Индианаполис". Параметры обработки приведены в примере 3. Эти образцы белых хлопьев Индианаполис ECM тестировали в университетах Иллинойса и Миссури, и результаты продемонстрированы в таблицах 2a, 2b и 2c. Контроль кормовой муки из канолы представляет собой получаемую коммерческим путем кормовую муку из канолы, которую поджаривали. Значения выражают в пересчете на сухое вещество, но включая масло.
| Таблица 2а Состав питательных веществ образцов кормовой муки из канолы белых хлопьев ECM Индианаполис в сравнении с общепринятой кормовой мукой из канолы |
||||||||
| Компонент, % DM, включая масло | 44864 (2010) | 44864 (2011) | 121460 (2011) | 121466 (2011) | 65620 (2011) | Общепринятая кормовая мука из канолы | Средн. значение ECM | ECM – кормовая мука из канолы |
| Сырой белок | 49,4 | 49,4 | 50,3 | 50,1 | 49,5 | 43,0 | 49,7 | 6,7 |
| Жир | 3,1 | 2,6 | 3,2 | 3,4 | 3,1 | 4,3 | 3,1 | -1,2 |
| Зола | 8,4 | 8,3 | 7,7 | 8,3 | 7,8 | 7,4 | 8,1 | 0,7 |
| Простые сахара | 4,3 | 0,5 | 0,6 | 0,6 | 1,1 | 0 | 1,4 | 1,4 |
| Сахароза | 4,6 | 8,3 | 7,6 | 5,9 | 7,7 | 8,1 | 6,8 | -1,3 |
| Олигосахариды | 0,5 | 3,0 | 4,0 | 3,4 | 2,8 | 2,8 | 2,7 | -0,1 |
| Крахмал | 0,1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NDF | 20,7 | 19,5 | 20,3 | 21,2 | 20,0 | 33,0 | 20,3 | -12,7 |
| ADF | 15,3 | 14,6 | 15,6 | 16,4 | 14,6 | 19,0 | 15,3 | -3,7 |
| Лигнин и полифенолы | 4,5 | 4,1 | 5,2 | 6,2 | 4,2 | 7,2 | 4,9 | -2,3 |
Аналитические результаты образцов белых хлопьев Индианаполис ECM из университетов Иллинойса и Миссури являлись аналогичными результатам целых семян из университета Манитобы. Олигосахариды являлись ниже, и простые сахара являлись выше в образце 44864 (2010) по сравнению с другими образцами ECM, включая 44864, выросший в 2011 году. Вероятно, что для образца 2010 года, растущее растение катаболизировало некоторые сахарозы и олигосахариды до простых сахаров ближе к дате уборки урожая.
При использовании протокола белых хлопьев Индианаполис более высокое содержание белка, более низкое содержание ADF и более низкое содержание лигнина и полифенолов, которые наблюдают в линиях ECM по сравнению с кормовой мукой из общепринятой канолы, являются аналогичными результатам, наблюдаемым для целых семян. Значение NDF 33% для коммерческой кормовой муки находится на верхней границе характерного диапазона.
| Таблица 2b Состав аминокислот (% от сырого белка) образцов белых хлопьев ECM Индианаполис по сравнению с общепринятой кормовой мукой из канолы |
||||||||
| Компонент, % DM, включая масло, % от сырого белка | 44864 (2010) | 44864 (2011) | 121460 (2011) | 121466 (2011) | 65620 (2011) | Общепринятая кормовая мука из канолы | Средн. значение ECM | ECM – кормовая мука из канолы |
| Сырой белок | 49,4 | 49,4 | 50,3 | 50,1 | 49,5 | 43,0 | 49,7 | 6,7 |
| Незаменимые амино-кислоты | ||||||||
| Аргинин | 5,63 | 5,67 | 6,04 | 5,95 | 6,02 | 5,78 | 5,86 | 0,08 |
| Гистидин | 2,53 | 2,60 | 2,55 | 2,52 | 2,64 | 2,68 | 2,57 | -0,11 |
| Изолейцин | 3,56 | 3,81 | 3,83 | 3,70 | 3,77 | 4,15 | 3,73 | -0,42 |
| Лейцин | 6,50 | 6,50 | 6,91 | 6,76 | 6,84 | 7,01 | 6,70 | -0,31 |
| Лизин | 5,49 | 5,69 | 5,54 | 5,37 | 5,90 | 5,37 | 5,60 | 0,23* |
| Метионин | 1,80 | 1,87 | 1,89 | 1,81 | 1,94 | 1,99 | 1,86 | -0,13* |
| Фенилаланин | 3,76 | 3,68 | 3,93 | 3,87 | 3,91 | 3,98 | 3,83 | -0,15 |
| Треонин | 3,82 | 3,82 | 4,17 | 4,01 | 4,20 | 4,12 | 4,01 | -0,11* |
| Триптофан | 1,27 | 1,23 | 1,29 | 1,35 | 1,19 | 1,23 | 1,27 | 0,04* |
| Валин | 4,66 | 4,78 | 4,87 | 4,71 | 4,80 | 5,21 | 4,76 | -0,45 |
| Заменимые амино-кислоты | ||||||||
| Аланин | 4,07 | 3,98 | 4,16 | 4,05 | 4,25 | 4,32 | 4,10 | -0,22 |
| Аспарагиновая кислота | 6,77 | 6,24 | 7,35 | 7,06 | 6,82 | 6,87 | 6,85 | -0,02 |
| Цистин | 2,35 | 2,47 | 2,26 | 2,20 | 2,53 | 2,30 | 2,36 | 0,06 |
| Глутамино-вая кислота | 16,57 | 17,19 | 16,92 | 16,54 | 17,54 | 16,84 | 16,95 | 0,11 |
| Глицин | 4,50 | 4,63 | 4,85 | 4,76 | 4,89 | 4,98 | 4,73 | -0,25 |
| Пролин | 5,41 | 5,80 | 5,92 | 5,78 | 5,98 | 6,20 | 5,78 | -0,42 |
| Серин | 3,76 | 3,57 | 3,75 | 3,65 | 4,04 | 3,54 | 3,75 | 0,21 |
| Тирозин | 2,66 | 2,47 | 2,73 | 2,70 | 2,77 | 2,83 | 2,67 | -0,16 |
| * Рассматривают как основные ограничивающие незаменимые аминокислоты в кормах для домашней птицы и свиней |
Как в случае с целыми семенами, результаты в таблице 2b демонстрируют, что состав аминокислот (в виде процентов от сырого белка) является аналогичным образцам белых хлопьев Индианаполис ECM и коммерческой кормовой муки из канолы. Это указывает на то, что вследствие увеличения содержания белка в линиях ECM содержание важных аминокислот увеличивается пропорционально.
