Штамм микроорганизма clonostachys rosea f. catenulata в качестве биофунгицида, стимулятора роста растений и продуцента метаболитов для сельскохозяйственного применения

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии. Описан штамм Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324. Данный штамм обладает фунгицидными свойствами и ростстимулирующей активностью и может быть использован в качестве средств для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями. Данный штамм также является продуцентом ценных метаболитов, таких как аминокислоты и фитогормоны, которые используются в сельском хозяйстве. Изобретение за счет своих свойств позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных растений. 5 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой штамм микроорганизма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324, используемый для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, а также в качестве стимулятора роста растений и продуцента метаболитов для сельскохозяйственного применения.

Микроорганизмы Clonostachys rosea f. catenulata известны с одной стороны в качестве деструктора поливинилового спирта. Из уровня техники известен документ RU 2415915 С1, 10.04.2011, в котором описан штамм Clonostachys rosea f. catenulata (J.C. Gilman et E.V. Abbott) Schroers ВКПМ F-991, используемый в качестве биодеструктора поливинилового спирта.

С другой стороны, известно, что микроорганизмы вида Clonostachys rosea f. catenulata используют в сельском хозяйстве. Известно использование для улучшения роста растений, например, в составе композиций, содержащих помимо микроорганизма также мульчу (см. WO 2014076663 А1, 22.05.2014).

Из уровня техники известны фунгицидные смеси на основе азолопиримидиниламинов, в которых в качестве противогрибковых агентов биологического контроля, биоактиваторов растений используют штамм, или бесклеточный экстракт, и/или мутант этого штамма или экстракта, имеющий все отличительные характеристики соответствующего штамма или экстракта Clonostachys rosea f. catenulata (WO 2011/117271, 29.09.2011).

Из уровня техники известно также использование других видов данного микроорганизма. Так, известен штамм Clonostachys rosea f. rosea, IDAC 040913-01, который подавляет или контролирует заболевание или патоген, которые поражают листья, цветы, плоды и/или корни растения (WO 2015/035504, 19.03.2015). В данном документе описана также композиция, включающая выделенную культуру данного штамма, способ обработки растения агентом биологической защиты, включающий контактирование растения с выделенной культурой, спорами гриба или указанной композицией, способ уменьшения порчи растительного материала, где способ включает контактирование растительного материала с выделенной культурой, спорами гриба или композицией.

Штамм Clonostachys solani f. nigrovirens (van Beyma) Schroers ВКПМ F-990 известен как биодеструктор термопластичного полиуретана и латекса на основе акриловой кислоты (RU 2415917 С1, 10.04.2011).

Задачей же настоящего изобретения является получение высокоэффективного штамма для использования в сельском хозяйстве для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, для ускорения роста и развития растений, для увеличения урожайности и качества продукции, а также для получения используемых в сельском хозяйстве ценных метаболитов, таких как аминокислоты и фитогормоны.

Авторами настоящего изобретения был выделен штамм Clonostachys rosea f. catenulata, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-F1324.

Штамм выделен из ризосферы хлопчатника в Ташкентской области.

Культурально-морфологические признаки штамма

Колонии на сусло-агаре вначале белые, опушенные, со временем приобретающие серо-зеленоватый цвет) с концентрической зональностью, реверс светло-желтый. Конидиеносцы по периферии колонии вертициллоидного типа, с широко расходящимися фиалидами, в центре преобладают конидиеносцы пенициллоидного типа с более плотно сжатыми фиалидами, двух- и трехъярусные, конидии овальные) в длинных цепочках, слизистые.

Растет в аэробных условиях. Хороший рост при 10…30°С, растет в широких пределах рН от 3,0 до 9.

Для штамма характерен хороший рост и спороношение при выращивании на агаровых средах - сусло-агар, картофельно-сахарозная среда, среда Чапека, крахмально-соевая, среда из отвара отрубей.

Спорообразование начинается на пятый день роста при 24…26°С.

Линейный рост колонии на агаризованных средах

На сусло-агаровой среде на чашках Петри - на 10-й день роста - размером в 50 мм, на 20-й день - 80 мм.

На картофельном агаре на 14-й день роста - 45 мм, на 20-й день 90 мм.

На агаровой среде Чапека с сахарозой на 12-й день роста - 45 мм, на 20-й день - 85 мм.

При глубинном культивировании на минеральных и органических средах штамм растет в виде гомогенной массы бежевого или зеленого цвета.

