Способ получения полипептидов в периплазме прокариотических клеток

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения полипептида, рекомбинантно продуцируемого в периплазму прокариотическими клетками. Способ включает инкубирование прокариотических клеток в растворе, содержащем Трис в концентрации от 10 мМ до 95 мМ и ЭДТК в концентрации от 2 мМ до 6 мМ и ЭДТК, при рН от 7 до 10 в течение от 15 мин до 6 ч при температуре от 20°С до 33°С. Изобретение обеспечивает выделение рекомбинантно продуцируемого полипептида с высоким выходом. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

 

В настоящем изобретении предложен способ получения полипептидов в прокариотических клетках, в котором рекомбинантно продуцируемый полипептид выделяют из периплазмы прокариотических клеток с использованием стадии инкубации в забуференной системе в присутствии хелатирующего агента при определенном значении pH и определенной температуре.

Предпосылки создания изобретения

При наличии соответствующей сигнальной последовательности рекомбинантно продуцируемые полипептиды могут секретироваться в периплазматическое пространство клеток E. coli (Joly J.С. и Laird M.W. в: The Periplasm, под ред. Ehrmann М., изд-во ASM Press, Washington D.C., 2007, cc. 345-360). Среда, содержащая химические окисляющие агенты, благоприятствует образованию дисульфидных связей и тем самым правильной укладке полипептидов. Целесообразно осуществлять избирательное выделение указанных полипептидов из периплазматического пространства E. coli для того, чтобы избегать загрязнения белками клетки-хозяина (НСР). Тем самым облегчается последующая очистка полипептидов.

Примером метода выделения является метод осмотического шока, описанный у Ren G. и др., J. of Bacteriology 189, 2007, сс. 2777-2786. При использовании этого метода ЭДТК, растворенная в Трис-буфере (pH 7,2), дестабилизирует наружную мембрану прокариотических клеток, что позволяет сахарозе проникать в периплазматическое пространство. Внутренняя мембрана является непроницаемой для сахарозы. После этого Трис-ЭДТК-буфер удаляют путем центрифугирования и клетки быстро ресуспендируют в охлажденной на льду дистиллированной воде. При этом вода проникает в наполненное сахарозой периплазматическое пространство и происходит разрушение дестабилизированной наружной мембраны в результате увеличения периплазматического объема. Добавление MgCl₂ приводит к восстановлению стабилизации наружной мембраны.

Описание других методов можно почерпнуть у Humphreys D.P. (в: The Periplasm, под ред. Ehrmann М., изд-во ASM Press, Washington, D.C., 2007, cc. 361-388) и Middelberg А.Р. (Biotechnol. Adv. 13, 1995, cc. 491-551).

Согласно Joly Laird (см. выше) «общепринятые методы выделения периплазматических фракций, применяемые для маломасштабного получения, такие как обработка, приводящая к образованию сферопластов, или воздействие осмотическим шоком, практически не осуществляют, когда объемы культур достигают 10 л или более». «Выделение белка из внешней среды или после разрушения лишь наружной мембраны и пептидогликана представляет собой цель, которая все еще не реализована на практике в случае крупномасштабного получения» (c. 354).

В WO 2012/013930 описан метод очистки рекомбинантного белка из образца или экстракта грамотрицательной бактериальной клетки-хозяина, экспрессирующей рекомбинантный белок и дисульфидизомеразу DsbC, в котором осуществляют регулирование значения pH образца или экстракта с целью осаждения и отделения DsbC. В WO 01/94585 описано новое антитело, специфическое в отношении человеческого фактора некроза опухоли TNF-альфа, которое можно применять для лечения опосредуемых TNF-альфа заболеваний, таких, например, как застойная сердечная недостаточность, септический или эндотоксический шок, кахексия и респираторный дистресс-синдром взрослых. В US 2005/048056 описан метод получения антитела к фактору некроза опухоли-альфа, которое имеет тяжелую и легкую цепь, заключающийся в том, что осуществляют ферментацию клеточной смеси, получают клеточный дебрис и дают клеточному дебрису выстояться в течение определенного времени.