| Таблица 2c Минеральный состав образцов белых хлопьев ECM Индианаполис по сравнению с общепринятой кормовой мукой из канолы |
||||||||
| Компонент, в пересчете на DM, включая масло | 44864 (2010) | 44864 (2011) | 121460 (2011) | 121466 (2011) | 65620 (2011) | Общепринятая кормовая мука из канолы | Средн. значе-ние ECM | ECM – кормо-вая мука из канолы |
| Кальций, % | 0,83 | 0,84 | 0,75 | 0,74 | 0,76 | 0,80 | 0,78 | -0,02 |
| Фосфор, % | 1,50 | 1,49 | 1,39 | 1,50 | 1,42 | 1,14 | 1,46 | 0,32 |
| Фитиновая кислота, % | 4,25 | 4,16 | 4,05 | 4,52 | 3,81 | 2,96 | 4,16 | 1,20 |
| Натрий, % | 0,001 | 0,003 | 0,003 | 0,002 | 0,002 | 0,13 | 0,002 | -0,13 |
| Калий, % | 1,65 | 1,67 | 1,36 | 1,43 | 1,45 | 1,32 | 1,51 | 0,19 |
| Сера, % | - | 0,97 | 0,87 | 0,85 | 0,87 | 0,83 | 0,89 | 0,06 |
| Магний, % | 0,67 | 0,69 | 0,64 | 0,62 | 0,68 | 0,62 | 0,66 | 0,04 |
| Железо, мг/кг | 94 | 124 | 93 | 88 | 98 | 150 | 99 | -51 |
| Марганец, мг/кг | 56 | 83 | 98 | 85 | 77 | 64 | 80 | 16 |
| Кобальт, мг/кг | 0,3 | 0,1 | 0,1 | 2,7 | 3,2 | 1,3 | 1,3 | 0 |
| Медь, мг/кг | 9 | 5 | 5 | 6 | 5 | 6 | 6 | 0 |
| Селен, мг/кг | 0,09 | 0,65 | 0,43 | 0,44 | 0,87 | 0,23 | 0,50 | 0,27 |
| Цинк, мг/кг | 60 | 52 | 58 | 61 | 59 | 59 | 58 | -1 |
Содержание минеральных веществ в образцах белых хлопьев Индианаполис ECM является аналогичным общепринятой кормовой муке из канолы при наличии двух исключений: фосфора и натрия. Как и в случае результатов университета Манитобы, в отношении целых семян предполагают, что содержание фосфора в линиях ECM является сопоставимо выше по сравнению с общепринятой кормовой мукой из канолы. Повышенное содержание натрия в общепринятой кормовой муке из канолы не вызывает сомнения вследствие добавления натрия при общепринятой обработке канолы.
Пример 6: Обработка ECM в POS Pilot Plant в Саскатуне, Канада для моделирования коммерческой обработки.
При получении оценки корма для животных ECM определяли, существуют ли эффекты обработки в отношении пищевой ценности при получении образцов кормовой мука из канолы в условиях способа коммерческой обработки. Таким образом, образцы обрабатывали в POS Pilot Plant в Саскатуне. Для подтверждения, что условия обработки не оказывают важного влияния на пищевую ценность, использовали два условия обработки: постоянную температуру (HT) в устройстве для удаления растворителя/тостере и более низкую температуру (LT). Условия обработки, используемые в POS, приведены в примере 2.
| Таблица 3 Состав питательных веществ в ECM и общепринятой кормовой муке из канолы, получаемой в условиях моделирования коммерческого способа обработки в POS Pilot Plant в Саскатуне, Канада (Анализы проводили в университетах Иллинойса и Миссури) |
|||
| Компонент, % как есть | 44864 (2010) LT |
Кормовая мука из канолы | Кормовая мука из канолы HT |
| Сухое вещество | 90,2 | 90,3 | 88,4 |
| Сырой белок | 44,7 | 37,0 | 36,0 |
| Жир | 3,3 | 3,3 | 3,6 |
| Зола | 7,9 | 6,7 | 6,5 |
| Сахара и сахароза | 6,9 | 7,1 | 6,7 |
| Олигосахариды | 0,45 | 1,57 | 1,55 |
| NDF | 20,8 | 27,0 | 28,1 |
| ADF | 13,8 | 19,2 | 19,0 |
| Лигнин и полифенолы | 4,2 | 8,2 | 8,2 |
| Фосфор | 1,43 | 1,11 | 1,06 |
| Лизин | 2,41 | 2,10 | 2,01 |
| Метионин | 0,83 | 0,72 | 0,69 |
| Треонин | 1,69 | 1,47 | 1,42 |
| Триптофан | 0,61 | 0,47 | 0,45 |
Для обработанной опытным способом кормовой муки продемонстрирован состав, аналогичный целым семенам и образцам белых хлопьев Индианаполис, и различия образца ECM и общепринятой канолы соответствуют анализу, описанному в таблице 2a и 2b: на 7% выше содержание белка, на 5% ниже содержание ADF, на 4% ниже содержание лигнина и полифенолов и на 0,35% выше содержание фосфора.
