Способы гликоконъюгирования и композиции

Группа изобретений относится к медицине, в частности к области вакционопрофилактики, и раскрывает способ получения гликоконъюгата, содержащего бактериальный капсульный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем через (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматный (еТЕС) спейсер, гликоконъюгат, полученный указанным способом, и иммуногенную композицию, содержащую указанный гликоконъюгат. Изобретения позволяют получать соответствующим образом блокированные конъюгаты на основе белка-носителя, у которых поддерживаются функциональные свойства носителя и сам конъюгат сохраняет способность вызывать желаемый иммунный ответ. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 15 табл., 9 пр., 8 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение в целом относится к гликоконъюгатам, содержащим сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматный (еТЕС) спейсер, к иммуногенным композициям, содержащим такие гликоконъюгаты, и к способам получения и применения таких гликоконъюгатов и иммуногенных композиций.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Подход к повышению иммуногенности слабо иммуногенных молекул посредством конъюгирования этих молекул с молекулами «носителя» успешно используется на протяжении нескольких десятилетий (см., например, Goebel et al. (1939) J. Exp. Med. 69:53). Например, описаны многие иммуногенные композиции, в которых очищенные капсульные полимеры были конъюгированы с белками-носителями для создания более эффективных иммуногенных композиций с использованием этого «эффекта носителя» (Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591). Также было показано, что конъюгирование позволяет обойти слабый антительный ответ, обычно наблюдаемый у младенцев при иммунизации свободным полисахаридом (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel etal. (1986) J. Exp. Med. 158: 294).

Успешно получены конъюгаты с использованием различных сшивающих агентов или агентов сочетания, таких как гомобифункциональные, гетеробифункциональные сшивающие агенты или сшивающие агенты «нулевой длины». В настоящее время известно много способов сочетания иммуногенных молекул, таких как сахариды, белки и пептиды, с пептидными или белковыми носителями. В большинстве способов создаются аминные, амидные, уретановые, изотиомочевинные или дисульфидные связи или в некоторых случаях простые тиоэфирные связи. Недостатком использования сшивающих агентов или агентов сочетания, при котором в боковые цепи реакционно-способных молекул аминокислот носителя и/или иммуногенных молекул вводятся реакционно-способные сайты, является то, что реакционно-способные сайты, если они не нейтрализованы, могут свободно реагировать с любой нежелательной молекулой либо in vitro (возможно негативно влияя, таким образом, на функциональные свойства или стабильность конъюгатов), либо in vivo (обуславливая, таким образом, возможный риск побочных эффектов у лиц или животных, иммунизированных данными препаратами). Такой избыток реакционно-способных сайтов может быть модифицирован или «блокирован (capped)» с целью инактивации этих сайтов с использованием различных известных химических реакций, но сами эти реакции могут оказаться по иным причинам разрушительными для функциональных свойств конъюгатов. Это может быть особенно проблематичным при попытке создания конъюгата путем введения реакционно-способных сайтов в молекулу носителя, поскольку ее более существенный размер и более сложная структура (по сравнению с иммуногенной молекулой) может делать ее более уязвимой к разрушительным последствиям химической обработки. Таким образом, сохраняется необходимость в новых способах получения соответствующим образом блокированных конъюгатов на основе белка-носителя, у которых поддерживаются функциональные свойства носителя и сам конъюгат сохраняет способность вызывать желаемый иммунный ответ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способы получения гликоконъюгатов, содержащих сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через бивалентный гетеробифункциональный линкер, называемый в данном описании как (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматный (еТЕС) спейсер. Этот еТЕС спейсер представляет собой структуру, линейная часть которой состоит из семи атомов (т.е. -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-), и обеспечивает образование стабильной тиоэфирной и амидной связей между сахаридом и белком-носителем. Согласно изобретению также предложены соединенные через еТЕС гликоконъюгаты (еТЕС linked glycoconjugates), иммуногенные композиции, содержащие их, и способы применения таких гликоконъюгатов и иммуногенных композиций.

В одном из аспектов изобретения предложен гликоконъюгат, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, при этом сахарид ковалентно связан с еТЕС спейсером через карбаматную связь, а белок-носитель ковалентно связан с еТЕС спейсером через амидную связь.

В некоторых воплощениях сахарид представляет собой полисахарид, такой как капсульный полисахарид, имеющий происхождение из бактерий, в частности из патогенных бактерий. В других воплощениях сахарид представляет собой олигосахарид или моносахарид.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты по изобретению могут быть представлены общей формулой (I):

где атомы, составляющие еТЕС спейсер, помещены в центральный блок.

Белки-носители, введенные в гликоконъюгаты по изобретению, выбраны из группы белков-носителей, обычно подходящих для таких целей, которые описаны далее в данном изобретении или известны специалистам в данной области техники. В конкретных воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197 (перекрестно-реагирующий материал (cross-reactive material; CRM)).

В другом аспекте изобретения предложен способ получения гликоконъюгата, содержащего сахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, включающий стадии: а) приведения во взаимодействие сахарида с производным угольной кислоты в органическом растворителе с получением активированного сахарида; б) приведения во взаимодействие активированного сахарида с цистамином или цистеамином либо их солью с получением тиолированного сахарида; в) приведения во взаимодействие тиолированного сахарида с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков; г) приведения во взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галогенацетамидных групп, с получением конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель); и д) приведения во взаимодействие конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель) с (1) первым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (2) вторым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки активированного тиолированного сахарида; с образованием таким образом соединенного через еТЕС гликоконъюгата.

Во многих воплощениях производное угольной кислоты представляет собой 1,1'-карбонил-ди-(1,2,4-триазол) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI). Предпочтительно производное угольной кислоты представляет собой CDT, а органический растворитель представляет собой полярный апротонный растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO). В предпочтительных воплощениях тиолированный сахарид получают путем взаимодействия активированного сахарида с бифункциональным симметричным тиоалкиламинным реагентом цистамином или его солью. Альтернативно, тиолированный сахарид может быть получен путем взаимодействия активированного сахарида с цистеамином или его солью. Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты, полученные способами по изобретению, могут быть представлены общей формулой (I).

Во многих воплощениях первым блокирующим реагентом является N-ацетил-L-цистеин, который взаимодействует с неконъюгированными α-галогенацетамидными группами на остатках лизина белка-носителя с образованием остатка S-карбоксиметилцистеина (CMC), ковалентно связанного с активированным остатком лизина посредством тиоэфирной связи. В других воплощениях вторым блокирующим реагентом является йодоацетамид (IAA), который взаимодействует с неконъюгированными свободными сульфгидрильными группами активированного тиолированного сахарида с получением блокированного тиоацетамида. Часто стадия д) включает блокирование с использованием как первого блокирующего реагента, так и второго блокирующего реагента. В некоторых воплощениях стадия д) включает блокирование с применением N-ацетил-L-цистеина в качестве первого блокирующего реагента и IAA в качестве второго блокирующего реагента.

В некоторых воплощениях стадия блокирования д) дополнительно включает взаимодействие с восстанавливающим агентом, например, DTT (дитиотреитол), ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил)фосфин) или меркаптоэтанолом, после взаимодействия с первым и/или вторым блокирующим реагентом.

В некоторых воплощениях стадия г) дополнительно включает получение активированного белка-носителя, содержащего одну или более α-галогенацетамидных групп, с последующим приведением во взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем. Во многих воплощениях активированный белок-носитель содержит одну или более α-бромацетамидных групп.

В другом аспекте изобретения предложен соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, полученный в соответствии с любым из способов, раскрытых в данном описании.

Для каждого из аспектов изобретения, в конкретных воплощениях способов и композиций, изложенных в данном описании, соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит сахарид, который представляет собой бактериальный капсульный полисахарид, в частности капсульный полисахарид, имеющий происхождение из патогенных бактерий.

В некоторых таких воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит пневмококковый (Pn) капсульный полисахарид, имеющий происхождение из Streptococcus pneumoniae. В конкретных воплощениях данный Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В других таких воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит менингококковый (Mn) капсульный полисахарид, имеющий происхождение из Neisseria meningitidis. В конкретных воплощениях данный Mn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y.

В особо предпочтительных воплощениях сахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид, такой как Pn или Mn капсульный полисахарид, ковалентно конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер.

Композиции и способы, изложенные в данном описании, полезны для различных приложений. Например, гликоконъюгаты по изобретению можно использовать для получения иммуногенных композиций, содержащих соединенный через еТЕС гликоконъюгат. Такие иммуногенные композиции можно использовать для защиты реципиентов от бактериальных инфекций, например, вызываемых патогенными бактериями, такими как S. pneumoniae или N. meningitidis.

Таким образом, в другом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, как изложено в данном описании.

Во многих воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид.

В некоторых таких воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит Pn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из S. pneumoniae. В некоторых конкретных воплощениях данный Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В других таких воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит Mn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из N. meningitidis. В некоторых конкретных воплощениях данный Mn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y.

В предпочтительных воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит бактериальный капсульный полисахарид, такой как Pn или Mn капсульный полисахарид, ковалентно конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер.

В некоторых воплощениях иммуногенные композиции содержат адъювант. В некоторых таких воплощениях адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. В одном воплощении иммуногенные композиции, изложенные в данном описании, содержат в качестве адъюванта фосфат алюминия.

В другом аспекте изобретения предложен способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению, которая содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид.

В одном воплощении инфекция, заболевание или состояние ассоциированы с бактериями S. pneumoniae, и гликоконъюгат содержит Pn капсульный полисахарид. В другом воплощении инфекция, заболевание или состояние ассоциированы с бактериями N. meningitidis, и гликоконъюгат содержит Mn капсульный полисахарид.

В других аспектах изобретения предложен способ индуцирования иммунного ответа против патогенных бактерий; способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности заболевания или состояния, вызванного патогенными бактериями; и способ снижения тяжести по меньшей мере одного симптома инфекции, заболевания или состояния, вызванного патогенными бактериями, в каждом случае путем введения субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид, имеющий происхождение из патогенных бактерий.

В другом аспекте изобретения предложен способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид. В предпочтительных воплощениях способ включает вызывание защитного иммунного ответа у субъекта, как далее изложено в данном описании.

В другом аспекте изобретения предложен способ введения субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат, для вызывания защитного иммунного ответа у субъекта, как далее изложено в данном описании.

В следующем аспекте изобретения предложено антитело, выработанное в ответ на соединенный через еТЕС гликоконъюгат по настоящему изобретению или на иммуногенную композицию, содержащую такой гликоконъюгат. Подобные антитела можно использовать в исследованиях и клинических лабораторных анализах, таких как обнаружение и серотипирование бактерий, или можно использовать для придания пассивного иммунитета субъекту.

В еще одном аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая соединенный через еТЕС гликоконъюгат по настоящему изобретению, для применения в предупреждении, лечении или уменьшении интенсивности бактериальной инфекции, например инфекции, вызванной S. pneumoniae или N. meningitidis.

В другом аспекте изобретения предложено применение иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат по настоящему изобретению, для изготовления лекарственного средства для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, например инфекции, вызванной S. pneumoniae или N. meningitidis.

В некоторых предпочтительных воплощениях терапевтических и/или профилактических способов и применений, описанных выше, иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий бактериальный капсульный полисахарид, ковалентно связанный с белком-носителем через еТЕС спейсер. Во многих воплощениях способов и применений, изложенных в данном описании, бактериальный капсульный полисахарид представляет собой Pn капсульный полисахарид или Mn капсульный полисахарид. В некоторых таких воплощениях Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В других таких воплощениях Mn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y.

В некоторых предпочтительных воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197. В особо предпочтительных воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий бактериальный капсульный полисахарид, такой как Pn или Mn капсульный полисахарид, ковалентно конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показана общая схема получения соединенных через еТЕС гликоконъюгатов по изобретению для гликоконъюгата, содержащего полисахарид, ковалентно конъюгированный с CRM197.

На Фиг. 2 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 33F (Pn-33F).

На Фиг. 3 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 22F (Pn-22F).

На Фиг. 4 показана повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 10А (Pn-10А).

На Фиг. 5 повторяющаяся полисахаридная структура капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 11А (Pn-11А).

На Фиг. 6 показана репрезентативная структура гликоконъюгата Pn-33F, в состав которого входит еТЕС линкер (А) и возможно блокированные и неблокированные свободные сульфгидрильные сайты (Б).

На Фиг. 7 показана блок-схема репрезентативных способов для процессов активации (А) и конъюгирования (Б), использованных при получении гликоконъюгата Pn-33F с CRM197.

На Фиг. 8 показан уровень тиолирования капсульного полисахарида Pn-33F как функция числа молярных эквивалентов CDT, использованного на стадии активации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение может быть более легко понято со ссылкой на следующее далее подробное описание предпочтительных воплощений изобретения и примеров, включенных в данное описание. Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют значение, обычно понимаемое средним специалистом в области техники, к которой данное изобретение относится. Хотя при практическом применении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные изложенным в данном описании, некоторые предпочтительные способы и материалы приведены в данном описании. При описании воплощений и составлении формулы изобретения будет использована определенная терминология в соответствии с изложенными ниже определениями.

Как использовано в данном описании, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если не указано иное. Так, например, ссылки на «способ» включают в себя один или более способов и/или стадий изложенного в данном описании типа, а ссылки на «еТЕС спейсер» относятся к одному или более чем одному еТЕС спейсеру, как будет очевидно среднему специалисту в данной области техники после прочтения данного описания.

Использованный в данном описании термин «примерно» означает нахождение в пределах статистически значимого диапазона величины, такой как установленный диапазон концентраций, период времени, молекулярная масса, температура или рН. Такой диапазон по порядку величины может находиться в типичном случае в пределах 20%, в более типичном случае в пределах 10% и в еще более типичном случае в пределах 5% указанной величины или диапазона. В некоторых случаях такой диапазон может находиться в пределах экспериментальной ошибки, типичной для стандартных методов, используемых для измерения и/или определения заданной величины или диапазона. Допустимое отклонение, охватываемое термином «примерно», будет зависеть от конкретной исследуемой системы и может быть легко оценено специалистом средней квалификации в данной области техники. В тех случаях, когда в данной заявке приводится диапазон, каждое целое число в пределах данного диапазона также рассматривается как воплощение изобретения.

Следует отметить, что использованные в данном описании такие термины, как «содержит», «содержал», «содержащий», «включает», «включающий» и им подобные, могут иметь значение, приписываемое им в патентном законе США; например, они могут означать «включает в себя», «включал в себя», «включающий в себя» и тому подобное. Такие термины подразумевают включение конкретных ингредиентов или набора ингредиентов без исключения любых других ингредиентов. Такие термины, как «состоящий по существу из» и «состоит по существу из», имеют значение, приписываемое им в патентном законе США; например, они позволяют включение дополнительных ингредиентов или стадий, которые не умаляют новые или основные характеристики изобретения, т.е. они исключают дополнительные неперечисленные ингредиенты или стадии, которые умаляют новые или основные характеристики изобретения. Термины «состоит из» и «состоящий из» имеют значение, приписываемое им в патентном законе США; а именно то, что эти термины являются закрытыми. Соответственно эти термины подразумевают включение конкретного ингредиента или набора ингредиентов и исключение всех других ингредиентов.

Термин «сахарид», использованный в данном описании, может относиться к полисахариду, олигосахариду или моносахариду. Часто ссылки на сахарид относятся к бактериальному капсульному полисахариду, в частности к капсульным полисахаридам, имеющим происхождение из патогенных бактерий, таких как S. pneumoniae или N. meningitidis.

Термины «конъюгат» или «гликоконъюгат» используются взаимозаменяемо в данном описании и относятся к сахариду, ковалентно конъюгированному с белком-носителем. Гликоконъюгаты по настоящему изобретению в некоторых случаях обозначены в данном описании как «соединенные через еТЕС» гликоконъюгаты, которые содержат сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем по меньшей мере через один еТЕС спейсер. Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты по изобретению и иммуногенные композиции, содержащие их, могут содержать некоторое количество свободного сахарида.

Термин «свободный сахарид», как он использован в данном описании, означает сахарид, который не конъюгирован ковалентно с белком-носителем, или сахарид, который соединен ковалентно с очень небольшим числом белков-носителей, присоединенных при большом соотношении сахарид/белок (больше 5:1), но тем не менее присутствует в составе гликоконъюгата. Этот свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с гликоконъюгатом (т.е. нековалентно связанным с гликоконъюгатом, адсорбированным на гликоконъюгате или заключенным в гликоконъюгат либо захваченным гликоконъюгатом) (конъюгированный сахарид)-(белок-носитель). Термины «свободный полисахарид» и «свободный капсульный полисахарид» могут быть использованы в данном описании для передачи одного и того же значения в отношении гликоконъюгатов, в которых сахарид представляет собой полисахарид или капсульный полисахарид соответственно.

Как использовано в данном описании, термины «конъюгировать», «конъюгированный» и «конъюгирование» относятся к способу, при котором сахарид, например бактериальный капсульный полисахарид, ковалентно присоединяют к молекуле-носителю или белку-носителю. В способах по настоящему изобретению сахарид ковалентно конъюгирован с белком-носителем по меньшей мере через один еТЕС спейсер. Конъюгирование может быть осуществлено способами, описанными ниже, или другими способами, известными в данной области техники. Конъюгирование с белком-носителем повышает иммуногенность бактериального капсульного полисахарида.

Гликоконъюгаты

Настоящее изобретение относится к гликоконъюгатам, содержащим сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через один или более еТЕС спейсеров, при этом сахарид ковалентно конъюгирован с еТЕС спейсером через карбаматную связь, и белок-носитель ковалентно конъюгирован с еТЕС спейсером через амидную связь.

