Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом



Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
Рекомбинантная плазмидная днк pal2-t-wbmag, используемая для создания днк-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2642315:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Общество с ограниченной ответственностью "Иноген" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к онкогематологии. Изобретение касается рекомбинантной плазмидной ДНК. Разработана рекомбинантная плазмидная ДНК pAL2-T-WBMAG, включающая фрагменты генов WT1, BAALC, MN1, ABL1 и GUSB. Изобретение используется в качестве калибраторов при проведении ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и детекции геноспецифических продуктов в режиме реального времени с целью сравнительной оценки экспрессии указанных генов у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Гены WT1, BAALC и MN1 выступают в качестве маркеров опухолевой прогрессии, а гены ABL1 и GUSB - в качестве нормализаторов экспрессии. Изобретение позволяет повысить точность оценки относительной экспрессии данных генов благодаря конструкции ДНК-калибраторов, совмещающих последовательности всех маркеров. Комплексный анализ генов WT1, BAALC и MN1 позволяет оценивать эффективность проводимой терапии в большинстве случаев ОМЛ, в том числе у пациентов без выявленных хромосомных аберраций. 4 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к онкогематологии, и касается рекомбинантной плазмидной ДНК для использования в качестве калибраторов при проведении ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и детекцией геноспецифических продуктов в режиме реального времени с целью оценки эффективности проводимой терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ).

Использование молекулярно-генетических методов исследования, благодаря их специфичности и чувствительности, является ключевым подходом в контроле полной излеченности пациента. Тем не менее, у половины пациентов с ОМЛ не удается идентифицировать информативный генетический маркер. Именно для этой группы пациентов внедрение альтернативных подходов контроля элиминации представляется наиболее актуальным в оценке эффективности терапии.

Гиперэкспрессия гена WT1 была обнаружена при ряде заболеваний крови опухолевой природы, в том числе и при ОМЛ. Высокая экспрессия WT1 встречается у более половины пациентов с ОМЛ и является фактором неблагоприятного прогноза заболевания и высокого риска развития рецидива [Liu-Yin, J. et al. Predictive value of minimal residual disease (MRD) monitoring by RQ-PCR in WT1 positive patients entered in the UK MRC AML-15 Trial. Blood 2008 112, 259]. Поскольку методом ОТ-ПЦР можно выявить четкие различия в уровне транскрипта WT1 в нормальных и лейкемических клетках, экспрессия WT1 является эффективным маркером в оценке минимальной остаточной болезни у пациентов при отсутствии крупных хромосомных аномалий или других мутаций, характерных для клеток опухолевого клона.

Экспрессия BAALC в зрелых клетках костного мозга и в периферической крови здоровых людей не обнаруживается. Согласно данным литературы, при ОМЛ гиперэкспрессия BAALC встречается у более 50% больных с нормальным кариотипом [Damiani D, Tiribelli М, Franzoni A et al. BAALC overexpression retains its negative prognostic role across all cytogenetic risk groups in acute myeloid leukemia patients. Am J Hematol. 2013 Oct; 88(10):848-52]. Чрезмерная экспрессия BAALC связана с низкими показателями общей выживаемости и повышенным кумулятивным риском развития рецидива заболевания в ходе терапии.

Сравнительно недавно было показано, что избыточная экспрессия MN1, независимо от вовлечения данного гена в образование химерного транскрипта, является неблагоприятным прогностическим фактором с точки зрения безрецидивной выживаемости [Heuser М, Beutel G, Krauter J, , von Neuhoff N, Schlegelberger B, Ganser A. High meningioma 1 (MN1) expression as a predictor for poor outcome in acute myeloid leukemia with normal cytogenetics. Blood. 2006; 108: 3898-3905]. Вместе с тем, было показано, что гиперэкспрессия гена MN1 является предиктором развития рецидива и коррелирует с другими показателями элиминации опухолевого клона, что косвенно указывает на возможность использования этого маркера с целью оценки ответа на противоопухолевую терапию [Carturan S et al. Variable but consistent pattern of Meningioma 1 gene (MN1) expression in different genetic subsets of acute myelogenous leukaemia and its potential use as a marker for minimal residual disease detection. Oncotarget. 2016 Sep 27].

