Опосредованное нуклеазой нацеливание с большими нацеливающими векторами

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу модификации целевого геномного локуса путем гомологичной рекомбинации в мышиной эмбриональной стволовой (ES) клетке. Для осуществления указанного способа сначала в мышиную ES-клетку вводят цинковопальцевую нуклеазу (ZFN), которая осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и большой нацеливающий вектор (LTVEC). Затем осуществляют отбор целевой мышиной ES-клетки, содержащей нуклеотидную вставку в целевом геномном локусе. При этом интеграция приводит к делеции эндогенной нуклеотидной последовательности в целевом геномном локусе и замене нуклеотидной. Указанный LTVEC содержит нуклеотидную вставку, фланкированную вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом, при этом нуклеотидная вставка составляет от около 5 т.н. до около 30 т.н. и общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность нацеливания путем применения LTVEC с ZFN по сравнению с применением только LTVEC. 35 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 1 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке US 61/638,267, поданной 25 апреля 2012, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Нуклеазы и конструкции ДНК, включая нацеливающие векторы (например, большие нацеливающие векторы (large targeting vectors, "LTVEC"), предназначенные для достижения гомологичной рекомбинации в целевом геномном локусе. Композиции и способы осуществления целевой генетической модификации путем гомологичной рекомбинации, которой способствуют одно- или двухцепочечные разрывы в целевом геномном локусе или около него. Композиции и способы для улучшения эффективности гомологичной рекомбинации между LTVEC и целевым геномным локусом в прокариотических или эукариотических клетках, использующие сконструированные нуклеазы.

Уровень техники

Гомологичная рекомбинация с использованием нацеливающих векторов, которые специально разработаны для того, чтобы добавить, удалить или заменить определенную нуклеотидную последовательность в геномном локусе, представляет собой популярный подход к достижению желаемой геномной модификации у животных, не являющихся человеком. Нуклеаза, которая специально разработана для введения одно- или двухцепочечного разрыва в целевом геномном локусе или около него, может использоваться вместе с нацеливающим вектором для того, чтобы повысить эффективность гомологичной рекомбинации в целевом геномном локусе.

Хотя область техники модификации генома посредством гомологичной рекомбинации значительно продвинулась за последние два десятилетия, во многих случаях все еще остаются трудности, связанные с достижением приемлемой частоты попадания в цель при использовании очень больших нацеливающих векторов, LTVEC, например, когда большой участок генома грызуна заменен большим фрагментом человеческого генома, или трудности, связанные с нацеливанием на определенные типы клеток, например, фибробласты или другие соматические клетки. Данная область техники нуждается в дальнейших и более совершенных способах модификации больших геномных локусов в эукариотическом геноме с использованием LTVEC.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам модификации геномного локуса, представляющего интерес, с использованием большого нацеливающего вектора (LTVEC) в сочетании с нуклеазным агентом, которые позволяют эффективно проводить удаление, добавление (например, инсерцию), и/или замену большой нуклеотидной последовательности в геномном локусе, представляющем интерес.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам модификации целевого геномного локуса млекопитающего в прокариотической клетке с использованием LTVEC и нуклеазного агента посредством бактериальной гомологичной рекомбинации (bacterial homologous recombination, BHR), где рекомбинации BHR способствует одно- или двухцепочечное расщепление в целевом геномном локусе или около него, созданное нуклеазным агентом. Настоящее изобретение относится к прокариотическим клеткам, содержащим LTVEC и нуклеазный агент, который при экспрессии способен к введению одно-ил и двухцепочечного расщепления в целевом сайте или около него. Настоящее изобретение относится к композициям и способам замены большого геномного локуса животного, не являющегося человеком, экзогенной нуклеотидной последовательностью, например, гомологичными или ортологичными геномными нуклеотидными последовательностями человека, в рекомбинантной прокариотической клетке, используя различные LTVEC и нуклеазы, как описано здесь.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам модификации геномного локуса, представляющего интерес, с использованием LTVEC и нуклеазного агента в различных плюрипотентных клетках млекопитающих. Настоящее изобретение относится к композициям и способам замены большого геномного локуса из животного, не являющегося человеком, экзогенной нуклеотидной последовательностью, например, гомологичными или ортологичными геномными нуклеотидными последовательностями человека, в плюрипотентной клетке животного, не являющегося человеком, используя различные LTVEC и нуклеазы, как описано здесь.

Настоящее изобретение относится к плюрипотентным клеткам из животного, не являющегося человеком, содержащим различные LTVEC и нуклеазные агенты, описанные здесь.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам получения генетически модифицированного животного, не являющегося человеком, содержащим одну или более целевых генетических модификаций, как описано здесь.

Один из объектов настоящего изобретения относится к прокариотической клетке, содержащей большой нацеливающий вектор (LTVEC), содержащий гомологичные плечи, направленные на целевой локус, и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазный агент, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в целевом геномном локусе или около него.

В одном варианте осуществления прокариотическая клетка способна экспрессировать рекомбиназу, которая опосредует бактериальную гомологичную рекомбинацию (BHR). В одном варианте осуществления прокариотическая клетка представляет собой способный к рекомбинации (компетентный) штамм E.coli.

В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 75 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 75 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 100 т.н. до 125 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 125 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 150 т.н. до около 175 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 175 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 225 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 225 т.н. до около 250 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 250 т.н. до около 275 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 27 5Кб до около 300 т.н.

В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи нацеливающего вектора происходят из ВАС-библиотеки, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из геномного локуса животного, не являющегося человеком, который не может служить целью при использовании стандартного способа. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК.

В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичного плеча составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит кассету селекции. В одном варианте кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном варианте осуществления промотор активен как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку с длиной в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 10 т.н. до 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 20 т.н. до 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 30 т.н. до 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 60 т.н. до 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 180 т.н. до 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота происходит от мыши, человека или их комбинации. В одном из вариантов осуществления целевые последовательности для сайт-специфической рекомбинации выбраны из группы, состоящей из lοxΡ, lοx511, lοx2272, lοx66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую условный (conditional) аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую кассету селекции. В одном варианте осуществления кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, причем нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является активной как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном варианте осуществления кассета селекции фланкирована целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

Один из объектов настоящего изобретения относится к эукариотической клетке, содержащей большой нацеливающий вектор, содержащий гомологичные плечи, направленные к целевому локусу в геноме эукариотической клетки, и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазный агент, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в целевом локусе или около него.

В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (embryonic stem (ES)) клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой ES-клетку не человека. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (induced pluripotent stem (iPS)) клетку. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от фибробласта. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от человеческого фибробласта. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку (hematopoietic stem cell (HSC)). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой нейрональную стволовую клетку (neuronal stem cell (NSC)). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эпибластную стволовую клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой клетку-предшественника с ограниченными потенциями к развитию. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой плюрипотентную клетку грызуна. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка грызуна представляет собой крысиную плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления крысиная плюрипотентная клетка представляет собой ES-клетку крысы. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка грызуна представляет собой мышиную плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой мышиную эмбриональную стволовую (ES) клетку.

В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой иммортализованную клетку мыши или крысы. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой иммортализованную человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой фибробласт человека. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой раковую клетку. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой человеческую раковую клетку.

В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 75 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 75 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 100 т.н. до около 125 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 125 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 150 т.н. до около 175 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 175 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 225 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 225 т.н. до около 250 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 250 т.н. до около 275 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 275 т.н. до около 300 т.н.

В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи нацеливающего вектора происходят из ВАС-библиотеки, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из геномного локуса животного, не являющегося человеком, который не может служить целью при использовании стандартного способа. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК.

