Микробиологический способ получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17 α,21-диацетата кортексолона

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения 17α -ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона проводят отмытым от питательной среды суточным мицелием штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 второй генерации в 0,05 М калий-фосфатном буфере pH 6,0 с добавлением 1% об./об. масляного раствора ретинола ацетата и 0,5% об./об. ПЭГ 400. Мицелий штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 берут в количестве 30-35 г/л в пересчете на вес сухой биомассы. Стероидный субстрат вносят в трансформационный буфер в виде горячего раствора диметилформамида (ДМФ) с конечной концентрацией растворителя 1,5% об./об. с последующим инкубированием и выделением путем экстракции или отгонки растворителя и кристаллизации. 4 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения 11β-гидроксистероида - 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленностях.

Физиологическая активность гидроксилированных по 11-му положению 3-кетостероидов широко используется в терапии многих заболеваний. Наличие гидроксильной группы в позиции 11β определяет противовоспалительные, антиаллергические и иммунодепрессивные свойства стероидов прегнанового ряда. [1-3]. Способность катализировать реакцию 11β-гидроксилирования в отношении кортексолона и его производных показана преимущественно для штаммов мицелиальных грибов рода Absidia, Cunninghamella и Curvularia [4-9]. Дейтеромицет Curvularia lunata и его телеоморф Cochliobolus lunatus отличаются высокой эффективностью в осуществлении введения гидроксильной группы в положение 11β прегнанов, в том числе при получении гидрокортизона из кортексолона и его производных [1, 8, 10-17]. К настоящему времени известны подходы, направленные на увеличение выхода 11β-гидроксилированных продуктов при трансформации кортексолона культурой Curvularia lunata [14-17, 18]. Малоизученными остаются процессы трансформации ацетилированных на стадии химического синтеза производных кортексолона, которые все чаще выступают в качестве субстратов для микробиологической конверсии.

Основной проблемой промышленного получения гидрокортизона и ацетата гидрокортизона путем микробиологической конверсии кортексолона и его ацетилированных производных является малая эффективность процессов, обусловленная наличием побочных 14α- или 11α-гидроксилированных производных, а также необходимостью использовать низкие нагрузки субстрата для достижения более полного его превращения в целевой продукт.

Целью заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона с использованием штамма Curvularia lunata ВКМ F-645, обладающего 11β-гидроксилазной активностью в отношении 3-кетостероидов прегнанового ряда.

Штамм Curvularia lunata ВКМ F-645 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН, г. Пущино).

В литературе описан способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона культурой Curvularia lunata CL-114 [8]. Оптимизированные условия проведения трансформации включают в себя использование субстрата в комплексе с β-циклодекстрином (молярное соотношение β-циклодекстрин:субстрат, 1:1), 1.2% ТВИН80 при 20-минутной стерилизации. Субстрат вносят на стадию конверсии в 80% этаноле с соотношением 1:18 (об./об.) к 24 часовой культуре гриба (конечная концентрация субстрата 1 г/л) и проводят трансформацию в течение 48 часов в ростовых условиях. Выход гидрокортизона при этом достигает 55%.

Недостатком рассматриваемого способа получения является невысокая производительность, обусловленная низким выходом 11β-гидроксилированного продукта и низкой концентрацией субстрата. Масштабирование этого способа осложнено, что исключает его практическую реализацию.

Известен способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона с помощью культуры Curvularia lunata CL-114 [11], который основывается на двухстадийном добавлении субстрата на стадии трансформации: сначала к 16-часовой культуре добавляют 0.3 г/л субстрата, затем через 8 часов добавляют оставшиеся 0.7 г/л субстрата. Выход гидрокортизона достигает 0.6 г/л за 72 часа трансформации. Среди недостатков данного способа получения гидрокортизона следует отметить длительность процесса трансформации - до 72 ч и невысокую производительность, обусловленную низкой концентрацией субстрата - 1 г/л.