В дополнение к наличию одного или более еТЕС спейсеров, новые признаки гликоконъюгатов по настоящему изобретению включают профили молекулярных масс сахаридов и конечных соединенных через еТЕС гликоконъюгатов, соотношение числа конъюгированных остатков лизина на одну молекулу белка-носителя и числа остатков лизина, ковалентно связанных с полисахаридом через еТЕС спейсер(ы), число ковалентных связей между белком-носителем и сахаридом как функцию от числа повторяющихся единиц сахарида и относительное количество свободного сахарида в сравнении с общим количеством сахарида.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты по изобретению могут быть представлены общей формулой (I):

Этот еТЕС спейсер представляет собой структуру, линейная часть которой состоит из семи атомов (т.е. -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-) и обеспечивает образование стабильной тиоэфирной и амидной связей между сахаридом и белком-носителем. Синтез соединенного через еТЕС гликоконъюгата включает в себя взаимодействие активированной гидроксильной группы сахарида с аминогруппой тиоалкиламинного реагента, например, цистамина или цистеинамина либо их соли, образование карбаматной связи с сахаридом с получением тиолированного сахарида. Образование одной или более свободных сульфгидрильных групп происходит в реакции с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида. В результате взаимодействия этих свободных сульфгидрильных групп активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, имеющим одну или более α-галогенацетамидных групп на остатках, содержащих аминогруппу, образуется тиоэфирная связь с получением конъюгата, при этом белок-носитель присоединяется к еТЕС спейсеру через амидную связь.

В гликоконъюгатах по изобретению сахарид может быть полисахаридом, олигосахаридом или моносахаридом, а белок-носитель может быть выбран из любого подходящего носителя, как в дальнейшем изложено в данном описании, или известного специалистам в данной области техники. Во многих воплощениях сахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид. В некоторых таких воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197.

В некоторых таких воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит Pn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из Streptococcus pneumoniae. В конкретных воплощениях данный Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В других воплощениях капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 10А, 11A, 22F и 33F. В одном из таких воплощений капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-33F. В другом таком воплощении капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-22F. В другом таком воплощении капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-10А. Еще в одном таком воплощении капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-11А.

В других воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит Mn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из N. meningitidis. В конкретных воплощениях данный Mn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y. В одном из таких воплощений капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Mn-А. В другом таком воплощении капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Mn-С. В другом таком воплощении капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Mn-W135. Еще в одном таком воплощении капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Mn-Y.

В особо предпочтительных воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит Pn или Mn бактериальный капсульный полисахарид, такой как капсульный полисахарид Pn-серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F, или капсульный полисахарид Mn-серотипа А, С, W135 или Y, который ковалентно конъюгирован с CRM197 через еТЕС спейсер.

В некоторых воплощениях соединенные через еТЕС гликоконъюгаты по настоящему изобретению содержат сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, при этом сахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях сахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях сахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа; или от 200 кДа до 500 кДа. В некоторых таких воплощениях сахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид, такой как капсульный полисахарид Pn-серотипа 1,3,4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F, или капсульный полисахарид Mn-серотипа А, С, W135 или Y, при этом данный капсульный полисахарид имеет молекулярную массу, лежащую в пределах любого из описанных диапазонов молекулярных масс.

В некоторых воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 50 кДа до 20000 кДа. В других воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат имеет молекулярную массу в диапазоне от 500 кДа до 10000 кДа. В других воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат имеет молекулярную массу в диапазоне от 200 кДа до 10000 кДа. В еще одних воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат имеет молекулярную массу в диапазоне от 1000 кДа до 3000 кДа.

В следующих воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 кДа до 15000 кДа; от 1000 кДа до 12500 кДа; от 1000 кДа до 10000 кДа; от 1000 кДа до 7500 кДа; от 1000 кДа до 6000 кДа; от 1000 кДа до 5000 кДа; от 1000 кДа до 4000 кДа; от 1000 кДа до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа.

Другой характеристикой соединенных через еТЕС гликоконъюгатов по изобретению является число остатков лизина в белке-носителе, подвергнутых конъюгированию с сахаридом через еТЕС спейсер, которое можно охарактеризовать в виде диапазона конъюгированных остатков лизина.

Во многих воплощениях белок-носитель ковалентно конъюгирован с еТЕС спейсером через амидную связь с одной или более ε-аминогруппами остатков лизина на белке-носителе. В некоторых таких воплощениях белок-носитель содержит от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно конъюгированных с сахаридом. В других таких воплощениях белок-носитель содержит от 4 до 16 остатков лизина, ковалентно конъюгированных с сахаридом.

В предпочтительном воплощении белок-носитель содержит CRM197, который содержит 39 остатков лизина. В некоторых таких воплощениях CRM197 может содержать от 4 до 16 остатков лизина, ковалентно связанных с сахаридом, из 39. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от примерно 10% до примерно 41% остатков лизина CRM197 являются ковалентно связанными с сахаридом. В другом таком воплощении CRM197 может содержать от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно связанных с сахаридом, из 39. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от примерно 5% до примерно 50% остатков лизина CRM197 являются ковалентно связанными с сахаридом.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты по изобретению также могут быть охарактеризованы соотношением (масса/масса) сахарида к белку-носителю. В некоторых воплощениях соотношение сахарид:(белок-носитель) (масс./масс.) находится в диапазоне от 0,2 до 4. В других воплощениях соотношение сахарид:(белок-носитель) (масс./масс.) находится в диапазоне от 1,0 до 2,5. В следующих воплощениях соотношение сахарид:(белок-носитель) (масс./масс.) находится в диапазоне от 0,4 до 1,7. В некоторых таких воплощениях сахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид и/или белок-носитель представляет собой CRM197.

Гликоконъюгаты также могут быть охарактеризованы числом ковалентных связей между белком-носителем и сахаридом в зависимости от числа повторяющихся единиц сахарида. В одном воплощении гликоконъюгат по изобретению содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4 повторяющиеся сахаридные единицы полисахарида. В другом воплощении ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 10 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В другом воплощении ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 15 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В следующем воплощении ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 25 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида.

Во многих воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197, а ковалентная связь через еТЕС спейсер между CRM197 и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида.

Важным фактором при образовании конъюгата является разработка условий, позволяющих сохранить потенциально чувствительные несахаридные функциональные группы заместителей отдельных компонентов, такие как О-ацильные, фосфатные или глицеролфосфатные боковые цепи, которые могут образовывать часть эпитопа сахарида.

В одном воплощении гликоконъюгат содержит сахарид, имеющий степень О-ацетилирования в диапазоне 10-100%. В некоторых таких воплощениях сахарид имеет степень О-ацетилирования в диапазоне 50-100%. В других таких воплощениях сахарид имеет степень О-ацетилирования в диапазоне 75-100%. В следующих воплощениях сахарид имеет степень О-ацетилирования больше 70% или ровно 70% (не менее 70%).

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободный сахарид, который не конъюгирован ковалентно с белком-носителем, но тем не менее присутствует в составе гликоконъюгата. Этот свободный сахарид может быть нековалентно ассоциированным с гликоконъюгатом (т.е. нековалентно связанным с гликоконъюгатом, адсорбированным на гликоконъюгате или заключенным в гликоконъюгат либо захваченным гликоконъюгатом).

В некоторых воплощениях соединенный через еТЕС гликоконъюгат содержит менее чем примерно 45% свободного сахарида, менее чем примерно 40% свободного сахарида, менее чем примерно 35% свободного сахарида, менее чем примерно 30% свободного сахарида, менее чем примерно 25% свободного сахарида, менее чем примерно 20% свободного сахарида, менее чем примерно 15% свободного сахарида, менее чем примерно 10% свободного сахарида или менее чем примерно 5% свободного сахарида относительно общего количества сахарида. Предпочтительно гликоконъюгат содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида и еще более предпочтительно менее 5% свободного сахарида.

В некоторых предпочтительных воплощениях изобретения предложен соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий капсульный полисахарид, предпочтительно Pn или Mn капсульный полисахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, имеющий один или более следующих признаков по отдельности или в комбинации: полисахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 50 кДа до 2000 кДа; гликоконъюгат имеет молекулярную массу в диапазоне от 500 кДа до 10000 кДа; белок-носитель содержит от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно связанных с сахаридом; соотношение сахарид:(белок-носитель) (масс./масс.) находится в диапазоне от 0,2 до 4; гликоконъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида; сахарид имеет степень О-ацетилирования в диапазоне 75-100%; конъюгат содержит менее чем примерно 15% свободного полисахарида относительно общего содержания полисахарида; белок-носитель представляет собой CRM197; капсульный полисахарид выбран из капсульных полисахаридов Pn-серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F, или капсульный полисахарид выбран из капсульных полисахаридов Mn-серотипа А, С, W135 или Y.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты также могут быть охарактеризованы своим распределением молекул по размерам (Kd). Молекулярный размер конъюгатов определяют с использованием гель-проникающей хроматографии (SEC) на Сефарозе CL-4B в качестве неподвижной фазы, применяя систему для жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Чтобы определить Kd, хроматографическую колонку сначала калибруют для установления V0, который представляет собой свободный объем или общий эксклюзионный объем, и Vi, начиная с которого элюируются молекулы наименьшего размера в образце, также известного как объем между частицами (interparticle volume). Все разделение при проведении SEC происходит в диапазоне между V0 и Vi. Значение Kd для каждой собранной фракции определяют согласно следующему выражению: Kd=(Ve-Vi)/(Vi-V0), где Ve представляет собой объем удерживания соединения. Процентное содержание (%) фракции (основного пика), которая элюируется со значением не более 0,3, определяет значение Kd (распределение молекул по размерам) для конъюгата. В некоторых воплощениях изобретения предложены соединенные через еТЕС гликоконъюгаты, имеющие распределение молекул по размерам (Kd), не менее 35%. В других воплощениях изобретения предложены соединенные через еТЕС гликоконъюгаты, имеющие распределение молекул по размерам (Kd), не менее 15%, не менее 20%, не менее 25%, не менее 30%, не менее 35%, не менее 40%, не менее 45%, не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90%.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать свободные сульфгидрильные остатки. В некоторых случаях, активированные тиолированные сахариды, полученные способами, предложенными в данном описании, будут содержать многочисленные свободные сульфгидрильные остатки, некоторые из которых могут не подвергаться ковалентному конъюгированию с белком-носителем во время стадии конъюгирования. Такие оставшиеся свободными сульфгидрильные остатки блокируют в реакции с реакционно-способным в отношении тиолов блокирующим реагентом, например йодоацетамидом (IAA), чтобы блокировать потенциально реакционно-способную функциональную группу. Другие реакционно-способные в отношении тиолов блокирующие реагенты, например, малеимидсодержащие реагенты и им подобные, также охвачены изобретением.

В дополнение к этому, соединенные через еТЕС гликоконъюгаты и иммуногенные композиции по изобретению могут содержать оставшийся неконъюгированным белок-носитель, который может включать активированный белок-носитель, подвергшийся модификации во время проведения стадий процесса блокирования.

Гликоконъюгаты по изобретению можно использовать при получении иммуногенных композиций для защиты реципиентов от бактериальных инфекций, например патогенных бактерий, таких как S. pneumoniae или N. meningitidis. Следовательно, в другом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, как изложено в данном описании.

Во многих воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид.

В некоторых таких воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит Pn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из S. pneumoniae. В некоторых конкретных воплощениях данный Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В других таких воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит Mn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из N. meningitidis. В некоторых конкретных воплощениях данный Mn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y.

В особо предпочтительных воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит бактериальный капсульный полисахарид, такой как Pn или Mn капсульный полисахарид, ковалентно конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер.

В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит адъювант. В некоторых таких воплощениях адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит в качестве адъюванта фосфат алюминия.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты по изобретению и иммуногенные композиции, содержащие их, могут содержать некоторое количество свободного сахарида. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит менее чем примерно 45%, менее чем примерно 40%, менее чем примерно 35%, менее чем примерно 30%, менее чем примерно 25%, менее чем примерно 20%, менее чем примерно 15%, менее чем примерно 10% или менее чем примерно 5% свободного полисахарида относительно общего количества сахарида. Предпочтительно иммуногенная композиция содержит менее 15% свободного сахарида, более предпочтительно менее 10% свободного сахарида и еще более предпочтительно менее 5% свободного сахарида.

В другом аспекте гликоконъюгаты или иммуногенные композиции по изобретению можно использовать для получения антител, которые являются функциональными по результатам измерений цитолиза бактерий в животной модели оценки эффективности или в опсонофагоцитарном анализе цитолитической активности. Гликоконъюгаты по изобретению, содержащие бактериальный капсульный полисахарид, можно использовать при получении антител против такого бактериального капсульного полисахарида. Такие антитела впоследствии можно использовать в исследованиях и клинических лабораторных анализах, таких как обнаружение и серотипирование бактерий. Такие антитела также могут быть использованы для придания пассивного иммунитета субъекту. В некоторых воплощениях антитела, полученные к бактериальным полисахаридам, являются функциональными как в животной модели оценки эффективности, так и в опсонофагоцитарном анализе цитолитической активности.

Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты и иммуногенные композиции, изложенные в данном описании, также могут быть использованы в различных терапевтических или профилактических способах для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта. В частности, соединенные через еТЕС гликоконъюгаты, содержащие бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид из патогенной бактерии, можно использовать для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта, вызванных патогенными бактериями.

Следовательно, в одном аспекте изобретения предложен способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий бактериальный капсульный полисахарид.

В одном воплощении инфекция, заболевание или состояние ассоциированы с бактериями S. pneumoniae, и гликоконъюгат содержит Pn капсульный полисахарид. В некоторых таких воплощениях инфекция, заболевание или состояние выбраны из группы, состоящей из пневмонии, синусита, среднего отита, менингита, бактериемии, сепсиса, эмпиемы плевры, конъюнктивита, остеомиелита, септического артрита, эндокардита, перитонита, перикардита, мастоидита, панникулита, инфекции мягких тканей и абсцесса головного мозга.

В другом воплощении инфекция, заболевание или состояние ассоциированы с бактериями N. meningitidis, и гликоконъюгат содержит Mn капсульный полисахарид. В некоторых таких воплощениях инфекция, заболевание или состояние выбраны из группы, состоящей из менингита, менингококкемии, бактериемии и сепсиса.

В другом аспекте изобретения предложен способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности заболевания или состояния, вызванного патогенными бактериями, у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид.

В другом аспекте изобретения предложен способ ослабления тяжести по меньшей мере одного симптома заболевания или состояния, вызванного инфекцией патогенными бактериями, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид, например, Pn или Mn капсульный полисахарид.

В другом аспекте изобретения предложен способ введения субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат по изобретению, с целью вызывания защитного иммунного ответа у субъекта, как в дальнейшем изложено в данном описании.

В еще одном аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая соединенный через еТЕС гликоконъюгат по настоящему изобретению, изложенный в данном описании, для применения в предупреждении, лечении или уменьшении интенсивности бактериальный инфекции, например инфекции S. pneumoniae или N. meningitidis.

В другом аспекте изобретения предложено применение иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат по настоящему изобретению, изложенный в данном описании, для получения лекарственного средства для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, например инфекции S. pneumoniae или N. meningitidis.

В терапевтических и/или профилактических способах и применениях, описанных выше, иммуногенная композиция часто содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий бактериальный капсульный полисахарид, ковалентно связанный с белком-носителем через еТЕС спейсер. Во многих воплощениях способов, изложенных в данном описании, бактериальный капсульный полисахарид представляет собой Pn капсульный полисахарид или Mn капсульный полисахарид. В некоторых таких воплощениях капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В других таких воплощениях капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y.

В некоторых предпочтительных воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197. В особо предпочтительных воплощениях иммуногенная композиция содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, который содержит бактериальный капсульный полисахарид, такой как Pn или Mn капсульный полисахарид, ковалентно конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены способы индуцирования иммунного ответа, направленного против бактерий S. pneumoniae или N. meningitidis у субъекта, способы предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности инфекции, заболевания или состояния, вызванных бактериями S. pneumoniae или N. meningitidis у субъекта, и способы ослабления тяжести по меньшей мере одного симптома инфекции, заболевания или состояния, вызванных инфекцией S. pneumoniae или N. meningitidis у субъекта, в каждом случае путем введения субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей соединенный через еТЕС гликоконъюгат и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид, имеющий происхождение из S. pneumoniae или N. meningitidis соответственно.

Сахариды

Сахариды могут включать полисахариды, олигосахариды и моносахариды. Во многих воплощениях сахарид представляет собой полисахарид, в частности бактериальный капсульный полисахарид. Капсульные полисахариды получают стандартными методами, известными среднему специалисту в данной области техники.

В настоящем изобретении капсульные полисахариды могут быть получены, например, из Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F S. pneumoniae. В одном воплощении пневмококки, содержащие каждый полисахаридный серотип, могут быть выращены в среде на основе сои. Индивидуальные полисахариды очищают центрифугированием, осаждением, ультрафильтрацией и/или колоночной хроматографией. Очищенные полисахариды могут быть активированы для того, чтобы сделать их способными к взаимодействию с еТЕС спейсером, и затем введены в гликоконъюгаты по изобретению, как в дальнейшем изложено в данном описании.

Молекулярная масса капсульного полисахарида представляет собой фактор, который учитывают при применении в иммуногенных композициях. Капсульные полисахариды с большой молекулярной массой способны индуцировать определенные антительные иммунные ответы ввиду большего числа эпитопов (т.е. большей валентности антигена), присутствующих на поверхности антигена. Выделение и очистка капсульных полисахаридов с большой молекулярной массой предусматриваются для применения в конъюгатах, композициях и способах по настоящему изобретению.