В WO 2007/106120 описан метод модулирования распределения пептидной молекулы в ткани, заключающийся в том, что вводят в ткань молекулу конъюгата, которая содержит пептид, связывающий сывороточный альбумин. В WO 01/45746 описаны пептидные лиганды, обладающие аффинностью в отношении иммуноглобулина (Ig) G, IgM и/или человеческого сывороточного альбумина, которые можно применять для конъюгации и использовать для удлинения времени полувыведения действующих веществ из кровотока. В US 2004/001827 описан метод модулирования распределения в ткани пептидной молекулы, предназначенный для повышения терапевтической эффективности и снижения побочных действий, заключающийся в том, что вводят в ткань молекулу конъюгата, содержащую домен пептидного лиганда и обладающий активностью домен.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании настоящего изобретения было установлено, что рекомбинантно продуцируемый полипептид можно выделять из периплазмы прокариотической клетки путем приведения в контакт или посредством инкубации клетки с раствором, содержащим забуферивающий агент (например, Трис) и хелатирующий агент (например, ЭДТК), при значении pH, составляющем примерно 8, и комнатной температуре. Способ позволяет выделять рекомбинантно продуцируемый полипептид с высоким выходом и чистотой в процессе крупномасштабного производства. Выделенный полипептид отличается высокой степенью пригодности для дальнейших процессов обработки (например, очистки).

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют прокариотические клетки в растворе, содержащем забуферивающий агент в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и хелатирующий агент в концентрации от примерно 0,5 мМ до примерно 9,5 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч.

В одном из вариантов осуществления изобретения хелатирующий агент выбирают из группы, включающей этилендиамин, нитрилоуксусную кислоту (НУК), этиленгликольтетрауксусную кислоту (ЭГТК), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ДТПК), 1,2-бис(орто-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (ВАРТА), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), фосфонаты (например, этилендиаминтетра(метиленфосфоновую кислоту) EDTMP или диэтилентриаминпента(метиленфосфоновую кислоту) DTPMP), цитрат, порфирины (например, гем, хлорофилл или витамин В12). В одном из вариантов осуществления изобретения хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК).

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют (ресуспендированные) прокариотические клетки в растворе, содержащем Трис-HCl в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и ЭДТК в концентрации от примерно 2 мМ до примерно 6 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч, при температуре примерно 25°С.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют (ресуспендированные) прокариотические клетки в растворе, содержащем Трис-HCl в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и ЭДТК в концентрации от примерно 2 мМ до примерно 4 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч, при температуре примерно 25°С.

В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 6 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 1 мМ до примерно 3 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 2 мМ до примерно 6 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет от примерно 2 мМ до примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет примерно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация хелатирующего агента составляет примерно 6 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет от примерно 0,5 мМ до 9,5 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет от примерно 1 мМ до примерно 3 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет примерно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет примерно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация ЭДТК составляет примерно 6 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 2 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 4 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 6 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения раствор имеет значение pH, составляющее от примерно 7,5 до примерно 8,5. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что значение pH составляет примерно 8.

В одном из вариантов осуществления изобретения время инкубации составляет от примерно 20 мин до примерно 3,5 ч. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что время инкубации составляет примерно 30 мин.

В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой субстанцию, которая вступает во взаимодействие с наружной мембраной прокариотических клеток.

В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой одновалентный органический амин. В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент представляет собой трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли.

В одном из вариантов осуществления изобретения забуферивающий агент выбирают из группы, включающей фосфорную кислоту или ее соли, морфолин или его соли (MOPS), 3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновую кислоту (TAPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Бицин), N-трис(гидроксиметил)метилглицин (Трицин), 3-[N-трис(гидроксиметил)метиламино]-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (TAPSO), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), 2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновую кислоту (TES), гистидин или его соли, глицин или его соли, или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли. В одном из вариантов осуществления изобретения соль представляет собой Трис-HCl.

В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация Трис-HCl составляет от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация Трис-HCl составляет от примерно 15 мМ до примерно 50 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения концентрация Трис-HCl составляет от примерно 20 мМ до примерно 60 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация Трис-HCl составляет примерно 20 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация Трис-HCl составляет примерно 40 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что концентрация Трис-HCl составляет примерно 60 мМ.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ осуществляют при комнатной температуре. В одном из вариантов осуществления изобретения способ осуществляют при температуре от 20°С до 33°С. В одном из вариантов осуществления изобретения способ осуществляют при температуре примерно 25°С.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ получения полипептида заключается в том, что осуществляю стадию, на которой инкубируют (ресуспендированные) прокариотические клетки в растворе, содержащем Трис-HCl в концентрации от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ и ЭДТК в концентрации примерно 2 мМ, при значении pH от примерно 7 до примерно 10 в течение периода времени, составляющего от примерно 15 мин до примерно 6 ч, при температуре примерно 25°С.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что прокариотическая клетка представляет собой грамотрицательную клетку.