Пример 7: Полный анализ необработанных ECM и семян общепринятой канолы
Состав питательных веществ необработанных семян канолы. В университете Манитобы анализировали пять образцов целых семян линий ECM из урожая 2010 года и 2011 года. Их сравнивали с официальным образцом семян композита Канадской комиссии по зерну (CGC) для урожая 2011 года, который по определению представляет собой среднее качество существующих в настоящее время коммерческих сортов канолы, который выращивали в западной Канаде в течение этого сезона. Результаты по составу питательных веществ выражены в пересчете на не содержащее масло сухое вещество и представлены в таблице 4a и 4b.
| Таблица 4a Состав питательных веществ образцов семян EMC в сравнении с семенами общепринятой канолы |
||||||||
| Компонент, % DM, не содержащий масло | 44864 (2010) | 44864 (2011) | 121460 (2011) | 121466 (2011) | 65620 (2011) | Композит CGC (2011) | Среднее ECM | ECM – компо-зит CGC |
| Сырой белок | 52,2 | 51,5 | 50,3 | 51,4 | 50,2 | 43,9 | 51,1 | 7,2 |
| Зола | 9,1 | 9,2 | 8,2 | 8,3 | 7,8 | 7,8 | 8,5 | 0,7 |
| Простые сахара | 1,8 | 0,4 | 0,1 | 0,1 | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,0 |
| Сахароза | 5,7 | 6,4 | 5,8 | 5,2 | 6,5 | 7,1 | 5,9 | -1,2 |
| Олигосахариды | 0,6 | 3,3 | 3,1 | 3,3 | 3,6 | 3,5 | 2,8 | -0,7 |
| Крахмал | 0,2 | 0,3 | 0,2 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,0 |
| NDF | 23,1 | 20,7 | 21,9 | 23,1 | 20,7 | 27,2 | 21,9 | -5,3 |
| ADF | 15,4 | 14,2 | 15,8 | 17,8 | 13,7 | 21,0 | 15,4 | -5,6 |
| Общее содержание клетчатки | 30,9 | 28,6 | 30,1 | 29,6 | 29,4 | 32,5 | 29,7 | -2,8 |
| NSP | 21,7 | 21,0 | 21,3 | 19,2 | 22,1 | 21,6 | 21,1 | -0,5 |
| Лигнин и полифенолы | 4,7 | 4,1 | 5,0 | 6,4 | 3,7 | 6,8 | 4,8 | -2,0 |
| Гликопротеин | 4,4 | 3,5 | 3,8 | 3,9 | 3,6 | 4,2 | 3,9 | -0,3 |
| Целлюлоза | 6,8 | 4,8 | 5,8 | 4,8 | 5,6 | 6,2 | 5,6 | -0,6 |
| Остаток ADF (ADF - лигнин-целлюлоза) | 3,8 | 5,3 | 5,1 | 6,6 | 4,4 | 8,0 | 5,0 | -3,0 |
| Гемицеллюлоза (NDF-ADF) | 7,7 | 6,5 | 6,2 | 5,3 | 7,0 | 6,2 | 6,5 | 0,4 |
| Пищевая клетчатка (NSP+ лигнин) | 26,5 | 25,0 | 26,3 | 25,6 | 25,9 | 28,4 | 25,8 | -2,5 |
| Фосфор | 1,6 | 1,4 | 1,4 | 1,5 | 1,3 | 1,1 | 1,4 | 0,3 |
| Фитатный фосфор | 0,8 | 0,7 | 0,8 | 0,8 | 0,6 | 0,6 | 0,7 | 0,1 |
| Нефитатный фосфор | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,8 | 0,7 | 0,5 | 0,7 | 0,2 |
| Сырой белок, 3% масла, 88% DM | 37,4 | 43,5 | 6,1 |
Результаты демонстрируют, что наибольшее различие между ECM и общепринятой канолой представляет собой более высокое содержание белка. Содержание белка в ECM на 7,2% больше (51,1% в сравнении с 43,9%) в пересчета на не содержащее масло сухое вещество, и содержание 3% масла и 88% сухого вещества (характерный основой признак коммерческой кормовой муки из канолы) на 6,1% выше (43,5% в сравнении с 37,4%). См. таблицу 4a, 4b. Предполагают, что более высокое содержание белка обусловлено на 2% более низким содержанием лигнина и полифенолов в ECM и на 3% более низким содержанием остатка ADF (ADF-лигнин/полифенолы-целлюлозы). Остаток ADF, вероятно, представляет собой комбинацию компонентов гликопротеина и гемицеллюлозы. Компоненты клетчатки встречаются в основном в клеточных стенках и шелухе. Содержание фосфора ECM почти на 30% выше, чем в общепринятой каноле, и оно оказывается равномерно распределенным между фитатной и нефитатной формами. Фосфор представляет собой ценное питательное вещество в кормах для животных, и даже несмотря на связанный с фитатом фосфор не переваривается хорошо у домашней птицы и свиней, широкое применение в кормах для животных фермента фитазы делает этот фосфор доступным для животного. В таблице 4b представлено аналогичное сравнение состава аминокислот в образцах целых семян.