В некоторых воплощениях сахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях сахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 50 кДа до 2000 кДа. В других таких воплощениях сахарид имеет молекулярную массу в диапазоне от 50 кДа до 1750 кДа; от 50 кДа до 1500 кДа; от 50 кДа до 1250 кДа; от 50 кДа до 1000 кДа; от 50 кДа до 750 кДа; от 50 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 2000 кДа; от 100 кДа до 1750 кДа; от 100 кДа до 1500 кДа; от 100 кДа до 1250 кДа; от 100 кДа до 1000 кДа; от 100 кДа до 750 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 2000 кДа; от 200 кДа до 1750 кДа; от 200 кДа до 1500 кДа; от 200 кДа до 1250 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 750 кДа или от 200 кДа до 500 кДа. В некоторых таких воплощениях сахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид, такой как капсульный полисахарид Pn-серотипа 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F, или капсульный полисахарид Mn-серотипа А, С, W135 или Y, при этом капсульный полисахарид имеет молекулярную массу, попадающую в один из описанных диапазонов молекулярных масс.

В некоторых воплощениях сахариды по изобретению являются О-ацетилированными. В некоторых воплощениях гликоконъюгат содержит сахарид, имеющий степень О-ацетилирования в диапазоне 10-100%, в диапазоне 20-100%, в диапазоне 30-100%, в диапазоне 40-100%, в диапазоне 50-100%, в диапазоне 60-100%, в диапазоне 70-100%, в диапазоне 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. В других воплощениях степень О-ацетилирования составляет не менее 10%, не менее 20%, не менее 30%, не менее 40%, не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90% или примерно 100%.

В некоторых воплощениях капсульные полисахариды, гликоконъюгаты или иммуногенные композиции по изобретению используют для получения антител, которые являются функциональными по результатам измерений цитолиза бактерий в животной модели оценки эффективности или в опсонофагоцитарном анализе цитолитической активности, который демонстрирует то, что данные антитела вызывают цитолиз бактерий.

Капсульные полисахариды могут быть получены непосредственно из бактерий с использованием методик выделения, известных среднему специалисту в данной области техники. См., например, Fournier et al. (1984), supra; Fournier et al. (1987) Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 138: 561-567; публикация заявки на патент США №2007/0141077 и публикация международной патентной заявки № WO 00/56357; каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки, как если бы были изложены во всей своей полноте. Помимо этого, они могут быть получены с использованием протоколов синтеза. Кроме того, капсульный полисахарид может быть получен рекомбинантным способом с использованием генно-инженерных методик, также известных среднему специалисту в данной области техники (см. Sau et al. (1997) Microbiology, 143: 2395-2405; и патент США №6027925; каждая их которых включена в данное описание посредством ссылки, как если бы были изложены во всей своей полноте).

Бактериальные штаммы S. pneumoniae или N. meningitidis, применяемые для получения соответствующих полисахаридов, которые используются в гликоконъюгатах по изобретению, могут быть получены из хорошо известных коллекций культур или клинических образцов.

Белки-носители

Другим компонентом гликоконъюгата по изобретению является белок-носитель, с которым сахарид конъюгирован. Термины «белковый носитель» или «белок-носитель» или «носитель» могут быть использованы взаимозаменяемо в данном описании. Белки-носители предпочтительно представляют собой белки, которые являются нетоксичными и нереактогенными и которые можно получать в достаточном количестве и с достаточной чистотой. Белки-носители должны поддаваться стандартным методикам конъюгирования. В новых гликоконъюгатах по изобретению белок-носитель ковалентно связан с сахаридом через еТЕС спейсер.

Конъюгирование с носителем может усиливать иммуногенность антигена, например бактериального антигена, такого как бактериальный капсульный полисахарид. Предпочтительными белковыми носителями для антигенов являются токсины, токсоиды или любой мутантный перекрестно-реагирующий материал (cross-reactive material; CRM) столбнячного токсина, дифтерийного токсина, коклюшного токсина, токсина из Pseudomonas, Е. coli, Staphylococcus и Streptococcus. В одном воплощении особо предпочтительным носителем является CRM197 из дифтерийного токсоида, имеющего происхождение из штамма С.diphtheriae С7 (β197), который продуцирует белок CRM197. Этот штамм имеет № доступа в АТСС (Американская коллекция типовых культур) 53281. Способ получения CRM197 описан в патенте США №5614382, который включен в данное описание посредством ссылки, как если бы был изложен во всей своей полноте.

Альтернативно, можно использовать фрагмент или эпитоп белка-носителя или другого иммуногенного белка. Например, гаптеновый антиген может быть соединен с Т-клеточным эпитопом бактериального токсина, токсоида или CRM. См. патентную заявку США под №150688, поданную 1 февраля 1988 г. и озаглавленную «Синтетические пептиды, представляющие Т-клеточный эпитоп, в качестве молекулы-носителя для конъюгатных вакцин» ("Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines"); включенную в данное описание посредством ссылки, как если бы она была изложена во всей своей полноте. Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный токсоид (например, как описано в международной патентной заявке № WO 2004/083251), LT (термолабильныйлабильный токсин) Е. coli, ST (стабильный токсин) Е. coli и экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa. Также можно использовать белки наружной мембраны бактерий, такие как белок С наружной мембраны (ОМРС), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмолизин, пневмококковый поверхностный белок A (PspA), пневмококковый поверхностный белок адгезии (PsaA) или белок D Haemophilus influenzae. В качестве белков-носителей также можно использовать другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенное белковое производное туберкулина (PPD).

Соответственно во многих воплощениях соединенные через еТЕС гликоконъюгаты содержат CRM197 в качестве белка-носителя, при этом капсульный полисахарид ковалентно связан с еТЕС спейсером через карбаматную связь, a CRM197 ковалентно связан с еТЕС спейсером через амидную связь, образованную активированным аминокислотным остатком белка, обычно через ε-аминогруппу одного или более остатков лизина.

Количество остатков лизина в белке-носителе, подвергнутых конъюгированию с сахаридом, может быть охарактеризовано в виде диапазона конъюгированных остатков лизина. Например, в некоторых воплощениях иммуногенных композиций CRM197 может содержать от 4 до 16 остатков лизина, ковалентно связанных с сахаридом, из 39. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от примерно 10% до примерно 41% остатков лизина CRM197 являются ковалентно связанными с сахаридом. В других таких воплощениях CRM197 может содержать от 2 до 20 остатков лизина, ковалентно связанных с сахаридом, из 39. Другой способ выражения этого параметра состоит в том, что от примерно 5% до примерно 50% остатков лизина CRM197 являются ковалентно связанными с сахаридом.

Частота присоединения сахаридной цепи к остаткам лизина на белке-носителе является другим параметром для характеристики гликоконъюгатов по изобретению. Например, в некоторых воплощениях имеется по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом на каждые 4 повторяющиеся сахаридные единицы полисахарида. В другом воплощении ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 10 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В другом воплощении ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 15 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В следующем воплощении ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 25 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида.

Во многих воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197, и ковалентная связь через еТЕС спейсер между CRM197 и полисахаридом встречается по меньшей мере один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида. В некоторых таких воплощениях полисахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид, имеющий происхождение из S. pneumoniae или N. meningitidis.

В других воплощениях конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 2-7 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 3-8 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 4-9 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 6-11 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 7-12 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 8-13 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 9-14 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 10-15 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 2-6 повторяющихся сахаридных единиц, каждые 3-7 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 4-8 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 6-10 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 7-11 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 8-12 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 9-13 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 10-14 повторяющихся сахаридных единиц; каждые 10-20 повторяющихся сахаридных единиц или каждые 4-25 повторяющихся сахаридных единиц.

В другом воплощении по меньшей мере одна связь между белком-носителем и сахаридом встречается на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных единиц полисахарида.

Способы получения соединенных через еТЕС гликоконъюгатов

Согласно настоящему изобретению предложены способы получения соединенных через еТЕС гликоконъюгатов, содержащих сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем через (2-((2-оксоэтил)тио)этил)-карбаматный (еТЕС) спейсер. Этот еТЕС спейсер представляет собой структуру, линейная часть которой состоит из семи атомов (т.е. -C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-), содержащую стабильные тиоэфирную и амидную связи, и служит для образования ковалентной связи между сахаридом и белком-носителем. Один конец еТЕС спейсера ковалентно связан с гидроксильной группой сахарида через карбаматную связь. Другой конец еТЕС спейсера ковалентно связан с содержащим аминогруппу остатком белка-носителя, обычно с ε-аминогруппой остатка лизина, через амидную связь.

Репрезентативный путь получения гликоконъюгатов по настоящему изобретению, содержащих полисахарид, конъюгированный с активированным белком-носителем CRM197, показан на Фиг. 1. Химическая структура репрезентативного бактериального капсульного полисахарида, полисахаридов пневмококковых серотипов 33F, 10А, 11А и 22F, имеющих происхождение из S. pneumoniae, имеющих возможные сайты модификации с использованием преобразований через еТЕС спейсер, показаны на Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4 и Фиг. 5 соответственно.

Структура репрезентативного соединенного через еТЕС гликоконъюгата по изобретению, содержащего пневмококковый полисахарид серотипа 33F, ковалентно конъюгированный с CRM197 с использованием химических преобразований через еТЕС линкер, показана на Фиг. 6(A). Возможные блокированные и неблокированные свободные сульфгидрильные сайты показаны на Фиг. 6(Б) в целях иллюстрации. Полисахариды обычно содержат многочисленные гидроксильные группы, и ввиду этого сайт присоединения еТЕС спейсера к конкретным гидроксилам в пределах полисахаридных повторяющихся единиц через карбаматную связь может варьировать.

В одном из аспектов способ включает стадии: а) приведения во взаимодействие сахарида с производным угольной кислоты, таким как 1,1'-карбонилди-(1,2,4-триазол) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI), в органическом растворителе с получением активированного сахарида; б) приведения во взаимодействие активированного сахарида с цистамином или цистеамином либо их солью с получением тиолированного сахарида; в) приведения во взаимодействие тиолированного сахарида с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков; г) приведения во взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галогенацетамидных групп, с получением конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель); и д) приведения во взаимодействие конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель) с (1) первым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (2) вторым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки активированного тиолированного сахарида; с образованием таким образом соединенного через еТЕС гликоконъюгата.

В особо предпочтительном воплощении способ включает стадии: а) приведения во взаимодействие капсульного полисахарида Pn-33F с CDT или CDI в органическом растворителе с получением активированного полисахарида Pn-33F; б) приведения во взаимодействие активированного полисахарида Pn-33F с цистамином или цистеинамином либо их солью с получением тиолированного полисахарида Pn-33F; в) приведения во взаимодействие тиолированного полисахарида Pn-33F с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного полисахарида Pn-33F, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков; г) приведения во взаимодействие активированного тиолированного полисахарида Pn-33F с активированным белком-носителем CRM197, содержащим одну или более α-бромацетамидных групп, с получением конъюгата (тиолированный полисахарид Pn-33F)-CRM197; и д) приведения во взаимодействие конъюгата (тиолированный полисахарид Pn-33F)-CRM197 с (1) N-ацетил-L-цистеином в качестве первого блокирующего реагента, способного блокировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и (2) йодоацетамидом в качестве второго блокирующего реагента, способного блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки активированного тиолированного полисахарида Pn-33F; с образованием таким образом соединенного через еТЕС гликоконъюгат (полисахарид Pn-33F)-CRM197.

Во многих воплощениях производное угольной кислоты представляет собой CDT или CDI. Предпочтительным производным угольной кислоты является CDT, а органическим растворителем является полярный апротонный растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO). Перед проведением стадий тиолирования и/или конъюгирования не требуется лиофилизации активированного сахарида.

В предпочтительном воплощении тиолированный сахарид получают в реакции активированного сахарида с бифункциональным симметричным тиоалкиламинным реагентом цистамином или его солью. Возможное преимущество этого реагента заключается в том, что симметричный цистаминный линкер может реагировать с двумя молекулами активированного сахарида с образованием в результате этого двух молекул тиолированного сахарида на одну молекулу цистамина после восстановления дисульфидной связи. Альтернативно, тиолированный сахарид может быть образован в реакции активированного сахарида с цистеамином или его солью. Соединенные через еТЕС гликоконъюгаты, полученные способами по изобретению, могут быть представлены общей формулой (I).

Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что стадия (в) является необязательной, когда активированный сахарид приводят во взаимодействие с цистеамином или его солью, который(ая) содержит свободные сульфгидрильные остатки. С практической точки зрения, тиолированные сахариды, содержащие цистеамин, обычно приводят во взаимодействие с восстанавливающим агентом на стадии (в), чтобы уменьшить количество любых окисленных дисульфидных побочных продуктов, которые могут образовываться в ходе реакции.

В некоторых воплощениях этого аспекта стадия (г) дополнительно включает получение активированного белка-носителя, содержащего одну или более α-галогенацетамидных групп, перед приведением во взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем для получения конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель). Во многих воплощениях активированный белок-носитель содержит одну или более α-бромацетамидных групп.

Конъюгат (тиолированный сахарид)-(белок-носитель) можно обработать одним или более блокирующими реагентами, способными взаимодействовать с оставшимися активированными функциональными группами, присутствующими в реакционной смеси. Такие оставшиеся реакционно-способные группы могут находиться на непрореагировавших компонентах, сахариде или белке-носителе, вследствие неполного конъюгирования или вследствие присутствия избытка одного из компонентов в реакционной смеси. В таком случае, блокирование может помочь в очистке или выделении гликоконъюгата. В некоторых случаях, оставшиеся активированные функциональные группы могут присутствовать в гликоконъюгате.

Например, избыток α-галогенацетамидных групп на активированном белке-носителе может быть блокирован в результате взаимодействия с низкомолекулярным тиолом, таким как N-ацетил-L-цистеин, который может быть использован в избытке для обеспечения полного блокирования. Блокирование с использованием N-ацетил-L-цистеина также позволяет подтвердить эффективность конъюгирования посредством обнаружения необычной аминокислоты S-карбоксиметилцистеина (CMC), образованной из остатков цистеина в блокированных сайтах, которую можно определить с использованием кислотного гидролиза и аминокислотного анализа продуктов конъюгирования. Обнаружение этой аминокислоты подтверждает успешность блокирования реакционно-способных бромацетамидных групп, делающего их в результате этого недоступными для любых нежелательных химических реакций. Приемлемые уровни ковалентности и блокирования составляют примерно 1-15 для CMCA/Lys и примерно 0-5 для CMC/Lys. Аналогично, избыток свободных сульфгидрильных остатков может быть блокирован в результате взаимодействия с низкомолекулярным электрофильным реагентом, таким как йодоацетамид. Часть СМСА (S-карбоксиметилцистеамин) может иметь происхождение от тиолов полисахарида, блокированных непосредственно йодоацетамидом, не вовлеченных в процесс конъюгирования с галогенацильными группами белка-носителя. Ввиду этого, образцы из реакционной смеси после конъюгирования (перед блокированием йодоацетамидом) необходимо проверить посредством аминокислотного анализа (в отношении СМСА) для точного определения уровней тиолов, непосредственно вовлеченных в конъюгирование. Для тиолированного сахарида, содержащего 10-12 тиолов, обычно обнаруживается 5-6 тиолов, непосредственно вовлеченных в конъюгирование между тиолированным полисахаридом и бромацетилированным белком, и 4-5 тиолов являются блокированными йодоацетамидом.

В предпочтительных воплощениях первым блокирующим реагентом является N-ацетил-L-цистеин, который взаимодействует с неконъюгированными α-галогенацетамидными группами на белке-носителе. В других воплощениях вторым блокирующим реагентом является йодоацетамид (IAA), который взаимодействует с неконъюгированными свободными сульфгидрильными группами активированного тиолированного сахарида. Зачастую, стадия (д) включает блокирование N-ацетил-L-цистеином в качестве первого блокирующего реагента и IAA в качестве второго блокирующего реагента. В некоторых воплощениях стадия блокирования (д) дополнительно включает взаимодействие с восстанавливающим агентом, например DTT, ТСЕР или меркаптоэтанолом, после взаимодействия с первым и/или вторым блокирующим реагентом.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает стадию очистки соединенного через еТЕС гликоконъюгата, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией.

В предпочтительном воплощении бифункциональный симметричный тиоалкиламинный реагент представляет собой цистамин или его соль и его приводят во взаимодействие с активированным сахаридом с получением тиолированного сахарида или его соли, который(ая) содержит дисульфидную группировку.

В результате взаимодействия таких производных тиолированного сахарида с восстанавливающим агентом получают активированный тиолированный полисахарид, содержащий один или более свободных сульфгидрильных остатков. Такие активированные тиолированные сахариды могут быть выделены и очищены, например, ультрафильтрацией/диафильтрацией. Альтернативно, активированные тиолированные сахариды могут быть выделены и очищены, например, стандартными методами гель-проникающей хроматографии (SEC) или методами ионообменной хроматографии, например, с использованием DEAE (диэтиламиноэтил), известными в данной области техники.

В случае производных тиолированных сахаридов, полученных с использованием цистамина, при взаимодействии с восстанавливающим агентом расщепляется дисульфидная связь с образованием активированного тиолированного сахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков. В случае производных тиолированных сахаридов, полученных с использованием цистеамина, реакция с восстанавливающим агентом является необязательной, и ее можно использовать для восстановления дисульфидных связей, образованных в результате окисления реагента или продукта.

Восстанавливающие агенты, использованные в способах по изобретению, включают, например, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), дитиотреитол (DTT) или меркаптоэтанол. Однако можно использовать любой подходящий агент, восстанавливающий дисульфидные связи.

