Универсальная питательная среда для изолирования микобактериоподобных микроорганизмов

Изобретение относится к биотехнологии. Универсальная питательная среда для культивирования коринебакетрий, нокардий и родококков содержит панкреатический гидролизат кильки, Д- глюкозу, KH2PO4, MgSO4, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, геотермальная вода, стерильная деффибринированная кровь животных и парафин в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие и ингибирующие свойства питательной среды. 2 табл.

 

Изобретение рекомендуется использовать в бактериологических лабораториях для культивирования микобактериоподобных микроорганизмов, в частности коринебактерий, нокардий и родококов, сенсибилизирующих по многочисленным данным организм животных к туберкулину.

Накопленные на сегодняшний день данные по лабораторному выявлению указанных микроорганизмов не позволяют определить универсальную, простую в изготовлении, доступную и эффективную питательную среду для культивирования, поэтому для повышения результативности приходиться пользоваться несколькими средами. Нередко при выборе сред исходят из лабораторных возможностей, доступности сред, пренебрегая при этом диагностическими свойствами [1, 5, 7].

Для изолирования коринебактерий используют питательные среды: нитритный агар по Виноградскому, среда Сотона, кровяной агар, кровяно-теллуритовый агар, среда Клауберг II, среда Бучина [1, 7], для нокардий и родококков, среда Мюнца, УМ-агар, среда с овсяной мукой, декстрозный агар, питательный бульон [5, 6].

Нитритный агар по Виноградскому [2] с н-алканами (гексодекан C16H34) в количестве 2% и синтетическая среда Сотона с добавлением 2%-ой смеси углеводородов имеют существенные недостатки. Углеводороды имеют разные температурные параметры кипения, в связи с чем стерилизовать в термостате их приходиться по отдельности при разных температурных режимах, что создает определенные трудности при их подготовке. Кроме того, среды отличаются слабыми ростовыми свойствами.

Кровяной агар, состоящий из расплавленного и охлажденного до 45-50°С питательного агара и 5-10% дефибринированной или цельной свежи взятой крови животного, имеет низкие ингибирующие свойства по отношению к сопутствующей микрофлоре.

Указанные недостатки относятся и к кровяно-теллуритовому агару, отличающемуся от кровяного агара наличием 2 мл 2% раствора теллурита калия (K2TeO3).

Среда Клауберг II, отличается сложностью в изготовлении. Химически чистый глицерин, требуемый для приготовления глицериновой смеси, необходимо стерилизовать при 110°С в течение 30 минут. Изготовление среды осложняется еще и тем, что нужно предварительно приготовить лаковую кровь из дистиллированной воды и дефибринированной крови животного, что сопряжено с дополнительными расходами и временем. Видимые колонии на данной среде появляются не раньше 48 ч.

Сывороточный агар, состоящий из питательной среды с 10-15% лошадиной или бычьей стерильной сывороткой, имеет низкие дифференцирующие свойства на фоне обильного роста сопутствующей микрофлоры.

Сухая хинозольная среда Бучина [4], характеризуется низкой высеваемостью. Среда содержит 2 вида минеральных солей, что по нашему мнению недостаточно для качественного обеспечения углеводородокисляющих микроорганизмов необходимыми факторами роста а также микро- и макроэлементами [1, 6].

Среда Мюнца для выделения и выращивания нокардий и родококков, с добавлением парафиновой приманки, обладает слабыми ростовыми свойствами.

Низкими ингибирующими свойствами характеризуются среды УМ-агар и питательный бульон.

Среда с овсяной мукой и декстрозный агар не отличаются диагностической ценностью из-за низкой высеваемости, а также обильным ростом посторонней микрофлоры.

С учетом вышесказанного, при конструировании универсальной питательной среды мы исходили из содержания в среде пластического материала (азот, углерод, водород, кислород) для построения тела микробных клеток, источника энергий (Д-глюкоза), а также минимального количество микроэлементов, участвующих в образовании коферментов. Кроме основных компонентов (пластических и энергетических) для нормального развития микроорганизмам необходим «фактор роста», которыми являются парафин, агар микробиологический и дефибринированная кровь животных.

Воду (дистиллированную), как основной растворитель питательных веществ, мы заменили на геотермальную (с минерализацией 5,02 г/л), в том числе и в целях расширения солевого состава среды, что позволить качественно обеспечить среду минеральными солями, анионами, катионами и тд.