В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит кассету селекции. В одном варианте кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном варианте осуществления промотор активен как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку с длиной в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 10 т.н. до 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 20 т.н. до 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 30 т.н. до 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 60 т.н. до 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 180 т.н. до 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота происходит от мыши, человека или их комбинации. В одном из вариантов осуществления целевые последовательности для сайт-специфической рекомбинации выбраны из группы, состоящей из lοxΡ, lοx511, lοx2272, lοx66, lοx71, lοxΜ2, lοx5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую условный аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую кассету селекции. В одном варианте осуществления кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является активной как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном варианте осуществления кассета селекции фланкирована целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

Один из объектов настоящего изобретения относится к способу модификации целевого геномного локуса в клетке млекопитающего с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (BHR) в прокариотической клетке, содержащему:

(a) введение в прокариотическую клетку, включающую целевой геномный локус млекопитающего:

(i) нацеливающего вектора, содержащего нуклеотидную вставку, фланкированную первым вышележащим гомологичным плечом и первым нижележащим гомологичным плечом, и

(ii) нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и

(b) отбор целевой прокариотической клетки, содержащей нуклеотидную вставку,

где прокариотическая клетка способна экспрессировать рекомбиназу, которая опосредует BHR.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус выбирают из локуса FcER1a, локуса TLR4, локуса PRLR, локуса Notch4, локуса Accn2, локуса Adamts5, локуса TRPA1, локуса FolH1, локуса LRP5 и локуса ERBB4.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус присутствует в большом нацеливающем векторе (LTVEC), содержащем второе вышележащее гомологичное плечо и второе нижележащее гомологичное плечо. В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой человека и нацеливание (таргетинг) производится ex vivo на человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой грызуна. В одном из вариантов осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят совместно с нацеливающим вектором. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят отдельно от нацеливающего вектора в течение определенного периода времени. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят перед введением нацеливающего вектора. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят после введения нацеливающего вектора.

В одном из вариантов осуществления комбинированное применение нацеливающего вектора с нуклеазным агентом приводит к повышенной эффективности нацеливания по сравнению с применением только нацеливающего вектора. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в три раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в четыре раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно.

В одном из вариантов осуществления прокариотическая клетка представляет собой компетентный (способный к рекомбинации) штамм E.coli. В одном из вариантов осуществления прокариотическая клетка содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбиназу. В одном из вариантов осуществления прокариотическая клетка не содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбиназу, и нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбиназу, вводят в прокариотическую клетку. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит ДНК или мРНК, кодирующую рекомбиназу. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбиназу, представляет собой pABG. В одном из вариантов осуществления рекомбиназа экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном из вариантов осуществления экспрессия рекомбиназы управляется арабинозой.

В одном из вариантов осуществления нуклеазным агентом является экспрессирующая конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном из вариантов осуществления промотор представляет собой конститутивно активный промотор. В одном варианте осуществления промотор представляет собой индуцируемый промотор. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой мРНК, кодирующую эндонуклеазу.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой цинковопальцевую нуклеазу (zinc-finger nuclease, ZFN). В одном из вариантов осуществления каждый мономер ZFN содержит 3 или более ДНК-связывающих доменов на основе "цинкового пальца", где каждый ДНК-связывающий домен на основе "цинкового пальца" связывается с субсайтом длиной в 3 п. н. В одном из вариантов осуществления ZFN представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе "цинкового пальца", функционально связанный с независимой нуклеазой. В одном из вариантов осуществления независимая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу Fokl. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент содержит первый ZFN и второй ZFN, где каждый из первого ZFN и второго ZFN функционально связан с нуклеазой Fokl, причем первый и второй ZFN распознают две сопредельные целевые последовательности ДНК в каждой цепи целевой последовательности ДНК, разделенные сайтом расщепления длиной от около 6 п. н. до около 40 п. н., при этом нуклеазы Fokl димеризуются и делают разрыв в двойной цепи.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN). В одном из вариантов осуществления каждый мономер TALEN содержит от 12 до 25 TAL-повторов, где каждый TAL-повтор связывается с субсайтом длиной в 1 п. н. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов (TAL repeat-based DNA binding domain), функционально связанный с независимой нуклеазой. В одном из вариантов осуществления независимая нуклеаза представляет собой эндонуклеазу Fokl. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент содержит первый ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов, где каждый из первого и второго ДНК-связывающего домена на основе TAL-повторов функционально связан с нуклеазой Fokl, причем первый и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов распознают две сопредельные целевые последовательности ДНК в каждой цепи целевой последовательности ДНК, разделенные сайтом расщепления длиной от около 6 п. н. до около 40 п. н., при этом нуклеазы Fokl димеризуются и делают разрыв в двойной цепи.

В одном из вариантов осуществления каждый мономер нуклеазы распознает целевую последовательность из по меньшей мере 9 нуклеотидов. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет в длину от около 9 до около 12 нуклеотидов. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет в длину от около 12 до около 15 нуклеотидов. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет в длину от около 15 до около 18 нуклеотидов. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет в длину от около 18 до около 21 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления целевая последовательность нуклеазного агента находится в интроне. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в экзоне. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в промоторе. В одном варианте осуществления целевая последовательность находится в области, не кодирующей белок. В одном из вариантов осуществления область, не кодирующая белок, представляет собой регуляторную область. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в регуляторной области промотора. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в области энхансера.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой мегануклеазу. В одном из вариантов осуществления мегануклеаза распознает двухцепочечные ДНК-последовательности длиной от 12 до 40 пар оснований. В одном из вариантов осуществления мегануклеаза распознает одну идеально подобранную целевую последовательность в геноме. В одном из вариантов осуществления мегануклеаза представляет собой хоуминг-нуклеазу (homing nuclease). В одном из вариантов осуществления хоуминг-нуклеаза представляет собой семейство LAGLIDADG хоуминг-нуклеазы. В одном из вариантов осуществления семейство LAGLIDADG хоуминг-нуклеазы выбирают из I-Scel, I-Crel и I-Dmol.

В одном из вариантов осуществления нацеливающий вектор является большим нацеливающим вектором (LTVEC).

В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 75 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 75 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 100 т.н. до около 125 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 125 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 150 т.н. до около 175 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 175 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 225 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 225 т.н. до около 250 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 250 т.н. до около 275 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 275 т.н. до около 300 т.н.

В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи нацеливающего вектора происходят из ВАС-библиотеки, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из геномного локуса животного, не являющегося человеком, на который нельзя нацелиться с помощью стандартного способа. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК.

В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления нацеливающий вектор содержит кассету селекции. В одном варианте кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном варианте осуществления промотор активен как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет около 5 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 10 т.н. до 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 20 т.н. до 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 30 т.н. до 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 60 т.н. до 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 180 т.н. до 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота происходит от мыши, человека или их комбинации. В одном из вариантов осуществления целевые последовательности для сайт-специфической рекомбинации выбраны из группы, состоящей из lοxΡ, lοx511, lοx2272, lοx66, lοx71, lοxM2, lοx5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит условный аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит кассету селекции. В одном варианте осуществления кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является активной как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном варианте осуществления кассета селекции фланкирована целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

В одном из вариантов осуществления интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус вводит одну или более генетических модификаций, как описано здесь. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой делецию эндогенной нуклеотидной последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой добавление экзогенной нуклеотидной последовательности в целевой геномный локус. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой замену эндогенной нуклеотидной последовательности экзогенной нуклеотидной последовательностью в целевом геномном локусе. В одном из вариантов осуществления экзогенная нуклеотидная последовательность является нуклеотидной последовательностью не мыши. В одном из вариантов осуществления экзогенная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность человека. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой нокаут, удаление, вставку, нокин (knock-in), точечную мутацию, замену домена, замену экзона, замену интрона, замену регуляторной последовательности, замену гена или их комбинацию.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка является гомологичной нуклеотидной последовательности мыши. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой нуклеиновую кислоту человека. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой фрагмент геномной нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота представляет собой геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка имеет длину в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н., как описано выше.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка является ортологичной нуклеотидной последовательности мыши. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой нуклеиновую кислоту человека. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой фрагмент геномной нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота представляет собой геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка имеет длину в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н., как описано выше.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в нервной системе, скелетной системе, пищеварительной системе, системе кровообращения, мышечной системе, органах дыхания, сердечно-сосудистой системе, лимфатической системе, эндокринной системе, мочеполовой системе, репродуктивной системе или их комбинации. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в клетке костного мозга или в клетке, происходящей из костного мозга. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в клетке селезенки. В одном из вариантов осуществления геномный локус содержит геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в В-клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в незрелой В-клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в зрелой В-клетке.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина.