В некоторых воплощениях способы дополнительно включают получение активированного белка-носителя, содержащего одну или более α-галогенацетамидных групп, предпочтительно одну или более α-бромацетамидных групп.

Взаимодействие активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галоген-ацетамидных группировок, приводит к нуклеофильному замещению α-галогеновой группы активированного белка-носителя одной или более чем одной свободной сульфгидрильной группой активированного тиолированного сахарида с образованием простой тиоэфирной связи с еТЕС спейсером.

Обычно остатки α-галогенацетилированных аминокислот белка-носителя присоединяются к ε-аминогруппам одного или более остатков лизина белка-носителя. Во многих воплощениях белок-носитель содержит один или более остатков α-бромацетилированных аминокислот. В одном воплощении белок-носитель активирован реагентом на основе бромуксусной кислоты, таким как N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS).

В одном воплощении способ включает стадию получения активированного белка-носителя, содержащего одну или более α-галоген-ацетамидных групп, и приведения во взаимодействие активированного тиолированного полисахарида с активированным белком-носителем с получением конъюгата (тиолированный полисахарид)-(белок-носитель), при этом получают гликоконъюгат, содержащий полисахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер.

В некоторых предпочтительных воплощениях способов, представленных в данном описании, бактериальный капсульный полисахарид представляет собой Pn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из S. pneumoniae. В некоторых таких воплощениях данный Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В некоторых предпочтительных воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197, и Pn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

В других предпочтительных воплощениях способов, представленных в данном описании, бактериальный капсульный полисахарид представляет собой Mn капсульный полисахарид, имеющий происхождение из N. meningitidis. В некоторых таких воплощениях данный Mn капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y. В некоторых предпочтительных воплощениях белок-носитель представляет собой CRM197, и капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов А, С, W135 и Y.

В некоторых воплощениях каждого из способов, представленных в данном описании, сахарид перемешивали с имидазолом или триазолом и затем приводили во взаимодействие с производным угольной кислоты, таким как CDT, в органическом растворителе (например, DMSO), содержащем примерно 0,2% (масс./об.) воды, с получением активированных сахаридов. Применение перемешанного сахарида на стадии активации повышает растворимость сахарида в органическом растворителе. Обычно сахарид перемешивали с 10 граммами эксципиента 1,2,4-триазола на один грамм полисахарида, после чего выполняли перемешивание при температуре окружающей среды с получением перемешанного сахарида.

Таким образом, в некоторых воплощениях способов дополнительно включают стадию перемешивания сахарида с триазолом или имидазолом с получением перемешанного сахарида перед стадией активации (а). В некоторых таких воплощениях перемешанный сахарид замораживают в тонком слое, лиофилизируют и повторно разводят в органическом растворителе (таком как DMSO) и добавляют примерно 0,2% (масс./об.) воды перед активацией производным угольной кислоты, например CDT.

В одном воплощении реакционную смесь с тиолированным сахаридом возможно обрабатывают метиловым эфиром N-ацетиллизина, чтобы блокировать весь непрореагировавший активированный сахарид. В некоторых таких воплощениях смесь с блокированным тиолированным сахаридом очищают ультрафильтрацией/диафильтрацией.

Во многих воплощениях тиолированный сахарид приводят во взаимодействие с восстанавливающим агентом с получением активированного тиолированного сахарида. В некоторых таких воплощениях восстанавливающий агент представляет собой трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), дитиотреитол (DTT) или меркаптоэтанол. В некоторых таких воплощениях активированный тиолированный сахарид очищают ультрафильтрацией/диафильтрацией.

В одном воплощении способ получения соединенного через еТЕС гликоконъюгата включает стадию подведения и поддержания рН реакционной смеси, содержащей активированный тиолированный сахарид и белок-носитель, до рН от примерно 8 до примерно 9 в течение примерно 20 часов при примерно 5°C.

В одном воплощении способ получения гликоконъюгата по изобретению включает стадию выделения конъюгата (тиолированный сахарид)-(белок-носитель) после его получения. Во многих воплощениях гликоконъюгат выделяют ультрафильтрацией/диафильтрацией.

В другом воплощении способ получения соединенного через еТЕС гликоконъюгата по изобретению включает стадию выделения выделенного конъюгата сахарид-(белок-носитель) после его получения. Во многих воплощениях гликоконъюгат выделяют ультрафильтрацией/диафильтрацией.

В еще одном воплощении способ получения активированного сахарида включает стадию подведения концентрации воды в реакционной смеси, содержащей сахарид и CDT в органическом растворителе, до значения от примерно 0,1 до 0,4%. В одном воплощении концентрацию воды в реакционной смеси, содержащей сахарид и CDT в органическом растворителе, подводят до примерно 0,2%.

В одном воплощении стадия активации сахарида включает приведение во взаимодействие полисахарида с некоторым количеством CDT, которое составляет примерно 5 молярных избытков по отношению к количеству полисахарида, присутствующего в реакционной смеси, содержащей капсульный полисахарид и CDT в органическом растворителе.

В другом воплощении способ получения гликоконъюгата по изобретению включает стадию определения концентрации воды в реакционной смеси, содержащей сахарид. В одном таком воплощении предложено количество CDT, добавляемого в реакционную смесь для активации сахарида, примерно равное количеству CDT, являющемуся эквимолярным количеству воды, присутствующей в реакционной смеси, содержащей сахарид и CDT в органическом растворителе.

В другом воплощении предложено количество CDT, добавляемого в реакционную смесь для активации сахарида, примерно равное количеству CDT, соответствующему молярному соотношению примерно 0,5:1 в сравнении с количеством воды, присутствующей в реакционной смеси, содержащей сахарид и CDT в органическом растворителе. В одном воплощении предложено количество CDT, добавляемого в реакционную смесь для активации сахарида, примерно равное количеству CDT, соответствующему молярному соотношению примерно 0,75:1 в сравнении с количеством воды, присутствующей в реакционной смеси, содержащей сахарид и CDT в органическом растворителе.

В одном воплощении способ включает стадию выделения тиолированного полисахарида диафильтрацией. В другом воплощении способ включает стадию выделения активированного тиолированного полисахарида диафильтрацией.

В одном воплощении белок-носитель, использованный в способе получения выделенного конъюгата (Pn капсульный полисахарид)-(белок-носитель), содержит CRM197. В другом воплощении белок-носитель, использованный в способе получения выделенного конъюгата (Mn капсульный полисахарид)-(белок-носитель), содержит CRM197.

В некоторых воплощениях соотношение сахарид:(активированный белок-носитель) (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4. В других воплощениях соотношение сахарид:(активированный белок-носитель) (масс./масс.) составляет от 1,0 до 2,5. В следующих воплощениях соотношение сахарид:(активированный белок-носитель) (масс./масс.) составляет от 0,4 до 1,7. В других воплощениях соотношение сахарид:(активированный белок-носитель) (масс./масс.) составляет примерно 1:1. В некоторых таких воплощениях сахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид, а активированный белок-носитель получают путем активации (бромацетилирования) CRM197.

В другом воплощении способ получения активированного сахарида включает применение органического растворителя. Во многих воплощениях органическим растворителем является полярный апротонный растворитель. В некоторых таких воплощениях полярный апротонный растворитель выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF), диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона (NMP), ацетонитрила, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинона (DMPU) и гексаметилфосфорамида (НМРА) или их смеси. В предпочтительном воплощении органическим растворителем является DMSO.

Во многих воплощениях выделение соединенного через еТЕС гликоконъюгата включает стадию ультрафильтрации/диафильтрации.

В одном воплощении сахарид, использованный в способе получения гликоконъюгата по изобретению, имеет молекулярную массу от примерно 10 кДа до примерно 2000 кДа. В другом воплощении сахарид, использованный в способе получения гликоконъюгата по изобретению, имеет молекулярную массу от примерно 50 кДа до примерно 2000 кДа.

В одном воплощении гликоконъюгат, полученный в способе получения гликоконъюгата (капсульный полисахарид)-(белок-носитель), имеет размер от примерно 50 кДа до примерно 20000 кДа. В другом воплощении гликоконъюгат, полученный в способе получения гликоконъюгата (капсульный полисахарид)-(белок-носитель), имеет размер от примерно 500 кДа до примерно 10000 кДа. В одном воплощении гликоконъюгат, полученный в способе получения гликоконъюгата (капсульный полисахарид)-(белок-носитель), имеет размер от примерно 1000 кДа до примерно 3000 кДа.

В другом аспекте изобретения предложен соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий сахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер, полученный любым из способов, изложенных в данном описании.

В другом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая соединенный через еТЕС гликоконъюгат, полученный любым из способов, изложенных в данном описании.

Степень О-ацетилирования сахарида может быть определена любым способом, известным в данной области техники, например, протонным ЯМР (Lemercinier and Jones (1996) Carbohydrate Research. 296: 83-96, Jones and Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 30: 1233-1247, WO 05/033148 или WO 00/56357). Другой часто используемый способ описан в Hestrin (1949) J. Biol. Chem., 180: 249-261. Еще один способ основан на HPLC-ионообменной хроматографии. Степень О-ацетилирования определяют, оценивая количество свободного ацетата, присутствующего в образце, и сравнивая эту величину с количеством высвободившегося ацетата после мягкого гидролиза в присутствии основания. Ацетат отделяют от других компонентов образца и количественно определяют, осуществляя детекцию в ультрафиолетовой (УФ) области при 210 нм. Другой способ основан на HPLC-ионообменной хроматографии. О-Ацетил определяют, оценивая количество свободного ацетата, присутствующего в образце, и сравнивая эту величину с количеством высвободившегося ацетата после мягкого гидролиза в присутствии основания. Ацетат отделяют от других компонентов образца и количественно определяют, осуществляя детекцию в ультрафиолетовой (УФ) области при 210 нм.

Степень конъюгирования определяли аминокислотным анализом

В результате кислотного гидролиза образцов конъюгатов «до блокирования с применением IAA», полученных с использованием химического процесса активации путем бромацетилирования, образуется устойчивый к кислотам S-карбоксиметилцистеамин (СМСА) из цистамина в сайтах конъюгирования и устойчивый к кислотам S-карбоксиметилцистеин (CMC) из цистеинов в блокированных сайтах. В результате кислотного гидролиза конъюгатов «после блокирования с применением IAA» (конечных конъюгатов), полученных с использованием химического процесса активации путем бромацетилирования, получается устойчивый к кислотам S-карбоксиметилцистеамин (СМСА) из цистамина в сайтах конъюгирования и сайтах, блокированных с применением IAA, и устойчивый к кислотам S-карбоксиметилцистеин (CMC) из цистеинов в блокированных сайтах. Все неконъюгированные и неблокированные остатки лизина превращались обратно в лизин, и их детектировали в таком виде. Все другие аминокислоты в результате гидролиза превращались в свободные аминокислоты, за исключением триптофана и цистеина, которые разрушались в условиях гидролиза. Аспарагин и глутамин превращались в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту соответственно.

Аминокислоты каждого гидролизованного образца и контроля разделяли, используя ионообменную хроматографию с последующей обработкой нингидриновым раствором NinRX от Beckman при 135°C. Производные аминокислот затем детектировали в видимом диапазоне при 570 нм и 440 нм (см. Таблицу 1). Стандартный набор аминокислот (Pierce Amino Acid Standard H), содержащий по 500 пикомолей каждой аминокислоты, подвергали разделению наряду с образцами и контролями для каждой серии анализов. S-карбоксиметилцистеин (Sigma-Aldrich) добавляли к стандарту.

Лизин был выбран для оценки на основании его соединения ковалентной связью с цистеином и цистеамином и ожидаемом сходном гидролизе. Полученное число молей аминокислот затем сравнивали с аминокислотным составом белка и указывали наряду с количествами CMC и СМСА. Количество СМСА использовали непосредственно для оценки степени конъюгирования, а количество CMC использовали непосредственно для оценки степени блокирования.

В одном воплощении гликоконъюгат характеризуют его распределением молекул по размерам (Kd). Молекулярный размер конъюгатов определяют с использованием гель-проникающей хроматографии (SEC) на Сефарозе CL-4B в качестве неподвижной фазы, применяя систему для жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Чтобы определить Kd, хроматографическую колонку сначала калибруют для установления V0, который представляет собой свободный объем или общий эксклюзионный объем, и Vi, начиная с которого элюируются молекулы наименьшего размера в образце, также известного как объем между частицами. Все разделение при проведении SEC происходит в диапазоне между V0 и Vi. Значение Kd для каждой собранной фракции определяют согласно следующему выражению: Kd=(Ve-Vi)/(Vi-V0), где Ve представляет собой объем удерживания соединения. Процентное содержание (%) фракции (основного пика), которая элюируется со значением не более 0,3, дает значение Kd (распределение молекул по размерам) для конъюгата.

Иммуногенные композиции

Термин «иммуногенная композиция» относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген (например, микроорганизм или его компонент), который можно использовать для вызывания иммунного ответа у субъекта.

Как использовано в данном описании, термин «иммуногенный» означает способность антигена (или эпитопа антигена), такого как бактериальный капсульный полисахарид, или гликоконъюгата, или иммуногенной композиции, содержащей бактериальный капсульный полисахарид, вызывать у субъекта-хозяина, такого как млекопитающее, как гуморально-, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ, либо и тот и другой.

Гликоконъюгат может служить для повышения чувствительности хозяина посредством презентации антигена вместе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) на клеточной поверхности. В дополнение к этому, могут быть выработаны антигенспецифические Т-клетки или антитела, чтобы обеспечить последующую защиту иммунизированного хозяина. Таким образом, гликоконъюгаты могут защищать хозяина от одного или более симптомов, ассоциированных с инфекцией бактериями, или могут защищать хозяина от смерти, обусловленной инфекцией бактериями, ассоциированными с капсульным полисахаридом. Гликоконъюгаты также можно использовать для получения поликлональных или моноклональных антител, которые можно применять для придания пассивного иммунитета субъекту. Гликоконъюгаты также можно использовать для получения антител, которые являются функциональными по результатам измерений цитолиза бактерий, как в животной модели оценки эффективности, так и в опсонофагоцитарном анализе цитолитической активности.

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную к специфическому связыванию с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством по меньшей мере одного антиген-распознающего сайта, локализованного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Как использовано в данном описании, если в контексте не указано иное, подразумевается, что данный термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также сконструированные антитела (например, химерные, гуманизированные и/или дериватизированные с целью изменения эффекторных функций, стабильности и других видов биологической активности) и их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные антитела (scFv) и доменные антитела, включая акульи и верблюжьи антитела, и слитые белки, содержащие часть антитела, мультивалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность), и фрагменты антител, которые изложены в данном описании, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит антиген-распознающий сайт. Антитело включает антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и антитело не обязательно должно быть антителом какого-либо конкретного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам. У человека имеется пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут дополнительно быть разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Субъединичные структуры и пространственные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Фрагменты антител» содержат только часть интактного антитела, при этом данная часть предпочтительно сохраняет по меньшей мере одну из функций, предпочтительно большинство функций или все функции, в норме ассоциированные с этой частью, когда она присутствует в интактном антителе.

Термин «антиген», как правило, относится к биологической молекуле, обычно к белку, пептиду, полисахариду, или к конъюгату в иммуногенной композиции, или иммуногенному веществу, которые могут стимулировать выработку антител или Т-клеточных ответов либо и того и другого у субъекта, включая композиции, которые вводятся субъекту посредством инъекции или абсорбции. Иммунный ответ может быть выработан на целую молекулу или на различные части молекулы (например, на эпитоп или гаптен). Этот термин можно использовать для обозначения индивидуальной молекулы либо для гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген распознается антителами, Т-клеточными рецепторами или другими компонентами специфического гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин «антиген» также включает в себя все связанные с ним антигенные эпитопы. Эпитопы данного антигена могут быть идентифицированы с использованием любого из большого числа методов эпитопного картирования, хорошо известных в данной области техники. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Например, линейные эпитопы могут быть определены посредством, например, одновременного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и приведения во взаимодействие данных пептидов с антителами, при этом пептиды по-прежнему остаются присоединенными к подложкам. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США №4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715; все они включены в данное описание посредством ссылки, как если бы была изложена во всей своей полноте. Аналогичным образом, конформационные эпитопы могут быть идентифицированы посредством определения пространственной конформации аминокислот, как, например, с использованием рентгеноструктурной кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Кроме того, для целей настоящего изобретения, термин «антиген» также можно использовать для обозначения белка, содержащего модификации, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативные по своей природе, но они могут быть и неконсервативными) нативной последовательности при условии, что белок сохраняет способность вызывать иммунологический ответ. Эти модификации могут быть спланированными, как при использовании сайт-специфического мутагенеза или отдельных методик синтеза или генно-инженерного подхода, либо могут быть случайными, как в случае мутаций у хозяев, продуцирующих антигены. Кроме того, антиген может происходить, быть получен или выделен из микроорганизма, например бактерии, или может представлять собой целый микроорганизм. Аналогичным образом, олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген, как, например, при применениях иммунизации нуклеиновыми кислотами, также является включенным в данное определение. Также включены синтетические антигены, например полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие антигены рекомбинантного или синтетического происхождения (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol., 23: 2777 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol., 157: 3242-3249; Suhrbier (1997) Immunol. Cell Biol., 75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 to Jul. 3, 1998).