Таблица 4b. Состав аминокислот (% от сырого белка) образцов ЕСМ семян в сравнении с семенами общепринятой канолы.
| Аспарагиновая кислота | 6,71 | 6,58 | 7,51 | 7,39 | 6,88 | 7,12 | 7,01 | -0,10 |
| Цистин | 2,21 | 2,42 | 2,16 | 2,14 | 2,33 | 2,16 | 2,25 | 0,09 |
| Глутаминовая кислота | 16,09 | 18,23 | 18,02 | 17,84 | 17,73 | 17,64 | 17,58 | -0,06 |
| Глицин | 4,29 | 4,72 | 4,97 | 4,90 | 4,79 | 4,93 | 4,74 | -0,19 |
| Пролин | 6,01 | 6,40 | 6,39 | 6,28 | 6,34 | 6,26 | 6,28 | 0,03 |
| Серин | 4,06 | 4,30 | 4,52 | 4,39 | 4,51 | 4,57 | 4,36 | -0,21 |
| Тирозин | 2,23 | 2,35 | 2,56 | 2,59 | 2,50 | 2,60 | 2,45 | -0,15 |
| * Рассматривают как основные ограничивающие незаменимые аминокислоты в кормах для домашней птицы и свиней |
Результаты в таблице 4b демонстрируют, что состав аминокислот (в виде процента от сырого белка) является аналогичным у ECM и коммерческой кормовой муки из канолы. Это свидетельствует о том, что вследствие того, что содержание белка увеличивается в линиях ECM, таким образом, содержатся важные аминокислоты.
Пример 8: TME и перевариваемость аминокислот у домашней птицы
Анализы истинной обменной энергии (TME) и истинной доступной аминокислоты (TAAA) были разработаны в 1976 году и 1981 году соответственно Dr. Ian Sibbald из министерства сельского хозяйства Канады в Оттаве. В следствие прямого или опосредованного характера анализов анализы стали предпочтительными способами определения доступности энергии и аминокислот в ингредиентах корма для домашней птицы в большинстве стран мира, включая США.
В качестве предпочтительных экспериментальных животных использовали взрослых петушков белого леггорна с листовидным гребнем (SCWL) в отдельных исследованиях, проводимых в университете Иллинойса и университете Джорджии. Хорошо известно, что птицы обладают коротким временем очищения кишечника. Удаляя корм на период в течение 24 часов, достоверно предполагают, что желудочно-кишечный тракт тестируемых индивидуумов освобождается от остатков ранее потребляемой пищи.
Каждую птицу (как правило, 8 индивидуумов на обработку) кормили точно 35 граммами тестируемого корма, помещаемым прямо в зоб посредством интубации. Как правило, скармливали 25 грамм ингредиентов с высоким содержанием клетчатки вместо 35 грамм при аналогичном пространственном объеме. После интубации птицам обеспечивают доступ к воде, но не к дополнительному корму, в течение 40 часов, в течение которых собирают и количественно определяют экскреты. После сбора экскреты сушат в печи с принудительной подачей воздуха, как правило, при 80ºC. Затем их взвешивают и измельчают для определения общей обменной энергии (GE) в анализах TME или для определения содержания аминокислот. GE и состав аминокислот ингредиентов определяют одновременно. После взвешивания образцы экскретов, как правило, объединяют и гомогенизируют для одного определения GE или аминокислот. Масса экскретов на птицу варьирует в большей степени, чем GE или состав аминокислот конкретных экскретов. Это наблюдение, а также затраты и задержка по времени определения GE и аминокислот оправдывают объединение.
Перевариваемость рассчитывают хорошо известными в данной области способами для энергии или для каждой отдельной аминокислоты. Оценки эндогенной потери GE и аминокислот используют для корректировки экспериментальных артефактов.
Пример 9: Перевариваемая энергия (DE), обменная энергия (ME) у свиней
DE и ME. В исследование с рандомизированным полноблочным планом в университете Иллинойса распределяли сорок восемь растущих боровов (начальной массы BW: 20 кг). Свиньям назначают 1 из 6 рационов, с 8 свиньями на рацион. Свиней помещают в метаболические клетки, которые оборудованы кормушкой и сосковой поилкой, полностью сетчатыми полами, решетчатым полом и поддонами для мочи. Это обеспечивает общий, но отдельный сбор веществ мочи и фекалий от каждой свиньи.
Количество корма, предоставляемого ежесуточно на свинью, рассчитывают как 3-х разовый теоретически рассчитанное необходимое для поддержания энергии (т.е. 106 ккал ME на кг0,75, NRC, 1998) для самой маленькой свиньи в каждом повторении и разделенный на 2 равных приема пищи. Nutrient requirements of swine, Tenth Revised Edition. National Academy Press. Washington, DC. Вода доступна все время. Эксперимент длится 14 суток. Первые 5 суток расценивают как период адаптации к рациону, где вещества мочи и фекалий собирают в течение последующих 5 суток стандартными способами с использованием подхода от маркера к маркеру (Adeola O., 2001, Digestion and balance techniques in pigs, стр. 903-916 в Swine Nutrition. 2nd ed. A.J. Lewis and L.L. Southern, ed. CRC Press, New York, NY. NRC. 1998. Nutrient Requirements of Swine. 10th rev. ed. Natl. Acad. Press, Washington DC.). Образцы мочи собирают в чаши для мочи с избытком консерванта 50 мл соляной кислоты. Образцы фекалий и 10% собираемой мочи хранят при -20°C сразу же после сбора. В завершении эксперимента образцы мочи размораживают и смешивают от одного животного и одного рациона, и отбирают часть образца для химического анализа.