Для перечисленных маркеров опухолевого роста подсчет абсолютных количеств копий осуществляется с использованием раздельных наборов калибраторов для анализируемого и референсного генов. Учитывая возможность неравномерной деградации плазмидной ДНК в калибраторах, существует вероятность искажения результатов исследования относительной экспрессии. Вместе с тем, при наличии вероятностных отклонений в оценке копийности плазмидной ДНК методом спетрофотометрии при создании калибраторов на основе последовательных разведений, наличие в последовательности целевого и референсного генов может повысить точность расчетов абсолютных значений относительной экспрессии генов.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание плазмидной ДНК, содержащей три последовательности калибраторов, включающих в себя копии целевого и референсного генов, что позволяет нивелировать возникновение возможных погрешностей и оценивать эффективность проводимой терапии в большинстве случаев ОМЛ, в том числе у пациентов без выявленных хромосомных аберраций.

Указанный технический результат обеспечивается тем, что рекомбинантная плазмидная ДНК pAL2-T-WBMAG, используемая для создания ДНК-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом, содержит вставку последовательно сшитых в реакции лигирования участков кДНК генов WT1, BAALC, MN1, ABL1, GUSB, амплифицируемых в ПЦР-РВ.

Так как совокупная частота выявляемости гиперэкспрессии генов WT1, BAALC, MN1 у пациентов с ОМЛ составляет более 90%, создание унифицированной системы на основе комплексного анализа позволяет оценивать эффективность проводимой терапии практически у всех пациентов с ОМЛ. Вместе с тем, комплексная оценка нескольких опухолевых маркеров представляется целесообразной и в связи с наблюдающимся в ряде случаев изменением профиля экспрессии генов в опухолевой популяции.

Гены WT1, BAALC и MN1 выступают в качестве маркеров опухолевой прогрессии, а гены ABL1 и GUSB - в качестве нормализаторов экспрессии.

Сущность изобретения поясняется фигурами 1-4.

На фиг. 1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pAL2-T-WBMAG со следующими обозначениями: f1 origin - сайт инициации транскрипции одноцепочечного нитевидного фага f1; Т7 - ранний промотор фага Т7 для РНК-полимеразы E. coli; LacZ - ген β-галактозидазы; AmpR - ген устойчивости к антибиотику ампициллину; WT1 - последовательность участка кДНК гена WT1; BAALC - последовательность участка кДНК гена BAALC; MN1 - последовательность участка кДНК гена MN1; ABL - последовательность участка кДНК гена ABL; GUSB - последовательность участка кДНК GUSb; NotII, ClaI, EcoRI, HindIII - сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции;

на фиг. 2 - уровни относительной экспрессии гена WT1 у здоровых доноров в костном мозге и периферической крови;

на фиг. 3 - кумулятивный риск развития рецидива в посттрансплантационном периоде на фоне гиперэкспрессии генов WT1, BAALC;

на фиг. 4 - сопоставление уровней экспрессии генов WT1, BAALC, MN1 с уровнем донорского химеризма и бластных клеток у пациента на фоне посттрансплантационного рецидива.

Рекомбинаную плазмидную ДНК pAL2-T-WBMAG, которая кодирует участки кДНК генов человека WT1, BAALC, MN1, ABL1, GUSB, получают генно-инженерным методом: путем встраивания ДНК-фрагменга, состоящего из последовательно сшитых в реакции лигирования нуклеотидных последовательностей участков кДНК генов WT1, MN1, BAALC, ABL1, GUSB, амплифицированных с использованием клинического материала пациентов и здоровых доноров, в вектор pAL2-T.

