Питательная среда плотная для культивирования и выращивания туляремийного микроба

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Питательная среда для культивирования туляремийного микроба содержит настой мозга теленка, мясной настой из мяса крупного рогатого скота, питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ), дрожжевой экстракт, глюкозу, L-цистеин, магний сернокислый, натрий сернистокислый, агар микробиологический, эмульсию желтка куриного яйца и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет получить достаточное количество колоний туляремийного микроба на 3 сутки. 2 пр.

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования и выращивания туляремийного микроба.

Известна свернутая желточная среда МакКоя, способ приготовления которой следующий: смешивают желток свежих куриных яиц с 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 3:2, смесь разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и в скошенном положении свертывают в течение 1 ч при 80°С. При обильном засеве рост туляремийного микроба появляется уже через 24-48 ч в виде сплошного газона с шероховатой поверхностью, однако при скудном посеве разрозненные беловатые колонии становятся заметными к 3-5-му дню. Поэтому посевы при температуре 37°С следует выдерживать до 10 суток (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководства. Москва: Медицина, Шико. 2009. С. 159).

Недостатком данной среды является незначительная чувствительность.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования и выделения туляремийного микроба сухая (FT-агар), содержащая, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной муки марки ФКС 17.0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 5.0; дрожжевой экстракт 2,3; магний сернокислый 0,5; натрия сульфит 0,7; агар 10±2.0. 34,0 г основы размешать в 970 мл дистиллированной воды, автоклавировать при 121°С в течение 15 мин. Охладить до температуры 50-45°С. Затем глюкозо-витаминной добавки (ГВД) в количестве 6,02 г растворить в 20 мл воды, автоклавировать при 110°С в течение 30 мин. В охлажденный раствор основы асептически внести раствор (ГВД), тщательно перемешать и разлить в чашки Петри (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. ФБУН государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. ГОСТ Р ИКО 9001-2015. Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для культивирования и выделения туляремийного микроба, сухая». (FT-агар). ТУ 9398-028-78095326-2007. Г. Оболенск., Московская обл., Серпуховской район. ФБУН ГНЦ ПМБ.

Данный качественный и количественный состав компонентов питательной среды максимально приближен по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению.

Целью настоящего изобретения является получение качественной питательной среды плотной для культивирования туляремийного микроба на водных настоях мозга теленка, мясного крупного рогатого скота и питательного бульона для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) и стимулирующей добавки эмульсии желтка куриного яйца.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит настои мозга теленка, мясного из мяса крупного рогатого скота и питательного бульона для культивирования микроорганизмов сухого (СПБ), среда также включает: дрожжевой экстракт, глюкозу, магний сернокислый, натрий сернистокислый, агар микробиологический, L-цистеин, дистиллированную воду, с добавлением в среду стимулирующей добавки, в качестве которой используют эмульсию желтка куриного яйца; при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Настой мозга теленка 200,0-300,0
Мясной настой из мяса КРС 200,0-300,0
Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (СПБ) 10,-20,0
Дрожжевой экстракт 1,5-3,5
Глюкоза 0,5-1,5
L-цистеин 0,3-0,7
Магний сернокислый 0,5-0,9
Натрий сернистокислый 0,5-0,9
Агар микробиологический 9,0-15,0
Эмульсия желтка куриного яйца 5,0-15,0
Дистиллированная вода до 1 л

Для приготовления питательной основы настоя мозгов теленка в качестве исходного сырья используют мозги теленка, содержащие, мг в 100 г субпродукта: глютаминовой кислоты 1426; оксипролина 32; пролина 732; серина 555; тирозина 375; общее количестве аминокислот составляет 11546; нуклеиновые кислоты 258. В 100 г субпродукта %: воды 77,6; белка 11,8. Незаменимые аминокислоты составляют 4464, в том числе: валина 602; изолейцина 546; лейцина 970; лизина 841; метионина 232; треонин 540; триптофана 164; фенилаланина 569. Заменимые аминокислоты, в том числе: аланина 772; аргинина 574; аспарагиновой кислоты 1138; гистидина 623; глицина 610. Приготовление желатина проводят из костной ткани, хрящей и соединительной ткани животных. Особенно много эластинов в связках и сухожилиях, содержащие много моноаминокислот, глицина, однако почти нет серосодержащих аминокислот и триптофана (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва: Пищевая промышленность. 1979. 247 с.).

Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) производства Махачкала, ул. Леваневского, д. 24. Состав, г/л: панкреатический гидролизат из кильки 10,0 натрия хлорида 4,95, рН 7,2±0,2. Порошок рассыпчатый, без комков готовый к применению. МИКРОГЕН ФГУН «НПО» Микроген МЗ РФ, РОССИЯ, г. Москва, ул. 1-я Дубровская, д. 15.

Дрожжевой экстракт, производство Франция, партия №071105630, дата изготовления 10.2015 г., годен до 10.2018 г. Дрожжевой экстракт используется в качестве полноценного и дешевого источника факторов роста микроорганизмов, что повышает ростовые свойства предлагаемой питательной среды (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1986). По химическому составу дрожжевые среды представляют высокоценный питательный субстрат, весьма близкий к мясу, содержит до 53% белка. Богатство дрожжей белками и витаминами позволяет получать из них высококачественные питательные среды (Козлов М.Ю., 1950).

Глюкоза безводная, ГОСТ6938-79, производство Нева-реактив, партия 6, дата изготовления 11.06.15 г., - источник углерода для обеспечения роста туляремийного микроба.

Натрий сернистокислый, импорт, партия №03 от 14.02.16 г., срок хранения 6 мес. Регулятор окислительно-восстановительного потенциала среды является серосодержащим веществом. Снижение окислительно-восстановительного потенциала можно достигнуть искусственным путем - введением в среду натрия сернистокислого. Концентрация натрия сернистокислого в пределах от 0,1 до 0,7% оказалась наиболее благоприятной. Указанные концентрации натрия сернистокислого создают оптимальный уровень окислительно-восстановительного потенциала (рН 7,0±0,2) для начала роста.

Агар микробиологический (европейский тип). Производитель: Испания. Партия LF15110173.

Приготовление водного настоя мозга теленка

Мелкий помол через мясорубку, на 1 килограмм продукта 1,5 литра воды питьевой, затем настаивают 6 дней при комнатной температуре. Полученный настой хранится под 2% хлороформом 6 суток, затем используется. Содержание сухого остатка составляет 2,5%.

Приготовление мясного настоя

Мясной настой приготавливают аналогично приготовления мозга теленка. Используют мясо крупного рогатого скота 1 сорт.

Приготовление эмульсии из желтка куриного яйца

Используют куриные яйца сорт 1, для снятия различных загрязнений их моют под проточной водой хозяйственным мылом щеткой, затем каждое яйцо обтирают спиртом и складывают в кристаллизатор, застланный марлей, смоченной 70°С спиртом, затем в стерильном боксе аккуратно вскрывают стерильным пинцетом - пробивают скорлупу, постепенно убирая полностью белок, не поранив желток, затем желток над факелом спиртовки опускают в стерильную колбу, добавляя на каждый желток половину скорлупки забуференного физиологического раствора, аккуратно взболтать до получения эмульсии.

Приготовление питательной среды для культивирования и выращивания туляремийного микроба заключается в следующем.

Берут по 250,0 г настоев мозга теленка и мясного, добавляют питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 15,0, а также добавляют следующие ингредиенты в соотношении, г/л: дрожжевой экстракт 2,5; глюкозу 1,0; магний сернокислый 0,7; натрий сернистокислый 0,7; агар микробиологический - 12,0; L-цистеин 0,5; дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) в количестве 0,5 мл до рН 7,0±0,1. Приготовленную питательную среду (основу) разливают в 5 градуированные флаконы объемом 200 мл по 198 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный в кипящей водяной бане и остуженный до 56°С агар, добавляют эмульсию желтка куриного яйца в количестве 2,0 мл в каждый флакон, затем тщательно перемешивают разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования туляремийного микроба проводят путем подсчета количества выросших колоний при посеве из 10-6 и 10-7 разведений.

Эффективность полученной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-07) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием в качестве тест-культуры F. Tularensis 15 НИИЭГ. Испытуемую культуру выращивают на поверхности скошенного FT агара рН 7,0±0,1 при температуре 37°С в течение 48±2 ч. Из двухсуточной культуры тест-штамма туляремийного микроба готовят взвесь в 0,9% растворе натрия хлористого, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П ГИСК им. Л.А. Тарасевича, эквивалентную 5×109 м.к./мл, полученную микробную взвесь культуры разводят в 5 раз (к 1 мл взвеси добавляют 4,0 мл раствора натрия хлористого). Полученное разведение эквивалентно 1×109 м.к./мл. Из исходной стандартной взвеси делают десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл культуры в 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлористого, тщательно перемешивают, меняют стерильную пипетку после каждого разведения. Для контроля качества сред применяют разведения 10-6 (1×103 м.к./мл) и 10-7 (1×102 м.к./мл).