«Защитный» иммунный ответ относится к способности иммуногенной композиции вызывать иммунный ответ, как гуморальный, так и клеточно-опосредованный, либо и тот и другой, которые служат для защиты субъекта от инфекции. Такая обеспечиваемая защита не обязательно должна быть абсолютной, т.е. инфекция не обязательно должна быть полностью предотвращена или устранена, если имеется статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией субъектов, например инфицированными животными, которым не вводилась вакцинная или иммуногенная композиция. Защита может быть ограничена смягчением тяжести или быстроты начала симптомов инфекции. В общем случае «защитный иммунный ответ» будет включать в себя индуцирование повышения уровней антител, специфичных к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая некоторый уровень поддающихся измерению функциональных антительных ответов на каждый антиген. В отдельных случаях «защитный иммунный ответ» может включать в себя индуцирование повышения в два раза уровней антител или повышения в четыре раза уровней антител, специфичных к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая некоторый уровень поддающихся измерению функциональных антительных ответов на каждый антиген. В некоторых воплощениях опсонизирующие антитела коррелируют с защитным иммунным ответом. Таким образом, защитный иммунный ответ может быть проанализирован путем измерения процентного уменьшения количества бактерий в опсонофагоцитарном анализе, например таком, который описан ниже. Предпочтительно имеется уменьшение количества бактерий по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более.

Термины «иммуногенное количество» и «иммунологически эффективное количество», использованные в данном описании взаимозаменяемо, относятся к количеству антигена или иммуногенной композиции, достаточному для вызывания иммунного ответа, который может быть клеточным (Т-клеточным) или гуморальным (В-клеточным или антительным) ответом либо и тем и другим, причем такой иммунный ответ может быть измерен в стандартных анализах, известных специалисту в данной области техники. В типичном случае иммунологически эффективное количество будет вызывать защитный иммунный ответ у субъекта.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно использовать профилактически или терапевтически для защиты или лечения субъекта, восприимчивого к бактериальной инфекции, например инфекции бактериями S. pneumoniae или N. meningitidis, посредством введения иммуногенных композиций системным, дермальным или мукозальным путем, или можно использовать для того, чтобы вызвать образование поликлональных или моноклональных антител, которые могли бы быть применены для придания пассивного иммунитета другому субъекту. Такие введения могут включать инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, интрадермальным или подкожным путями; или могут быть осуществлены посредством мукозального введения в ротовую полость/пищеварительный тракт, респираторный или мочеполовой тракты. Иммуногенные композиции также могут быть использованы для получения антител, которые являются функциональными по результатам измерений цитолиза бактерий либо в животной модели оценки эффективности, либо в опсонофагоцитарном анализе цитолитической активности.

Оптимальные количества компонентов для конкретной иммуногенной композиции могут быть установлены в результате стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций через адекватные промежутки времени.

В некоторых воплощениях иммуногенная композиция будет содержать один или более адъювантов. Как определено в данном описании, «адъювант» представляет собой вещество, которое служит для повышения иммуногенности иммуногенной композиции по данному изобретению. Таким образом, адъюванты часто добавляют для усиления иммунного ответа, и они хорошо известны специалисту в данной области техники. Подходящие адъюванты для повышения эффективности композиции включают, но не ограничиваются этим:

(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.;

(2) композиции в виде эмульсии типа масло-в-воде (с добавлением или без добавления других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамилпептиды (MDP) (определенные ниже) или компоненты клеточной стенки бактерий), такие как, например:

(а) композиция MF59 (публикация РСТ № WO 90/14837), содержащая 5% сквалена, 0,5% твина 80 и 0,5% спана 85 (возможно, содержащая разные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя это не обязательно), изготовленная в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, Mass.),

(б) адъювантная композиция Syntex (Syntex adjuvant formulation; SAF), содержащая 10% сквалена, 0,4% твина 80, 5% блокированного плуроником полимера LI21 и thr-MDP (см. ниже), подвергнутых или микрофлюидизации с получением субмикронной эмульсии, или перемешиванию на вортексе с получением эмульсии частиц большего размера, и

(в) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Corixa, Hamilton, Mont.), содержащая 2% сквалена, 0,2% твина 80 и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из 3-О-деацилированного монофосфориллипида A (MPL™), описанного в патенте США №4912094 (Corixa), димиколята трегалозы (TDM) и остова клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox™);

(3) могут быть использованы сапониновые адъюванты, такие как Quil А или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham. Mass.) (патент США №5057540), или изготовленные из них частицы, такие как ISCOMs (иммуностимулирующие комплексы);

(4) бактериальные липополисахариды, синтетические аналоги липида А, такие как соединения аминоалкилглюкозаминфосфата (AGP) или их производные или аналоги, которые поставляются Corixa и которые описаны в патенте США №6113918; один из таких AGP представляет собой 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил-2-дезокси-4-O-фосфоно-3-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил-амино]-b-D-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529), который изготовляют в виде водной формы или в виде стабильной эмульсии; синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив(ы) CpG (патент США №6207646);

(5) цитокины, такие как интерлейкины (IL) (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), костимулирующие молекулы В7-1 и В7-2 и т.д.;

(6) детоксифицированные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такого как холерный токсин (СТ), как в форме, присутствующей у дикого типа, так и в мутантной форме, например, когда глутаминовая кислота в аминокислотном положении 29 заменена на другую аминокислоту, предпочтительно на гистидин, в соответствии с опубликованной международной патентной заявкой под номером WO 00/18434 (см. также WO 02/098368 и WO 02/098369), коклюшный токсин (РТ) или термолабильный токсин (LT) Е. coli, в частности, LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (см., например, WO 93/13302 и WO 92/19265); и

(7) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты, повышая эффективность композиции.

Мурамилпептиды включают, но не ограничиваются этим, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

В некоторых воплощениях адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, такой как соль алюминия. В конкретных воплощениях адъювант на основе алюминия выбран из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия. В конкретном воплощении адъювант представляет собой фосфат алюминия.

Иммуногенная композиция возможно может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители включают носители, одобренные к применению регулирующим органом федерального правительства, правительства штата или другим регулирующим органом, или перечисленные в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях для применения у субъектов, включая людей, а также млекопитающих, не являющихся человеком. Термин «носитель» можно использовать для обозначения разбавителя, эксципиента или наполнителя, вместе с которым вводят фармацевтическую композицию. Воду, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно применять в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны E.W. Martin в "Remington's Pharmaceutical Sciences". Композиция должна соответствовать способу введения.

Иммуногенные композиции по изобретению могут дополнительно содержать один или более консервантов в дополнение к некоторому количеству конъюгатов (капсульный полисахарид)-белок. FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (США)) требует, лишь с несколькими исключениями, чтобы биологические продукты в многодозовых (мультидозовых) флаконах содержали консервант. Вакцинные продукты, содержащие консерванты, включают вакцины, содержащие хлорид бензетония (против сибирской язвы), 2-феноксиэтанол (против дифтерии, столбняка и коклюша (Diphtheria, Tetanus and Pertussis; DTaP), гепатита A (НерА), болезни Лайма, полиомиелита (для парентерального введения)), фенол (против пневмококковой инфекции (pneumo), тифа (для парентерального введения), оспы) и тимеросал (против DTaP, DT, столбняка и дифтерии (Td), гепатита В (НерВ), Haemophilus influenzae типа b (Hib), гриппа, японского энцефалита (japanese encephalitis; JE), менингококковой инфекции (mening), пневмококковой инфекции, бешенства). Консерванты, одобренные к применению в инъекционных лекарственных средствах, включают, например, хлорбутанол, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, 2-феноксиэтанол, хлорид бензетония, хлорид бензалкония, бензойную кислоту, бензиловый спирт, фенол, тимеросал и нитрат фенил ртути.

В некоторых воплощениях композиция по изобретению, которая подходит для парентерального введения, содержит одно или более чем одно неионное поверхностно-активное вещество, включая, но не ограничиваясь этим, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, полисорбат-80 (твин 80), полисорбат-60 (твин 60), полисорбат-40 (твин 40) и полисорбат-20 (твин 20), простые алкиловые эфиры полиоксиэтилена, включая, но не ограничиваясь этим, Brij 58, Brij 35, а также другие, такие как тритон Х-100; тритон Х-114, NP40, спан 85 и неионные поверхностно-активные вещества серии плюроников (например, плюроник 121), причем предпочтительными компонентами являются полисорбат-80 в концентрации от примерно 0,001% до примерно 2% (при этом предпочтительная концентрация составляет до примерно 0,25%) или полисорбат-40 в концентрации от примерно 0,001% до примерно 1% (при этом предпочтительная концентрация составляет до примерно 0,5%).

Упаковка и лекарственные формы

Непосредственную доставку иммуногенных композиций по настоящему изобретению субъекту можно осуществлять путем парентерального введения (внутримышечно, внутрибрюшинно, интрадермально, подкожно, внутривенно или в интерстициальное пространство ткани) или путем мукозального введения в ротовую полость/пищеварительный тракт, респираторный или мочеполовой тракты; или путем местного, трансдермального, интраназального введения, введения в глаз, ухо, легкое или другого мукозального введения.

В одном воплощении парентеральное введение осуществляют путем внутримышечной инъекции, например, в бедро или плечо субъекта. Инъекцию можно осуществить через иглу (например, иглу для подкожных инъекций), но альтернативно можно использовать безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл. В другом воплощении интраназальное введение используют для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку с большей эффективностью может быть предупрежден носоглоточный перенос пневмококков, тем самым ослабляется инфекция в ее самой ранней стадии).

Композиции по изобретению могут быть изготовлены в различных формах, например, для инъекций или в виде жидких растворов, или суспензий. В некоторых воплощениях композиция может быть изготовлена в виде порошка или спрея для легочного введения, например, в ингаляторе. В других воплощениях композиция может быть изготовлена в виде суппозитория или пессария, или для назального, ушного или глазного введения, например, в виде спрея, капель, геля или порошка.

Количество гликоконъюгата в каждой дозе иммуногенной композиции выбирают в виде количества, которое индуцирует иммунопротективный ответ без значительных неблагоприятных эффектов. Такое количество может варьировать в зависимости от бактериального серотипа полисахарида, присутствующего в гликоконъюгате. Как правило, каждая доза будет содержать 0,1-100 мкг полисахарида, в частности 0,1-10 мкг и более конкретно 1-5 мкг.

В конкретном воплощении настоящего изобретения иммуногенная композиция представляет собой стерильную жидкую композицию Pn или Mn капсульного полисахарида, по отдельности конъюгированных с CRM197 через еТЕС линкер, при этом каждую дозу 0,5 мл готовят в виде препарата таким образом, что она содержит 1-5 мкг полисахарида, которая (композиция) может дополнительно содержать 0,125 мг адъюванта из расчета на элементный алюминий (0,5 мг фосфата алюминия); и хлорид натрия и буфер сукцинат натрия в качестве эксципиентов.

Оптимальные количества компонентов для конкретной иммуногенной композиции могут быть установлены в результате стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций через адекватные промежутки времени.

Иммуногенные композиции по изобретению могут быть упакованы в форме однократной дозы или многодозовой форме (например, по 2 дозы, 4 дозы или более). Что касается многодозовых форм, то обычно, но не обязательно, флаконы являются более предпочтительными по сравнению с предварительно наполненными шприцами. Подходящие многодозовые форматы включают от 2 до 10 доз на один контейнер по 0,1-2 мл на одну дозу, но не ограничиваются этим. В некоторых воплощениях такая доза представляет собой дозу, составляющую 0,5 мл. См., например, международную патентную заявку WO 2007/127668, которая включена в данное описание посредством ссылки.

Композиции могут быть представлены во флаконах или других подходящих контейнерах для хранения или могут быть представлены в предварительно наполненных устройствах для доставки, например, одно- или многокомпонентных шприцах, которые могут поставляться с иглами или без них. Шприц обычно, но не обязательно, содержит разовую дозу иммуногенной композиции по изобретению, содержащей консервант, хотя также рассматриваются многодозовые, предварительно наполненные шприцы. Аналогичным образом, флакон может включать в себя разовую дозу, но, альтернативно, может включать в себя многократные дозы.

Эффективные объемы дозировок можно устанавливать обычным способом, однако типичная доза композиции для инъекций имеет объем 0,5 мл. В некоторых воплощениях дозу готовят в виде препарата для введения субъекту-человеку. В некоторых воплощениях дозу готовят в виде препарата для введения взрослому человеку, тинейджеру, подростку, ребенку ясельного возраста или младенцу (т.е. в возрасте не более одного года), и в предпочтительных воплощениях она может быть введена путем инъекции.

Жидкие иммуногенные композиции по изобретению также подходят для разведения других иммуногенных композиций, которые представлены в лиофилизированной форме. В том случае, когда иммуногенная композиция предназначена для применения для такого экстемпорального разведения, согласно данному изобретению предложен набор с двумя или более флаконами, двумя или более готовыми к применению наполненными шприцами, или одним или более чем одним из каждого, причем содержимое шприца используется для разведения содержимого флакона до инъекции или наоборот.

В еще одном воплощении контейнер многодозового формата выбран из одной или более групп, состоящих из, но не ограничивающихся этим, обычной лабораторной стеклянной посуды, колб, химических стаканов, мерных цилиндров, ферментеров, биореакторов, шлангов, трубок, пакетов, банок, флаконов, крышек к флаконам (например, резиновых крышек, крышек с резьбой), ампул, шприцев, двух- или многокамерных шприцев, крышек шприцев, поршней шприцев, резиновых крышек, пластиковых крышек, стеклянных крышек, картриджей и одноразовых шприц-ручек и тому подобного.

Контейнер по настоящему изобретению не ограничивается материалом, из которого он изготовлен, и включает такие материалы, как стекло, металлы (например, сталь, нержавеющую сталь, алюминий и т.д.) и полимеры (например, термопластические материалы, эластомеры, термопластические эластомеры). В конкретном воплощении контейнер такого формата представляет собой стеклянный флакон 1 типа емкостью 5 мл от компании Schott с бутилкаучуковой пробкой. Специалисту в данной области будет очевидно, что форматы, изложенные выше, никоим образом не являются исчерпывающим списком, а просто служат в качестве руководства для специалиста в отношении множества форматов, приемлемых для настоящего изобретения. Дополнительные форматы, рассматриваемые для применения в настоящем изобретении, можно найти в опубликованных каталогах от поставщиков и производителей лабораторного оборудования, таких как United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.

Способы индуцирования иммунного ответа и защиты от инфекции

Настоящее изобретение также включает способы применения соединенных через еТЕС гликоконъюгатов и содержащих их иммуногенных композиций как в профилактических, так и в терапевтических целях. Например, согласно одному из аспектов изобретения предложен способ индуцирования иммунного ответа, направленного против патогенных бактерий, например пневмококковых или менингококковых бактерий, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества любой из иммуногенных композиций, изложенных в данном описании, содержащих бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид, имеющий происхождение из патогенных бактерий. Согласно одному из воплощений изобретения предложен способ защиты субъекта от инфекции патогенными бактериями или способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности инфекционного заболевания или состояния, ассоциированного с патогенными бактериями, или способ снижения тяжести или задержки начала по меньшей мере одного из симптомов, ассоциированных с инфекцией, вызванной патогенными бактериями, при этом в каждом случае способы включают введение субъекту иммунологически эффективного количества любой из иммуногенных композиций, изложенных в данном описании, содержащих бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид, имеющий происхождение из патогенных бактерий.

Согласно одному из воплощений изобретения предложен способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению, которая содержит соединенный через еТЕС гликоконъюгат, содержащий бактериальный антиген, такой как бактериальный капсульный полисахарид.

В некоторых воплощениях способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния включает лечение человека, ветеринарное лечение или лечение сельскохозяйственных животных. В другом воплощении предложен способ предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности бактериальной инфекции, заболевания или состояния, ассоциированных с патогенными бактериями, у субъекта, включающий изготовление препарата поликлональных или моноклональных антител с использованием иммуногенной композиции, изложенной в данном описании, и применение указанного препарата антител для придания субъекту пассивного иммунитета. В одном воплощении изобретения предложен способ предупреждения бактериальной инфекции у субъекта, перенесшего хирургическое вмешательство, включающий стадию введения профилактически эффективного количества иммуногенной композиции, изложенной в данном описании, субъекту перед хирургическим вмешательством.

В предпочтительных воплощениях каждого из вышеизложенных способов патогенные бактерии представляют собой пневмококковые или менингококковые бактерии, например бактерии S. pneumoniae или N. meningitidis. В некоторых таких воплощениях бактериальный антиген представляет собой капсульный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F. В других таких воплощениях бактериальный антиген представляет собой капсульный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из капсульных полисахаридов Mn-серотипов A, C, W135 и Y.

Иммунный ответ на антиген или иммуногенную композицию характеризуется развитием у субъекта гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в представляющем интерес антигене или представляющей интерес иммуногенной композиции. Для целей настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» представляет собой антитело-опосредованный иммунный ответ и включает индуцирование и выработку антител, которые распознают и связываются с некоторой аффинностью с антигеном, присутствующим в иммуногенной композиции по изобретению, тогда как «клеточно-опосредованный иммунный ответ» представляет собой ответ, опосредованный Т-клетками и/или другими белыми клетками крови. «Клеточно-опосредованный иммунный ответ» вызывается в результате презентации эпитопов антигенов вместе с молекулами класса I или класса II главного комплекса гистосовместимости (МНС), CD1 или другими неклассическими МНС-подобными молекулами. В результате этого активируются антигенспецифические CD4+ Т-хелперные клетки или CD8+ цитотоксические Т-лимфоцитарные клетки («CTL»). CTL обладают специфичностью к пептидным антигенам, которые презентируются вместе с белками, представляющими собой классические или неклассические молекулы МНС, и экспрессируются на поверхности клеток. CTL помогают индуцировать и стимулировать внутриклеточное разрушение внутриклеточных микроорганизмов или лизис клеток, инфицированных такими микроорганизмами. Другой аспект клеточного иммунитета включает в себя антигенспецифический ответ хелперных Т-клеток. Хелперные Т-клетки действуют, помогая стимулировать функционирование, и фокусируют активность неспецифических эффекторных клеток против клеток, презентирующих пептидные или другие антигены вместе с классическими или неклассическими молекулами МНС на своей поверхности. «Клеточно-опосредованный иммунный ответ» также относится к продуцированию цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими белыми клетками крови, включая клетки, происходящие от CD4+ и CD8+ Т-клеток. Способность конкретного антигена или композиции стимулировать клеточно-опосредованный иммунологический ответ может быть определена в целом ряде анализов, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализы цитотоксических клеток CTL, в анализе Т-лимфоцитов, специфичных к антигену у сенсибилизированного субъекта, или путем измерения продуцирования цитокинов Т-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие анализы хорошо известны в данной области техники. См., например, Erickson et al. (1993), J. Immunol., 151: 4189-4199; и Doe et al. (1994), Eur. J. Immunol., 24: 2369-2376.