Колонии на агаре Чапека белые, распростертые, пушистые, с конидиеносной зоной в центре колонии, оливково-зеленого или зеленого цвета, при старении темно-зеленого, разделенной 1-2 концентрическими кругами (зонами) стерильного светлого мицелия. Воздушный мицелий обильный, часто в виде гифальных тяжей. Конидиеносцы обычно однократно, иногда двукратно ветвистые, грубые, с шероховатой или точечной оболочкой 50-125 μ длины, с цепочками конидий, соединенными слизью в плотную колонку до 150 μ длины. Первичные веточки 15-20=3,5-4 μ; метули 15-25 μ, стеригмы 10-20 μ длины. Конидии эллиптические, гладкие, бледно- или темно-зеленые 4-7,5=3-4 μ.

Физиолого-биохимические свойства

При росте на среде Чапека из источников углерода усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, галактозу, лактозу, рафинозу, арабинозу, сорбозу, крахмал, глицерин. Из источников азота использует нитрат Na и нитрат K, сернокислый аммоний, нитрат аммония, хлористый аммоний, аммоний фосфорнокислый однозамещенный, пептон, лейцин, лизин, аспарагин.

Штамм синтезирует

Антибиотики: глиокладин, глиоверин, виридин; ферменты: Бета-1,2-глюконазу, целлобиазу, хитиназу; аминокислоты: глутаминовую, глицин, аргинин, пролин, цистеин, меионин, орнитин, лизин, фенилаланин; ауксины: индолилмолочную, индолилуксусную, индолилкарбоновую кислоты; гиберрилиновую и абсцизовую кислоту; углеводороды, в том числе этилен.

Штамм гриба Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 не патогенен для теплокровных животных и человека.

Были исследованы антагонистические свойства по отношению к широкому перечню фитопатогенных грибов и бактерий. Также был проведен анализ синтеза ряда метаболитов.

В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что в результате действия штамма существенно снижается заболеваемость растений, снимаются острые формы поражения, ускоряется развитие растений, возрастает урожай и качество продукции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Изучение антагонизма активности штамма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ ВКПМ-F1324 сравнивалось с изученными штаммами Gliocladium в чашках Петри и на газонах фитопатогенных грибов Verticillium dahliae и Fusarium oxysporum. Активность оценивали по диаметру зоны отсутствия роста тест-объекта вокруг блока антагониста и по интенсивности воздействия антагониста на газон - степени просветления газона, что отмечено плюсами.

Оценка защитного действия штаммов грибов-антагонистов проводилась на сероземной почве +2 т/га лигнина в микровегетационном опыте, где в почву совместно с антагонистами были внесены микросклероции Verticillium dahliae 0,15 г/кг. Для сравнения в опыт был включен штамм - Trichoderma B-18. Действие антагонистов на Verticillium dahliae в почве и на заражение хлопчатника вертициллезом представлено в таблице 2.

Защитный эффект Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 оказался сильнее других штаммов Gliocladium catenulatum и Trichoderma.

Оценка фитотоксичности культуральной жидкости штамма проводилась по методике Берестецкого на семенах огурца и томата в сравнении с другими Gliocladium catenulatum 3, Trichoderma harzianum B-18, Fusarium oxysporum и Verticillium dahliae.

Результат сравнения свидетельствует о значительном стимулирующем действии на прорастание семян при их замачивании в культуральной жидкости штамма ВКПМ-F1324.

Штамм Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 способен также проявлять антибактериальные свойства. Оценка антибактериального действия штамма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 проводилась на чашках Петри методом противоположных колоний со штаммом бактерии Ralstonia solanacearum. Активность оценивали по воздействию микроорганизмов друг на друга.

Через 3 дня после начала эксперимента произошло соприкосновение зон роста штамма Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324 и бактерии Ralstonia solanacearum. Рост бактерии прекратился и началось подавление Ralstonia solanacearum. Через 14 дней штамм бактерии Ralstonia solanacearum был полностью подавлен штаммом Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324.

Таким образом, штамм Clonostachys rosea f. сatenulata, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика» 18 мая 2016 года под регистрационным номером ВКПМ-F1324, может быть успешно и эффективно использован против возбудителей грибных и бактериальных болезней растений, а также для стимуляции роста растений.

Анализ фитогормонов (ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты) в культуральной жидкости гриба.