Расширенный лабораторный анализ геотермальной воды (фотометрия, потенциометрия, атомно-абсорбционная спектрометрия, комплексометрия и тд.) показал качественное и количественное отличие данной воды от дистиллированной по микро- и макроэлементам. Суммарное значение составляло: анионов - 1,6771 г/л (NH4, Na, K, Mg, Са, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni), катионов - 3,4732 г/л (Cl, Br, I, SO4, HCO3, HPO4, NO3). Кроме того, в геотермальной воде содержится нейтральные и кислые битумы (2,5 мг/л), гумусовые вещества (7,1 мг/л) как источник углеводородов. Для углеводородокисляющих микроорганизмов, к которым относятся коринебактерий, нокардий и родококки, такой источник является стимулом повышения ростовых свойств, предлагаемой среды [3, 5, 6, 7].

Наиболее близким к заявляемой среде являются:

- для выделения коринебактериии, сухая хинозольная среда Бучина (панкреатический гидролизат кильки - 30,6 г; натрия хлорид - 5,0±0,05 г; д-глюкоза - 15,0 г; водный голубой - 0,25 г; натрий углекислый - 0,4±0,05 г; агар микробиологический - 8,0±1,0 г (PH 7,4±0,2); дистиллированная вода - до 1 литра; 5% стерильная дефибринированая кровь человека или животных).

- для нокардий и родококков, среда Мюнца (KNO3 - 1 г, MgSO4 - 0,1 г, Na2HPO4 - 0,6 г, KH2PO4 - 0,14 г, NaCl - 1,0 г, водопроводная вода - 0,5 л, вода дистиллированная - 0,5 л, рН - (6,8-7) - подводят кислотой.

К недостаткам данных сред относятся слабые ростовые и низкие ингибирующие постороннюю микрофлору свойства.

Цель изобретения: разработка универсальной питательной среды для культивирования коринебактерий, нокардии и родококов, характеризующейся диагностической ценностью и практической значимостью.

Для достижения поставленной цели взяли панкреатический гидролизат кильки - 31,7 г, д-глюкозу - 16,0 г, KH2PO4 - 0,17 г, MgSO4 - 0,2 г, водный голубой - 0,28 г, натрий углекислый - 0,3 г ± 0,05, агар микробиологический - 8,1 г ± 1,0 (рН 7,4±0,2), добавили геотермальную воду до 1 л и стерильную дефибринированную кровь животных - 5%. В процессе размешивания, не допуская образования пены, вносили 4-5 капель парафина, разлили в чашки Петри. После застывания среду слегка подсушили в термостате при температуре 37±1°С в течение 40-60 мин. Цвет готовой среды темно-синий. Хранили в холодильнике, использовали в течение 3-4 сут.

Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известных, подбором минимального количество компонентов для построения тела углеводородокисляющими микроорганизмами (азот, углерод, водород, кислород) - пластический материал, парафин - фактор роста, (д-глюкоза) - источник энергий, кроме того, заменой дистиллированной воды геотермальной и расширением солевого состава за счет большего содержания микро- и макроэлементов в геотермальной воде. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна».

При экспериментальной проверке были испытаны среды, наиболее часто используемые для культивирования коринебактерий, нокардий и родококков. Среды готовили по прописи авторов [2].

Оценку сред проводили посевом тест-штаммов и свежевыделенных культур коринебактерий, нокардий и родококков. В качестве музейного штамма использовали Corynebacterium xerosis N1911, N. asteroides ВКМ Ac 1077 и R. bronchialis ИМВ Ac 737. а нативным материалом служили лабораторные штаммы, выделенные из объектов внешней среды (почва, корма, навоз и кровь крупного рогатого скота).

Культуру каждого штамма высевали в 8 чашках Петри каждой среды. Коринебактерии на нитритный агар по Виноградскому, среду Сотона, кровяной агар, кровяно-теллуритовый агар, среду Клауберг II, среду Бучина и на универсальную среду. Нокардии и родококки - среду Мюнца, УМ-агар, среду с овсяной мукой, дакстрозный агар, питательный бульон, универсальная среда.

Для соблюдения равнозначности опыта материал высевали равными дозами (500 клеток в 0,1 мл). При учете результатов провели сравнительный анализ эффективности сред изучаемых образцов с предлагаемым по скорости и интенсивности роста, по величине колоний и ингибирующим к сопутствующей микрофлоре свойствам. Результаты учитывали через 24 и 48 ч. Опыты повторялись двукратно.

По результатам проведенных исследований, среда Мюнца и декстрозный агар показали низкие ростовые свойства 1-2 колонии. Низкие ингибирующие постороннюю микрофлору свойства обнаружили на среде с овсяной мукой, аналогичная картина на УМ-агаре, на фоне слабых ростовых свойств (Табл. 1)

На питательном бульоне колонии не поддаются подсчету из-за обильного роста посторонней микрофлоры.

На универсальной среде обнаружили умеренный рост на первые сутки с тест-штаммами и с нативным материалом - до 12 колонии, на вторые сутки - до 23 колонии в чашках с нативным материалом, но фоне хороших ингибирующих постороннюю микрофлору свойств.