В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина или нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C_H1, шарнирной области, C_H2, C_H3 и их комбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи содержит C_H1-шарнирную область-C_H2-C_H3. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина или нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C_H1, шарнирной области, C_H2, C_H3 и их комбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи содержит C_H1-шарнирную область-C_H2-C_H3.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека. В одном из вариантов осуществления нереаранжированная или реаранжированная нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ функционально связана с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного, крысиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека кодирует внеклеточный белок. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека кодирует лиганд для рецептора. В одном из вариантов осуществления лиганд представляет собой цитокин. В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой хемокин, выбранный из CCL, CXCL, CX3CL и XCL. В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой фактор некроза опухоли (ФНО, tumor necrosis factor (TNF)). В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой интерлейкин (IL). В одном из вариантов осуществления интерлейкин выбран из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 и IL-36. В одном из вариантов осуществления интерлейкин представляет собой IL-2. В одном из вариантов осуществления последовательность геномной нуклеиновой кислоты человека кодирует цитоплазматический белок. В одном из вариантов осуществления последовательность геномной нуклеиновой кислоты человека кодирует мембранный белок. В одном из вариантов осуществления мембранный белок представляет собой рецептор. В одном из вариантов осуществления рецептор представляет собой рецептор цитокина. В одном из вариантов осуществления рецептор цитокина является рецептором интерлейкина. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является альфа-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является бета-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является гамма-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления последовательность геномной нуклеиновой кислоты человека кодирует ядерный белок. В одном из вариантов осуществления ядерный белок является ядерным рецептором.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит генетическую модификацию в кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация содержит делеционную мутацию кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация содержит слияние двух эндогенных кодирующих последовательностей.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, кодирующую мутантный белок человека. В одном варианте мутантный белок человека характеризуется измененной характеристикой связывания, измененной локализацией, измененной экспрессией и/или измененным паттерном экспрессии. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека содержит по меньшей мере один аллель заболевания человека. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель неврологического заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель сердечно-сосудистого заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания почек. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель мышечного заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания крови. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель канцерогенного гена. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель болезни иммунной системы. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой доминантный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой рецессивный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека содержит аллель однонуклеотидного полиморфизма (single nucleotide polymorphism (SNP)).

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит регуляторную последовательность. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность промотора. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность энхансера. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность, связывающую репрессор транскрипции. В одном варианте нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, где нуклеотидная последовательность человека содержит делецию не кодирующей белок последовательности, но не содержит делецию белок-кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция не кодирующей белок последовательности содержит делецию регуляторной последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция регуляторного элемента содержит делецию промоторной последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция регуляторного элемента содержит делецию последовательности энхансера.

Один из объектов настоящего изобретения относится к способу модификации целевого геномного локуса в клетке млекопитающего, содержащему введение в клетку млекопитающего: (I) нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в целевом геномном локусе или около него, и (II) большого нацеливающего вектора (LTVEC), содержащего нуклеиновую кислоту, фланкированную вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом.

В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой ES-клетку не человека. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от фибробласта. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от человеческого фибробласта. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку (HSC). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой нейрональную стволовую клетку (NSC). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эпибластную стволовую клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой клетку-предшественника с ограниченными потенциями к развитию.

В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой плюрипотентную клетку грызуна. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка грызуна представляет собой плюрипотентную клетку крысы. В одном из вариантов осуществления крыса плюрипотентная клетка представляет собой ES-клетку крысы. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка грызуна представляет собой мышиную плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой мышиную эмбриональную стволовую (ES) клетку.

В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой иммортализованную клетку мыши или крысы. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой иммортализованную человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой фибробласт человека. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой раковую клетку. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой человеческую раковую клетку.

В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку человека, выделенную от пациента, имеющего заболевание. В одном из вариантов осуществления клетка человека содержит последовательность человеческой нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный белок. В одном варианте мутантный белок человека характеризуется измененной характеристикой связывания, измененной локализацией, измененной экспрессией и/или измененным паттерном экспрессии. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека содержит по меньшей мере один аллель заболевания человека. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель неврологического заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель сердечно-сосудистого заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания почек. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель мышечного заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания крови. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель канцерогенного гена. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель болезни иммунной системы. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой доминантный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой рецессивный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека содержит аллель однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус выбирают из локуса FcER1a, локуса TLR4, локуса PRLR, локуса Notch4, локуса Accn2, локуса Adamts5, локуса TRPA1, локуса FolH1, локуса LRP5 и локуса ERBB4.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит человеческую геномную последовательность. В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит последовательность геномной нуклеиновой кислоты животного, не являющегося человеком. В одном из вариантов осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой грызуна. В одном из вариантов осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один аллель заболевания человека, описанный выше, который расположен в целевом геномном локусе, заменяют на нуклеотидную вставку. В одном из вариантов осуществления замена аллеля заболевания человека опосредуется нокаутом, делецией, вставкой, нокином ("knock-in"), заменой домена, заменой экзон, заменой интрона, заменой регуляторной последовательности, заменой гена или их комбинацией.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят совместно с большим нацеливающим вектором (LTVEC). В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят отдельно от LTVEC в течение определенного периода времени. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят перед введением LTVEC. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят после введения LTVEC.

В одном из вариантов осуществления комбинированное применение нацеливающего вектора с нуклеазным агентом приводит к повышенной эффективности нацеливания по сравнению с применением только нацеливающего вектора. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в три раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в четыре раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно.

В одном из вариантов осуществления нуклеазным агентом является экспрессирующая конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном из вариантов осуществления промотор представляет собой конститутивно активный промотор. В одном варианте осуществления промотор представляет собой индуцируемый промотор. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой мРНК, кодирующую эндонуклеазу.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой цинковопальцевую нуклеазу (ZFN). В одном из вариантов осуществления каждый мономер ZFN содержит 3 или более ДНК-связывающих доменов на основе "цинкового пальца", где каждый ДНК-связывающий домен на основе "цинкового пальца" связывается с субсайтом длиной в 3 п. н. В одном из вариантов осуществления ZFN представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе "цинкового пальца", функционально связанный с независимой нуклеазой. В одном из вариантов осуществления независимая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу Fokl. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент содержит первый ZFN и второй ZFN, где каждый из первого ZFN и второго ZFN функционально связан с нуклеазой Fokl, причем первый и второй ZFN распознают две сопредельные целевые последовательности ДНК в каждой цепи целевой последовательности ДНК, разделенные сайтом расщепления длиной от около 6 п.н. до около 40 п.н., при этом нуклеазы Fokl димеризуются и делают разрыв в двойной цепи.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN). В одном из вариантов осуществления каждый мономер TALEN содержит от 12 до 25 TAL-повторов, где каждый TAL-повтор связывается с субсайтом длиной в 1 п. н. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов (TAL repeat-based DNA binding domain), функционально связанный с независимой нуклеазой. В одном из вариантов осуществления независимая нуклеаза представляет собой эндонуклеазу Fokl. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент содержит первый ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов, где каждый из первого и второго ДНК-связывающего домена на основе TAL-повторов функционально связан с нуклеазой Fokl, причем первый и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов распознают две сопредельные целевые последовательности ДНК в каждой цепи целевой последовательности ДНК, разделенные сайтом расщепления длиной от около 6 п.н. до около 40 п.н., при этом нуклеазы Fokl димеризуются и делают разрыв в двойной цепи.