Исходным генетическим материалом для конструирования плазмиды служат следующие генно-инженерные конструкции:

- плазмидный вектор pAL2-T (Евроген, кат. номер ТА002);

- консервативный участок кДНК гена WT1, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала пациентов с ОМЛ;

- консервативный участок кДНК гена BAALC, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала пациентов с ОМЛ;

- консервативный участок кДНК гена MN1, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала пациентов с ОМЛ;

- консервативный участок кДНК гена ABL1, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала здоровых доноров;

- консервативный участок кДНК гена GUSb, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала здоровых доноров;

- синтетические олигонуклеотиды

Полученная плазмида pAL2-T-WBMAG, кодирующая участки последовательностей кДНК генов WT1, BAALC, MN1, ABL1, GUSB, имеет молекулярную массу 2,61 МДа и размер 4225 п.н. и содержит следующие элементы:

- участок плазмиды pAL2-T, размером 3009 п.н., включающий сайт инициации транскрипции одноцепочечного нитевидного фага f1, ранний промотор фага Т7 для РНК-полимеразы Е. coli, запускающий экспрессию рекомбинантного гена, ген устойчивости к ампициллину AmpR для селекции трансформированных плазмидой клеток Е. coli и лактозноый оперон, позволяющий проводить отбор трансформированных бактерий методом сине-белой селекции;

- ClaI/EcoRI фрагмент кДНК гена WT1, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала пациентов с ОМЛ;

- ClaI/EcoRI фрагмент кДНК гена BAALC, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала пациентов с ОМЛ;

- ClaI/EcoRI фрагмент кДНК гена MN1, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала пациентов с ОМЛ;

- EcoRI/HindIII фрагмент кДНК гена ABL1, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала здоровых доноров;

- EcoRI/HindIII фрагмент кДНК гена GUSb, амплифицированного с кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции из РНК, выделенной из клинического материала здоровых доноров;

- уникальный сайт узнавания рестриктазой NotI для линеаризации плазмидной ДНК, имеющий следующие координаты - 4211.

Синтез плазмидной ДНК проводят следующим образом.

Участки кДНК, кодирующие анализируемые методом ОТ-ПЦР последовательности транскриптов, амплифицируют с помощью синтетических олигонуклеотидов, подобранных таким образом, что амплифицируемый в ОТ-ПЦР участок находится внутри клонируемого фрагмента, а на 5'-концах олигонуклеотидов находятся сайты специфического узнавания эндонуклеаз рестрикции:

ПЦР проводят в объеме 25 мкл с использованием реакционной смеси для ПЦР HF Master Mix (Dialat), содержащей высокоточную Pfu-полимеразу. Концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 300 мМ (прямой и обратный), концентрация ионов магния 2,5 мМ, кДНК добавляют в объеме 5 мкл.

Амплифицированные последовательности подвергают электрофоретическому разделению в 1,5% агарозном геле, фрагменты ДНК, размер которых совпадает с теоретическим, вырезают из геля и очищают с помощью набора для очистки фрагментов двухцепочечной ДНК из геля Cleanup Standard (Евроген).

Полученные фрагменты амплифицируют в реакции ПЦР с помощью пар синтетических олигонуклеотидов, подбиранных таким образом, что каждый праймер одним концом комплементарен последовательности одного гена, а другим концом - гену, который будет расположен рядом с ним в генно-инженерной конструкции.

Амплификацию продуктов для клонирования осуществляют методом ПЦР. ПЦР проводят в объеме 25 мкл с использованием реакционной смеси для ПЦР HF Master Mix (Dialat), содержащей высокоточную Pfu-полимеразу. Реакционная смесь содержит праймеры в концентрации 300 мМ (прямой и обратный), ионы магния в концентрации 2,5 мМ. Очищенный из геля фрагмент ДНК добавляют в реакционную смесь в количестве 20-30 нг.

Протокол амплификации:

- первичная денатурация - 2 минуты при 98°С

- амплификационный цикл (×30)

- денатурация - 20 секунд при 98°С

- отжиг праймеров - 30 секунд при 60°С

- элонгация - 20 секунд при 72°С

- финальная элонгация - 2 минуты при 72°С.