Для экстракции ауксинов, гиббереллинов и абсцизовой кислоты брали 20 мл культуральной жидкости или стерильной питательной среды (контроль). Растворы доводили до рН=3,0 4н соляной кислотой и экстрагировали эквивалентными объемами этилацетата. Полученные экстракты выпаривали досуха под вакуумом при 350°С и растворяли в 350 мкл 18% ацетонитрила. Анализ ауксинов в полученных пробах проводили методом Ультра Производительной жидкостной хроматографии (UPLC) на системе Waters ACQUITY UPLC Н-класса (Waters, США). Анализ содержания ауксинов проводили с использованием флуоресцентного детектора при длинах волн: Ех=280 нм, Ем=350 нм. Анализ проводили на хроматографической колонке Waters ACQUITY UPLC ВЕН RP18 Shield 1,7 мкм × 50 мм в 18% растворе ацетонитрила с добавлением 0,1% уксусной кислоты при скорости потока 0,3 мл/мин. После анализа каждого образца колонку промывали 3 минуты 80% ацетонитрилом. Анализ абсцизовой и гибберелловой кислот проводился по той же методике, но с обнаружением целевого метаболита на ультрафиолетовом диодноматричном детекторе при длине волны 265 нм (абсцизовая кислота) и 208 нм (гиббереллины).

Результаты анализа представлены в таблице 4

Анализ содержания аминокислот в культуральных жидкостях.

Равные объемы культуральных жидкостей (по 50 мл) концентрировали под вакуумом на ротационном испарителе до объема 3 мл. Для определения состава аминокислот использовался современный высокочувствительный метод AccQ-Tag (Waters, США), основанный на применении дериватизационного реагента ACQ - 6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl carbamate, превращающего аминокислоты в стабильные флуоресцирующие производные. Полученные производные разделялись методом обращеннофазовой хроматографии на колонке С18 Waters AccQ-Tag с обнаружением на флуоресцентном детекторе согласно стандартной методике Waters. Определение содержания L-триптофана проводилось в тех же концентрированных образцах, но без обработки реактивом ACQ с обнаружением на флуоресцентном детекторе (длина волны возбуждения флуоресценции - 280 нм, длина эмиссионной волны - 350 нм).

Количество обнаруженных аминокислот представлено в таблице 5. Показано, что культуральная жидкость гриба отличается повышенным количеством глутаминовой кислоты и глицина.

Контроль - стерильная питательная среда.

GABA - гамма-аминомасляная кислота.

Штамм Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324, используемый для защиты растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, а также в качестве стимулятора роста растений и продуцента метаболитов, таких как фитогормоны и аминокислоты.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения молекулярного комплекса, обладающего активностью GAA (кислой альфа-глюкозидазы), включающий контактирование полипептида с активностью GAA с протеазой из гриба вида Aspergillus oryzae, при этом указанная протеаза расщепляет указанный полипептид в одном или более сайтах между аминокислотой 50 и аминокислотой 74 последовательности указанного полипептида.

Группа изобретений относится к способу понижения содержания ДНК в ферментационном бульоне, полученном от культивирования клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов.
Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к производству ферментных препаратов, которые могут быть использованы в кормовой отрасли. Предложены штаммы мицеллиальных грибов: Penicillium canescens ВКМ F-4643D – продуцент комплексного ферментного препарата, включающего кислую протеазу, лейцинаминопептидазу, эндо-ксиланазу и β-глюканазу, отличающегося повышенной активностью по гемоглобину, L-лейцин-пара(4)-нитроанилиду, ксилану и бета-глюкану, Penicillium canescens BKM F-4668D – продуцент комплексного ферментного препарата, включающего сериновую протеазу, эндо-ксиланазу и β-глюканазу, отличающиеся повышенной активностью по казеинату натрия, ксилану и бета-глюкану.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микроскопического гриба Trichoderma asperellum OPF-19, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1323 и может быть использован для создания биопрепарата комплексного действия для использования в растениеводстве, в том числе при ведении органического земледелия.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм нематофагового гриба Arthrobotrys oligospora Т-15, обладающий способностью прорастать внутрь цист и поражать яйца, а также личинки нематод в них, разрушая их содержимое, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1303.

Изобретение относится к медицине, а именно к андрологии, репродуктологии. Применение «Экстракта мицелия вешенки «РЕВИТАЦЕЛ» в качестве препарата для приращения процентного соотношения уровня повышения активности сперматозоидов человека.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ упаковки грибных спор, грибные споры, упакованные вышеуказанным способом, и запечатанная упаковка с жизнеспособными спорами грибов.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиального гриба Trametes hirsute, обладающий способностью продуцировать этиловый спирт, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1287.