В одном из вариантов осуществления изобретения прокариотическая клетка представляет собой ресуспендированную клетку.

В одном из вариантов осуществления изобретения прокариотическую клетку выбирают из группы грамотрицательных бактерий, имеющих наружную мембрану. В одном из вариантов осуществления изобретения прокариотическую клетку выбирают из бактерий рода Acetobacter, Bacteroides, Borrelia, Bortadella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Fusobacterium, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Leptospiria, Neisseria, Nitrobacter, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Shigella, Thiobacter, Treponema, Vibrio, Xanthomonas или Yersinia. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, отличается тем, что прокариотическая клетка представляет собой клетку E. coli.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид представляет собой негликозилированный полипептид.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент антитела выбирают из Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерных антител (диабоди), линейных антител; молекул одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифических антител, созданных из фрагментов антител.

В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит гидролизующих пептидогликаны ферментов. В одном из вариантов осуществления изобретения гидролизующий пептидогликаны фермент выбирают из лизоцимов (мурамидаз), литических трансгликозилаз, N-ацетил-β-D-глюкозаминидаз, N-ацетилмурамил-L-аланинамидаз или эндопептидаз.

В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит сахара. В одном из вариантов осуществления изобретения сахар представляет собой сахарозу.

В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит сахар и практически не содержит гидролизующих протеогликаны ферментов. В одном из вариантов осуществления изобретения раствор, применяемый в способе, представленном в настоящем описании, практически не содержит сахарозу и практически не содержит лизозим.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно заключается в том, что после стадии инкубации осуществляют стадию, на которой выделяют полипептид.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно заключается в том, что осуществляют стадию, на которой очищают выделенный полипептид.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 2 мМ, значение pH составляет примерно 8, время инкубации составляет примерно 30 мин, концентрация Трис-HCl составляет примерно 20 мМ, температура инкубации составляет примерно 25°С и прокариотическая клетка представляет собой клетку Е. coli.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 4 мМ, значение pH составляет примерно 8, время инкубации составляет примерно 30 мин, концентрация Трис-HCl составляет примерно 40 мМ, температура инкубации составляет примерно 25°С и прокариотическая клетка представляет собой клетку Е. coli.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что концентрация ЭДТК составляет примерно 6 мМ, значение pH составляет примерно 8, время инкубации составляет примерно 30 мин, концентрация Трис-HCl составляет примерно 60 мМ, температура инкубации составляет примерно 25°С и прокариотическая клетка представляет собой клетку Е. coli. Одним из объектов настоящего изобретения является применение способа, предлагаемого в настоящем изобретении, для выделения периплазматического полипептида из прокариотической клетки.

Описание чертежей

На чертежах показано:

На фиг. 1 - результаты гель-электрофореза (ДСН-ПААГ) экспрессированного в периплазме белка (α-синуклеина), выделенного с помощью представленного в настоящем описании способа крупномасштабного получения; полосы: LS обозначает стандарт длины, WC обозначает целые клетки, Ре обозначает клеточный дебрис, IPP обозначает выделенный периплазматический белок;

на фиг. 2 - результаты гель-электрофореза (ДСН-ПААГ) экзотоксина Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M), выделенного с помощью представленного в настоящем описании способа крупномасштабного получения; полосы: LS обозначает стандарт длины, WC обозначает целые клетки, IPP обозначает выделенный периплазматический белок, Ре обозначает клеточный дебрис.

Подробное описание изобретения

Определения

Понятие «периплазматическое пространство» или «периплазма» обозначает пространство, ограниченное двумя избирательно проницаемыми барьерами, например, биологическими мембранами. В одном из вариантов осуществления изобретения периплазма в грамотрицательных бактериях находится между внутренней мембраной (т.е. цитоплазматической мембраной) и наружной мембраной.

Понятие «хелатирующий агент» обозначает субстанцию, которая может образовывать несколько связей с одним ионом металла. Иными словами, хелатирующий агент представляет собой мультидентатный лиганд.