В одном из вариантов осуществления каждый мономер нуклеазы распознает целевую последовательность из по меньшей мере 9 нуклеотидов. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет от около 9 до около 12 нуклеотидов в длину. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет от около 12 до около 15 нуклеотидов в длину. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет от около 15 до около 18 нуклеотидов в длину. В одном варианте осуществления целевая последовательность составляет от около 18 до около 21 нуклеотидов в длину

В одном варианте осуществления целевая последовательность нуклеазного агента находится в интроне. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в экзоне. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в промоторе. В одном варианте осуществления целевая последовательность находится в области, не кодирующей белок. В одном из вариантов осуществления область, не кодирующая белок, представляет собой регуляторную область. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в регуляторной области промотора. В одном варианте осуществления целевая последовательность расположена в области энхансера.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой мегануклеазу. В одном из вариантов осуществления мегануклеаза распознает двухцепочечные ДНК-последовательности длиной от 12 до 40 пар оснований. В одном из вариантов осуществления мегануклеаза распознает одну идеально подобранную целевую последовательность в геноме. В одном из вариантов осуществления мегануклеаза представляет собой хоуминг-нуклеазу. В одном из вариантов осуществления хоуминг-нуклеаза представляет собой семейство LAGLIDADG хоуминг-нуклеазы. В одном из вариантов осуществления семейство LAGLIDADG хоуминг-нуклеазы выбирают из I-Scel, I-Crel и I-Dmol

В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 75 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 75 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 100 т.н. до около 125 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 125 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 150 т.н. до около 175 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 175 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 225 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 225 т.н. до около 250 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 250 т.н. до около 275 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 275 т.н. до около 300 т.н.

В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи нацеливающего вектора происходят из ВАС-библиотеки, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из геномного локуса животного, не являющегося человеком, на который нельзя нацелиться с помощью стандартного способа. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК.

В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления нацеливающий вектор содержит кассету селекции. В одном варианте кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в клетке млекопитающего. В одном варианте осуществления промотор активен как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет около 5 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 10 т.н. до 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 20 т.н. до 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 30 т.н. до 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 60 т.н. до 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 180 т.н. до 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота происходит от мыши, человека или их комбинации. В одном из вариантов осуществления целевые последовательности для сайт-специфической рекомбинации выбраны из группы, состоящей из lοxΡ, lοx511, lοx2272, lοx66, lοx71, lοxM2, lοx5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит условный аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит кассету селекции. В одном варианте осуществления кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в клетке млекопитающего. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является активной как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном варианте осуществления кассета селекции фланкирована целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

В одном из вариантов осуществления интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус вводит одну или более генетических модификаций, как описано здесь. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой делецию эндогенной нуклеотидной последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой добавление экзогенной нуклеотидной последовательности в целевой геномный локус. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой замену эндогенной нуклеотидной последовательности экзогенной нуклеотидной последовательностью в целевом геномном локусе. В одном из вариантов осуществления экзогенная нуклеотидная последовательность не является мышиной нуклеотидной последовательностью. В одном из вариантов осуществления экзогенная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность человека. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой нокаут, удаление, вставку, нокин, точечную мутацию, замену домена, замену экзона, замену интрона, замену регуляторной последовательности, замену гена или их комбинацию.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка является гомологичной нуклеотидной последовательности мыши. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой нуклеиновую кислоту человека. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой фрагмент геномной нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота представляет собой геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка имеет длину в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н., как описано выше.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка является ортологичной нуклеотидной последовательности мыши. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой нуклеиновую кислоту человека. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой фрагмент геномной нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота представляет собой геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка имеет длину в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н., как описано выше.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в нервной системе, скелетной системе, пищеварительной системе, системе кровообращения, мышечной системе, органах дыхания, сердечно-сосудистой системе, лимфатической системе, эндокринной системе, мочеполовой системе, репродуктивной системе или их комбинации. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в клетке костного мозга или в клетке, происходящей из костного мозга. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в клетке селезенки. В одном из вариантов осуществления геномный локус содержит геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в В-клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в незрелой В-клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в зрелой В-клетке.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина.

В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина или нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C_H1, шарнирной области, C_H2, C_H3 и их комбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи содержит C_H1-шарнирную область-C_H2-C_H3. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина или нуклеотидную последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C_H1, шарнирной области, C_H2, C_H3 и их комбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи содержит C_H1-шарнирную область-C_H2-C_H3.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека. В одном из вариантов осуществления нереаранжированная или реаранжированная нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ функционально связана с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного, крысиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека кодирует внеклеточный белок. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека кодирует лиганд для рецептора. В одном из вариантов осуществления лиганд представляет собой цитокин. В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой хемокин, выбранный из CCL, CXCL, CX3CL и XCL. В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой фактор некроза опухоли (TNF). В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой интерлейкин (IL). В одном из вариантов осуществления интерлейкин выбран из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 и IL-36. В одном из вариантов осуществления интерлейкин представляет собой IL-2. В одном из вариантов осуществления последовательность геномной нуклеиновой кислоты человека кодирует цитоплазматический белок. В одном из вариантов осуществления геномную нуклеотидную последовательность человека кодирует мембранный белок. В одном из вариантов осуществления мембранный белок представляет собой рецептор. В одном из вариантов осуществления рецептор представляет собой рецептор цитокина. В одном из вариантов осуществления рецептор цитокина является рецептором интерлейкина. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является альфа-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является бета-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является гамма-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность человека кодирует ядерный белок. В одном из вариантов осуществления ядерный белок является ядерным рецептором.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит генетическую модификацию в кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация содержит делеционную мутацию кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация содержит слияние двух эндогенных кодирующих последовательностей.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, кодирующую мутантный белок человека. В одном варианте мутантный белок человека характеризуется измененной характеристикой связывания, измененной локализацией, измененной экспрессией и/или измененным паттерном экспрессии. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека содержит по меньшей мере один аллель заболевания человека. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель неврологического заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель сердечно-сосудистого заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания почек. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель мышечного заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания крови. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель канцерогенного гена. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель болезни иммунной системы. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой доминантный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой рецессивный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека содержит аллель однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит регуляторную последовательность. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность промотора. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность энхансера. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность, связывающую репрессор транскрипции. В одном варианте нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, где нуклеотидная последовательность человека содержит делецию не кодирующей белок последовательности, но не содержит делецию белок-кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция не кодирующей белок последовательности содержит делецию регуляторной последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция регуляторного элемента содержит делецию промоторной последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция регуляторного элемента содержит делецию последовательности энхансера.

Один из объектов настоящего изобретения относится к клетке млекопитающего, полученной с помощью способа, как описано здесь. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего содержит нуклеотидную вставку, содержащую одну или более генетических модификаций, как описано здесь, в целевом геномном локусе.

В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ES) клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от фибробласта. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от человеческого фибробласта. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку (HSC). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой нейрональную стволовую клетку (NSC). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эпибластную стволовую клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой клетку-предшественника с ограниченными потенциями к развитию.

В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой мышиную плюрипотентную клетку. В одном варианте осуществления плюрипотентная клетка представляет собой мышиную эмбриональную стволовую (ES) клетку.