Образцы фекалий сушат в печи с принудительной подачей воздуха и мелко размельчают перед анализом. Образцы фекалий, мочи и корма анализируют в двух повторениях для DM и общей обменной энергии с использованием калориметрической бомбы (Parr Instruments, Moline, IL). После химического анализа рассчитывают суммарные значения перевариваемости энергии кормов в пищеварительном тракте в каждом рационе способами, описанными выше (Widmer M.R., L.M. McGinnis and H.H. Stein, 2007, Energy, phosphorus, and amino acid digestibility of high-protein distillers dried grains and com germ fed to growing pigs. J. Anim. Sci., 85:2994-3003). Рассчитывают количество потери энергии в кале и моче соответственно и рассчитывают величины DE и ME в каждом из 24 рационов (Widmer et al., 2007). DE и ME кукурузы рассчитывают делением значений DE и ME для рациона на основе кукурузы посредством процента ввода кукурузы в этот рацион. Эти значения затем используют для расчета вклада кукурузы в DE и ME в рационах на основе кормовой муки из кукурузы и канолы и в рационах на основе кормовой муки из кукурузы и сои, а затем рассчитывают DE и ME в каждом источнике образца кормовой муки из канолы и в кормовая мука из сои посредством вычитания, как описано ранее (Widmer et al., 2007).
Данные анализируют способом Proc Mixed в SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Получаемые от каждого рациона данные и для каждого ингредиента сравнивают с использованием ANOVA. Однородность колебаний вариаций подтверждают способом UNIVARIATE в Proc Mixed. Рацион или ингредиент являются фиксированным эффектом, и свинья и повторение являются случайными эффектами. Рассчитывают средние значения способом наименьших квадратов с использованием теста LSD и разделяют средние значения с использованием протокола PDIFF в Proc Mixed. Свинья представляет собой статистическую единицу для всех расчетов, и для оценки значимости средних используют альфа-уровень 0,05.
Пример 10: Перевариваемость аминокислот (AID и SID) у свиней
AID и SID у свиней анализировали в исследовании в университете Иллинойса. Двенадцати растущим боровам (начальной массы BW: 34,0±1,41 кг) вводили T-образную канюлю около дистальной подвздошной кишки и распределяли в повторяющемся опыте по схеме латинского квадрата 6×6 с 6 видами рациона и 6 периодами времени в каждом квадрате. Свиней содержали индивидуально в загонах 1,2×1,5 м в помещении с регулируемыми характеристиками окружающей среды. Загоны имели твердые боковые стенки, полностью сеточные полы в каждый из загонов устанавливали кормушку и сосковую поилку.
Составляли шесть видов рациона. Пять рационов основаны на кукурузном крахмале, сахаре и SBM или кормовой муки из канолы, и SBM или кормовая мука из канолы являлись единственными источниками аминокислот в этих рационах. Последний рацион представлял собой не содержащий N рацион, который использовали для оценки фонового уровня эндогенных потерь в подвздошной кишке CP и аминокислот. Во все рационы вводили витамины и минеральные вещества, чтобы советовать или превосходить существующие в настоящее время требования для растущих свиней (NRC, 1998). Все рационы также содержали 0,4% оксид хрома в качестве неперевариваемого маркера.
В начале и конце каждого периода регистрировали массы свиней, а также регистрировали количество даваемого каждые сутки корма. Всех свиней кормили на уровне 2,5 раза для суточного поддержания энергетической потребности, и вода являлась доступной все время на всем протяжении эксперимента. Первые 5 суток каждого периода расценивали как период адаптации к рациону. Образцы перевариваемого содержимого подвздошной кишки собирали в течение 8 часов на сутки 6 и 7 стандартным способом. К телу канюли прикрепляли пластиковый мешок с использованием соединительного кабеля, и собирали перевариваемое содержимое, стекающее в мешок. Мешки удаляли, когда они наполнялись перевариваемым содержимым, или по меньшей мере каждые 30 мин, и сразу же замораживали при -20°C для предотвращения бактериального разложения аминокислоты в перевариваемом содержимом. По окончанию одного экспериментального периода животных лишали корма в течение ночи и следующего утра и предоставляли новый экспериментальный рацион.
В завершении эксперимента образцы подвздошной кишки размораживали, объединяли от одного животного и рациона, и отбирали часть образца для химического анализа. Также собирали образец каждого рациона и каждый из образцов кормовой муки из канолы и SBM. Перед химическим анализом образцы перевариваемого содержимого лиофилизировали и мелко измельчали. Все образцы рационов и перевариваемого содержимого анализировали в отношении DM, хрома, сырого белка и аминокислот и анализировали кормовую муку из канолы и SBM в отношении сырого белка и аминокислот.
Значения кажущейся перевариваемости в подвздошной кишке (AID) аминокислот в каждом рационе рассчитывали с использованием уравнения [1]:
AID, (%) = [1-(AAd/AAf)×(Crf/Crd)]×100, [1]
где AID представляет собой значение кажущейся перевариваемости в подвздошной кишке аминокислот (%), AAd представляет собой концентрацию этой аминокислоты в DM перевариваемого содержимого подвздошной кишки, AAf представляет собой концентрацию этой аминокислоты в DM корма, Crf представляет собой концентрацию хрома в DM корма, и Crd представляет собой концентрацию хрома в DM перевариваемого содержимого подвздошной кишки. AID для CP также рассчитывают с использованием этого уравнения.
Базовый эндогенный приток в дистальную подвздошную кишку каждой аминокислоты определяли на основании притока, получаемого после кормления не содержащим N рационом, с использованием уравнения [2]:
IAAend = AAd×(Crf/Crd) [2]
где IAAend представляет собой базовую эндогенную потерю аминокислоты (мг на кг DMI). Базовую эндогенную потерю CP определяют с использованием того же самого уравнения.
Корректируя AID для IAAend каждой аминокислоты, рассчитывали стандартизированные значения перевариваемости аминокислоты в подвздошной кишке с использованием уравнения [3]:
SID, (%) = AID+[(IAAend/AAf)×100] [3]
где SID представляет собой стандартизированное значение перевариваемости аминокислоты в подвздошной кишке (%).
Данные анализировали способом Proc GLM от SAS (SAS inst. Inc., Cary, NC). 5 рационов, содержащих кормовую муку из канолы или SBM, сравнивали с использованием ANOVA с источником кормовой муки из канолы, свиньями и периодом времени в качестве основных эффектов. Для выделения средних использовали тест LSD. Для оценки значимости средних использовали альфа-уровень 0,05. Отдельная свинья представляла собой статистическую единицу для всех анализов.