Амплифицированные нуклеотидные последовательности подвергают электрофоретическому разделению в 1,5% агарозном геле, очищают с помощью набора для очистки фрагментов двухцепочечной ДНК из геля Cleanup Standard (Евроген) и сшивают в один фрагмент длиной 1180 п.н. с помощью набора для лигирования фрагментов ДНК NEBuilder® HiFi DNA Assembly (NEB). Для этого в одной пробирке смешивают 100 нг целевых фрагменов ДНК и 50 нг вектора pAL2-T, 10 мкл смеси NEB Master Mix и доводят дедионизованной водой до объема 20 мкл. Реакционную смесь инкубируют в течение 60 минут при 50°С и трансформируют при помощи нее химически компетентные клетки и высеивают их на агаризованную ампициллин-содержащую среду LB. Образовавшиеся через сутки колонии тестируют на предмет наличия генно-инженерной вставки с помощью метода скрининговой ПЦР с праймерами WT1_OL_F и ABL-GUSB_OL_R и секвенирования по Сенгеру с помощью универсальных плазмидных праймеров М13. Бактериальные клетки, несущие в себе вектор pAL2-T со вставкой участков кДНК генов ABL1, GUSB, WT1, MN1, BAALC, инокулируют в 0.5 л жидкой питательной среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и культивируют при 37°С на шейкере в течение 8-12 часов. Затем выделяют плазмидную ДНК из массы бактериальных клеток с помощью набора для выделения плазмидной ДНК Maxiprep Purification Kit (Qiagen). Выделенную плазмидную ДНК pAL2-T-WBMAG анализируют с помощью рестрикционного анализа по сайтам NotI и HindIII, секвенируют вставки генов ABL1, GUSB, WT1, MN1, BAALC и хранят при -20°С.

Для использования в качестве ДНК-катибраторов плазмидную ДНК pAL2-T-WBMAG линеализируют по сайту узнавания рестриктазой NotI, измеряют концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop, рассчитывают количество копий плазмидной ДНК по формуле:

N=(С*6.022×1023)/(L*650*1×109),

где N - количество копий ДНК в 1 мкл исходного раствора, С - концентрация плазмидной ДНК в исходном растворе (нг/мкл), L - длина плазмидной ДНК (п.н), и готовят десятичные разведения плазмидной ДНК, содержащие от 10 до 1000000 копий плазмидной ДНК в 5 микролитрах буфера.

Для амплификации участка гена BAALC используют праймеры:

Для амплификации участка гена MN1 используют олигонуклеотидные последовательности:

I

Для амплификации участка гена WT1 используют олигонуклеотидные последовательности:

Для амплификации участка гена ABL1 используют олигонуклеотидные последовательности:

Для амплификации участка гена GUSB используют олигонуклеотидные последовательности:

С использованием заявленной рекомбинантной плазмидной ДНК pAL2-T-WBMAG была проанализирована экспрессия исследуемых генов от 108 пациентов в возрасте от 2 до 60 лет (медиана - 27 лет). Период наблюдения составил в среднем 6 месяцев (от 1 до 47 месяцев). Оценка экспрессии проводилась преимущественно в посттрансплантационном периоде (19 пациентов после родственной аллогенной трансплантациии гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК), 73 пациента после неродственной аллоТГСК и 16 пациентов после гаплоидентичной аллоТГСК). Помимо этого был обследован материал здоровых доноров (n=10).

Относительную экспрессию генов WT1, BAALC, и MN1 в анализируемых образцах определяли исходя из уравнений калибровочных кривых для соответствующих генов. Для этого в каждую амплификацию включали 5 последовательных убывающих десятичных разведений плазмидной ДНК известной концентрации, содержащей амплифицируемые участки анализируемых генов. Эффективность амплификации определяли как угол наклона калибровочной кривой. Для всех пар праймеров эффективность амплификации составила от 90% до 100%, коэффициент корреляции R2 был больше или равен 0,990.

Для оценки воспроизводимости значений порогового цикла (Ct) все анализируемые образцы с каждой парой праймеров амплифицировались в двойном повторе. В анализ включались образцы, для которых разница значений Ct между повторами была не более 0,3 цикла.

Абсолютное количество кДНК каждого гена определяли исходя из уравнения калибровочной кривой при помощи программного обеспечения iQ5 от Bio-rad. В анализ включали образцы, для которых рассчитанное относительно калибровочной кривой количество кДНК гена ABL1 превышало 10000 копий на реакцию. Уровень относительной экспрессии гена WT1,составляющий более 250 копий гена WT1 на 10000 копий гена ABL рассматривали как гиперэкспрессию маркера. Для гена BAALC под гиперэкспресией понимали выявление более 10 копий данного гена на 100 копий гена ABL, для гена MN1 - выявление более 100 копий на 100 копий гена ABL.