В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой иммортализованную клетку мыши или крысы. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой иммортализованную человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой фибробласт человека. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой раковую клетку. В одном из вариантов осуществления клетка млекопитающего представляет собой человеческую раковую клетку.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус выбирают из локуса FcER1a, локуса TLR4, локуса PRLR, локуса Notch4, локуса Accn2, локуса Adamts5, локуса TRPA1, локуса FolH1, локуса LRP5 и локуса ERBB4.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит одну или более генетических модификаций, как описано здесь. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой делецию эндогенной нуклеотидной последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой добавление экзогенной нуклеотидной последовательности в целевой геномный локус. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой замену эндогенной нуклеотидной последовательности экзогенной нуклеотидной последовательностью в целевом геномном локусе. В одном из вариантов осуществления экзогенная нуклеотидная последовательность не является мышиной нуклеотидной последовательностью. В одном из вариантов осуществления экзогенная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность человека. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация представляет собой нокаут, удаление, вставку, нокин, точечную мутацию, замену домена, замену экзона, замену интрона, замену регуляторной последовательности, замену гена или их комбинацию.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит нуклеотидную вставку, которая является гомологичной нуклеотидной последовательности мыши. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой нуклеиновую кислоту человека. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой фрагмент геномной нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота представляет собой геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их сочетание. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка имеет длину в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н., как описано выше.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит нуклеотидную вставку, которая является ортологичной нуклеотидной последовательности мыши. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой нуклеиновую кислоту человека. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка представляет собой фрагмент геномной нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота представляет собой геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка имеет длину в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н., как описано выше.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит условный аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, кодирующую белок, экспрессируемый в нервной системе, скелетной системе, пищеварительной системе, системе кровообращения, мышечной системе, органах дыхания, сердечно-сосудистой системе, лимфатической системе, эндокринной системе, мочеполовой системе, репродуктивной системе или их комбинации. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в клетке костного мозга или в клетке, происходящей из костного мозга. В одном варианте осуществления нуклеотидная вставка содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в клетке селезенки. В одном из вариантов осуществления геномный локус содержит геномную нуклеиновую кислоту мыши, геномную нуклеиновую кислоту человека или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в В-клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в незрелой В-клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномный локус, который кодирует белок, экспрессируемый в зрелой В-клетке.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, которая кодирует нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления реаранжированная нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина функционально связана с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацией. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C_H1, шарнирной области, C_H2, C_H3 и их комбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи содержит C_H1-шарнирную область-C_H2-C_H3. В одном из вариантов осуществления человеческая геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина функционально связана с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацией. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из C_H1, шарнирной области, C_H2, C_H3 и их комбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи содержит C_H1-шарнирную область-C_H2-C_H3.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит человеческую нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления человеческая нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека. В одном из вариантов осуществления человеческая нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ человека. В одном из вариантов осуществления нереаранжированная или реаранжированная нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи λ и/или κ функционально связана с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека кодирует внеклеточный белок. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека кодирует лиганд для рецептора. В одном из вариантов осуществления лиганд представляет собой цитокин. В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой хемокин, выбранный из CCL, CXCL, CX3CL и XCL. В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой фактор некроза опухоли (TNF). В одном из вариантов осуществления цитокин представляет собой интерлейкин (IL). В одном из вариантов осуществления интерлейкин выбран из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 и IL-36. В одном из вариантов осуществления интерлейкин представляет собой IL-2. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность человека кодирует цитоплазматический белок. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность человека кодирует мембранный белок. В одном из вариантов осуществления мембранный белок представляет собой рецептор. В одном из вариантов осуществления рецептор представляет собой рецептор цитокина. В одном из вариантов осуществления рецептор цитокина является рецептором интерлейкина. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является альфа-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является бета-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления рецептор интерлейкина является гамма-рецептором интерлейкина 2. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеотидная последовательность человека кодирует ядерный белок. В одном из вариантов осуществления ядерный белок является ядерным рецептором.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит генетическую модификацию в кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация содержит делеционную мутацию кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления генетическая модификация содержит слияние двух эндогенных кодирующих последовательностей.

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, кодирующую мутантный белок человека. В одном варианте мутантный белок человека характеризуется измененной характеристикой связывания, измененной локализацией, измененной экспрессией и/или измененным паттерном экспрессии. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность человека содержит по меньшей мере один аллель заболевания человека. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель неврологического заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель сердечно-сосудистого заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания почек. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель мышечного заболевания. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель заболевания крови. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель канцерогенного гена. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой аллель болезни иммунной системы. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой доминантный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека представляет собой рецессивный аллель. В одном варианте осуществления аллель заболевания человека содержит аллель однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

В одном из вариантов осуществления нуклеотидная вставка содержит регуляторную последовательность. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность промотора. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность энхансера. В одном из вариантов осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность, связывающую репрессор транскрипции. В одном варианте нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека, где нуклеотидная последовательность человека содержит делецию не кодирующей белок последовательности, но не содержит делецию белок-кодирующей последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция не кодирующей белок последовательности содержит делецию регуляторной последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция регуляторного элемента содержит делецию промоторной последовательности. В одном из вариантов осуществления делеция регуляторного элемента содержит делецию последовательности энхансера.

Один объект настоящего изобретения относится к способу получения не являющегося человеком животного, содержащего в зародышевой линии одну или более генетических модификаций, как описано здесь, содержащему:

(a) модификацию представляющего интерес геномного локуса животного, не являющегося человеком, в прокариотической клетке с использованием большого нацеливающего вектора (LTVEC) и нуклеазного агента, который генерирует одно-или двухцепочечный разрыв в геномном локусе, представляющем интерес, или около него, причем LTVEC содержит нуклеотидную вставку, фланкированную вышележащим и нижележащим гомологичными плечами, и прокариотическая клетка способна экспрессировать рекомбиназу;

(b) селекцию модифицированной прокариотической клетки, содержащей генетически модифицированный LTVEC;

(c) выделение генетически модифицированного LTVEC;

(d) введение генетически модифицированного LTVEC в плюрипотентную клетку животного, не являющегося человеком, чтобы генерировать генетически модифицированную плюрипотентную клетку, содержащую нуклеотидную вставку в геномном локусе, представляющем интерес;

(e) селекцию генетически модифицированной плюрипотентной клетки;

(f) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки в хозяйский эмбрион животного, не являющегося человеком, на стадии, предшествующей стадии морулы; и

(g) имплантирование хозяйского эмбриона, содержащего генетически модифицированную плюрипотентную клетку, в суррогатную мать для генерации поколения F0, происходящего из генетически модифицированной плюрипотентной клетки.

В одном из вариантов осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой млекопитающее. В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой грызуна. В одном из вариантов осуществления грызун выбран из мыши, крысы и хомяка. В одном из вариантов осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой мышь и плюрипотентная клетка представляет собой мышиную ES-клетку. В одном из вариантов осуществления животное, не являющееся человеком, представляет собой крысу и плюрипотентная клетка представляет собой крысиную ES-клетку.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус содержит одну или более генетических модификаций, как описано здесь.

В одном из вариантов осуществления стадия выделения (с) дополнительно содержит стадию (с)' линеаризации генетически модифицированного LTVEC.

В одном из вариантов осуществления стадия введения (d) дополнительно включает стадию (d)' введения нуклеазного агента, как описано выше, в плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой цинковопальцевую нуклеазу (ZFN). В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN).

В одном из вариантов осуществления стадии селекции (b) и/или (е) осуществляют, применяя селективный агент, как описано выше, к прокариотической клетке или к плюрипотентной клетке.

В одном из вариантов осуществления стадии селекции (b) и/или (е) проводят с помощью анализа для определения модификации аллеля (modification of allele (MOA)), как описано здесь.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует сайт расщепления цинковопальцевой нуклеазы (ZFN) на гене II2rg мыши. Фигура не масштабировалась пропорционально. Последовательности в рамке, показанные на нижней панели, представляют целевые для ZFN последовательности.

Подробное описание

Настоящее изобретение не ограничивается определенными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьироваться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, приведена с целью описания определенных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

Если не указано иное, все термины и фразы, используемые здесь, включают значения, которые термины и фразы приобрели в данной области техники, если иное прямо не указано или не очевидно из контекста, в котором используется данный термин или фраза. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут быть использованы на практике или при испытании настоящего изобретения, определенные способы и материалы описаны ниже. Все упомянутые публикации включены в данное описание посредством ссылки.

Определения

Термин "эмбриональная стволовая клетка" или "ES-клетка", как он использован здесь, включает в себя происходящую из эмбриона тотипотентную или плюрипотентную клетку, которая способна к недифференцированной пролиферации in vitro и способна внести вклад в развитие любой ткани развивающегося эмбриона при введении в эмбрион. Термин "плюрипотентная клетка", как он использован здесь, включает недифференцированную клетку, которая обладает способностью развиваться в более чем один тип дифференцированной клетки.

Термин "зародышевая линия" по отношению к нуклеотидной последовательности иммуноглобулина включает нуклеотидную последовательность, которая может быть передана потомству.

Выражение "тяжелая цепь" или "тяжелая цепь иммуноглобулина" включает в себя последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, включая последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, из любого организма. Вариабельные домены тяжелой цепи включают в себя три области CDR тяжелой цепи и четыре каркасные (framework (FR)) области, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают CDR, CDR и FR и их комбинации. Типичная тяжелая цепь имеет, следуя после вариабельного домена (от N-конца к С-концу), домен C_H1, шарнирную область, домен C_H2 и домен C_H3. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает в себя фрагмент, который способен специфически распознавать эпитоп (например, распознавание эпитопа с величиной Ко в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне), который способен экспрессироваться и секретироваться из клетки и который содержит по меньшей мере одну CDR. Вариабельные домены тяжелой цепи кодируются нуклеотидной последовательностью вариабельной области, которая обычно содержит сегменты V_H, D_H и J_H, полученные из репертуара сегментов V_H, D_H и J_H, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, местоположения и номенклатуру для сегментов V, D, и J тяжелой цепи для различных организмов можно найти в базе данных IMGT, которая доступна через Интернет по всемирной паутине (www) на URL "imgt.org."

