Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы

Авторы патента:

Чурашов Сергей Викторович (RU)

Гаврилюк Илья Олегович (RU)

Куликов Алексей Николаевич (RU)

Черныш Валерий Федорович (RU)

C12N5/00 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2646162:

Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) (RU)

Изобретение относится к области медицины. Изобретение представляет собой способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы путем фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны, где подложку-носитель клеток на основе биологической мембраны механически фиксируют в расправленном состоянии на предварительно залитом в чашку Петри стерильном агар-агаре при помощи стерильных игл от инсулиновых шприцев под острым углом вкола от 10 до 60 градусов, вершина которого направлена к подложке-носителю клеток. Изобретение позволяет обеспечить надежную фиксацию подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны. 4 ил.

Изобретение может применяться в медицине, в частности в офтальмологии, с целью создания биоинженерных трансплантатов, необходимых для реконструкции поврежденных эпителиальных тканей передней поверхности глаза, и позволяет оптимизировать культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких культуральных системах путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (на основе биомембран), что предотвращает ее деформацию в результате движения жидкостей культуральной системы в течение всего периода культивирования.

В настоящее время для реконструкции поврежденных эпителиальных тканей передней поверхности глаза применяется трансплантация культивированных эпителиальных стволовых клеток различного происхождения на различных подложках на основе биомембран.

Например, для культивирования клеток эпителия эктодермального происхождения (роговичного, буккального и т.д.) с целью их последующего использования в реконструктивной хирургии передней поверхности глаза в настоящее время применяется амниотическая мембрана [Tsai, R.J., Li, L.M., Chen, J.K., 2000. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N. Engl. J. Med. 343, 86-93; Nakamura, Т., Endo, K., Cooper, L.J., Fullwood, N.J., Tanifuji, N., Tsuzuki, M., Koizumi, N., Inatomi, Т., Sano, Y., Kinoshita, S., 2003. The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 106-116], известная своим благоприятным лечебным эффектом при данных патологиях, а также хорошими адгезивными свойствами для культивируемых эпителиальных клеток. При этом подготовка биотрансплантата на основе амниотической мембраны с культивированными на ней эпителиальными клетками, в случае выращивания их с использованием жидких питательных сред, зачастую является достаточно трудной задачей, так как в результате движения жидкостей культуральной системы не иммобилизированная амниотическая мембрана легко деформируется и ее сложно поддерживать в расправленном состоянии, что приводит не только к неправильному распределению клеток, но и к невозможности получения их качественного монослоя.

Известен способ культивирования эпителиальных стволовых клеток, в качестве подложки-носителя при котором используется капсула хрусталика [Galal, A., Perez-Santonja, J.J., Rodriguez-Prats, J.L., Abad, М., Alio, J., 2007. Humananterior lens capsule as a biologic substrate for the ex vivo expansion of limbalstem cells in ocular surface reconstruction. Cornea 26, 473-478]. Этот способ также не предусматривает фиксацию подложки-носителя, что при использовании жидких культуральных сред приводит к ее деформированию и существенно затрудняет процедуру культивирования.

Поэтому для решения этой проблемы предлагается использовать разработанный нами «Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы», что позволит оптимизировать культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких культуральных системах путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (на основе биомембран) и предотвратит ее деформацию в результате движения жидкостей культуральной системы в течение всего периода культивирования.

Технический результат предлагаемого изобретения - обеспечение надежной фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны.

Технический результат достигается благодаря тому, что подготовленная в стерильных условиях подложка-носитель клеток на основе биологической мембраны по краям механически надежно фиксируется в расправленном состоянии к предварительно залитому в чашку Петри стерильному агар-агару при помощи одноразовых стерильных игл от инсулиновых шприцев под острым углом вкола от 10 до 60 градусов, вершина которого направлена к подложке-носителю клеток на основе биологической мембраны, что позволяет выполнить надежную ее фиксацию и культивировать эпителиальные стволовые клетки в любой жидкой культуральной среде без риска деформации подложки и контаминации клеточной культуры.

Изобретение поясняется фиг. 1-4, на которых показаны этапы иммобилизации мембраны.

Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы подразумевает несколько этапов.

1. Заполнение стерильной чашки Петри 1 таким объемом стерильного агар-агара 2 (Фиг. 1), которое будет достаточно не только для надежной фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны 3, но и для размещения ее и жидкой культуральной системы (Фиг. 2). Необходимо отметить, что тут действует следующий принцип: чем больше стерильного агар-агара 2, тем надежнее фиксация подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны 3, однако тем меньше места остается для размещения ее и жидкой культуральной системы, поэтому решение о количестве используемого стерильного агар-агара 2 принимается индивидуально в соответствии с размером используемой чашки Петри 1 и задачами культивирования.

2. После застывания стерильного агар-агара 2 в чашке Петри 1 на его поверхность укладывается и расправляется подложка-носитель клеток на основе биологической мембраны 3 (Фиг. 2).