Пример 11: Расщепляемость аминокислот у молочных животных
Расщепляемость аминокислот ECM оценивают инкубацией in situ образцов кормовой муки ECM у животных с введенной в рубец канюлей, таких как молочный крупный рогатый скот, для оценки содержаний растворимого и расщепляемого белка и определения скорости расщепления (Kd) расщепляемой фракции.
Крупный рогатый скот содержат на смешанном рационе таком, как однородная смесь компонентов рациона (TMR), содержащая 28,1% силоса из кукурузы, 13,0% силоса из люцерны, 7,4% люцернового сена, 20,4% измельченной кукурузы, 14,8% сырой пивной дробины, 5,6% целых семян хлопчатника, 3,7% соевой шелухи и 7,0% добавок (белка, минеральных веществ, витаминов). Стандартные полиэфирные мешки in situ (R510, 5 см ×10 см, размер пор 50 микрометров), содержащие приблизительно 6 г сухого вещества (DM) соевой кормовой муки (SBM), общепринятой кормовой муки из канолы (CM) или улучшенной кормовой муки из канолы (ECM), инкубируют в рубце в течение 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48 и 64 часов. Второй экземпляр мешка извлекают в каждый момент времени и промывают в водопроводной воде до тех пор, пока вытекающая жидкость не станет чистой. Мешки сушат при 55ºC в течение 3 суток, а затем извлекают остаток и взвешивают для определения потери сухого вещества (DM). Остатки анализируют на содержание N способом сжигания LECO. Образцы момента времени ноль не инкубируют в рубце, но промывают и обрабатывают аналогичным образом как инкубируемые в рубце образцы.
Образцы остатка момента времени ноль и остатка, сохраняющегося после 16 часов инкубации в рубце, анализируют на проксимальные компоненты (DM, сырой жир, сырую клетчатку и золу) и состав аминокислот (AA) (без триптофан). Эти параметры можно использовать для получения оценочных показателей расщепляемого в рубце белка (RDP) и нерасщепляемого в рубце белка (RUP), как используют в руководстве требований к питательным веществам молочного крупного рогатого скота National Research Council (2001).
Можно рассчитывать процент N исходного образца, остающегося в каждый момент времени, и усреднять значения повторных измерений каждого момента времени для коровы. Значения от трех коров подбирают для нелинейного уравнения, описанного Orskov и McDonald (1979). В этом подходе предполагают, что потеря CP в рубце происходит согласно кинетике первого порядка, как определено уравнением, потеря CP=A+B×(1-e-Kd×1), где A представляет собой растворимую фракцию CP (% от CP), B представляет собой потенциально расщепляемую фракцию CP (% от CP), Kd представляет собой константу скорости расщепления (h-1), и t представляет собой время инкубации (h) в рубце. Фракцию C (нерасщепляемая в рубце) рассчитывают как фракция A минус фракция B. Уравнения подбирают с использованием PROC NLIN от SAS (версия 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC) способом расчета Марквардт.
Уравнения для вычисления значений RDP и RUP (в виде процента от CP) представляют собой: RDP = A+B[Kd/(Kd+Kp)] и RUP = B[Kp/(Kd+Kp)]+C, где Kp представляет собой скорость прохождения через рубец. Вследствие того, что невозможно рассчитать скорость прохождения непосредственно на основании этих данных (где субстраты содержатся в рубце и защищены от прохождения в нижележащий тракт), скорость Kp следует использовать как предполагаемое значение. В этом исследовании для Kp используют значение 0,07, которое является аналогичным значению, рассчитываемому по уравнениям NRC (2001) для высокопродуктивой молочной коровы, потребляющей характерный рацион в период лактации. Вследствие того, что этого проекта является сравнение источников белка и оценочных показателей расщепляемости в рубце в тех же условиях, выбор скорости прохождения для определения RDP и RUP является произвольным.
Конечное уравнение для каждого образца получают с использованием образцов, инкубируемых в течение 0, 2, 4, 8, 16, 24 и 48 часов согласно рекомендациям NRC (2001). Данные дополнительных моменты времени инкубации в этом исследовании study (т.е. 12, 20, 32, 40 и 64 часов) можно использовать для верификации кинетики системы и для подтверждения того, что модифицированная кормовая мука из канолы соответствует допущениям в описаниях NRC (2001).
Пример 12: TME и TAAA у домашней птицы, включая сравнение действительного TME с теоретически рассчитанным TME на основании аналитических результатов из университетов Иллинойса, Миссури и Манитобы.
Определения истинной обменной энергии (TME) у домашней птицы в образцах ECM проводили в университете Иллинойса и Джорджии. Протоколы описаны в примере 8.