При оценке уровня относительной экспрессии было выявлено наличие достоверных различий в уровне экспрессии гена WT1 у здоровых доноров в костном мозге и периферической крови (фиг.2), что совпадает с результатами других исследователей [K Inoue, Н Ogawa, Т Yamagami, Т Soma, Y Tani, Т Tatekawa, Y Oji, H Tamaki, T Kyo, H Dohy, A Hiraoka, T Masaoka, T Kishimoto and H Sugiyama. Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 (Wilms tumor gene) expression levels. Blood, 1996, 88, 2267-2278].

При анализе данных пациентов в посттрансплантационном периоде обращает на себя внимание наличие прямой корреляционной связи между уровнем экспрессии исследуемых генов и выявляемых химерных транскриптов. Для гена WT1 коэффициент корреляции (критерий Спирмена) составил 0,26 (р=0.01), а для гена BAALC - 0.27 (р=0.0001). Сопоставимые результаты были получены и при анализе корреляционной зависимости изменения количества клеток опухолевой популяции. При сопоставлении полученных данных экспрессии с результатами исследования донорского химеризма (приживления клеток донора после аллоТГСК) наблюдалась обратная зависимость, выражающаяся в обратной корреляции - коэффициент корреляции для WT1 составил -0,18 для гена WT1 (р=0.0006) и -0.21 для гена BAALC (р=0.00001).

При оценке куммулятивного риска развития рецидива после аллоТГСК были получены данные, указывающие на высокую вероятность развития рецидива заболевания на фоне гиперэкспрессии исследуемых генов (фиг.3). Нами было показано, что при наличии гиперэкспресии генов WT1 и BAALC достоверно возникает риск развития рецидива у пациентов в посттрансплантационном периоде - р=0,009 и р=0,027 соответственно.

На фиг. 4 представлены данные, указывающие на клиническую значимость оценки экспрессии гена MN1. При увеличении экспрессии данного гена также отмечалось увеличение экспрессии генов WT1 и BAALC, что сопровождалось снижением уровня донорского химеризма. Данные изменения, в свою очередь, отражали количественные значения популяции клеток опухолевого клона (количество бластных клеток).

Таким образом, изобретение позволяет повысить точность оценки относительной экспрессии данных генов благодаря конструкции ДНК-калибраторов, совмещающих последовательности всех маркеров. Комплексный анализ генов WT1, BAALC и MN1 позволяет оценивать эффективность проводимой терапии в большинстве случаев ОМЛ, в том числе у пациентов без выявленных хромосомных аберраций.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pAL2-T-WBMAG, используемая для создания ДНК-калибраторов при оценке эффективности терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом, содержащая вставку последовательно сшитых в реакции лигирования участков кДНК генов WT1, BAALC, MN1, ABL1, GUSB, амплифицируемых в ПЦР-РВ,