Контроль плотных питательных сред. По 0,1 мл взвеси тест-штамма F. tularensis из разведений 106 (100 м.к./мл) и 107 (10 м.к./мл) высевают на 3 чашки Петри с испытуемой средой и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Контролем служит заранее проверенный агар высокого качества FT-агар. Посевы инкубируют при температуре 37±1°С. Учитывали результат подсчета выросших колоний через каждые 24-48-72-120 ч.

Эффективность исследуемых сред оценивают в соответствии с методическими рекомендациями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителя чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза», Москва, 2008.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на плотной питательной среде, содержащей, г/л: настой мозга теленка 200,0; мясной настой 200,0; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 10,0; дрожжевой экстракт 1,5; глюкозу 0,5; L-цистеин 0,3; магний сернистокислый 0,5; натрий сернистокислый 0,5; агар микробиологический 9,0; эмульсию желтка куриного яйца 5,0; воду дистиллированную до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для туляремийного микроба тест-штамма F. tularensis 15 НИИЭГ при посевной дозе 100 м.к. и 10 м.к. составило 35% колоний соответственно диаметром 1,2 мм, тогда как на контрольной среде FT-агаре вырастало более 40% колоний соответственно диаметром 1,5 мм.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на плотной питательной среде, содержащей, г/л: настой мозга теленка 250,0; мясной настой 250,0; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 15,0; дрожжевой экстракт 2,5; глюкозу 1,0; L-цистеин 0,5; магний сернистокислый 0,7; натрий сернистокислый 0,7; агар микробиологический 12,0; эмульсию желтка куриного яйца 10,0; воду дистиллированную до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для туляремийного микроба тест-штамма F. tularensis 15 НИИЭГ при посевной дозе 100 м.к. и 10 м.к. составило более 60% колоний соответственно диаметром 1,8 и 2,0 мм, тогда как на контрольной среде FT-агаре вырастало более 40% колоний соответственно диаметром 1,5 мм.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: настой мозга теленка 300,0; мясной настой 300,0; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 20,0; дрожжевой экстракт 3,5; глюкозу 1,5; L-цистеин 0,7; магний сернистокислый 0,9; натрий сернистокислый 0,9; агар микробиологический 15,0; эмульсию желтка куриного яйца 15,0; воду дистиллированную до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для туляремийного микроба тест-штамма F. tularensis 15 НИИЭГ при посевной дозе 100 м.к. и 10 м.к. составило 30% колоний соответственно диаметром 1,5 мм, тогда как на контрольной среде FT-агаре вырастало более 40% колоний соответственно диаметром 1,5 мм.

Таким образом, пример 2 питательной среды является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов питательной среды плотной для выращивания и культивирования туляремийного микроба, что позволяет получить достаточное количество колоний туляремийного микроба на 3 сутки.

Питательная среда плотная для культивирования и выращивания туляремийного микроба, содержащая, г/л:

Настой мозга теленка 200,0-300,0
Мясной настой из мяса КРС 200,0-300,0
Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (СПБ) 10,0-20,0
Дрожжевой экстракт 1,5-3,5
Глюкоза 0,5-1,5
L-цистеин 0,3-0,7
Магний сернокислый 0,5-0,9
Натрий сернистокислый 0,5-0,9
Агар микробиологический 9,0-15,0
Эмульсия желтка куриного яйца 5,0-15,0
Дистиллированная вода до 1 л



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения белка с помощью микроорганизма. Настоящий способ включает введение экспрессионной конструкции в микроорганизм, которая содержит промотор и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, и экспрессию белка в микроорганизме.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения 17α -ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона проводят отмытым от питательной среды суточным мицелием штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 второй генерации в 0,05 М калий-фосфатном буфере pH 6,0 с добавлением 1% об./об.

Настоящее изобретение относится к биохимии и генетической инженерии, в частности к рекомбинантному штамму Escherichia coli BL21(DE3; pQE-Nit2). Указанный штамм получен путём трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной конструкцией pQE-Nit2, которая находится под контролем промотора фага Т5, и предназначен для получения ω-амидазы человека (Nit2) при культивировании на питательных средах на основе пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой набор, содержащий авирулентные штаммы Yersinia pestis подвида pestis биовара orientalis КМ 2011, подвида pestis биовара antiqua КМ 2008, КМ 2012, КМ 260 (12), КМ 130(3), подвида pestis биовара medievalis КМ 2010, КМ 2014, КМ 2024, подвида caucasica КМ 2013, штаммы Yersinia pseudotuberculosis КМ 2004, КМ 2005, КМ 2006, Yersinia enterocolitica КМ 2007 и штамм Pasteurella multocida КМ 2003, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C.