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ определения относительной устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков Bipolaris sorokiniana Shoem путем обработки растительных образцов культуральными фильтратами возбудителя, содержащими токсины гриба, отличающийся тем, что в качестве растительных образцов используют проростки, выращенные в рулонной культуре на водопроводной воде до фазы 2-3 листьев, опытные образцы проростков выдерживают в культуральном фильтрате возбудителя болезни в разведении 1:1 в течение 24 часов, контрольные образцы - в дистиллированной воде то же время, готовят нарезки из средней части вторых листьев проростков контрольных и опытных образцов, помещают их в дистиллированную воду в соотношении 1:4 на 1,5 часа в условия освещения, фильтруют вытяжки, определяют их электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 кГц и оценивают относительную устойчивость сорта по отношению где Gк - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов;Go - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов, чем меньше вычисленное отношение, тем устойчивее сорт среди группы оцениваемых сортов мягкой яровой пшеницы.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложена питательная среда для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов, содержащая пивное сусло, углеводы, муку зерновых и воду с добавлением перекиси водорода (0,01%-0,02%) и водного раствора коллоидного серебра (0,0015%-0,0045%).

Группа изобретений относится к био-нематоцидной композиции для профилактики или уничтожения или борьбы с нематодами в культурах, пораженных нематодами Globodera spp, образующими цисты, и ее применению.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микроскопического гриба Trichoderma asperellum OPF-19, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1323 и может быть использован для создания биопрепарата комплексного действия для использования в растениеводстве, в том числе при ведении органического земледелия.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм нематофагового гриба Arthrobotrys oligospora Т-15, обладающий способностью прорастать внутрь цист и поражать яйца, а также личинки нематод в них, разрушая их содержимое, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1303.

Изобретение относится к биологическим средствам для повышения продуктивности культурных растений и защиты их от болезней. Изобретение представляет собой базовую композицию комплексного биопрепарата для растениеводства, включающую в себя комплекс жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, продуцируемых микромицетом Mortierella alpina ВКПМ F-1134 и целевые добавки: биоразлагаемый детергент, а также аскорбиновую кислоту или α-токоферол или β-каротин, а среди жирных кислот присутствуют гептадекановая и эйкозановая кислоты, в ее составе также присутствуют продуцируемые штаммом Mortierella alpina ВКПМ F-1134 миристиновая, пентадекановая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, γ-линоленовая, дигомо- γ-линоленовая, эйкозадиеновая и гондоиновая жирные кислоты, содержание и соотношение которых не нормируется.

Изобретение относится к биотехнологии, химическому производству биологически активных веществ, сельскому хозяйству. Для получения состава с гербицидной активностью производят растворение феосферида А или экстракта из культуры его продуцента, содержащего не менее 60% феосферида А, в органическом растворителе и добавление водного раствора адъюванта в соотношении 1:50:950 и 5:50:950 соответственно.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Комбинация активных соединений для борьбы с насекомыми, нематодами или фитопатогенами содержит: (A) флуопирам, (B) спорообразующую бактерию рода Bacillus, выбранную из группы, состоящей из Bacillus firmus, Bacillus firmus штамма CNCM I-1582, и (C) по меньшей мере один биологический контролирующий агент, выбранный из группы, состоящей из (С1) бактерий, выбранных из (С1.27) Bacillus thuringiensis, и (С2) грибов или дрожжей, выбранных из (С2.9) Metarhizium anisopliae.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для создания биозащиты растений от фитопатогенов и стимуляции их роста. Группа изобретений включает: штаммы гриба вида Trichoderma longibrachiatum (3 варианта); биопрепарат для стимулирования роста растений и их защиты от фитопатогенов на основе этих штаммов и способ получения этого биопрепарата.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептид с элиситорной активностью в отношении иммунного ответа на патогены у растений, представляющий собой субтилизин, имеющий происхождение из штамма Acremonium strictum, где такой полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к области защиты растений от вредителей и болезней. Штамм Lecanicillium muscarium МП-4 обладает инсектоакарицидной, а также антибиотической активностью к комплексу фитопатогенных грибов и бактерий.

Предложен штамм гриба Mortierella alpina ВКПМ F-1134 для производства комплекса жирных кислот с преобладанием арахидоновой кислоты, проявляющего рострегулирующий эффект по отношению к растениям.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Гербицидный препарат содержит: по меньшей мере один гербицидный активный компонент, представляющий собой глуфосинат-аммоний; гидротроп, представляющий собой октансульфонат натрия; и адъювант, представляющий собой С8 эфиросульфат, где массовое отношение гербицидного активного компонента к адъюванту составляет от 1:1 до 1:5.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии. Описан штамм Clonostachys rosea f. catenulata ВКПМ-F1324. Данный штамм обладает фунгицидными свойствами и ростстимулирующей активностью и может быть использован в качестве средств для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями. Данный штамм также является продуцентом ценных метаболитов, таких как аминокислоты и фитогормоны, которые используются в сельском хозяйстве. Изобретение за счет своих свойств позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных растений. 5 табл.

Наверх