Выражение "легкая цепь" включает в себя последовательность легкой цепи иммуноглобулина из любого организма, и если не указано иное, не включает легкие цепи каппа (κ) и лямбда (λ) человека и VpreB, а также суррогатные легкие цепи. Вариабельные домены легкой цепи, как правило, включают в себя три CDR легкой цепи, и четыре FR, если не указано иное. Как правило, полноразмерная легкая цепь включает в себя, от амино-конца к карбокси-концу, вариабельную область, которая включает FR1-CDR1-Fr2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи. Вариабельные домены легкой цепи кодируются нуклеотидной последовательностью вариабельной области легкой цепи, которая обычно содержит сегменты генов V_L легкой цепи и J_L легкой цепи, полученные из репертуара сегментов генов V и J легкой цепи, присутствующих в зародышевой линии. Последовательности, местоположения и номенклатуру для сегментов генов V и J легкой цепи для разных организмов можно найти в базе данных IMGT, которая доступна через Интернет по всемирной паутине (www) на URL "imgt.org." Легкие цепи включают, например, те, которые не связываются выборочно либо с первым либо со вторым эпитопом, выборочно связываемым эпитоп-связывающим белком, в котором они появляются. Легкие цепи также включают те, которые связывают и распознают или помогают тяжелой цепи со связыванием и распознаванием одного или более эпитопов, выборочно связываемым эпитоп-связывающим белком, в котором они появляются.

Термин "гомологичная нуклеиновая кислота", как он использован здесь, включает нуклеотидную последовательность, которая является либо идентичной, либо по существу аналогичной известной эталонной последовательности. В одном из вариантов осуществления термин "гомологичная нуклеиновая кислота" используют для описания последовательности ДНК или РНК, идентичной по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или даже на 100% известной эталонной последовательности.

Термин "ортологичная нуклеиновая кислота", как он использован здесь, включает нуклеотидную последовательность из одного вида, которая является функционально эквивалентной известной эталонной последовательности в другом виде.

Термин "большой нацеливающий вектор" или "LTVEC", как он использован здесь, включает в себя большие нацеливающие векторы для эукариотических клеток, которые получены из фрагментов клонированной геномной нуклеиновой кислоты большего размера, чем обычно используемые при других подходах, предназначенных для выполнения гомологичного нацеливания в эукариотических клетках. Размер LTVEC слишком велик, чтобы позволить скрининг событий нацеливания обычными анализами, например, Саузерн-блоттингом и продолжительной (long-range) (например, от 1 т.н. до 5 т.н.) ПЦР. Примеры LTVEC, включают в себя, но без ограничения, векторы, полученные из бактериальной искусственной хромосомы (bacterial artificial chromosome (ВАС)) и дрожжевой искусственной хромосомы (yeast artificial chromosome (YAC)).

Термин "модификация аллеля" или "MOA" включает в себя модификацию точной последовательности ДНК одной аллели гена(ов) или хромосомного локуса (локусов) в геноме. Примеры "модификации аллеля (МОА)" включают, но без ограничения, делеции, замены или инсерции как всего лишь одного нуклеотида, так делеции участков во много килобаз, охватывающих ген(ы) или хромосомный локус (локусы), представляющий интерес, а также любые и все возможные модификации между данными двумя крайними случаями.

Термин "нуклеаза", как он использован здесь, включает агент, который вызывает разрыв в нуклеотидной последовательности, например, разрыв в одной цепи или в двух цепях в последовательности двухцепочечной ДНК. Нуклеазы включают те, которые связывают заранее выбранную или определенную последовательность и делают разрез в заранее выбранной или определенной последовательности или рядом с ней, например, сконструированные цинковопальцевые нуклеазы и сконструированные TAL-эффекторные нуклеазы (подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (transcription activator-like effector nucleases). Нуклеазы не ограничиваются ZFN-нуклеазами и TAL-эффекторной нуклеазой, и любая нуклеаза может быть подходящей для применения с LTVEC, чтобы достичь повышенную эффективность нацеливания. Неограничивающие примеры включают в себя другие нуклеазы на основе "цинкового пальца" и сконструированные мегануклеазы, которые делают разрез в заранее выбранных или специфических последовательностях.

TAL-эффекторные нуклеазы, подходящие для применения по изобретению, включают любые TAL-нуклеазы, известные в данной области. Примеры подходящих TAL-нуклеаз и способы получения подходящих TAL-нуклеаз раскрыты, например, в заявках на патент США 2011/0239315 А1, 2011/0269234 А1, 2011/0145940 А1, 2003/0232410 А1, 2005/0208489 А1, 2005/0026157 А1, А1 2005/0064474, 2006/0188987 А1, А1 и 2006/0063231 (каждая включена сюда посредством ссылки). В различных вариантах осуществления разработаны TAL-эффекторные нуклеазы, которые делают разрез в пределах целевой нуклеотидной последовательности или рядом с ней, например, в геноме, представляющем интерес, где целевая нуклеотидная последовательность находится внутри последовательности, которая должна быть модифицирована с помощью LTVEC, или рядом с ней. TAL-эффекторные нуклеазы являются белками, которые содержат домен эндонуклеазы и один или более TAL-эффекторных ДНК-связывающих доменов, причем один или более TAL-эффекторных ДНК-связывающих доменов содержат последовательность, которая распознает заранее выбранную или специфическую нуклеотидную последовательность. TAL-нуклеазы, подходящие для применения по изобретению, включают те, которые специально предназначены для связывания с целевыми нуклеотидными последовательностями, которые должны быть модифицированы с помощью LTVEC, как описано здесь, или рядом с ними.

Фраза "функционально связанный" включает взаимоотношение, когда компоненты, функционально связанные, функционируют предназначенным образом. В одном случае нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может быть функционально связана с регуляторными последовательностями (например, последовательность промотора, энхансера, "глушителя" и т.п.) с тем, чтобы сохранить надлежащее регулирование транскрипции. В одном случае нуклеотидная последовательность вариабельной области иммуноглобулина (или сегменты V(D)J) может быть функционально связана с нуклеотидной последовательностью константной области иммуноглобулина таким образом, чтобы обеспечить надлежащую рекомбинацию между последовательностями в последовательности тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина.

Термин "промотор" и "регуляторный элемент промотора" и тому подобное, как он использован здесь, включает элемент нуклеотидной последовательности в пределах фрагмента нуклеиновой кислоты или ген, который контролирует экспрессию данного гена.

Термин "сайт рекомбинации", как он использован здесь, включает нуклеотидную последовательность, которая распознается сайт-специфической рекомбиназой и которая может служить в качестве субстрата для рекомбинации.

Термин "сайт-специфическая рекомбиназа", как он использован здесь, включает в себя группу ферментов, которые могут способствовать рекомбинации между "сайтами рекомбинации", где два сайты рекомбинации физически разделены в пределах одной молекулы нуклеиновой кислоты или находятся в отдельных молекулах нуклеиновых кислот.Примеры "сайт-специфической" рекомбиназы включают, но без ограничения, рекомбиназы CRE, Flp и Dre.

Модификация геномных локусов с использованием LTVEC и нуклеазного агента

В то время как был достигнут прогресс в нацеливании на различные локусы геномов животных, не являющихся человеком, еще остается много геномных локусов или клеточных типов, которые не могут служить целями при использовании стандартных стратегий нацеливания. Причины неудачи могут быть разными, но, в целях настоящего изобретения, они включают локусы или клетки, на которые либо вообще нельзя успешно нацелиться, или на них нацеливаются ненадлежащим образом или с существенно низкой эффективностью при использовании стандартных способов нацеливания. Стандартные способы нацеливания предусматривают нацеливание с использованием гомологичной рекомбинации с применением обычных нацеливающих векторов. Локусы, на которые трудно нацелиться, включают локусы, на которые невозможно нацелиться даже при использовании векторов LTVEC в одиночку, то есть в отсутствие содействия в виде рекомбиногенного одно- или двухцепочечного разрыва, или на которые LTVEC нацеливаются ненадлежащим образом или с низкой эффективностью в отсутствие рекомбиногенного одно- или двухцепочечного разрыва.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам нацеливания на нуклеотидные последовательности с использованием нуклеазного агента, способного образовывать рекомбиногенный одно- или двухцепочечный разрыв, в сочетании с большим нацеливающим вектором, или LTVEC, причем целевая нуклеотидная последовательность (или последовательность рядом с целевой нуклеотидной последовательностью) модифицируется посредством LTVEC. Композиции и способы могут быть использованы для модификации геномных нуклеотидных последовательностей, которые трудно или невозможно модифицировать с помощью стандартных стратегий нацеливания, даже при использовании векторов LTVEC в одиночку.