Иммуногенные композиции и способы по изобретению могут быть полезны для одного или более из следующего: (1) предупреждения инфекции или реинфекции, как и в случае традиционной вакцины, (2) снижения тяжести или устранения симптомов и/или (3) существенного или полного устранения рассматриваемого патогена или расстройства. Так, лечение может быть осуществлено с профилактической (до инфицирования) или терапевтической (после инфицирования) целью. В настоящем изобретении профилактическое лечение является предпочтительным. Согласно конкретному воплощению настоящего изобретения предложены композиции и способы, с помощью которых осуществляется лечение, включая профилактическую и/или терапевтическую иммунизацию субъекта-хозяина против бактериальной инфекции, например инфекции S. pneumoniae или N. meningitidis. Способы по настоящему изобретению полезны для придания иммунитета субъекту в профилактических и/или терапевтических целях. Способы по настоящему изобретению также могут быть применены на практике на субъектах в целях биомедицинских исследований.

Использованный в данном описании термин «субъект» означает человека или не являющегося человеком животного. Более конкретно, термин «субъект» относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, животных для научных исследований, для зоопарков, для спортивных мероприятий и домашних питомцев, таких как животные, используемые в домашнем хозяйстве, и другие одомашненные животные, включая, но не ограничиваясь этим, крупный рогатый скот, овец, хорьков, свиней, лошадей, кроликов, коз, собак, кошек и тому подобных животных. Предпочтительными домашними животными являются собаки и кошки. Предпочтительно субъектом является человек.

Количество конкретного конъюгата в композиции обычно рассчитывают на основе общего количества полисахарида, как конъюгированного, так и неконъюгированного, для данного конъюгата. Например, конъюгат с 20% свободного полисахарида будет содержать примерно 80 мкг конъюгированного полисахарида и примерно 20 мкг неконъюгированного полисахарида в дозе полисахарида 100 мкг. При расчете дозы конъюгата вклад белка в конъюгат обычно не учитывается. Иммуногенное количество конъюгата или иммуногенной композиции может варьировать в зависимости от бактериального серотипа. Обычно каждая доза будет содержать от 0,1 до 100 мкг полисахарида, в частности от 0,1 до 10 мкг и более конкретно от 1 до 10 мкг. Иммуногенное количество разных полисахаридных компонентов в иммуногенной композиции может отличаться, и каждая из них может содержать 1 мкг, 2 мкг, 3 мкг, 4 мкг, 5 мкг, 6 мкг, 7 мкг, 8 мкг, 9 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг, 30 мкг, 40 мкг, 50 мкг, 60 мкг, 70 мкг, 80 мкг, 90 мкг или примерно 100 мкг любого конкретного полисахаридного антигена.

Термин «инвазивное заболевание» относится к выделению бактерий из обычно стерильной области, когда имеются ассоциированные клинические признаки/симптомы заболевания. Обычно стерильные области тела включают кровь, цереброспинальную жидкость (CSF), плевральную жидкость, перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, суставную/синовиальную жидкость, кость, внутреннюю область в организме (лимфатический узел, головной мозг, сердце, печень, селезенку, стекловидное тело, почку, поджелудочную железу, яичник) или другие обычно стерильные области. Клинические состояния, характеризующие инвазивные заболевания, включают бактериемию, пневмонию, панникулит, остеомиелит, эндокардит, септический шок и другие.

Эффективность антигена в качестве иммуногена может быть измерена либо в анализах пролиферации, либо цитолитических анализах, таких как анализы высвобождения хрома для измерения способности Т-клеток лизировать свои специфические клетки-мишени, либо путем измерения уровней активности В-клеток при измерении уровней циркулирующих антител, специфичных к антигену в сыворотке. Иммунный ответ также можно определять путем измерения уровней в сыворотке антигенспецифического антитела, индуцированного после введения антигена, и более конкретно, путем измерения способности индуцированных таким образом антител повышать опсонофагоцитирующую способность конкретных белых клеток крови, как изложено в данном описании. Уровень защиты, обусловленный иммунным ответом, можно измерять путем стимуляции иммунизированного хозяина введенным антигеном. Например, если антиген, на который желательно получить иммунный ответ, представляет собой бактерию, уровень защиты, индуцированный иммуногенным количеством антигена, измеряют путем определения процента выживаемости или процента смертности после заражения животных бактериальными клетками. В одном воплощении величину защиты можно оценивать путем измерения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с бактериальной инфекцией, например, повышения температуры, ассоциированного с инфекцией. Количество каждого из антигенов в мультиантигенных или многокомпонентных вакциных либо иммуногенных композициях будет варьировать относительно каждого из других компонентов и может быть определено способами, известными специалисту в данной области. Такие способы будут включать методики для измерения иммуногенности и/или эффективности in vivo.

В другом аспекте изобретения предложены антитела и композиции антител, которые связываются специфически и селективно с капсульными полисахаридами или гликоконъюгатами по настоящему изобретению. В некоторых таких воплощениях изобретения предложены антитела и композиции антител, которые связываются специфически и селективно с капсульными полисахаридами Pn-серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F или 33F или содержащими их гликоконъюгатами. В других таких воплощениях изобретения предложены антитела и композиции антител, которые связываются специфически и селективно с капсульными полисахаридами Mn-серотипов А, С, W135 или Y или содержащими их гликоконъюгатами. В некоторых воплощениях антитела получают после введения субъекту капсульных полисахаридов или гликоконъюгатов по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях изобретения предложены очищенные или выделенные антитела, направленные против одного или более капсульных полисахаридов или гликоконъюгатов по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях антитела по настоящему изобретению являются функциональными по результатам измерений цитолиза бактерий или в животной модели оценки эффективности, или в опсонофагоцитарном анализе цитолитической активности. Антитела или композиции антител по изобретению могут быть использованы в способе лечения или предупреждения бактериальной инфекции, заболевания или состояния, ассоциированных с патогенными бактериями, у субъекта, например, бактериями S. pneumoniae или N. meningitidis, включающем изготовление препарата поликлональных или моноклональных антител и использование указанного антитела или указанной композиции антител для придания пассивного иммунитета субъекту. Антитела по изобретению также могут быть полезны для диагностических методов, например обнаружения присутствия или количественного определения уровней капсульного полисахарида или гликоконъюгата на его основе. Например, антитела по изобретению также могут быть полезны для детекции присутствия или количественного определения уровней Pn или Mn капсульного полисахарида или гликоконъюгата на его основе, при этом гликоконъюгат содержит бактериальный капсульный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем через еТЕС спейсер.

Для оценки эффективности любой из иммуногенных композиций, изложенных в данном описании, можно использовать различные виды анализов и животных моделей, известных в данной области техники. Например, в Chiavolini et al. Clin. Microbiol. Rev., (2008), 21(4): 666-685 описываются животные модели заболеваний, вызываемых S. pneumoniae. В Gorringe et al. Methods in Molecular Medicine, vol. 66 (2001), Chapter 17, Pollard and Maiden eds. (Humana Press Inc.) описываются животные модели вызываемых менингококками заболеваний.

Анализ опсоФагоцитирующей активности (OPA)

Методики анализа ОРА основывались на способах, описанных ранее Hu и др. (Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2005, 12(2): 287-95), с приведенными далее модификациями. Образцы инактивированной нагреванием сыворотки серийно разводили в 2,5 раза в буфере. В используемые для анализа планшеты добавляли бактерии-мишени и инкубировали в течение 30 мин при 25°C на шейкере. Затем в каждую лунку добавляли комплемент крольчат-сосунков (в возрасте 3-4 недель, PeI-Freez, конечная концентрация 12,5%) и дифференцированные клетки HL-60 в соотношении эффектор:мишень приблизительно 200:1. Используемые в анализе планшеты инкубировали в течение 45 мин при 37°C на шейкере. Для остановки реакции во все лунки добавляли по 80 мкл 0,9%-ного NaCl, перемешивали и аликвоту объемом 10 мкл переносили в лунки фильтровальных планшетов MultiScreenHTS HV от Millipore, содержащие по 200 мкл воды. Жидкость фильтровали через планшеты под вакуумом, в каждую лунку добавляли по 150 мкл среды HySoy и проводили фильтрование. После этого фильтровальные планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение ночи и затем фиксировали раствором Destain Solution (Bio-Rad). Далее планшеты окрашивали кумасси голубым и один раз отмывали. Колонии визуализировали и подсчитывали на устройстве ImmunoSpot Analyzer® от Cellular Technology Limited (CTL). Титр антител в анализе ОРА получали интерполяцией величин, обратных двум разведениям сыворотки вблизи точки 50%-ного уменьшения числа бактериальных колоний, в сравнении с контрольными лунками, которые не содержали иммунной сыворотки.

В приведенном выше описании в целом излагается настоящее изобретение. Более полное понимание может быть получено со ссылкой на следующие далее конкретные примеры. Эти примеры приводятся исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Общий способ получения соединенных через еТЕС гликоконъюгатов

Активация сахарида и тиолирование с использованием дигидрохлорида цистамина

Сахарид разводят в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Содержание влаги в растворе определяют методом Карла Фишера (KF) и подводят до величины содержания влаги в диапазоне от 0,1 до 0,4%, обычно до 0,2%.

Чтобы инициировать активацию, готовят свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) в концентрации 100 мг/мл в DMSO. Сахарид активируют, используя различные количества CDT/CDI (1-10 молярных эквивалентов), и реакции дают возможность протекать в течение 1 часа при 23±2°C. Уровень активации может быть определен посредством HPLC. Готовят свежий раствор дигидрохлорида цистамина в безводном DMSO в концентрации 50 мг/мл. Активированный сахарид приводят во взаимодействие с 1 мол.экв. дигидрохлорида цистамина. Альтернативно, активированный сахарид приводят во взаимодействие с 1 мол.экв. гидрохлорида цистеамина. Реакции тиолирования дают возможность протекать в течение 21±2 часов при 23±2°C с получением тиолированного сахарида. Уровень тиолирования определяют, исходя из добавленного количества CDT/CDI.

Оставшееся количество CDT/CDI в реакционном растворе для активации гасят добавлением 100 мМ раствора тетрабората натрия, рН 9,0. Для определения добавляемого количества тетрабората и подведения общего конечного содержания влаги до 1-2% проводят расчеты.

Восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида

Реакционную смесь, содержащую тиолированный сахарид, разбавляют в 10 раз, добавляя к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0, и фильтруют через 5 мкм фильтр. Проводят диафильтрацию тиолированного сахарида против 40-кратного используемого при диафильтрации объема воды для инъекций (WFI). К ретентату добавляют раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 1-5 мол.экв., после разведения 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0, в количестве 10% от объема. Этой реакции восстановления дают возможность протекать в течение 20±2 часов при 5±3°C. Очистку активированного тиолированного сахарида проводят, предпочтительно используя ультрафильтрацию/диафильтрацию против предварительно охлажденного 10 мМ раствора одноосновного фосфата натрия, рН 4,3. Альтернативно, тиолированный сахарид очищают, используя стандартные методики гель-проникающей хроматографии (SEC) или методы ионообменной хроматографии. Отбирают аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида для проведения анализов с целью определения концентрации сахарида и содержания тиолов (реактив Эллмана).

Альтернативный способ восстановления и очистки активированного тиолированного сахарида

В качестве альтернативы описанной выше методике активированный тиолированный сахарид также очищали, как приведено ниже.

К реакционной смеси, содержащей тиолированный сахарид, добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 5-10 мол.экв., и реакции давали возможность протекать в течение 3±1 часа при 23±2°C. Затем реакционную смесь разбавляли 5 раз, добавляя предварительно охлажденный 5 мМ раствор сукцината натрия в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0, и фильтровали через 5 мкм фильтр. Проводили диафильтрацию тиолированного сахарида против 40-кратного используемого при диафильтрации объема 10 мМ раствора одноосновного фосфата натрия, рН 4,3. Отбирали аликвоту ретентата активированного тиолированного сахарида для проведения анализов с целью определения концентрации сахарида и содержания тиолов (реактив Эллмана).

Активация и очистка боомацетилированного белка-носителя

Свободные аминогруппы белка-носителя подвергают бромацетилированию в реакции с бромацетилирующим агентом, таким как N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS), бромацетилбромид или другой подходящий реагент.

Белок-носитель (в 0,1 М растворе фосфата натрия, рН 8,0±0,2) перед активацией сначала выдерживают при 8±3°C и рН примерно 7. К раствору белка добавляют раствор N-гидроксисукцинимидного эфира бромуксусной кислоты (BAANS) в виде концентрированного раствора в диметилсульфоксиде (DMSO) (20 мг/мл) в соотношении ВАА1М8:белок 0,25:0,5 (масс./масс.). Реакционную смесь осторожно перемешивают при 5±3°C в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, например ультрафильтрацией/диафильтрацией, используя мембрану с отсечением по молекулярной массе (molecular weight cut-off; MWCO) 10 кДа и 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,0). После очистки измеряют концентрацию бромацетилированного белка-носителя, определяя белок по методу Лоури.

Степень активации определяют в анализе общего содержания бромида посредством ионообменной жидкостной хроматографии в сочетании с кондуктометрическим детектированием с подавлением фоновой электропроводности (ионная хроматография). При приготовлении образца для анализа бромид, связанный с активированным бромацетилированным белком, отщепляют от белка и определяют количественно вместе с любым свободным бромидом, который может присутствовать. Любой остающийся ковалентно связанным бром на белке высвобождают путем превращения в ионную форму (бромид-ион) в результате нагревания образца в щелочном растворе 2-меркаптоэтанола.

Активация и очистка бромацетилированного CRM197

CRM197 разбавляли до концентрации 5 мг/мл, используя забуференный 10 мМ фосфатом 0,9%-ный NaCl, рН 7, (PBS) и затем переводили в 0,1 М NaHCO3, рН 7,0, используя 1 М концентрированный раствор. Добавляли BAANS в соотношении CRM197:BAANS 1:0,35 (масс./масс.), используя концентрированный раствор BAANS (20 мг/мл) в DMSO. Реакционную смесь инкубировали при температуре от 3°C до 11°C в течение от 30 мин до 1 часа, затем очищали ультрафильтрацией/диафильтрацией, используя мембрану с MWCO 10 кДа и 10 мМ фосфат натрия/0,9%-ный NaCl, рН 7,0. Очищенный активированный CRM197 анализировали методом Лоури для определения концентрации белка и затем разбавляли PBS до концентрации 5 мг/мл. В качестве криопротектора добавляли сахарозу до 5% (масс./об.), активированный белок замораживали и хранили при -25°C до тех пор, пока он не требовался для конъюгирования.

Бромацетилирование остатков лизина в CRM197 было очень устойчивым, приводя к активации от 15 до 25 остатков лизина из 39 доступных. В результате реакции получали высокие выходы активированного белка.

Конъюгирование активированного тиолированного сахарида с бромацетилированным белком-носителем

Перед началом реакции конъюгирования реакционные сосуды предварительно охлаждают до 5°C. Последовательно добавляют бромацетилированный белок-носитель и активированный тиолированный сахарид и перемешивают при скорости перемешивания 150-200 об/мин.

Исходное соотношение сахарид/белок составляет 0,9±0,1. Значение рН реакционной смеси подводят до 8,0±0,1, используя 1 М раствор NaOH. Реакции конъюгирования дают возможность протекать при 5°C в течение 20±2 часов.

Блокирование оставшихся реакционно-способных функциональных групп

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасят путем взаимодействия с 2 мол.экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве блокирующего реагента в течение 3 часов при 5°C. Оставшиеся свободные сульфгидрильные группы блокируют, используя 4 мол.экв. йодоацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°C.

Очистка соединенного через еТЕС гликоконъюгата

Смесь после проведения реакции конъюгирования (после блокирования с применением IAA) фильтруют через 0,45 мкм фильтр. Проводят ультрафильтрацию/диафильтрацию гликоконъюгата против 5 мМ сукцината в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0. Ретентат, содержащий гликоконъюгат, затем фильтруют через 0,2 мкм фильтр. Отбирают аликвоту гликоконъюгата для проведения анализов. Остальной гликоконъюгат хранят при 5°C.

Пример 2. Получение конъюгатов, содержащих Pn-33F-eTEC

Способ активации

Активация полисахарида Pn-33F

Полисахарид Pn-33F перемешивали с 500 мМ 1,2,4-триазолом (в WFI), получая 10 граммов триазола на один грамм полисахарида. Смесь замораживали в тонком слое, используя баню со смесью сухой лед/этанол, и затем лиофилизировали досуха. Лиофилизированный полисахарид 33F повторно разводили в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Содержание влаги в растворе лиофилизированного 33F в DMSO определяли методом Карла Фишера (KF). Содержание влаги подводили до значения 0,2%, добавляя WFI к раствору 33F/DMSO.