atgtctgaat tcgacctgca ggtcgaccat atgggagagc tcccaacgcg ttggatgcat 60
agcttgagta ttctatagtg tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 180
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 240
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 300
gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 360
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 420
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 480
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 540
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 600
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 660
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 720
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 780
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 840
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 900
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 960
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 1020
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 1080
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 1140
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 1200
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 1260
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 1320
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 1380
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 1440
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 1500
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 1560
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 1620
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 1680
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 1740
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 1800
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 1860
ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 1920
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 1980
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 2040
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 2100
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 2160
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 2220
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg atgcggtgtg aaataccgca 2280
cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gaaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa 2340
ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 2400
atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 2460
aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 2520
ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 2580
aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 2640
gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 2700
agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 2760
ggcgcgtcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 2820
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 2880
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg taatacgact 2940
cactataggg cgaattgggc ccgacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggag 3000
acatttaaaa cgacggccag tgccaatatc gattacctgc ccagctgcct cgagagccag 3060
cccgctattc gcaatcaggg ttacagcacg gtcaccttcg acgggacgcc cagctacggt 3120
cacacgccct cgcaccatgc ggcgcagttc cccaaccact cattcaagca tgaggatccc 3180
atgggccagc agggctcgct gggtgagcag cagtactcgg tggaattcaa aaatcgatac 3240
tcgggcatgc tggaagatgg actgccctcc aatggtgtgc cccgatctac agccccaggt 3300
ggaataccca acccagagaa gaagacgaac tgtgagaccc agtgcccaaa tccccagagc 3360
ctcagctcag gccctctgac ccagaaacag aatggccttc agaccacaga ggctaaaaga 3420
gatgctaaga gaatgcctgc aaaagaagtc accattaatg taacagatag catccaacag 3480
atggacagaa ggaattctaa aatcgatacc attgacctgg actcgctgat ggcagagcac 3540
agcgctgcct ggtacatgcc cgctgacaag gccctggtgg acagcgcgga cgacgacaag 3600
acgttggcgc cctgggagaa ggccaaaccc cagaacccca acagcaaaga agcccacgac 3660
ctccctgcaa acaaggcctc agcatcccag cctggcagcc acttgcagtg cctgtctgtc 3720
cactgcgaat tctaaagaat tcaggaaaac cttctcgctg gacccagtga aaatgacccc 3780
aaccttttcg ttgcactgta tgattttgtg gccagtggag ataacactct aagcataact 3840
aaaggtgaaa agctccgggt cttaggctat aatcacaatg gggaatggtg tgaagcccaa 3900
accaaaaatg gccaaggctg ggtcccaagc aactacatca cgccagtcaa cagtctggag 3960
aaacactcct ggtaccatgg gcctgtgtcc cgcaatgccg ctgagtatct taaagctttt 4020
aagcttgcag aaacgattgc agggtttcac caggatccac ctctgatgtt cactgaagag 4080
taccagaaaa gtctgctaga gcagtaccat ctgggtctgg atcaaaaacg cagaaaatac 4140
gtggttggag agctcatttg gaattttgcc gatttcatga ctgaacagtc accgacgaga 4200
gtgctcgtaa tcatggtcat agctg 4225



 

Похожие патенты:

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный аденовирус для обнаружения раковых клеток или диагностики рака, содержащий репликативную кассету, маркерную кассету, ген, который кодирует связывающий CD46 фибриллярный белок.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и генной инженерии. Предложен рекомбинантный химерный полипептид-иммуноген, включающий консервативные Т- и В-клеточные эпитопы вируса ВИЧ-1 и последовательно расположенные пептидные фрагменты белков р24, gp41, gp120, узнаваемые широконейтрализующими антителами 10e8, 2F5, VRC01.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу создания живой вакцины на основе биологически активного штамма Еnterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей антигена клинически актуального патогенного микроорганизма.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения трансформированного растения розы, имеющего повышенное содержание в лепестках дельфинидина по сравнению с нетрансформированным растением розы, включающему стадию трансформации разновидности садовой розы (Rosa hybrida) плазмидой, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы, и 35S промотор вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к вектору экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую секретируемый доминантно негативный белок HrpY.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ повышения экспрессии гена сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro, включающий: приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 10 до 30 нуклеотидов, который специфично гибридизуется с комплементарным участком природного антисмыслового полинуклеотида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и повышает, за счет этого, экспрессию указанного гена сайт-1 мембраносвязанной пептидазы транскрипционных факторов (MBTPS1) в клетках или тканях млекопитающего in vivo или in vitro.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному полинуклеотиду для борьбы с западным кукурузным жуком (WCR), вектору, клетке, растению, семени растения, его содержащим, а также к способу снижения популяции насекомого-вредителя WCR с его использованием.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к синтетическому двунаправленному промоторному полинуклеотиду для повышения экспрессии гетерологичных белков в растительной клетке, а также к синтетическому полинуклеотиду для экспрессии двух гетерологичных белков в растительной клетке.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенному растению сои, обладающему устойчивостью к глифосату и изоксафлютолу. Также раскрыты трансгенное семя указанного растения, молекула нуклеиновой кислоты, геномная ДНК сои, продукт из сои, набор, пара праймеров и пара специфичных зондов для идентификации одновременного присутствия генов устойчивости к указанным гербицидам.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены нуклеиновая кислота, кодирующая белок, являющийся патогенным антигеном, структуру "стебель-петля" гистонов и последовательность поли(А) или сигнал полиаденилирования, набор и фармацевтическая композиция, содержащие одну или более указанную нуклеиновую кислоту, для лечения инфекционного заболевания, а также способ повышения экспрессии кодируемого белка и применение указанных нуклеиновой кислоты, набора или композиции для повышения экспрессии кодируемого белка.