Различные объекты изобретения относятся к композициям и способам, предназначенным для применения LTVEC с целью модификации целевой нуклеиновой кислоты, например, локуса в геноме, причем целевая нуклеиновая кислота содержит целевую последовательность, которая должна быть модифицирована последовательностью LTVEC (путем гомологичной рекомбинации нуклеиновой кислоты-мишени с LTVEC), где одно- или двухцепочечный разрыв выполнен в целевой нуклеиновой кислоте в целевой последовательности или поблизости от нее.

Наличие одно- или двухцепочечного разрыва в целевой нуклеиновой кислоте в целевой последовательности или рядом с ней, в различных вариантах осуществления, повышает эффективность и/или частоту рекомбинации между LTVEC и целевой нуклеиновой кислотой. В одном из вариантов осуществления рекомбинация представляет собой гомологичную рекомбинацию. В другом варианте осуществления рекомбинация представляет собой инсерцию присоединением негомологичного концевого участка. В различных вариантах осуществления, в присутствии одно- или двухцепочечного разрыва, эффективность нацеливания последовательности LTVEC на целевой геномный локус по меньшей мере в около 2 раза выше, по меньшей мере в около 3 раза выше, по меньшей мере в около 4 раза выше, чем в отсутствие одно- или двухцепочечного разрыва (при использовании, например, того же LTVEC и той же целевой нуклеиновой кислоты, содержащей ту же целевую последовательность, но в отсутствие добавленной нуклеазы, которая осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв).

LTVEC, подходящие для использования в настоящем изобретении, и способы их получения описаны, например, в патентах США №№6586251, 6596541, 7105348 и в WO 2002/036789 (PCT/US 01/45375).

Хотя широко обсуждаются варианты осуществления, относящиеся к введению LTVEC в мышиную плюрипотентную клетку, например, мышиную ES-клетку, в настоящем документе также предлагаются другие способы, которые позволяют вводить LTVEC в различные типы клеток млекопитающих. Такие клетки млекопитающих включают любые клетки млекопитающих, которые могут быть генетически модифицированы в соответствии с способом, как описано здесь, включая, например, клетку мыши, клетку крысы, клетку кролика, клетку свиньи, клетку крупного рогатого скота, клетку оленя, клетку овцы, клетку козы, клетку курицы, клетку кошки, клетку собаки, клетку хорька, клетку приматов (например, мартышки, макака-резуса) и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления, для тех млекопитающих, для которых подходящие генетически модифицируемые плюрипотентные клетки не всегда доступны, используются другие способы для того, чтобы перепрограммировать соматические клетки в плюрипотентные клетки, например, с помощью введения в соматические клетки комбинации индуцирующих плюрипотентность факторов, включая, но без ограничения, Oct3/4, Sox2, KLF4, Мус, Nanog, LIN28 и Glis1.

В одном из вариантов осуществления вышележащие и нижележащие гомологичные плечи происходят из того же генома, что и целевой геном. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из родственного генома, например, целевой геном мыши представляет собой геном первого штамма, и нацеливающие плечи происходят из мышиного генома второго штамма, причем первый штамм и второй штамм различны. В одном из вариантов осуществления нацеливающие плечи происходят из библиотеки ВАС, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из гена, на который нельзя нацелиться с использованием традиционных способов. В определенном варианте осуществления гомологичные плечи происходят из гена, на который невозможно нацелиться с использованием традиционной технологии нацеливания или возможно нацелиться только неправильно или только с существенно низкой эффективностью в отсутствие одно- или двухцепочечного разрыва, вызываемого нуклеазным агентом.

В различных вариантах осуществления, для того, чтобы облегчить идентификацию целевой модификации, используется количественный анализ с высокой пропускной пропускностью, а именно, анализ для определения модификации аллеля (MOA). Анализ на MOA, описанный здесь, позволяет проводить широкомасштабный скрининг модифицированного аллеля(ей) в родительской хромосоме с последующей генетической модификацией. Анализ на MOA можно проводить с помощью различных аналитических способов, включая, но без ограничения, количественную ПЦР, например, ПЦР в реальном времени (qPCR). Например, ПЦР в реальном времени содержит первый набор праймеров, который распознает целевой локус, и второй набор праймеров, который распознает нецелевой референсный локус.Кроме того, набор праймеров содержит флуоресцентный зонд, который распознает амплифицированную последовательность. Количественный анализ также можно проводить с помощью различных аналитических способов, включая, но без ограничения, флуоресцентную гибридизацию in situ (fluorescence-mediated in situ hybridization (FISH)), сравнительную геномную гибридизацию, изотермическую амплификацию ДНК, количественную гибридизацию с иммобилизованным зондом (зондами), Invader Probes®, ММР assays®, TaqMan® Molecular Beacon и способ с зондом Eclipse™. (Смотри, например, US2005/0144655, включен в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте).

В некоторых вариантах осуществления различные генетические модификации целевых геномных локусов, описанные здесь, могут быть выполнены с помощью серии реакций гомологичной рекомбинации (BHR) в бактериальных клетках с использованием LTVEC, полученного из ДНК бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) с помощью генно-инженерной технологии VELOCIGENE® (см, например, патент США №6586251 и публикацию Valenzuela, D.M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659, которые включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте).

В некоторых вариантах осуществления целевые мышиные ES-клетки, содержащие различные генетические модификации, как описано в настоящем документе, используют в качестве доноров ES-клеток и вводят в мышиный эмбрион на стадии, предшествующей стадии морулы, например, в мышиный эмбрион на 8-клеточной стадии, с помощью способа VELOCIMOUSE® (смотри, например, US 7576259, US 7659442, US 7294754, и US 2008-0078000 А1, все из которых включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте). Мышиный эмбрион, содержащий генетически модифицированные ES-клетки, инкубируют до стадии бластоцисты, а затем имплантируют в суррогатную мать для получения мышей поколения F0. Мыши, несущие генетически модифицированный геномный локус, могут быть определены с помощью анализа для определения модификации аллеля (MOA), как описано здесь. Полученную мышь поколения F0, происходящую из генетически модифицированных ES-клеток, скрещивают с мышью дикого типа, чтобы получить потомство поколения F1. После генотипирования со специфическими праймерами и/или зондами помет F1, который являются гетерозиготным по генетически модифицированному геномному локусу, скрещивают друг с другом для получения мышей, которые являются гомозиготными по генетически модифицированному геномному локусу.

Следует отметить, что, как используется в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа "а", "и" и "the" включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Все технические и научные термины, используемые здесь, имеют тот же смысл.

Публикации, обсуждаемые в данном описании, предоставляются исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данном описании не должно быть истолковано как признание того, что описанное изобретение не имеет права датировать задним числом такую публикацию в силу предшествующего изобретения. Дополнительно, даты публикации могут отличаться от фактических дат публикаций, что, возможно, нуждается в подтверждении независимыми источниками.

Описанное изобретение может быть воплощено в других определенных формах без отхода от сущности или существенных признаков его и, соответственно, должна быть сделана ссылка на прилагаемую формулу изобретения, а не на предшествующее описание, указывающее объем изобретения.

Примеры

Следующие примеры приведены таким образом, чтобы предоставить специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как осуществить и применять настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения считают их изобретением, и не предназначены для представления того, что эксперименты, приведенные ниже, представляют собой все осуществленные эксперименты или только осуществленные эксперименты. Хотя были предприняты усилия, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количества, температура и т.д.), возможность некоторых экспериментальных ошибок и отклонений должна приниматься во вниманиея. Если не указано иное, части являются массовыми частями, молекулярная масса представляет собой усредненную по массе молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному.