Рост колоний на среде Бучина формировался на первые сутки от 1 до 3 колоний с тест-штаммами и умеренным ростом с нативным материалом от 4 до 12 колоний (Табл. 2). На вторые сутки количество колоний в чашках с тест-штаммами увеличилось до 12 колоний.

По ростовым свойствам кровяной и кровяно-теллуритовые агары не уступают среде Бучина, но рост колоний формировался на фоне низких ингибирующих свойств по отношению к сопутствующей микрофлоре.

Низкими дифференцирующими свойствами обладает и сывороточный агар, где обнаружили обильный рост сопутствующей микрофлоры на вторые сутки.

Эффективность нитритного агара и Клауберг II была самой низкой. Слегка заметный рост обнаружили на средах через 48 ч.

Слегка заметное помутнение обнаружили на среде Сатона, на вторые сутки картина практически не изменилось.

Предлагаемая среда показала высокие дифференцирующие и ингибирующие свойства. Колонии появились на первые сутки в количестве от 4 до 12 в чашках с тест-штаммами и с нативным материалом. На вторые сутки обнаружили обильный рост в обеих чашках до 23 колонии, без сопутствующей микрофлоры, что является показателем высокой ингибирующей активности. Рост отличался не только числом, но и характером и размером колонии.

Выводы. Таким образом, проведенные исследования показали, что универсальная среда (М-10), для микобактериоподобных микроорганизмов обладает хорошими ростовыми свойствами на фоне высокой активности ингибирующей постороннюю микрофлору свойств. Кроме того, среда отличается от остальных вариантов по массивности выросших колоний, что в конечном итоге является показателем диагностической ценности и практической значимости универсальной среды.

Литература

1. Баратов М.О. Сравнительное изучение наиболее часто используемых сред для выделения коринебактерий / М.О. Баратов, М.М. Ахмедов О.П. Сакидибиров // Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. « Повышение продуктивности с/х. животных и птицы на основе инновационных достижений». - 2009 г. - Новочеркасск – С. 64-67.

2. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / М.О. Биргер, Е.А. Ведьмина, В.В. Влодавец // - М: Медицина, 1985. - 261 с.

3. Высоцкий В.В. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение 8 представителей рода Corynebacterium, выращенных на твердой питательной среде в стационарной фазе развития / В.В. Высоцкий, И.К. Мазурова, Е.А. Шмелева // Микробиология. - 1976. - №7. - С. 121-125.

4. Меджидов М.М. Сухие микробиологические питательные среды / Меджидов М.М. и др. // - Каталог. - Махачкала, 1998, 78 с.

5. Нуратинов Р.А. Кислотоустойчивые микроорганизмы - микобактерии, нокардии, родококки: химический состав, биологические свойства, антигенная структура / Р.А. Нуратинов и др. // Проблемы туберкулеза. - 2001. - №5. - С. 54-58.

6. Нестеренко O.A. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / О.А. Нестеренко // - Киев: Наукова Думка, 1985. С. 320-333.

7. Шапелева Р.Г. Сравнительное изучение питательных сред для выделения коринебактерий / Р.Г. Шапелева, З.Г. Андреева, Г.П. Сокольникова // Журнал микробиология. - 1989. - №5. – С. 62-64.

Универсальная питательная среда для культивирования коринебактерий, нокардий и родококков, содержащая панкреатический гидролизат кильки, Д-глюкозу, KH2PO4, MgSO4; водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, геотермальную воду, стерильную дефибринированую кровь животных и парафин, при следующем соотношении компонентов:

Панкреатический гидролизат кильки 31,7 г
Д-глюкоза 16,0 г
KH2PO4 0,17 г
MgSO4 0,2 г
Водный голубой 0,28 г
Натрий углекислый 0,3 г ± 0,05
Агар микробиологический 8,1 г ± 1,0 (рН 7,4±0,2)
Геотермальная вода до 1 литра