Чтобы инициировать активацию, готовили свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) в концентрации 100 мг/мл в DMSO. Полисахарид Pn-33F активировали, используя различные количества CDT, перед стадией тиолирования. Активацию с использованием CDT осуществляли при 23±2°C в течение 1 часа. Уровень активации определяли посредством HPLC (А220205). Чтобы погасить любые оставшиеся количества CDT в реакционном растворе для активации, добавляли 100 мМ раствор тетрабората натрия, рН 9,0. Для определения добавляемого количества тетрабората и подведения общего конечного содержания влаги до 1-2% проводят расчеты. Реакции давали возможность протекать в течение 1 часа при 23±2°C.

Тиолирование активированного полисахарида Pn-33F

Готовили свежий раствор дигидрохлорида цистамина в безводном DMSO и к реакционному раствору, содержащему активированный полисахарид, добавляли 1 мол.экв. дигидрохлорида цистамина. Реакции давали возможность протекать в течение 21±2 часов при 23±2°C. Раствор тиолированного сахарида разбавляли в 10 раз, добавляя к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0. Разбавленный реакционный раствор фильтровали через 5 мкм фильтр. Диафильтрацию раствора тиолированного полисахарида Pn-33F проводили с применением кассет ультрафильтрационных мембран с MWCO 100 кДа, используя воду для инъекций (WFI).

Уровень тиолирования активированных полисахаридов Pn-33F как функция от числа молярных эквивалентов CDT показан на Фиг. 8.

Восстановление и очистка активированного тиолированного полисахарида Pn-33F

К ретентату добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 5 мол.экв., после разведения 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0, в количестве 10% от объема. Этой реакции восстановления давали возможность протекать в течение 2±1 часа при 23±2°C. Диафильтрацию раствора тиолированного полисахарида 33F проводили, используя кассеты ультрафильтрационных мембран с MWCO 100 кДа. Диафильтрацию проводили против предварительно охлажденного 10 мМ раствора фосфата натрия, рН 4,3. Отбирали аликвоту ретентата тиолированного полисахарида 33F для проведения анализов с целью определения как концентрации сахарида, так и содержания тиолов (реактив Эллмана).

Альтернативный способ восстановления и очистки активированного тиолированного полисахарида Pn-33F

В качестве альтернативы описанной выше методике очистки активированный тиолированный сахарид 33F также очищали, как приведено ниже.

К реакционной смеси, содержащей тиолированный сахарид, добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 5 мол.экв., и реакции давали возможность протекать в течение 3±1 часа при 23±2°C. Затем реакционную смесь разбавляли 5 раз, добавляя к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0, и фильтровали через 5 мкм фильтр. Диафильтрацию раствора тиолированного сахарида проводили против 40-кратного используемого при диафильтрации объема предварительно охлажденного 10 мМ раствора одноосновного фосфата натрия, рН 4,3, используя кассеты ультрафильтрационных мембран с MWCO 100 кДа. Отбирали аликвоту ретентата тиолированного полисахарида 33F для проведения анализов с целью определения как концентрации сахарида, так и содержания тиолов (реактив Эллмана). Блок-схема данного способа активации приведена на Фиг. 7(A).

Способ конъюгирования

Конъюгирование тиолированного полисахарида Pn-33F с бромацетилированным CRM197

Белок-носитель CRM197 активировали отдельно путем бромацетилирования, как описано в примере 1, и затем приводили во взаимодействие с активированным полисахаридом Pn-33F для осуществления реакции конъюгирования. Перед началом реакции конъюгирования реакционный сосуд предварительно охлаждали до 5°C. Бромацетилированный CRM197 и тиолированный полисахарид 33F смешивали вместе в реакционном сосуде со скоростью перемешивания 150-200 об/мин. Исходное соотношение сахарид/белок составляло 0,9±0,1. Значение рН реакционной смеси подводили до 8,0-9,0. Реакции конъюгирования давали возможность протекать при 5°C в течение 20±2 часов.

Блокирование реакционно-способных групп на бромацетилированном CRM197 и тиолированном полисахариде Pn-33F

Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белках CRM197 блокировали путем взаимодействия с 2 мол.экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3 часов при 5°C, после чего осуществляли блокирование всех оставшихся свободных сульфгидрильных групп тиолированного полисахарида 33F, используя 4 мол.экв. йодоацетамида (IAA) в течение 20 часов при 5°C.

Очистка соединенного через еТЕС гликоконъюгата, содержащего Pn-33F

Раствор после проведения конъюгирования фильтровали через 0,45 мкм или 5 мкм фильтр. Диафильтрацию 33Р-содержащего гликоконъюгата проводили, используя кассеты ультрафильтрационных мембран с MWCO 300 кДа. Диафильтрацию проводили против 5 мМ сукцината в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0. Затем 300 кДа-ретентат Pn-33F-содержащего гликоконъюгата фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при 5°C.

Блок-схема данного способа конъюгирования приведена на Фиг. 7(Б).

Результаты

Параметры реакций и данные, характеризующие несколько партий гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F-eTEC, показаны в Таблице 2. В результате активации с использованием CDT и тиолирования с использованием дигидрохлорида цистамина получали гликоконъюгаты с выходом по сахариду от 63 до 90% и содержанием свободных сахаридов менее чем от 1% до 13%.

OPA-титры гликоконъюгатов Pn-33F-eTEC с CRM197

ОРА-титры для Pn-33F у мышей определяли в стандартных условиях. ОРА-титры (GMT (средние геометрические титры) с 95% CI (доверительный интервал)) на четвертую и седьмую недели показаны в Таблице 3, демонстрируя, что гликоконъюгат на основе Pn-серотипа 33F вызывал ОРА-титры в мышиной модели иммуногенности.

Пример 3. Получение конъюгатов, содержащих Pn-22F-eTEC

Способ активации

Активация полисахарида Pn-22F

Полисахарид Pn-22F перемешивали с 500 мМ 1,2,4-триазолом (в WFI), получая 10 граммов триазола на один грамм полисахарида. Смесь замораживали в тонком слое, используя баню со смесью сухой лед/этанол, и затем лиофилизировали досуха. Лиофилизированный полисахарид 22F повторно разводили в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Содержание влаги в растворе лиофилизированного 22F в DMSO определяли методом Карла Фишера (KF). Содержание влаги подводили до значения 0,2%, добавляя WFI к раствору Pn-22F/DMSO.

Чтобы инициировать активацию, готовили свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) в концентрации 100 мг/мл в DMSO. Полисахарид Pn-22F активировали, используя различные количества CDT с последующим тиолированием с применением 1 мол.экв. дигидрохлорида цистамина. Активацию с использованием CDT осуществляли при 23±2°C в течение 1 часа. Уровень активации определяли посредством HPLC (А220205). Чтобы погасить любые оставшиеся количества CDT в реакционном растворе для активации, добавляли 100 мМ раствор тетрабората натрия, рН 9,0. Для определения добавляемого количества тетрабората и подведения общего конечного содержания влаги до 1,2%, проводят расчеты. Реакции давали возможность протекать в течение 1 часа при 23±2°C.

Тиолирование активированного полисахарида Pn-22F

Готовили свежий раствор дигидрохлорида цистамина в безводном DMSO и добавляли в реакционный раствор. Реакции давали возможность протекать в течение 21±2 часов при 23±2°C. Раствор тиолированного сахарида разбавляли 10 раз, добавляя к предварительно охлажденному 5 мМ раствору сукцината натрия в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0. Разбавленный реакционный раствор фильтровали через 5 мкм фильтр. Диафильтрацию раствора тиолированного полисахарида Pn-22F проводили с применением кассет ультрафильтрационных мембран с MWCO 100 кДа, используя воду для инъекций (WFI).

Восстановление и очистка активированного тиолированного полисахарида Pn-22F

К ретентату добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 5-10 мол.экв., после разведения 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 6,0, в количестве 10% от объема. Этой реакции восстановления давали возможность протекать в течение 2±1 часа при 23±2°C. Диафильтрацию раствора тиолированного полисахарида 22F проводили, используя кассеты ультрафильтрационных мембран с MWCO 100 кДа. Диафильтрацию проводили против предварительно охлажденного 10 мМ раствора фосфата натрия, рН 4,3. Отбирали аликвоту ретентата тиолированного полисахарида 22F для проведения анализов с целью определения как концентрации сахарида, так и содержания тиолов (реактив Эллмана).

Конъюгирование, блокирование и очистка гликоконъюгатов, содержащих Pn-22F-eTEC

Конъюгирование активированного тиолированного полисахарида Pn-22F с активированным CRM197, блокирование и очистку гликоконъюгатов, содержащих Pn-22F-eTEC, проводили в соответствии со способами, описанными в примере 2.

Результаты

Данные, характеризующие репрезентативные гликоконъюгаты Pn-22F-eTEC с CRM197 и способ их получения, приведены в Таблице 4.

Пример 4. Получение конъюгатов Pn-10А-еТЕС с CRM197

Получение гликоконъюгатов, содержащих Pn-10А-еТЕС

Гликоконъюгаты, содержащие пневмококковый капсульный полисахарид серотипа 10А (Pn-10А), конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер, получали в соответствии со способами, описанными в примере 2.

Определение характеристик гликоконъюгатов, содержащих Pn-10А-еТЕС

Данные, характеризующие репрезентативные гликоконъюгаты Pn-10А-еТЕС с CRM197 и способ их получения, приведены в Таблице 5.

ОРА-титры для Pn-10А

ОРА-титры против конъюгата Pn-10А-еТЕС с CRM197 у мышей определяли в стандартных условиях. ОРА-титры как функция от дозы показаны в Таблице 6. ОРА-титры были значительно выше для конъюгата по сравнению с неконъюгированным полисахаридом серотипа 10А.

Пример 5. Получение конъюгатов Pn-11А-еТЕС с CRM197

Получение гликоконъюгатов, содержащих Pn-11А-еТЕС

Гликоконъюгаты, содержащие пневмококковый капсульный полисахарид серотипа 11А (Pn-11А), конъюгированный с CRM197 через еТЕС спейсер, получали в соответствии со способами, описанными в примере 2.

Определение характеристик гликоконъюгатов, содержащих Pn-11А-еТЕС

Данные, характеризующие репрезентативные гликоконъюгаты Pn-11 А-еТЕС с CRM197 и способ их получения, приведены в Таблице 7.

ОРА-титры для Pn-11А

ОРА-титры против конъюгата Pn-11А-еТЕС с CRM197 у мышей определяли в стандартных условиях. ОРА-титры как функция от дозы показаны в Таблице 8.

Пример 6. Получение RAC/водных конъюгатов Pn-33F с CRM197

Получение RAC/водных гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F

Гликоконъюгаты, содержащие Pn-33F, получали, используя восстановительное аминирование в водной фазе (Reductive Amination (Conjugation) in Aqueous Phase) (RAC/водные конъюгаты), которое было успешно применено для получения пневмококковой конъюгатной вакцины (см., например, WO 2006/110381). Этот подход включает две стадии. Первая стадия представляет собой окисление полисахарида с целью образования функциональных альдегидных групп из вицинальных диолов. Вторая стадия заключается в конъюгировании активированного полисахарида с остатками лизина (Lys) в CRM197.

Кратко, замороженный полисахарид размораживали и окисление осуществляли в натрий-фосфатном буфере при рН 6,0 путем добавления разного количества периодата натрия (NaIO4). Выполняли концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида и очищенный активированный полисахарид хранили при 4°C. Активированный полисахарид перемешивали с белком CRM197. Проводили тщательное смешивание полисахарида и CRM197, после чего колбу помещали в баню со смесью сухой лед/этанол с последующей лиофилизацией смеси полисахарид/CRM197. Лиофилизированную смесь повторно разводили в 0,1 М натрий-фосфатном буфере. Реакцию конъюгирования инициировали, добавляя 1,5 молярного эквивалента цианоборгидрида натрия и инкубируя в течение 20 ч при 23°C и дополнительно в течение 44 ч при 37°C. Реакционные смеси разбавляли однократным объемом 0,9%-ного физиологического раствора и блокировали, используя 2 мол.экв. боргидрида натрия в течение 3 ч при 23°C. Реакционную смесь разбавляли однократным объемом 0,9%-ного физиологического раствора и затем фильтровали через 0,45 мкм фильтр перед очисткой. Концентрирование и диафильтрацию конъюгата проводили, используя кассеты ультрафильтрационных (UF) мембран с MWCO 100 кДа.

С использованием описанного выше способа получали некоторое количество конъюгатов, варьируя различные параметры (например, рН, температуру реакций и концентрацию полисахарида).

Для этих конъюгатов типичный выход по полисахариду составлял приблизительно 50% с 15%-ным содержанием свободного сахарида для конъюгатов с MW в диапазоне 2000-3500 кДа.

Однако природный полисахарид серотипа 33F несет О-ацетильную группу в положении С2 своего 5-галактофуранозильного остатка, и было обнаружено, что приблизительно 80% ацетильных функциональных групп удаляется при проведении процесса конъюгирования с использованием восстановительного аминирования в водной фазе. Было отмечено, что О-ацетильная группа на пятичленной кольцевой структуре (5-галактофуранозиде) может перемещаться и легко быть удалена при использовании химического процесса восстановительного аминирования в водной фазе.

Оценка стабильности RAC/водных гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F

Аликвоты репрезентативного RAC/водного конъюгата, полученного описанным выше способом, переносили в полипропиленовые пробирки. Эти пробирки хранили или при 25°C, или при 37°C и стабильность отслеживали в течение до 3,5 месяцев включительно. В каждый момент времени регистрации стабильности оценивали уровни процентного содержания (%) свободного сахарида. Данные по стабильности при обеих температурах суммированы в Таблице 9. Как показано в Таблице 9, уровни процентного содержания (%) свободного сахарида значительно повышались при 25°C и 37°C. Повышение уровней процентного содержания (%) свободного сахарида в процессе хранения является возможным индикатором разложения полисахарида в конъюгате.

Несмотря на то, что полисахарид серотипа 33F был успешно активирован в реакции с периодатом натрия и далее конъюгирован с CRM197 с использованием химического процесса восстановительного аминирования в водной фазе, результаты измерения стабильности на основании данных по процентному содержанию свободного сахарида в условиях ускоренных испытаний, в сочетании с отсутствием возможности сохранить ацетильные функциональные группировки (ключевой для иммуногенности полисахаридный эпитоп) при образовании конъюгата, дали основания предположить, что RAC/водный способ не является оптимальным для конъюгирования полисахарида серотипа 33F.

Пример 7. Получение RAC/DMSO конъюгатов Pn-33F с CRM197

Получение RAC/DMSO гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F

В сравнении с RAC/водным способом, конъюгирование, проводимое с использованием восстановительного аминирования в DMSO (RAC/DMSO), характеризуется, как правило, значительно меньшей вероятностью де-О-ацетилирования. В связи с проблемами, связанными с сохранением О-ацетильных функциональных группировок при использовании RAC/водного способа, описанного в примере 6, провели оценку альтернативного подхода, применяя RAC в DMSO в качестве растворителя, который был успешно применен для получения пневмококковой конъюгатной вакцины (см., например, WO 2006/110381).

Активированный полисахарид перемешивали с сахарозой (50% масс/об. в WFI), используя соотношение 25 граммов сахарозы на один грамм активированного полисахарида. Компоненты хорошо смешивали перед замораживанием в тонком слое с использованием бани со смесью сухой лед/этанол. Подвергнутую перемешиванию смесь, замороженную в колбе в тонком слое, затем лиофилизировали досуха.

Лиофилизированный активированный полисахарид повторно разводили в диметилсульфоксиде (DMSO). DMSO добавляли к лиофилизированному CRM197 для повторного разведения. Повторно разведенный активированный полисахарид объединяли с повторно разведенным CRM197 в реакционном сосуде. Конъюгирование инициировали, добавляя в реакционную смесь NaCNBH3. Реакционную смесь инкубировали при 23°C в течение 20 ч. Прекращения реакции конъюгирования (блокирование) достигали, добавляя NaBH4, и реакцию продолжали в течение еще 3 ч. Реакционную смесь разбавляли 4-кратным объемом буфера, содержащего 5 мМ сукцинат в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0, и затем фильтровали через 5 мкм фильтр перед очисткой. Концентрирование и диафильтрацию конъюгата проводили, используя мембраны с MWCO 100 кДа. Диафильтрацию проводили против 40-кратного используемого при диафильтрации объема буфера, содержащего 5 мМ сукцинат в 0,9%-ном физиологическом растворе, рН 6,0. Ретентат фильтровали через 0,45 и 0,22 мкм фильтры и анализировали.

С использованием описанного выше способа получали некоторое количество конъюгатов, варьируя различные параметры (например, исходное соотношение сахарид-белок, концентрацию в реакционной смеси, количество мол.экв. цианоборгидрида натрия и содержание воды). В целом, данные для конъюгатов, полученных способом RAC/DMSO, продемонстрировали, что данный способ превосходит RAC/водный способ и позволяет получить конъюгаты с хорошим выходом в процессе конъюгирования, низким процентным содержанием свободного сахарида (менее 5%) и более высокой степенью конъюгирования (конъюгированные остатки лизина). Кроме того, возможно сохранение более 80% ацетильных функциональных группировок при конъюгировании способом RAC/DMSO.

Оценка стабильности RAC/DMSO гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F

Аликвоты репрезентативных RAC/DMSO конъюгатов, полученных описанным выше способом, переносили в полипропиленовые пробирки, которые хранили или при 4°C, или при 25°C и стабильность отслеживали в течение 3 месяцев, анализируя содержание свободного сахарида. Как показано в Таблице 10, в образцах, которые хранили при 4°C, продемонстрировано увеличение содержания свободного сахарида на 4,8% за 3 месяца. Однако в образцах, которые хранили при 25°C, продемонстрировано 15,4%-ное увеличение процентного содержания свободного сахарида за три месяца. Увеличение процентного содержания (%) свободного сахарида в RAC конъюгатах объясняется разложением конъюгата, в частности при 25°C.