Известен способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона с помощью клеток мицелия Absidia orchidis, включенных в кальций-альгинатный гель. Выход гидрокортизона достигает 59-61% при концентрации субстртата 1 г/л [6]. Побочным продуктом данного процесса является эпигидрокортизон (11α-изомер гидроокортизона). Способ позволяет многократно использовать иммобилизованные клетки (до шести раз) без значительного снижения их гидроксилирующей активности.

Основной недостаток данного способа получения гидрокортизона заключается в малой производительности, обусловленной низкой концентрацией субстрата и высоким содержанием побочного продукта эпигидрокортизона (до 40%) в среде трансформации, что может являться одной из главных причин значительных потерь целевого продукта на стадии выделения и химической очистки.

В литературе описан способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона мутантным штаммом Curvularia lunata. Субстрат (концентрация 1 г/л) вносят на стадию конверсии в 80% этаноле с соотношением 1:18 (об./об.) к 24 часовой культуре гриба и проводят трансформацию в течение 48 часов в ростовых условиях. Выход гидрокортизона при этом составляет 83,67% [12].

Недостатком данного способа получения гидрокортизона является его малая производительность, обусловленная низкой концентрацией субстрата.

Наиболее близким по достигаемому эффекту является способ получения ацетата гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона культурой Cunninghamella blakesleeana АТСС 8688а [19]. Трансформацию субстрата проводят 72 часовой культурой в ростовых условиях в присутствии ТВИН80, жидкого парафина или минерального масла в концентрации 1% (об./об.). Различные концентрации субстрата (0,15, 0,5, 1,0 г/л) на стадию трансформации вносят в 95% этаноле. Максимальный выход 21-ацетата гидрокортизона составляет 85,6% при концентрации субстрата 0,15 г/л.

Главным недостатком способа получения является малая производительность, обусловленная низкой концентрацией субстрата. При концентрации субстрата выше 0,15 г/л выход продукта в описанном способе резко снижается: при концентрации субстрата 0,5 г/л выход ацетата гидрокортизона не превышает 40%, а при концентрации субстрата 1,0 г/л выход продукта достигает лишь 30%.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании эффективного микробиологического способа получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона, обеспечивающего селективность реакции 11β-гидроксилирования, высокий выход продукта и возможность использования повышенных нагрузок стероидного субстрата.

Технический результат достигается за счет использования штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 и подбора оптимальных условий культивирования мицелия и трансформации 17α,21-диацетата кортексолона.

Анализ продуктов трансформации в динамике процесса проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого пробы культуральной жидкости заливают 2-4-кратным объемом этилацетата и проводят экстракцию стероидных соединений при интенсивном перемешивании в течение 3 мин. Анализ соединений проводят на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ (Россия) в системе бензол : ацетон 3:1 (об./об.). Просмотр хроматограмм в УФ-свете проводят на хемископе CN-15MC (Vilber Lourmat, Франция) при 254 нм.

Определение содержания продуктов на момент завершения процесса трансформации осуществляют методом ВЭЖХ. Анализ проводят на колонке Symmetry С18 250×4.6 мм (Waters), с предколонкой ODS-100, 10×4.6 мм (Serva); в следующих условиях: элюент - ацетонитрил : Н2O : уксусная кислота в соотношении 52:48:0,01 (об./об.), скорость протока - 1 мл/мин; объем петли - 20 мкл; температура колонки - 50°C; детекция при λ=240 нм; расчет концентраций производился с использованием значений площадей пиков.

Полученный предлагаемым способом 17α-ацетат гидрокортизона может быть выделен любым из известных методов, предусматривающих экстракцию продуктов органическим растворителем, отгонку растворителя и последующую кристаллизацию конечного продукта.

Способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Мицелий культуры грибного штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 первой генерации получают путем засева суспензии спор с одного агаризованного косяка 7 суточной культуры в 50 мл среды №1 следующего состава (г/л дистиллированной воды): крахмал - 40; соевая мука 15; pH 6.0 в колбе Эрленмейера (750 мл) и инкубированием на роторной качалке при 220 об/мин и 29°C в течение 72 ч. Посевной материал (10% об./об.) переносят в 90 мл среды №2 следующего состава (г/л дистиллированной воды): KH2РО4 - 16; K2HPO4 - 2; сахароза - 20; дрожжевой экстракт - 15; NaNO3 - 2; (NH4)2HPO4 - 3; MgSO4 - 0.5; FeSO4 - 0.01, pH 6.0 и продолжают культивирование в аналогичных условиях в течение 24 ч. Выросший мицелий отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 4000 об/мин 40 мин и промывают дважды 0.05М калий-фосфатным буфером. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона (4 г/л) проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл отмытым суточным мицелием второй генерации, который берут в количестве 30-35 г/л (в пересчете на вес сухой биомассы) в 50 мл 0.05 М калий-фосфатного буфера (pH 6.0) с добавлением 1% (об./об.) масляного раствора ретинола ацетата. Стероидный субстрат (4 г/л) вносят в трансформационный буфер в виде суспензии с использованием 1 мл дистиллированной воды с ТВИН 80 (0.1% об./об.) и продолжают инкубирование на роторной качалке при 220 об/мин. в течение 32 часов. По данным ВЭЖХ анализа культуральной жидкости мольный выход 17α-ацетата гидрокортизона составляет 78% или 2.88 г/л.

Пример 2. Способ осуществляется по примеру 1, но 17α,21-диацетат кортексолон (4 г/л) вносят в трансформационный буфер в виде горячего раствора диметилформамида (ДМФ) (конечная концентрация растворителя 1.5% об./об.). Мольный выход 17α-ацетата гидрокортизона за 24 ч трансформации составляет 86% или 3.16 г/л.

Пример 3. Способ осуществляется по примеру 2, но с добавлением в трансформационный буфер 0.5% (об./об.) ПЭГ 400. Мольный выход 17а-ацетата гидрокортизона за 18 ч трансформации составляет 95% или 3.49 г/л.

Пример 4. Способ осуществляется по примеру 3, но трансформацию проводят в биореакторе АНКУМ 2М объемом 10 л (рабочий объем 5 л). Для этого посевной материал 72 ч мицелия первой генерации (10% об./об.) переносят в биореактор, содержащий 4.5 л свежей среды №2 и продолжают культивирование при 700-800 об/мин, аэрации - 0.3-1 л/мин, pO2-15-20% при 29°C в течение 24 ч. Выросший мицелий отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 4000 об/мин 40 мин и промывают дважды 0.05 М калий-фосфатным буфером. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона (4 г/л) проводят отмытым суточным мицелием второй генерации, который берут в количестве 30-35 г/л (в пересчете на вес сухой биомассы) в 5 л 0.05 М калий-фосфатного буфера (pH 6.0 контролируют в течение всего времени трансформации титрованием 10% раствором NaOH) при 900 об/мин, аэрации 0.3-1.5 л/мин, рО2-40-45% при 29°C. Мольный выход 17а-ацетата гидрокортизона за 14 ч трансформации составляет 90% или 3.3 г/л.

Источники информации

1. Kelly S.L., Lamb D.C., Jackson C.J., Warrilow A.G., Kelly D.E. / Adv. Microb. Physiol. V. 47. P. 131-186. 2003.

2. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H.M. / Enzyme Microb. Technol. V. 32. №6. P.688-705. 2003.

3. Андрюшина В.А., Войшвилло H.E., Дружинина А.В. и др. / Патент РФ 2399674.

4. Sedlaczek L. / Crit. Rev. Biotechnol. V. 7. N. 3. P. 187-236. 1988.

5. Ангелова Б.А., Суходольская Г.В., Кощеенко К.А. / Микробиология. Т. 54. С. 704-709. 1985.