Понятие «антитело» используют в настоящем описании в его наиболее широком смысле, и оно включает различные структуры антитела, в том числе (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, если они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антитела являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерные антитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

В контексте настоящего описания понятие «забуференный» обозначает раствор, в котором изменения значения pH, обусловленные добавлением или высвобождением кислых или основных субстанций, компенсируются забуферивающим агентом. Можно использовать любой забуферивающий агент, обладающий таким действием. В одном из вариантов осуществления изобретения применяют фармацевтически приемлемые забуферивающие агенты, такие, например, как фосфорная кислота или ее соли (пригодный диапазон pH 6,8-8,2), морфолин или его соли (MOPS, пригодный диапазон pH 6,5-7,9), 3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота (TAPS, пригодный диапазон pH 7,7-9,1), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Бицин, пригодный диапазон pH 7,6-9,0), N-трис(гидроксиметил)метилглицин (Трицин, пригодный диапазон pH 7,4-8,8), 3-[N-трис(гидроксиметил)метиламино]-2-гидроксипропансульфоновая кислота (TAPSO, пригодный диапазон pH 7,0-8,2), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES, пригодный диапазон pH 6,8-8,2), 2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота (TES, пригодный диапазон pH 6,8-8,2), гистидин или его соли (5,5-7,5), глицин или его соли (8,7-10,7) или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис, пригодный диапазон pH 7,5-9,0) или его соли. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтически приемлемый забуферивающий агент представляет собой фосфорную кислоту или ее соли, или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли.

Буферная емкость забуферивающего агента является максимальной при p[Н+]=pKa. Она снижается до 33% от максимальной величины при p[Н+]=pKa±1 и до 10% при p[Н+]=pKa±1,5. По этой причине пригодным диапазоном является примерно pKa±1.

Понятие «рекомбинантная» относится к аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, которая была преднамеренно модифицирована методами рекомбинации. В контексте настоящего описания понятие «рекомбинантная нуклеиновая кислота» относится к нуклеиновой кислоте, первоначально созданной in vitro, как правило, путем обработки нуклеиновой кислоты эндонуклеазами, в форме, которая, как правило, не встречается в естественных условиях. Так, в контексте настоящего изобретения выделенная мутантная нуклеиновая кислота ДНК-полимеразы, находящаяся в линейной форме, или экспрессионный вектор, созданный in vitro посредством сшивания ДНК-молекул, которые в норме не являются соединенными, считаются рекомбинантными. Следует иметь в виду, что, когда рекомбинантная нуклеиновая кислота создана и реинтродуцирована в клетку-хозяина, то она будет реплицироваться нерекомбинантным путем, т.е. посредством присущего клетке-хозяину клеточного механизма in vivo, а не посредством манипуляций in vitro; однако такие нуклеиновые кислоты, которые, созданы путем рекомбинации, но затем реплицируются нерекомбинантным путем, в контексте настоящего изобретения все еще рассматриваются как рекомбинантные. «Рекомбинантный полипептид» представляет собой полипептид, созданный с помощью методов рекомбинации, т.е. путем экспрессии указанной выше рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Он необязательно является выделенным или очищенным.

«Выделенный полипептид» представляет собой полипептид, который практически отделен от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углевод, липид, или других белковых примесей, ассоциированных с полипептидом в естественных условиях. Как правило, препарат выделенного полипептида содержит полипептид в высокоочищенной форме, т.е. с чистотой, составляющей по меньшей мере примерно 80%, с чистотой, составляющей по меньшей мере примерно 90%, с чистотой, составляющей по меньшей мере примерно 95%, с чистотой более чем 95% или более чем 99%. Один из путей, позволяющих продемонстрировать, что конкретный белковый препарат содержит выделенный полипептид, заключается в выявлении одиночной полосы после электрофореза белкового препарата в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) и окрашивания геля кумасси бриллиантовым голубым. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид очищают до более чем 95% или 99% чистоты по данным, например, электрофоретического анализа (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографического анализа (например, ионообменной хроматографии или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антитела представлен, например, у Flatman S. и др., J. Chromatogr. В 848, 2007, сс. 79-87. Однако понятие «выделенный» не исключает того, что тот же самый полипептид может находиться в различных физических формах, таких, например, как димеры, дериватизированные формы, формы с неправильной укладкой, формы с неправильными дисульфидными связями или «перемешанные» формы.