Стабильность другой партии RAC/DMSO конъюгата также изучали при 4°C, 25°C и 37°C. Аликвоты переносили в полипропиленовые пробирки и отслеживали возможные тенденции изменения процентного содержания (%) свободного сахарида. Как показано в Таблице 11, в образцах, которые хранили при 4°C, продемонстрировано увеличение процентного содержания (%) свободного сахарида на 4,7% за 2 месяца. Увеличение содержания свободного сахарида было значительно выше при 25°C и 37°C, указывая на возможное разложение конъюгата.

Несмотря на то, что в конъюгатах, полученных RAC/DMSO способом, сохранялась О-ацетильная группа, наблюдалось увеличение процентного содержания (%) свободного сахарида, в частности, при 25°C и выше, указывая на возможную нестабильность при использовании этого способа получения. Ввиду такого наблюдения возможной нестабильности RAC/DMSO конъюгатов, RAC/DMSO способ не выглядел оптимальным для конъюгирования полисахарида серотипа 33F, и был разработан альтернативный химический процесс для получения более стабильных конъюгатов (еТЕС-содержащих конъюгатов).

Пример 8. Получение дополнительных конъюгатов. содержащих Pn-33F-eTEC

Дополнительные конъюгаты, содержащие Pn-33F-eTEC, получали, используя способ, описанный в примере 2. Реакционные параметры и данные, характеризующие эти дополнительные партии гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F-eTEC, показаны в Таблице 12.

Как показано выше и в Таблице 12, некоторое количество конъюгатов, содержащих Pn-33F, было получено с использованием описанного выше способа конъюгирования через еТЕС. Применение химического процесса с использованием еТЕС позволило получить конъюгаты с высоким выходом, низким процентным содержанием свободного сахарида и высокой степенью конъюгирования (конъюгированные остатки лизина). Кроме того, возможно сохранение более 80% ацетильных функциональных группировок при применении способа конъюгирования через еТЕС.

Пример 9. Оценка стабильности гликоконъюгатов, содержащих Pn-33F-еТЕС: тенденции изменения процентного содержания (%) свободного сахарида

Аликвоты партии конъюгата 33F-2B (см. Таблицу 2) переносили в полипропиленовые пробирки, хранили при 4°C, 25°C и 37°C соответственно и отслеживали тенденции изменения процентного содержания (%) свободного сахарида. Данные (процентное содержание (%) свободного сахарида) показаны в Таблице 13. Как показано в этой таблице, не наблюдали значительных изменений процентного содержания (%) свободного сахарида.

Оценку стабильности в условиях ускоренных испытаний для другой партии конъюгата (партии 33F-3C) также проводили при 37°C в течение до 1 месяца включительно. Как показано в Таблице 14, не было значительного изменения процентного содержания (%) свободного сахарида при 37°C в течение до 1 месяца включительно.

Для дальнейшего подтверждениястабильности конъюгатов содержащих еТЕС, дополнительные партии конъюгатов (33F-3C и 33F-5E (см. Таблицу 2 и 12)), которые хранили при 4°C, отслеживали в течение приблизительно до одного года включительно на возможные тенденции изменения процентного содержания (%) свободного сахарида. Как показано в Таблице 15, не наблюдали значительных изменений процентного содержания (%) свободного сахарида для конъюгатов, которые хранили при 4°C, в течение протяженного периода времени приблизительно до одного года включительно.

В отличие от RAC/водных и RAC/DMSO конъюгатов, конъюгаты серотипа 33F, полученные с применением химического процесса с использованием 33F и еТЕС, продемонстрировали значительно более высокую стабильность без заметного разложения, как было отслежено по тенденциям изменения содержания свободного сахарида при различных температурах (в режиме реального времени и в условиях ускоренных испытаний).

Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, ориентированы на уровень специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки тем самым включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки.

Хотя приведенное выше изобретение для ясности понимания описано довольно подробно посредством иллюстрации и примеров, при практическом применении могут быть внесены некоторые изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

1. Способ получения гликоконъюгата, содержащего бактериальный капсульный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем через (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматный (еТЕС) спейсер, включающий стадии:

а) приведения во взаимодействие бактериального капсульного полисахарида с 1,1'-карбонил-ди-(1,2,4-триазолом) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазолом (CDI) в органическом растворителе с получением активированного бактериального капсульного полисахарида;

б) приведения во взаимодействие указанного активированного бактериального капсульного полисахарида с цистамином или цистеамином либо их солью с получением тиолированного бактериального капсульного полисахарида;

в) приведения во взаимодействие указанного тиолированного бактериального капсульного полисахарида с агентом, восстанавливающим дисульфидные связи, с получением активированного тиолированного бактериального капсульного полисахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков;

г) приведения во взаимодействие указанного активированного тиолированного бактериального капсульного полисахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галогенацетамидных групп, с получением конъюгата (тиолированный бактериальный капсульный полисахарид)-(белок-носитель); и

д) приведения во взаимодействие указанного конъюгата (тиолированный бактериальный капсульный полисахарид)-(белок-носитель) с (1) первым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (2) вторым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки;

с образованием таким образом соединенного через еТЕС гликоконъюгата.

2. Способ по п. 1, где стадия блокирования д) включает приведение во взаимодействие конъюгата (тиолированный бактериальный капсульный полисахарид)-(белок-носитель) с (1) N-ацетил-L-цистеином в качестве первого блокирующего реагента и/или (2) йодацетамидом в качестве второго блокирующего реагента.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию перемешивания бактериального капсульного полисахарида при взаимодействии с триазолом или имидазолом с получением перемешанного бактериального капсульного полисахарида, который замораживают в тонком слое, лиофилизируют и повторно разводят в органическом растворителе перед стадией а).

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий очистку тиолированного бактериального капсульного полисахарида, полученного на стадии в), где стадия очистки включает диафильтрацию.

5. Способ по п. 1, где агент, восстанавливающий дисульфидные связи, на стадии в) представляет собой трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), дитиотреитол (DTT) или меркаптоэтанол.

6. Способ по п. 1, где белок-носитель активирован с использованием активированного производного бромуксусной кислоты.

7. Способ по п. 6, где производное бромуксусной кислоты представляет собой N-гидроксисукцинимидный эфир бромуксусной кислоты (BAANS).

8. Способ по п. 1, дополнительно включающий очистку соединенного через еТЕС гликоконъюгата диафильтрацией.

9. Способ по п. 1, где органический растворитель на стадии а) представляет собой полярный апротонный растворитель, выбранный из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF), диметилацетамида (DMA), N-метил-2-пирролидона (NMP), ацетонитрила, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинона (DMPU) и гексаметилфосфорамида (НМРА) или их смеси.

10. Способ по п. 1, где соотношение бактериальный капсульный полисахарид : белок-носитель (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4 или от 0,4 до 1,7.

11. Способ по п. 1, где бактериальный капсульный полисахарид представляет собой имеющий происхождение из S. pneumoniae капсульный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из пневмококковых (Pn) капсульных полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F.

12. Способ по п. 11, где капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Pn-серотипа 11А, 10А, 22F или 33F.

13. Способ по п. 1, где бактериальный капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид, имеющий происхождение из N. meningitidis.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где белок-носитель представляет собой CRM197 (перекрестно-реагирующий материал).

15. Гликоконъюгат, полученный способом по любому из пп. 1-14, для индуцирования иммунного ответа против инфекции, вызванной S. pneumoniae или N. meningitidis.

16. Иммуногенная композиция, содержащая гликоконъюгат по п. 15 и фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или разбавитель, для индуцирования иммунного ответа против инфекции, вызванной S. pneumoniae или N. meningitidis.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственному средству с активностью против грамположительных бактерий, микобактерий и грибов. Лекарственное средство представляет собой соединение класса перимидинонов производных салицилового альдегида и пергидропиримидин-2,4,6-трионов общей формулы где X1, X3 выбраны из группы: H, галоген, NO2; X2, X4 представляют собой Н; Z выбран из группы: O, NNH2, NOH, пергидропиримидин-5-илиден-2,4,6-трион, замещенный по атому азота метильной, аллильной, метоксибензильной, фенильной группой; Y выбран из группы: Н, Na, Li, K.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения in vitro композиции, содержащей секреторноподобный иммуноглобулин, включающий стадии получения белковой композиции, выделенной из крови, содержащей иммуноглобулин, имеющий в составе J-цепь, в неочищенном виде, и смешивания композиции стадии (а) с секреторным компонентом.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к средствам лечения млекопитающих при некробактериозе. Средство содержит сульфат магния – 29,0; сульфат натрия – 30,0; сульфат меди – 5,0; сульфат цинка – 5,0; поливиниловый спирт(порошок) - 30,5-32,0; порошок новокаин - 0,5.

Изобретение относится к способу получения новых соединений- этил 3-(3-гидрокси-1,4-диоксо-1,4-дигидронафталин-2-ил)-2,5,10-триоксо-10b-фенил-1,2,3,5,10,10b-гексагидро-3aH-нафто[2',3':4,5]фуро[3,2-b]пиррол-3а-карбоксилатов общей формулы I, где R=CH2Ph(a), С6Н11-с(b), Ph(c), C6H4OMe-4 (d), С6Н4Ме-4 (е), C6H4Cl-4 (f), Me(g), путем взаимодействия 5-фенил-4-этоксикарбонил-1H-пиррол-2,3-дионов с 2-гидроксинафталин-1,4-дионом в соотношении 1:2 в присутствии уксусной кислоты в среде инертного апротонного растворителя.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой готовую к использованию антимикробную композицию, включающую пенетамат (PNT) или его фармацевтический эквивалент и по меньшей мере один масляный носитель, незагущающее, препятствующее слеживанию средство, где композиция составлена таким образом, что вязкость композиции составляет ниже 3000 мПа·с при температуре 20°С, и способ ее изготовления.

Изобретение относится к 3-(азол-1-ил)-6-аминозамещенным 1,2,4,5-тетразинам формулы: где Het = имидазол-1-ил, NHR = аллиламино (Ia); Het = 4-метилимидазол-1-ил, NHR = аллиламино (Ib); Het = бензимидазол-1-ил, NHR = аллиламино (Ic); Het = индазол-1-ил, NHR = аллиламино (Id); Het = имидазол-1-ил, NHR = пропаргиламино (Ie); Het = 4-метилимидазол-1-ил, NHR = пропаргиламино (If); Het = бензимидазол-1-ил, NHR = пропаргиламино (Ig); Het = индазол-1-ил, NHR = пропаргиламино (Ih).

Изобретение относится к новым N-арил-4-(5-нитрофуран-2-ил)-пиримидин-5-аминам общей формулы I и способу их получения, заключающемуся в том, что 5-бром-4-(5-нитрофуран-2-ил)пиримидин (6) смешивают с соответствующим ариламином, взятым в 1,5-кратном избытке, ацетатом палладия (II) и 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферраценом, взятыми в каталитических количествах, и фосфатом калия, взятым в 2,5-кратном избытке, полученную смесь растворяют в дегазированном 1,4-диоксане и нагревают при 85°С и интенсивном перемешивании в течение не менее 15 часов, с последующим отгоном растворителя на роторном испарителе при пониженном давлении и полученный остаток подвергают хроматографическому разделению на колонке с силикагелем с соотношением компонентов в элюенте этилацетат:гексан, равном 1:3.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к получению нового ранее не описанного 4-амино-3-метоксиметил-5-фенил-1Н-пиразола. 4-Амино-3-метоксиметил-5-фенил-1Н-пиразол, имеющий приведенную ниже формулу, получают в результате циклоароматизации изонитрозодикетона и восстановления нового, ранее не описанного промежуточного продукта - 4-нитрозо-3-метоксиметил-5-фенил-1Н-пиразола.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для лечения бактериальной инфекции у животного. Для этого вводят инъецируемую ветеринарную композицию, содержащую хинолон и цефалоспорин или их фармацевтически приемлемые соли с пропиленгликоля дикаприлокапратом и/или глицерилкаприлокапратом в масляной суспензии.

Изобретение относится к новому полусинтетическому производному гликопептидного антибиотика эремомицина, представляющему собой тетраметиленимид эремомицина формулы 2 и его фармацевтически приемлемым солям.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к лечебно-косметическому средству наружного применения, Средство содержит смесь динатрийпирофосфата и тетракалийпирофосфата в весовом соотношении 1:1 в количестве 0,05-3,0 масс.%, в качестве бисфосфоната содержит калий натриевую соль гидросиэтилиденбисфосфоновой кислоты или 1-гидрокси-3-диметиламино-пропилиденбисфосфоновую кислоту в количестве 0,005-2,0 масс.%, липиды в количестве до 35,0 масс.%, эмульгаторы в количестве 0,1-15,0 масс.%, структурообразователи в количестве до 10,0 масс.%, ароматизаторы в количестве до 3,0 масс.%, красители в количестве до 0,1 масс.%, консерванты в количестве 0,01-1,0 масс.%, биологически активные и лекарственные добавки в количестве 1,0-10,0 масс.% и воду в количестве до 100%.

Группа изобретений относится к области фармакологии и медицины и касается жидкой композиции, содержащей комбинацию длительно действующего инсулина в форме, в которой инсулин связан с Fc-областью иммуноглобулина и инсулинотропного пептида, который находится в форме, в которой пептид связан с Fc-областью иммуноглобулина.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к средствам лечения млекопитающих при некробактериозе. Средство содержит сульфат магния – 29,0; сульфат натрия – 30,0; сульфат меди – 5,0; сульфат цинка – 5,0; поливиниловый спирт(порошок) - 30,5-32,0; порошок новокаин - 0,5.
Изобретение описывает 2 варианта фармацевтической композиции сухого порошка для ингаляций. Композиция по 1 варианту содержит малеата индакатерол в количестве 20-1200 мкг в сочетании с фуроатом флутиказона в количестве 0,5-800 мкг или циклезонидом в количестве 20-800 мкг, лактозу и, необязательно, один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию для трансдермальной доставки, содержащую нековалентные комплексы между несульфатированным хондроитином, имеющим молекулярную массу от 5 до 100 кДа, определенную эксклюзионной хроматографией, и активными ингредиентами, выбранными из диклофенака или его солей и кеторолака или его солей.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композициям на основе конъюгата производного оксинтомодулина, и может быть использовано в медицине для снижения уровней липидов в крови при предупреждении или лечении гиперлипидемии, жировой болезни печени или артериосклероза.

Группа изобретений относится к области медицины и представляет собой: глазную взвесь, содержащую циклоспорин А формы 2 и какую-либо среду, где циклоспорин А формы 2 характеризуется следующими пиками при сканировании рентгеновским дифрактометром с излучением Cu Kα, 2θ: 7,5, 8,8, 10,2, 11,3, 12,7, 13,8, 14,5, 15,6 и 17,5; способ приготовления состава циклоспорина, который включает этапы смешивания циклоспорина А формы 2 со средой для образования взвеси; размельчение взвеси; глазную взвесь, содержащую частицы циклоспорина А Формы 2; и среду, в которой средний размер (d90) частиц меньше чем около 10 мкм; способ лечения состояния выбранного из: сидром сухого глаза, блефарит, заболевание мейбомиевой железы, нарушение чувствительности роговицы, аллергический конъюнктивит, атопический кератоконъюнктивит, весенний кератоконъюнктивит и птеригий, включающий этап применения к пациенту, имеющему такое состояние, вышеуказанной глазной взвеси.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается фармацевтической композиции для лечения диабета или ожирения, содержащей первый тип гранул и второй тип гранул, в которых указанный первый тип гранул содержит соль N-(8-(2-гидроксибензоил)амино)каприловой кислоты и не содержит пептид GLP-1, и в которых указанный второй тип гранул содержит пептид GLP-1 и не содержит соль N-(8-(2-гидроксибензоил)амино)каприловой кислоты, а также относится к способам получения композиции и к их применению в медицине.

Изобретение описывает ректальные суппозитории для лечения заболеваний предстательной железы, в частности хронического простатита, включая хронический абактериальный простатит (ХАП), аденомы предстательной железы, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, и для лечения пред- и послеоперативного вмешательства предстательной железы.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой пероральное средство для лечения онкологических заболеваний, включающее: терапевтически эффективное количество метансульфоната (S)-3-[(3-амино-1-пирролидинил)карбонил]-4,11-дигидрокси-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-диона, представленного формулой: и жидкий фармацевтически приемлемый носитель, включающий один или более растворителей, выбранных из воды, полиэтиленгликоля, 1,2-полипропиленгликоля, этанола, глицерина.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно предложен высокостабильный Т-клеточный рецептор, что может быть использовано в медицине. Полученный Т-клеточный рецептор, имеющий мутации в своем гидрофобном коровом домене, используют в составе фармацевтической композиции для лечения опухоли. Настоящее изобретение позволяет осуществлять эффективную терапию заболеваний, связанных с образованием опухолей. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 49 ил., 13 табл., 16 пр.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к области вакционопрофилактики, и раскрывает способ получения гликоконъюгата, содержащего бактериальный капсульный полисахарид, конъюгированный с белком-носителем через тио)этил)карбаматный спейсер, гликоконъюгат, полученный указанным способом, и иммуногенную композицию, содержащую указанный гликоконъюгат. Изобретения позволяют получать соответствующим образом блокированные конъюгаты на основе белка-носителя, у которых поддерживаются функциональные свойства носителя и сам конъюгат сохраняет способность вызывать желаемый иммунный ответ. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 15 табл., 9 пр., 8 ил.

Наверх