6. Wang J., Chen С., Li В., Zhang J., Yu Y. / Enz. Microbiol. Technol. V. 22. P. 368-373. 1998.

7. Ohlson S., Flygare S., Larsson P.O., Mosbach K. / Eur. J. Microbiol. Biotechnol. V. 10. P. 1-9. 1980.

8. Lu W., Du L., Wang M., Guo Y., Sun В., Wen J., Jia X. / Food and Bioprod. Proc. V. 85. P. 63-72. 2007.

9. VitasM., Rozman D., Komel R., Kelly S.L. // J. Biotechnol. V. 42. P. 145-150. 1995.

10. Ядерец В.В., Андрюшина В.А, Бартошевич Ю.А., Домрачева А.Г., Норвак М.И., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. / Прикладная биохим. микробиол. Т. 43. С. 695-700. 2007.

11. Lu W., Du L., Wang M, Wen J., Sun В., Guo Y. / Biochem. Eng. J. V. 32. P. 233-238. 2006.

12. Lu W., Du L., Wang M., Jia X., Wen J., Huang Y., Guo Y., Gong W., Bao H., Yang J., Sun B. / Appl. Biochem. Biotechnol. V. 142 P. 7-13. 2007.

13. Paraszkiewicz K., Dlugonski J. / Journal of Biotechnology. V. 65. P. 217-224. 1998.

14. Wang M., Lu FP., Wang FQ., Jiang Y., Du LX. / Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. V. 17. P. 710-712. 2001.

15. Суходольская Г.В., Ангелова Б., Кощеенко К.А., Басовская И.М., Скрябин Г.К. Патент РФ 1411336.

16. Wilmanska D, Milczarek К, Rumijowska A, Bartnicka К, Sedlaczek L. / Appl Microbiol Biotechnol. V. 37. P. 626-30. 1992.

17. Rozman D, Komel R. / Curr Genet. V. 22. P. 123-7. 1992.

18. Zhang В., Zhu H., Liu X. / Biotechnol. Prog. V. 20. P. 1885-1887. 2004.

19. Manosroi J., Saowakhon S., Manosroi A. / Enz. Microbiol Technol. V. 41. P. 322-325. 2007.

Микробиологический способ получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона, включающий культивирование в течение 24 ч мицелия Curvularia lunata ВКМ F-645 на питательной среде следующего состава, г/л дистиллированной воды: KH2PO4 - 16; K2HPO4 - 2; сахароза - 20; дрожжевой экстракт - 15; NaNO3 - 2; (NH4)2HPO4 - 3; MgSO4 – 0,5; FeSO4 - 0.01, pH 6,0, отделение выросшего мицелия от культуральной жидкости и промывку 0.05M калий-фосфатным буфером, внесение полученного мицелия в количестве 30-35 г/л в пересчете на вес сухой биомассы в трансформационную среду, состоящую из 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,0 с добавлением 1% об./об. масляного раствора ретинола ацетата и 0,5% об./об. ПЭГ 400, добавление 4 г/л 17α,21-диацетата кортексолона в трансформационную среду в виде горячего раствора диметилформамида с конечной концентрацией растворителя 1,5% об./об., инкубирование в течение 14-18 ч, выделение полученного 17α-ацетата гидрокортизона из культуральной жидкости путем экстракции и отгонки растворителя и кристаллизации известными методами.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к биохимии и генетической инженерии, в частности к рекомбинантному штамму Escherichia coli BL21(DE3; pQE-Nit2). Указанный штамм получен путём трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной конструкцией pQE-Nit2, которая находится под контролем промотора фага Т5, и предназначен для получения ω-амидазы человека (Nit2) при культивировании на питательных средах на основе пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой набор, содержащий авирулентные штаммы Yersinia pestis подвида pestis биовара orientalis КМ 2011, подвида pestis биовара antiqua КМ 2008, КМ 2012, КМ 260 (12), КМ 130(3), подвида pestis биовара medievalis КМ 2010, КМ 2014, КМ 2024, подвида caucasica КМ 2013, штаммы Yersinia pseudotuberculosis КМ 2004, КМ 2005, КМ 2006, Yersinia enterocolitica КМ 2007 и штамм Pasteurella multocida КМ 2003, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C.