| Таблица 5 Содержание TME ECM и общепринятой кормовой муки из канолы в исследованиях университете Иллинойса и университета Джорджии |
||
| Образец | TME, ккал/кг DM университет Иллинойса | TME, ккал/кг DM университет Джорджии |
| Образцы, получаемые от POS Pilot Plant | n=10 | n=6 |
| 44864 (2010) ECM низкая температура (LT) | 2524 a* (60)** | 2200 a (27) |
| Кормовая мука из канолы низкая температуры (LT) | 2320 b (59) | 1933 b (95) |
| Кормовая мука из канолы высокая температура (HT) | 2373 a, b (65) | 2048 a, b (99) |
| ECM LT - кормовая мука из канолы LT | 204 (9%)*** | 267 (14%) |
| Белые хлопья (WF) ECM | 2199 a (91) | |
| Кормовая мука из канолы белые хлопья (WF) | 1899 b (51) | |
| ECM WF - Кормовая мука из канолы WF | 300 (16%) | |
| Образцы белые хлопья Индианаполис | n=5 | n=6 |
| 44864 (2011) | 2460 f, g (85) | 2143 (46) |
| 121460 | 2353 g (97) | 2318 (81) |
| 121466 | 2635 f (92) | 2221(99) |
| 65620 | 2611 f (99) | 2130 (44) |
| Соевая кормовая мука | 2913 (52) | 2790 (32) |
| * средние значения в колонке и группе с различными буквами являются достоверно отличными (p<0,05) ** (SE) *** (различие в процентах) |
В случае получаемых в POS образцов ECM и кормовой муки из канолы соответствующее сравнение проводят между двумя видами кормовой муки LT для устранения эффектов обработки. Результаты являлись сравнимыми в исследованиях университета Иллинойса и университета Джорджии. TME у домашней птицы является значительно выше для ECM (LT) по сравнению с общепринятой кормовой мукой из канолы (LT) - на 9% выше в исследовании университета Иллинойса и на 14% выше в исследовании университета Джорджии. Эти результаты подтверждают результаты уравнения прогноза ниже. Таблица 4.
Образцы белых хлопьев ECM и общепринятой кормовой муки из канолы также получали от POS непосредственно после стадии экстракции растворителем и перед стадией DT. TME у домашней птицы для этих видов кормовой муки WF сравнивали в отдельном исследовании в университете Джорджия и, также как и образцы LT, ECM WF обладала значительно более высокой TME по сравнению с общепринятой кормовой мукой из канолы WF. Таблица 4.
Четыре сорта ECM независимо обрабатывали в лабораториях Dow AgroSciences в Индианаполисе способом обработки с получением белых хлопьев, описанным в примере 3. Затем эти образцы подвергали анализу TME у домашней птицы в двух университетах. Не наблюдали значимых отличий в TME между тестируемыми линями ECM, за исключением того, что выявили, что линия 121460 обладает более низкой TME, чем линии 121466 или 65620.
Наблюдаемые значения TME из этих исследований соответствовали следующим ниже теоретически рассчитанным содержаниям обменной энергии. Требования к питательным веществам домашней птицы от Национального научно-исследовательского совета (NRC, 1984, Nutrient requirements of poultry. Ninth Revised Edition. National Academy Press. Washington, DC) содержат уравнение прогноза для ME в кормовой муке из канолы (два нуля кормовая мука из рапсового жмыха):
ME ккал/кг = (32,76×CP%)+(64,96×EE%)+(13,24×NFE%)
Путем расчета на 7% более высокое значение CP должно быть уравновешено на 7% более низким NFE, таким образом, что чистый коэффициент для CP должен составлять: 32,76-13,24=19,52. Это обуславливает на 137 ккал/кг большую ME в ECM по сравнению с кормовой мукой из канолы (7%×19,52=137). Проблема с этим уравнением заключается в том, что NFE является слабым оценочным показателем энергетической ценности сахара и крахмала.
Альтернативное уравнение представляет собой уравнение прогноза EEC для ME у домашней птицы (взрослой). (Fisher C. and J.M. McNab, 1987, Techniques for determining the ME content of poultry feeds. In: Haresign and D.J.A. Cole (Eds), Recent Advances in Animal Nutrition - 1987. Butterworths, London. P. 3-17):
ME, ккал/кг=(81,97×EE%)+(37,05×CP%)+(39,87×крахмал %)+(31,08×сахара %)
Уравнение EEC представляет собой уравнение "положительного вклада", которое предоставляет значение для перевариваемых питательных веществ в кормовой муке из канолы, таких как белок, жир, крахмал и свободные сахара. Вследствие того, что единственным аналитическим отличием между ECM и кормовой мукой канолы является белок, авторы могут использовать коэффициент 37,05 для расчета избыточной энергии:
37,05×7%=259 ккал/кг. Уравнение EEC построено для полноценных кормов, которые, как правило, обладают более высокой перевариваемостью, чем кормовая мука канолы. Таким образом, коэффициент 37,05 является слишком большим.
Альтернативный подход представляет собой использование основных принципов энергетической ценности белка. Ориентировочная оценка представляет собой 4 калории общей обменной энергии на грамм белка × 80% перевариваемости белка × 5% потерь на экскрецию азота = приблизительно 75% суммарных калорий на грамм (3 калории обменной энергии на грамм или 30×белок %. Это дает обменную энергию: 30×7%=210 ккал/кг избыточной ME в ECM.
В кратком изложении, предполагают, что кормовая мука ECM обладает на 140-260 ккал/кг больше ME у домашней птицы, чем общепринятая кормовая мука из канолы. Значение 140 ккал/кг, вероятно, является недооцененным, и 260 ккал/кг может составлять верхний предел. Ожидают увеличение на 200-220 ккал/кг ME у домашней птицы. Выражая это в условиях "как есть" (таблица 1), ожидают, что коммерческая ECM обладает ME у домашней птицы 2200 ккал/кг в сравнении с 2000 ккал/кг общепринятой кормовой муки из канолы. Это представляет собой 10% увеличение энергии.