Изобретение относится к биохимии. Описано антитело для снижения концентрации антигена в плазме, содержащее антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, активность связывания антигена которого отличается в двух различных условиях концентрации кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция, где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ, а высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ, где указанное антитело содержит по крайней мере четыре аминокислоты, выбранные из группы, включающей аминокислоты в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 в соответствии с нумерацией по Kabat в легкой цепи, которые обладают хелатирующей активностью в отношении металла. А также описана фармацевтическая композиция, содержащая данное антитело. Изобретение может быть использовано для ускорения захвата антигенсвязывающими молекулами антигена в клетки, увеличения количества раз связывания антигена одной антигенсвязывающей молекулой, ускорения снижения концентрации антигена в плазме и увеличения удержания антигенсвязывающей молекулы в плазме, а также антигенсвязывающих молекул. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 56 ил., 28 табл., 25 пр.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, в частности фармакологии, и раскрывает систему для стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот и способ стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот. Настоящая группа изобретений позволяет получать однородные частицы липидов и нуклеиновых кислот с помощью простых стадий, воспроизводимо и в асептических условиях и может быть использована для доставки этого класса терапевтических молекул в клетки-мишени. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 13 табл., 7 пр, 1 ил.

Настоящее изобретение относится к новым ДНК-аптамерам, способным прочно и специфически связываться с гельзолином. Кроме того, изобретение относится к применению этих аптамеров для оценки уровня гельзолина в данном образце и для очистки немеченного гельзолина и его аналогов в большом объёме. Таким образом, настоящее изобретение исключает использование разных животных или их тканей для получения белков, связывающих гельзолин, которое является намного более дорогостоящим и социально неприемлемым способом в отличие от синтеза молекулы ДНК с помощью ПЦР in vitro. Используя эту стратегию, массовое производство гельзолин-связывающего матрикса может быть осуществлено с гораздо меньшими затратами. Кроме того, аптамеры могут быть использованы для блокирования связывания гельзолина с его партнерами для связывания с целью диагностического и/или терапевтического применения. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Изобретения относятся к области иммунологии и вирусологии. Представленные однодоменые и олигомерные антитела содержат антигенсвязывающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, на основе которых созданы композиции, предназначенные для профилактики и лечения инфекции млекопитающих, вызванной вирусом Эбола. Предлагаемые антитела связываются с белком GP вируса Эбола и обладают вируснейтрализующей активностью и защищают от заражения и развития инфекции in vivo. 6 н.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл., 9 пр.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к РНК-аптамеру, представляющему 26-звенный олигонуклеотид смешанного типа. Настоящий РНК-аптамер содержит пуриновые рибонуклеотиды и 2’-дезокси-2’-фторпиримидиновые рибонуклеотиды. Указанный РНК-аптамер имеет нуклеотидную последовательность 5’-AUG CGG UCA АUU АСС UGA GAG CAG GA-3’, где A, G - рибонуклеотиды, U, С - 2’-дезокси-2’-фтор-рибонуклеотиды. Указанный РНК-аптамер обладает способностью узнавать аутоантитела, характерные для рассеянного склероза, и является перспективным компонентом биосенсоров для диагностики рассеянного склероза. Настоящее изобретение позволяет получать РНК-аптамер, способный высокоаффинно и специфично связывать аутоантитела-маркеры, характерные для рассеянного склероза. 5 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к трансгенной растительной клетке табака, трансгенному растению табака, растительному материалу табака для получения повышенного количества С2С16:0, С2С17:0 и С2С18:0 сложных эфиров сахарозы, а также к курительному изделию, содержащему вышеуказанный растительный материал или часть вышеуказанного растения. Также раскрыты способ повышения количества С2С16:0, С2С17:0 и С2С18:0 сложных эфиров сахарозы, по меньшей мере, в части растения табака, а также способ получения композиции, содержащей один или несколько сложных эфиров сахарозы. Изобретение также относится к способу получения бета-метилвалериановой кислоты. Изобретение позволяет эффективно увеличивать количество сложных эфиров сахарозы в растении табака. 10 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированной клетке растения сои, продуцирующей масло, содержащее 0,36-8,00% ДГК от общего количества жирных кислот и 0,30-3,98% ДПК(n-6) от общего количества жирных кислот, а также к способу ее получения. Также раскрыты генетически модифицированные растение и семя сои для получения масла сои, содержащего 0,36-8,00% ДГК от общего количества жирных кислот и 0,30-3,98% ДПК(n-6) от общего количества жирных кислот. Изобретение также относится к маслу сои, содержащему 0,36-8,00% ДГК от общего количества жирных кислот и 0,30-3,98% ДПК(n-6) от общего количества жирных кислот, а также к способу его получения. Изобретение позволяет эффективно получать масло сои, содержащее 0,36-8,00% ДГК от общего количества жирных кислот и 0,30-3,98% ДПК(n-6) от общего количества жирных кислот. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 39 ил., 14 табл., 12 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к химерному антигенному рецептору (CAR), обладающему специфичностью к CD22, что может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают рецептор CAR, содержащий антигенсвязывающий домен HA22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, а также нуклеиновую кислоту, кодирующую заявленный рецептор, рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, популяцию выделенных клеток-хозяев для экспрессии полученного рецептора, фармацевтическую композицию, содержащую полученный рецептор, предложены способы лечения и обнаружения CD22-экспрессирующего рака и применение полученного рецептора для получения лекарственного средства для лечения CD22-экспрессирующего рака. Изобретение позволяет эффективно бороться с CD22-экспрессирующим раком за счет активизации лизиса указанных клеток полученным химерным рецептором. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 8 пр.