«Полипептид» представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, который получен в естественных условиях или путем синтеза. Полипептиды, состоящие менее чем из примерно 20 аминокислотных остатков, обозначают как «пептиды». «Белок» представляет собой молекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей, из которых по меньшей мере одна содержит 100 или более аминокислотных остатков. Полипептиды и белок могут содержать также компоненты, не являющиеся аминокислотами, такие как углеводные группы. Углеводные группы и другие не являющиеся аминокислотами компоненты могут добавляться в клетке, которая продуцирует полипептид или белок, и они могут варьироваться в зависимости от типа клетки. В контексте настоящего описания полипептиды и белки определяют в понятиях структур их аминокислотных каркасов; при этом, как правило, заместители, такие как углеводные группы, не указывают, но, тем не менее, они могут присутствовать.

Способ, предлагаемый в настоящем изобретении

Одним из объектов изобретения, представленного в настоящем описании, является способ получения полипептида, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой инкубируют прокариотические клетки в растворе, содержащем забуферивающий агент в концентрации, составляющей от примерно 10 мМ до примерно 95 мМ, и хелатирующий агент в концентрации, составляющей от примерно 0,5 мМ до примерно 9,5 мМ, при значении pH, составляющем от примерно 7 до примерно 10, в течение периода времени от примерно 15 мин до примерно 6 ч.

Для рекомбинантного получения полипептида выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине.

Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессии кодирующих полипептид векторов, включают прокариотические клетки, указанные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, прежде всего в тех случаях, когда не требуются гликозилирование и опосредуемая Fc эффекторная функция. Информация об экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях приведена, например, в US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также Charlton K.А., в: Methods in Molecular Biology, т. 248, под ред. Lo В.K.С., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, 2003, сс. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антител в Е. coli). После осуществления экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно подвергать дополнительной очистке.

При создании настоящего изобретения было установлено, что рекомбинантно продуцируемый полипептид можно выделять из периплазмы прокариотической клетки путем приведения в контакт или инкубации клетки с раствором, содержащим забуферивающий агент (например, Трис) и хелатирующий агент (например, ЭДТК), при значении pH, составляющем примерно 8, и при комнатной температуре. Способ позволяет выделять рекомбинантно продуцируемый полипептид с высоким выходом и чистотой при осуществлении крупномасштабных процессов производства. Выделенный полипептид отличается высокой степенью пригодности для дальнейших процессов обработки (например, очистки).

С помощью способа, представленного в настоящем описании, периплазматические полипептиды высвобождают из клеток избирательно в отличие, например, от лизиса/механического разрушения целых клеток.

Кроме того, представленный в настоящем описании способ не требует присутствия гидролизующих пептидогликан ферментов, таких как лизоцим, т.е. способ осуществляют в отсутствии лизоцима или любого другого гидролизующего пептидогликан фермента, т.е. раствор практически не содержит лизоцим или другой гидролизующий пептидогликан фермент.

Кроме того, представленный в настоящем описании способ пригоден для получения чувствительных к температуре полипептидов.

Кроме того, представленный в настоящем описании способ не требует присутствия сахарозы или любого другого сахара, т.е. способ осуществляют в отсутствии сахарозы или любого другого сахара, т.е. раствор практически не содержит сахарозу или любой другой сахар.

В представленной ниже таблице приведены примеры выходов, которые могут быть достигнуты в различных условиях.

При инкубации в течение 16 ч в отсутствии ЭДТК может быть достигнут высокий выход белка (сравнительное условие 18).

При создании настоящего изобретения было установлено, что продолжительность инкубации можно уменьшать, если к инкубируемой смеси добавляют ЭДТК в низкой концентрации, например, ниже 10 мМ, например, 2 мМ или 4 мМ, или 6 мМ. В этих условиях в присутствии ЭДТК может быть достигнут выход, сопоставимый с выходом при инкубации в отсутствии ЭДТК.

Было установлено, что повышение температуры до уровня выше примерно 25°С приводит к снижению достигаемого выхода.

Было установлено, что снижение значения pH до уровня ниже примерно 8 (например, pH 6,8) приводит к снижению достигаемого выхода. Повышение значения pH может приводить к увеличению выхода.