Истинную перевариваемость аминокислот (TAAA) у домашней птицы также измеряли в университете Иллинойса и университете Джорджии. В этом случае анализировали только получаемые POS образцы кормовой муки, т.к. более высокая перевариваемость аминокислот белых хлопьев в сравнении с поджаренной кормовой мукой из канолы не считают коммерчески подходящей. Таблица 6.
| Таблица 6 Истинная доступность аминокислот (TAAA) у домашней птицы ключевых аминокислот в ECM и общепринятой муки из канолы, получаемой в POS в исследованиях |
||||||
| Амино-кислота, TAAA % | Университет Иллинойса | Университет Иллинойса | Университет Иллинойса | Университет Джорджии | Университет Джорджии | Университет Джорджии |
| ECM LT | CM LT | CM HT | ECM LT | CM LT | CM HT | |
| Лизин | 81,8 | 79,6 | 76,6 | 86,8 | 83,5 | 82,9 |
| Метионин | 91,4 | 89,1 | 88,1 | 92,1 | 89,9 | 90,5 |
| Цистин | 80,2 | 82,8 | 79,8 | 79,6 | 80,7 | 78,1 |
| Треонин | 82,5 | 86,1 | 79,3 | 83,2 | 82,1 | 80,7 |
| Аргинин | 88,9 | 90,0 | 89,6 | 89,8 | 85,0 | 89,0 |
| Триптофан | 97,7 | 97,9 | 98,9 | 94,4 | 95,2 | 95,4 |
Не существовало статистически значимых отличий истинной доступности аминокислот у домашней птицы между различными образцами кормовой муки из канолы. Таблица 6.
Пример 13: Перевариваемость аминокислота (AID и SID)у свиней и теоретически рассчитанная NE
Исследование перевариваемости аминокислот в подвздошной кишке у свиней проводили в университете Иллинойса. Для сравнения использовали кормовую муку, получаемую от POS Pilot Plant.
| Таблица 7 Кажущаяся перевариваемость аминокислот в подвздошной кишке (AID) у свиней и стандартизированная перевариваемость аминокислот в подвздошной кишке (SID) у свиней белка и ключевых аминокислот в ECM и общепринятой кормовой муке из канолы, получаемой от POS, в исследовании университета Иллинойса |
|||||||
| Аминокислота, перевариваемость % | AID | AID | AID | SID | SID | SID | |
| ECM LT | CM LT | CM HT | ECM LT | CM LT | CM HT | ||
| Сырой белок | 66,5 а* | 61,9 b | 63,9 а,b | 73,9 | 71,4 | 73,5 | |
| Лизин | 73,0 а | 67,8 b | 67,9 b | 76,1 а | 71,6 b | 71,8 | |
| Метионин | 81,2 | 80,0 | 79,4 | 83,0 | 81,6 | 82,3 | |
| Цистин | 72,2 а,b | 71,1 b | 74,1 а | 74,9 b | 75,1 а,b | 77,8 а | |
| Треонин | 63,1 | 61,0 | 63,6 | 69,4 | 68,6 | 71,0 | |
| Аргинин | 77,3 | 78,7 | 78,7 | 82,0 | 84,5 | 84,8 | |
| Триптофан | 81,1 а | 75,1 b | 78,4 а | 84,9 а | 80,7 b | 84,0 а | |
| * средние значения в ряде и группе с различными буквами являются достоверно различными (p<0,05) |
Отмечали некоторые статистически значимые отличия в перевариваемости белка и аминокислот между образцами ECM и кормовой муку из канолы. ECM обладала более высокой AID сырого белка по сравнению с кормовой мукой из канолы, но различия в SID белка являлись незначительными. Для AID и SID лизин является более перевариваемым в ECM, чем в общепринятой кормовой муке из канолы, которую подвергали аналогичной тепловой обработке. Таблица 7.
Для свиней общепринятые уравнения для теоретического расчета DE, ME и NE у свиней представляют собой уравнения Noblet, как описано в EvaPig (2008, Version 1,0. INRA, AFZ, Ajinomoto Eurolysine) и в NRC Nutrient Requirements of Swine (NRC, 1998, Nutrient requirements of Swine, Tenth Revised Edition; National Academy Press. Washington, DC):
Уравнение 1-4
DE, ккал/кг=4151-(122×зола %)+(23×CP %)+(38×EE %)-(64×CF %)
Уравнение 1-14
NE, ккал/кг=2790+(41,22×EE %)+(8,1×крахмал %)-(66,5×зола %)-(47,2×ADF %)
Уравнения Noblet представляют собой гибрид положительных и отрицательных факторов влияния: жир, белок и крахмал имеют положительные коэффициенты, тогда как зола, CF и ADF имеют отрицательные коэффициенты. В уравнении для нетто-энергии (NE) не используют белок, но различия между ECM и кормовой мукой канолы можно выявлять по различиям в ADF. Вследствие того, что крахмал и зола являются одинаковыми в ECM и кормовой муке из канолы, тогда основное различие представляет собой ADF. На 5% более низкие уровни ADF приводят к NE на 47,2×5%=236 ккал/кг больше в ECM. Это теоретически рассчитанное число является аналогичным числу ME у домашней птицы, таким образом, предполагают снова увеличение нетто-энергии у свиней на 200 ккал/кг для ECM в условиях "как есть" (таблица 1). Это должно приводить приблизительно к 12% увеличению энергии.
Пример 14: Дополнительные гибриды ECM
Для нового гибрида канолы CL166102H также продемонстрировали свойства улучшенной кормовой муки (ECM). Продуктивные признаки и признаки качества, измеряемые на семенах этого гибрида, собранного из 2011 небольших полевых опытах на делянках, включают масло, белок кормовой муку, ADF и общие глюкозинолаты (Tgluc). См. таблицу 8.
Результаты в таблице 8 ясно указывают на то, что эта новая линия DAS ECM превосходит коммерческий сорт в отношении качественных признаков кормовой муки.
| Таблица 8b Агрономическая продуктивность линий ECM (испытания C3B03) |
||||
| Линия | Масло (%) | Белок (%) | ADF (%) | Tgluc мкМ/г |
| Гибрид CL166102 | 49,4 | 49,9 | 12,8 | 10,6 |
| Коммерческий сорт 5440 (129436) | 50,2 | 45,9 | 16,3 | 9,7 |
Применение темных семян канолы для получения кормовой муки канолы, причем темные семена канолы выбраны из группы, состоящей из семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11697, семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11696, семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11698, и семян, депонированных в АТСС под номером PTA-11699.