Пример 1 Улучшение нацеливания вектора LTVEC цинковопальцевой нуклеазой (ZFN)

Для того, чтобы проверить, может ли индуцирование цинковопальцевой нуклеазой (ZFN) двухцепочечного разрыва в гене повысить нацеливание на тот же ген вектора LTVEC (большой нацеливающий вектор на основе ВАС), провели три процедуры введения электропорацией в ES-клетки F1H4c вектора LTVEC, нацеливающего на ген II2rg, и плазмид, кодирующих каждую половину пары ZFN, в следующих сочетаниях: (1) 1,5 мкг только II2rg LTVEC; (2) 20 мкг II2rg ZFN-1+20 мкг II2rg LTVEC ZFN-2+1,5 мкг II2rg LTVEC; и (3) 20 мкг II2rg ZFN-1+20 мкг II2rg ZFN-2 без LTVEC.

ZFN-1 и ZFN-2, применяемые в данном изобретении, были спроектированы, чтобы содержать (1) ДНК-связывающие домены "цинкового пальца", которые распознают две смежные целевые последовательности ДНК в каждой цепи целевой последовательности, разделенные сайтом расщепления в 6 п.н.; и (2) нуклеазы Fokl, которые димеризуются и делают двухцепочечный разрыв в целевом сайте. Более определенно, домен "цинкового пальца" ZFN-1 был спроектирован для распознавания последовательности 5'-AGCTCCAAGGTCCTC-3' (SEQ ID NO: 1) в смысловой цепи экзона 1; и домен "цинкового пальца" ZFN-2 был спроектирован для распознавания последовательности 5'-GTCUCATTCGCACT-3' (SEQ ID NO: 2) в анти-смысловой цепи экзона 1 в гене II2rg.

Был спроектирован LTVEC (VelociGene MAID 5057L1), чтобы удалить около 3000 пар оснований (3 т.н.) гена II2rg, включая всю последовательность, кодирующую гамма-цепь рецептора IL-2, и заменить эндогенную последовательность кассетой селекции, которая экспрессирует гигромицинфосфотрансферазу, придающую устойчивость к гигромицину В. LTVEC 5057L1 происходит от родительского ВАС-клона 290о15, изолированного из коммерчески доступной ВАС-библиотеки (ВАС ES Release 2; Incyte Genomics), и содержит два больших гомологичных плеча, имеющих около 90 т.н. (гомологичное плечо 1) и около 8 т.н. (гомологичное плечо 2).

В случае электропораций (1) и (2), изолировали колонии, устойчивые к гигромицину В. В случае электропораций (3), колониям давали образоваться без отбора на устойчивость к лекарственному препарату. Колонии отбирали после каждой электропораций и культивировали в 96-луночных планшетах, а затем проводили скрининг событий нацеливания анализами на определение потери аллеля (loss-of-allele (LOA)), предназначенными для обнаружения делеции размером в 3 т.н., создаваемой правильным нацеливанием на ген II2rg вектором LTVEC. Анализы на LOA также применяли для обнаружения событий расщепления, вызванных ZFN в экзоне 1.

Как показано в таблице 3, когда плазмиды, кодирующие ZFN, предназначенную для расщепления сайта в целевом гене, объединяли с LTVEC, который нацеливается на тот же ген (Электропорация # 2), было достигнуто значительное улучшение (приблизительно около 4-кратное увеличение в описанном эксперименте) эффективности нацеливания по сравнению только с одним LTVEC (Электропорация 1 #).

В то время как описанное изобретение было описано со ссылкой на определенные варианты его осуществления, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что можно произвести различные изменения и можно заменить эквиваленты без отхода от сущности и объема настоящего изобретения. Кроме того, можно выполнить многие модификации, чтобы приспособиться к определенной ситуации, материалу, составу вещества, способу, стадии или стадиям способа, объективной сущности и объему описанного изобретения. Все такие модификации должны находиться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

1. Способ модификации целевого геномного локуса путем гомологичной рекомбинации в мышиной эмбриональной стволовой (ES) клетке, содержащий:

(a) введение в мышиную ES-клетку:

(i) цинковопальцевой нуклеазы (ZFN), которая осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и

(ii) большого нацеливающего вектора (LTVEC), содержащего нуклеотидную вставку, фланкированную вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом, при этом нуклеотидная вставка составляет от около 5 т.н. до около 30 т.н. и общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н.; и

(b) отбор целевой мышиной ES-клетки, содержащей нуклеотидную вставку в целевом геномном локусе, при этом интеграция приводит к делеции эндогенной нуклеотидной последовательности в целевом геномном локусе и замене нуклеотидной вставкой, и при этом комбинированное применение LTVEC с ZFN приводит к повышенной эффективности нацеливания по сравнению с применением только LTVEC.

2. Способ по п. 1, в котором эффективность нацеливания LTVEC увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с применением только LTVEC.

3. Способ по п. 1, в котором ZFN представляет собой экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ZFN, и в котором нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, активным в мышиной ES-клетке.

4. Способ по п. 1, в котором ZFN представляет собой мРНК, кодирующую белок ZFN.

5. Способ по п. 1, в котором целевая последовательность ZFN находится в интроне, экзоне, промоторе, регуляторной области промотора или области энхансера в целевом геномном локусе.

6. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит кассету селекции.

7. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит репортерный ген.

8. Способ по п. 1, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к делеции эндогенного гена в целевом геномном локусе.

9. Способ по п. 1, в котором интеграция нуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к нокауту, нокину, точечной мутации, замене домена, замене экзона, замене интрона, замене регуляторной последовательности, замене гена или их комбинации.

10. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность человека.

11. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина.

12. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит геномную нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого иммуноглобулина.

13. Способ по п. 12, в котором геномная нуклеотидная последовательность содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи κ и/или λ человека.

14. Способ по п. 12, в котором геномная нуклеотидная последовательность содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи κ и/или λ человека.

15. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит аллель заболевания человека.

16. Способ по п. 11, в котором нуклеотидная вставка содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.

17. Способ по п. 11, в котором нуклеотидная вставка содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина.

18. Способ по п. 16, в котором последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, или их комбинации.

19. Способ по п. 16, в котором нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из С_Н1, шарнирной области, С_Н2, С_Н3 и их комбинации.

20. Способ по п. 17, в котором последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность константной области тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, последовательность константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или их комбинацию.

21. Способ по п. 17, в котором нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина выбрана из С_Н1, шарнирной области, С_Н2, С_Н3 и их комбинации.

22. Способ по п. 12, в котором нуклеотидная вставка содержит нереаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ или κ человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.

23. Способ по п. 12, в котором нуклеотидная вставка содержит реаранжированную нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи λ или κ человека, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью константной области легкой цепи мышиного или человеческого иммуноглобулина, выбранной из нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи λ и нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи κ.

24. Способ по п. 1, в котором стадию селекции (b) осуществляют с помощью анализа определения модификации аллеля (МОА).

25. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность, гомологичную заменяемой нуклеотидной последовательности в геноме мышиной ES-клетки.

26. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность, ортологичную заменяемой нуклеотидной последовательности в геноме мышиной ES-клетки.

27. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит нуклеотидную последовательность вида, отличного от мыши.

28. Способ по п. 1, в котором LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н.

29. Способ по п. 28, в котором LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 100 т.н.

30. Способ по п. 28, в котором LTVEC составляет от около 100 т.н. до около 200 т.н.

31. Способ по п. 28, в котором LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 300 т.н.

32. Способ по п. 1, в котором длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 200 т.н.

33. Способ по п. 32, в котором длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н.

34. Способ по п. 1, в котором нуклеотидная вставка содержит условный аллель.

35. Способ по п. 1, в котором длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 200 т.н. и в котором длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н.

36. Способ по любому из пп. 1-35, который дополнительно включает:

(c) введение модифицированной мышиной ES-клетки в эмбрион на стадии, предшествующей стадии морулы; и

(d) инкубирование эмбриона до стадии бластоцисты и имплантирование эмбриона в суррогатную мать для генерации поколения F0 мыши, несущего генетически модифицированный целевой геномный локус.