Было установлено, что концентрация применяемого Трис-буфера должна быть ниже 100 мМ, например, ниже 50 мМ, например, должна составлять примерно 20 мМ.

Было установлено, что указанные результаты, полученные в условиях маломасштабного производства (выделяемый объем 150 мкл), могут быть перенесены на крупномасштабное выделение периплазматического белка из клеток, культивируемых в ферментерах. Это должно облегчать производство рекомбинантных белков для поставки на рынок.

В некоторых случаях для крупномасштабного получения может оказаться предпочтительным повышать концентрацию забуферивающего и хелатирующего агентов при уменьшении объемов буфера.

При создании настоящего изобретения было установлено, что с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно эффективно выделять представляющий интерес экспрессируемый в периплазму белок (см. фиг. 1).

В конкретных вариантах осуществления изобретения полипептид представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают (но не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, Fab'-SH-, F(ab')₂-, Fv- и scFv-фрагменты, а также другие, описанные ниже фрагменты. Обзор, посвященный конкретным фрагментам антител, представлен у Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134. Обзор, посвященный scFv-фрагментам, представлен, например, у Plueckthun А. в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185, а также US 5571894 и US 5587458. Обсуждение Fab- и F(ab')2-фрагментов, содержащих остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и имеющих увеличенное время полужизни in vivo, см. в US 5869046.

Димерные антитела (диабоди) представляют собой фрагменты антител, имеющие два антигенсвязывающих центра, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134; и Holliger Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448). Трехмерные антитела (триабоди) и четырехмерные антитела (тетрабоди) описаны также у Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134.

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В конкретных вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis Inc., Уолтэм, шт. Массачусетс; см., например, US 6248516 В1).

Фрагменты антител можно создавать различными методами, включая их производство рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фагом), как указано в настоящем описании.

Общие хроматографические методы и их применение известны специалисту в данной области (см., например, Chromatography, 5-е изд., часть А: Fundamentals and Techniques, под ред. Heftmann Е., изд-во Elsevier Science Publishing Company, New York, 1992; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, под ред. Deyl Z., изд-во Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, 1998; Poole C.F. и Poole S.K., Chromatography Today, изд-во Elsevier Science Publishing Company, New York, 1991, Scopes Protein Purification: Principles and Practice, 1982; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, под ред. Sambrook J. и др., второе изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F.M. и др., изд-во John Wiley & Sons, Inc., New York; или Freitag R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24, 2007, cc. 421-453 (Animal cell biotechnology, 2-е изд.)).

Методы очистки полипептидов хорошо разработаны и широко применяются. Их применяют индивидуально или в комбинации. Такими методами являются, например, аффинная хроматография с использованием тиольных лигандов с комплексообразующими ионами металлов (например, с использованием Ni(II)- и Cu(II)-аффинного материала) или выведенных из микроорганизмов белков (например, аффинная хроматография с использованием белка А или белка G), ионообменная хроматография (например, катионообменная (с использованием карбоксиметильных смол), анионообменная (с использованием аминоэтильных смол) и ионообменная хроматография смешанного типа, тиофильная адсорбционная хроматография (например, с использованием бета-меркаптоэтанола и других SH-лигандов), хроматография гидрофобного взаимодействия или адсорбционная хроматография с использованием ароматических сорбентов (например, с использованием фенил-сефарозы, аза-аренофильных смол или мета-аминофенилбороновой кислоты), гель-фильтрация и препаративные электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, сс. 93-102).

Представленные ниже примеры, чертежи и последовательности даны для лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого определяется прилагаемой формулой изобретения. Следует иметь в виду, что в представленные процедуры могут быть внесены модификации без отклонения от сущности изобретения.

Примеры

Общий способ, представленный в настоящем описании

Ресуспендируют собранные клетки в 20 мМ Трис-HCl-буфере (pH 8);

Добавляют буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl-4 мМ ЭДТК в соотношении 1:1, (pH 8);

Инкубируют в течение 30 мин при 25°С при встряхивании;

Отделяют клетки от супернатанта, который содержит белки, присутствующие в периплазматическом пространстве.

Пример 1

Определение количества рекомбинантно продуцированного белка В данном примере описано определение количества представляющего интерес рекомбинантно продуцированного белка, который можно выделять из периплазматического пространства Е. coli с помощью различных методов.