стерильная дефибринированная кровь животных 5%

Парафин 4-5 капель



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой набор, содержащий авирулентные штаммы Yersinia pestis подвида pestis биовара orientalis КМ 2011, подвида pestis биовара antiqua КМ 2008, КМ 2012, КМ 260 (12), КМ 130(3), подвида pestis биовара medievalis КМ 2010, КМ 2014, КМ 2024, подвида caucasica КМ 2013, штаммы Yersinia pseudotuberculosis КМ 2004, КМ 2005, КМ 2006, Yersinia enterocolitica КМ 2007 и штамм Pasteurella multocida КМ 2003, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда. Указанный набор предназначен для идентификации ДНК возбудителя бластомикоза Blastomyces dermatitidis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.
Изобретение относится к области биохимии. Предложено биосенсорное устройство для обнаружения биологических микро- и нанообъектов, таких как бактерии и вирусы.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложено устройство и способ для обнаружения целевых биомолекул с использованием вышеуказанного устройства.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложены заготовка для изготовления тест-системы для проведения экспресс-диагностики инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности биоптата и способ изготовления вышеуказанной тест-системы.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ оценки пригодности водорослей и цианобактерий для формирования активного ила очистных сооружений.
Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования и выращивания биомассы чумного микроба вакцинного штамма Y.
Изобретение относится к биотехнологии и клинической микробиологии. Предложен способ определения чувствительности микроорганизмов полости рта в биопленке к антимикробным средствам.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии, и касается способа оценки эффективности фаготерапии при лечении инфекционных заболеваний.
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Питательная среда для культивирования туляремийного микроба содержит настой мозга теленка, мясной настой из мяса крупного рогатого скота, питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ), дрожжевой экстракт, глюкозу, L-цистеин, магний сернокислый, натрий сернистокислый, агар микробиологический, эмульсию желтка куриного яйца и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен способ получения капсулярного полисахарида Haemophilus influenzae типа b, применение вышеуказанного капсулярного полисахарида для получения вакцинной композиции и способ получения вакцинной композиции.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ продуцирования С2-оксигенатов путем анаэробной ферментации с использованием микробной культуры карбоксидотрофного микроорганизма.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D, обладающий способностью биодеградировать устойчивые токсичные соединения перфтороктансульфоновой кислоты (ПФОС), депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.

Изобретение относится к способу получения модели ожирения животного. Способ предусматривает инокулирование аксенического животного бактерией Enterobacter cloacae, имеющей ген 16S рРНК, для получения инокулированного животного, где последовательность гена 16S рРНК представляет собой SEQ ID NO.1; и кормление инокулированного животного кормом, имеющим 34,9% содержания жира, в течение по крайней мере четырех недель для получения модели ожирения животного.

Изобретение относится к автоматизации технологических процессов. Предложен способ управления процессом производства биомассы аэробных микроорганизмов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен способ получения белка протеазы посредством бактерии рода Bacillus путем введения в нее первой экспрессионной конструкции, которая кодирует целевой белок протеазу, и второй экспрессионной конструкции, которая кодирует отличную от целевого белка вспомогательную протеазу с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и дальнейшей экспрессии указанных протеаз в указанном микроорганизме.

Настоящее изобретение относится к биохимии и генетической инженерии, в частности к рекомбинантному штамму Escherichia coli BL21(DE3; pQE-Nit2). Указанный штамм получен путём трансформации штамма Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной конструкцией pQE-Nit2, которая находится под контролем промотора фага Т5, и предназначен для получения ω-амидазы человека (Nit2) при культивировании на питательных средах на основе пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой набор, содержащий авирулентные штаммы Yersinia pestis подвида pestis биовара orientalis КМ 2011, подвида pestis биовара antiqua КМ 2008, КМ 2012, КМ 260 (12), КМ 130(3), подвида pestis биовара medievalis КМ 2010, КМ 2014, КМ 2024, подвида caucasica КМ 2013, штаммы Yersinia pseudotuberculosis КМ 2004, КМ 2005, КМ 2006, Yersinia enterocolitica КМ 2007 и штамм Pasteurella multocida КМ 2003, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ отбора пробиотического штамма Bacillus, включающий оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR или белка NHE3; пробиотический штамм Bacillus subtilis, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3, депонированный в CNCM под регистрационным номером I-2745; клетки, полученные путем культивирования пробиотического штамма Bacillus, и композиция, содержащая эффективное количество клеток, для применения при лечении и/или предотвращении диареи.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ культивирования бифидобактерий предусматривает внесение бифидобактерий в питательную среду, содержащую гидролизат гороха с содержанием аминного азота 160-180 мг, отвар листьев и стеблей люцерны, кукурузный экстракт, Д(-)-лактозу, натрий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат железа семиводный, цистеин и осветленную творожную сыворотку в заданном соотношении компонентов и проводят наращивание биомассы бифидобактерий в течение 24 часов. Изобретение позволяет повысить сроки хранения и получать биомассу бифидобактерий высокого качества, с более высокой скоростью роста и повышенной жизнеспособностью. 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Универсальная питательная среда для культивирования коринебакетрий, нокардий и родококков содержит панкреатический гидролизат кильки, Д- глюкозу, KH2PO4, MgSO4, водный голубой, натрий углекислый, агар микробиологический, геотермальная вода, стерильная деффибринированная кровь животных и парафин в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить дифференцирующие и ингибирующие свойства питательной среды. 2 табл.

Наверх