Группа изобретений относится к штаммам бактерий рода Lactobacillus, композициям на их основе и их применению. Предложены штамм бактерий Lactobacillus paracasei DSM 25832, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25833, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25834, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25835, штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25836 и штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 25837.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный модифицированный глюкагоноподобный пептид-1 человека (рмГПП-1), способ его получения и штамм-продуцент E.coli ВКПМ В-12555.

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Способ изготовления состава ароматизированного молока, содержащего штамм Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis DL2126, VTT Е-123249 в качестве продуцирующего диацетил штамма и диацетил в количестве по меньшей мере 50 мг/кг в молочной среде, осуществляют следующим образом.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Заявлены - штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D, обладающий антагонистической активностью по отношению к штаммам Escherichia coli, и композиция, содержащая штамм Lactobacillus gasseri ВКМ B-2918D и лактоферрин.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, применение вышеуказанного капсулярного полисахарида для получения вакцинной композиции и способ получения вакцинной композиции.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ продуцирования С2-оксигенатов путем анаэробной ферментации с использованием микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D, обладающий способностью биодеградировать устойчивые токсичные соединения перфтороктансульфоновой кислоты (ПФОС), депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.

Изобретение относится к способу получения модели ожирения животного. Способ предусматривает инокулирование аксенического животного бактерией Enterobacter cloacae, имеющей ген 16S рРНК, для получения инокулированного животного, где последовательность гена 16S рРНК представляет собой SEQ ID NO.1; и кормление инокулированного животного кормом, имеющим 34,9% содержания жира, в течение по крайней мере четырех недель для получения модели ожирения животного.

Изобретение относится к автоматизации технологических процессов. Предложен способ управления процессом производства биомассы аэробных микроорганизмов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения белка протеазы посредством бактерии рода Bacillus путем введения в нее первой экспрессионной конструкции, которая кодирует целевой белок протеазу, и второй экспрессионной конструкции, которая кодирует отличную от целевого белка вспомогательную протеазу с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и дальнейшей экспрессии указанных протеаз в указанном микроорганизме.

Настоящее изобретение относится к биохимии и генетической инженерии, в частности к рекомбинантному штамму Escherichia coli BL21(DE3; pQE-Nit2). Указанный штамм получен путём трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной конструкцией pQE-Nit2, которая находится под контролем промотора фага Т5, и предназначен для получения ω-амидазы человека (Nit2) при культивировании на питательных средах на основе пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой набор, содержащий авирулентные штаммы Yersinia pestis подвида pestis биовара orientalis КМ 2011, подвида pestis биовара antiqua КМ 2008, КМ 2012, КМ 260 (12), КМ 130(3), подвида pestis биовара medievalis КМ 2010, КМ 2014, КМ 2024, подвида caucasica КМ 2013, штаммы Yersinia pseudotuberculosis КМ 2004, КМ 2005, КМ 2006, Yersinia enterocolitica КМ 2007 и штамм Pasteurella multocida КМ 2003, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма Brucella melitensis Rev-1. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота предусматривает посев и выращивание штамма Brucella melitensis Rev-1 на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина глубокой степени расщепления, экстракта дрожжей, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и агар-агар в заданном соотношении компонентов в течение 72 часов при 37°C.

Изобретение относится к биотехнологии. Универсальная питательная среда для культивирования коринебакетрий, нокардий и родококков содержит панкреатический гидролизат кильки, Д- глюкозу, KH2PO4, MgSO4, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, геотермальная вода, стерильная деффибринированная кровь животных и парафин в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие и ингибирующие свойства питательной среды. 2 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Питательная среда для культивирования туляремийного микроба содержит настой мозга теленка, мясной настой из мяса крупного рогатого скота, питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой, дрожжевой экстракт, глюкозу, L-цистеин, магний сернокислый, натрий сернистокислый, агар микробиологический, эмульсию желтка куриного яйца и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет получить достаточное количество колоний туляремийного микроба на 3 сутки. 2 пр.

Наверх