Контрольная величина:

Лизат целых клеток, соответствующий 100% представляющего интерес белка, получали путем разрушения клеток без какой-либо предварительной обработки.

Количество образца:

Все методы осуществляли на клетках, содержащихся в культивируемом образце, количество которых соответствовало величинам оптической плотности ОП 3 (3/ОП = мл). Клетки получали путем центрифугирования.

Приготовление образца целых клеток для ДСН-ПААГ-анализа:

Добавляли 150 мкл ЗФР к клеткам, после чего добавляли 150 мкл содержащего ДСН буфера для приготовления образца. После нагревания до 95°С в течение 10 мин при встряхивании, 5 мкл вносили на ДСН-гель.

Приготовление образца клеточных экстрактов с помощью выделения из периплазматического пространства для ДСН-ПААГ-анализа

Клеточный дебрис ресуспендировали с использованием 150 мкл охлажденного на льду ТРИС-буфера с добавлением или без добавления ЭДТК.

Ресуспендированные клетки инкубировали при определенной температуре при встряхивании. После инкубации смесь центрифугировали при 10000×g в течение 10 мин.

Дебрис отбрасывали.

К супернатанту добавляли 150 мкл содержащего ДСН буфера для приготовления образца. После нагревания до 95°С в течение 10 мин при встряхивании, 5 мкл вносили на ДСН-гель.

Сравнительные используемые в эксперименте параметры и полученные результаты (серия 1):

Сравнительные используемые в эксперименте параметры и полученные результаты (серия 2):

Сравнительные используемые в эксперименте параметры и полученные результаты (серия 3):

Пример 2:

Крупномасштабное получение низкомолекулярного транспортного белка (α-синуклеина)

Клетки Е. coli, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую низкомолекулярный транспортный белок (α-синуклеин), культивировали в 10 л ферментере. После завершения культивирования собирали 9,52 л продукта с величиной ОП, измеренной при 578 нм, равной 78. Это соответствовало 817 г влажной массы клеток.

Из этого количества 110 г клеточного дебриса ресуспендировали в 5 л буфера для инкубации (20 мМ ТРИС, 2 мМ ЭДТК, pH 8). После инкубации в течение 30 мин при 25°С при перемешивании клетки отделяли от супернатанта, который содержал представляющий интерес белок из периплазматического пространства, путем центрифугирования при 4700 об/мин в течение 60 мин при 4°С.

Выход низкомолекулярного транспортного белка избирательно выделенного из периплазматического пространства, составлял 94,9%.

Было установлено, что с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно эффективно выделять экспрессируемый в периплазматическом пространстве представляющий интерес белок (см. фиг. 1).

Пример 3:

Крупномасштабное получение экзотоксина Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M)

Клетки Е. coli, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую экзотоксин Pseudomonas (Nlys-PE25-LR8M), культивировали и собирали согласно методу, описанному в примере 2.

106 г клеточного дебриса ресуспендировали в 5 л буфера для инкубации (20 мМ ТРИС, 2 мМ ЭДТК, pH 8). После инкубации в течение 30 мин при 25°С при перемешивании клетки отделяли от супернатанта, который содержал представляющий интерес белок из периплазматического пространства, путем центрифугирования при 4700 об/мин в течение 60 мин при 4°С.

Экзотоксин Pseudomonas избирательно выделяли из периплазматического пространства.

Было установлено, что с помощью способа, предлагаемого в изобретении, можно эффективно выделять из периплазматического пространства представляющий интерес белок (см. фиг. 2).

1. Способ получения полипептида, рекомбинантно продуцируемого в периплазму прокариотическими клетками, включающий

- инкубирование прокариотических клеток в растворе, содержащем Трис в концентрации, составляющей от 10 мМ до 95 мМ и ЭДТК в концентрации от 2 мМ до 6 мМ, при значении рН, составляющем от 7 до 10, в течение периода времени от 15 мин до 6 ч при температуре от 20°С до 33°С,

где раствор практически свободен от гидролизующих пептидогликан ферментов и сахара.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что значение рН составляет примерно 8.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что продолжительность инкубации составляет примерно 30 мин.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что концентрация Трис составляет примерно 20 мМ.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что прокариотическая клетка представляет собой грамотрицательную клетку.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что прокариотическая клетка представляет собой клетку E. coli.