Представлен способ выявления ракового биомаркера у субъекта in vitro. Охарактеризованный способ включает получение от субъекта биологического образца; измерение уровня RISC-белка во фракции экзосом образца и/или активности процессинга первичной микроРНК или активности процессинга предшественника микроРНК во фракции экзосом образца и эталонного образца; идентификацию того, что субъект обладает раковым биомаркером, на основании (i) выявления RISC-белка во фракции экзосом образца, полученного от субъекта, или (ii) выявления активности процессинга микроРНК во фракции экзосом образца, которая отсутствует в эталонном образце. Изобретение может быть использовано при диагностике рака. 20 з.п. ф-лы, 6 табл., 2 пр., 112 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу одновременной детекции множества последовательностей нуклеотидов при проведении одной полимеразной цепной реакции. Предложенное решение позволяет в ходе одной реакции выполнять амплификацию множества последовательностей нуклеотидов в одном образце, кодируя их с помощью соотношения количества прямых праймеров определенной структуры. 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 8 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к онкогематологии. Изобретение касается рекомбинантной плазмидной ДНК. Разработана рекомбинантная плазмидная ДНК pAL2-T-WBMAG, включающая фрагменты генов WT1, BAALC, MN1, ABL1 и GUSB. Изобретение используется в качестве калибраторов при проведении ПЦР с обратной транскрипцией и детекции геноспецифических продуктов в режиме реального времени с целью сравнительной оценки экспрессии указанных генов у пациентов с острым миелоидным лейкозом. Гены WT1, BAALC и MN1 выступают в качестве маркеров опухолевой прогрессии, а гены ABL1 и GUSB - в качестве нормализаторов экспрессии. Изобретение позволяет повысить точность оценки относительной экспрессии данных генов благодаря конструкции ДНК-калибраторов, совмещающих последовательности всех маркеров. Комплексный анализ генов WT1, BAALC и MN1 позволяет оценивать эффективность проводимой терапии в большинстве случаев ОМЛ, в том числе у пациентов без выявленных хромосомных аберраций. 4 ил.

Наверх