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Lactobacillus, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм бактерий Lactobacillus paracasei DSM 25832, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25833, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25834, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25835, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25836 и штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25837.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный модифицированный глюкагоноподобный пептид-1 человека (рмГПП-1), способ его получения и штамм-продуцент E.coli ВКПМ В-12555.

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Способ изготовления состава ароматизированного молока, содержащего штамм Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis DL2126, VTT Е-123249 в качестве продуцирующего диацетил штамма и диацетил в количестве по меньшей мере 50 мг/кг в молочной среде, осуществляют следующим образом.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Заявлены - штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D, обладающий антагонистической активностью по отношению к штаммам Escherichia coli, и композиция, содержащая штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D и лактоферрин.

Изобретение относится к промышленной и экологической микробиологии. Предложен способ очистки содержащих толуол сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических предприятий.

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Propionibacterium, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм Propionibacterium acidipropionici DSM 25845, штамм Propionibacterium freudenreichii подвида shermanii DSM 25846, штамм Propionibacterium freudenreichii DSM 25847, штамм Propionibacterium thoenii DSM 25848 и штамм Propionibacterium thoenii DSM 25849.

Предложен усовершенствованный способ получения известного соединения ряда андростана, 17,17-этилендиоксиандроста-1,4-диен-3-она. Технический результат: разработан новый усовершенствованный способ, который осуществляется взаимодействием андроста-1,4-диен-3,17-диона с этиленгликолем в гетерогенной среде в присутствии триалкилортоформиата и арилсульфокислоты с последующим выделением целевого продукта путем фильтрации непосредственно из предварительно нейтрализованной реакционной массы.

Изобретение относится к соединению 2β,3α,5α-тригидрокси-андрост-6-ону, имеющему структуру формулы I Изобретение также относится к фармацевтической композиции и к способу получения соединения формулы I.

Настоящее изобретение относится к четырем кристаллическим формам (кристаллическим формам А, В, С и D) 5α-андростан-3β,5,6β-триола (YC-6) и к способам их получения. Указанные кристаллические формы имеют лучшую стабильность по сравнению с известными формами, содержат меньшее количество примесей и являются более безопасными.

Изобретение относится к соединениям формулы (I), обладающим свойствами антипрогестинов, и способу лечения рака молочной железы с применением этих соединений. В общей формуле (I) X представляет собой О; R1, R2, R3 и R4 представляют собой атом водорода; R5 представляет собой радикал Y, Y представляет собой ацетил, С3-циклоалкил или пиридинил; R6 представляет собой -ОН; и R7 представляет собой радикал формулы CnFmHo, где n равно 3, m равно 2 или 3, о равно 2 или 3 и m плюс о равно 5.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения андроста-4,9(11)-диен-3,17-диона из фитостерина.

Изобретение относится к стероидным лигандам для применения в индуцибельных системах экспрессии генов на основе ядерных рецепторов, а также к способам модуляции экспрессии представляющих интерес генов с использованием системы, включающей один или более комплексов ядерных рецепторов и один или более стероидных лигандов.

Изобретение относится к диацетату рацемического 18-этилгона-1,3,5(10),8(9)-тетраен-3,17 -диола, обладающему антиимплантационной и антиоксидантной активностью при пониженном утеротропном действии.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения 17α -ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона проводят отмытым от питательной среды суточным мицелием штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 второй генерации в 0,05 М калий-фосфатном буфере pH 6,0 с добавлением 1 об.об. масляного раствора ретинола ацетата и 0,5 об.об. ПЭГ 400. Мицелий штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 берут в количестве 30-35 гл в пересчете на вес сухой биомассы. Стероидный субстрат вносят в трансформационный буфер в виде горячего раствора диметилформамида с конечной концентрацией растворителя 1,5 об.об. с последующим инкубированием и выделением путем экстракции или отгонки растворителя и кристаллизации. 4 пр.

Наверх