3. Расправленная по поверхности стерильного агар-агара 2 подложка-носитель клеток на основе биологической мембраны 3 по краям фиксируется при помощи одноразовых стерильных игл от инсулиновых шприцев 4 (Фиг. 3), под острым углом вкола от 10 до 60 градусов 5, вершина 6 которого направлена к подложке-носителю клеток на основе биологической мембраны 3 (Фиг. 4).

К особенностям предлагаемого «Способа иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы», позволившим достичь технический результат, относится.

1. Стерильный агар-агар 2 является мягким, ареагенным материалом приготавливающийся в стерильных условиях, который, во-первых, не влияет на условия культивирования клеток, во-вторых, дает возможность «приколоть» к нему любую клеточную подложку на основе биомембран 3, и, в-третьих, ввиду стерильности, исключает контаминацию клеточной культуры.

2. Одноразовые стерильные инсулиновые иглы от инсулиновых шприцев 4 позволяют иммобилизировать клеточную подложку на основе биомембран 3 без риска нарушения стерильности, при этом маленький их внешний диаметр не приводит к разрывам клеточной подложки на основе биомембран 2 в местах вколов.

3. Острый угол вкола от 10 до 60 градусов 5 в стерильный агар-агар 2 одноразовых стерильных инсулиновых игл от инсулиновых шприцев 4, направленный вершиной 6 к подложке-носителю клеток на основе биологической мембраны 3, исключает возможность соскальзывания клеточной подложки на основе биомембран 3 с одноразовой стерильной инсулиновой иглы от инсулиновых шприцев 4.

Таким образом, «Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы» позволяет выполнить надежную фиксацию клеточной подложки на основе биомембран и культивировать эпителиальные стволовые клетки в любой жидкой культуральной среде без риска деформации подложки и контаминации клеточной культуры.

Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы путем фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны, отличающийся тем, что подложку-носитель клеток на основе биологической мембраны механически фиксируют в расправленном состоянии на предварительно залитом в чашку Петри стерильном агар-агаре при помощи стерильных игл от инсулиновых шприцев под острым углом вкола от 10 до 60 градусов, вершина которого направлена к подложке-носителю клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен мультиэлементный референтный материал и способ его получения.

Способ хранения почки поросенка для получения монослоя первичнотрипсинизированных клеток и использования его в вирусологических исследованиях // 2646135

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ хранения почек поросят при субнормальных температурах (0÷4°C) от 2 до 7 суток для получения монослоя первично трипсинизированных культур.

Способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс // 2646122

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ совместного культивирования зрелых адипоцитов с клетками крыс.

Клеточная культура конъюнктивы человека chang conjunctiva атсс - ccl 20.2 для предупреждения феномена усиления токсичности глазных инстилляций при совместном применении комбинации лекарственных препаратов // 2646100

Изобретение относится к биотехнологии. Конкретно, изобретение относится к предупреждению феномена усиления токсичности глазных инстилляций при совместном применении комбинации лекарственных препаратов.

Способ получения индуцированных нервных стволовых клеток, перепрограммированных из клеток, не являющихся нервными, с использованием hmga2 // 2646099

Изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно к получению индуцированной нервной стволовой клетки из дифференцированной клетки. Способ включает доставку в клетку, не являющуюся нервной, набора для индукции перепрограммирования, состоящего из белка SOX2 или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок SOX2, и белка HMGA2 или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок HMGA2, либо увеличение экспрессии указанных белков в клетке с последующим культивированием.

Тканевые конструкции, полученные с помощью биоинженерии, и способы их получения и применения // 2645473

Изобретение относится к биотехнологии. Описана биоинженерная конструкция для восстановления больных или поврежденных тканей.

Способ получения химически полисиалированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека // 2645458

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к конъюгату рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека и окисленной каламиновой кислоты со средней молекулярной массой 27 кДа.

Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций // 2645455

Изобретение относится к области биохимии. Предложен биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций.

Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека // 2645255

Изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно к получению биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека. Способ включает выделение из плаценты человека после операции «кесарево сечение» культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона, дезагрегацию ткани раствором, содержащим 0,2% коллагеназы 2 типа и 0,18% коллагеназы 4 типа, приготовленным на среде DMEM\F12 в соотношении 1:1 и инкубирование при 37°С в течение 30 мин.

Иммуноцитокины на основе il-15 и il-r[альфа] домена sushi // 2644671

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Получают иммуноцитокин, содержащий: конъюгат интерлейкина 15 и домена sushi IL-15Rα, ковалентно связанный с антителом или его фрагмент, направленным против антигена, имеющего отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, или опухолевого антигена.

Способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток // 2648162

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа получения ростовой добавки к среде для культивирования клеток человека из тромбоцитарной массы доноров. Представленный способ включает нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов 1,75×109 кл/мл посредством центрифугирования тромбоцитарной массы при 3130 g в течение 40 минут при 20°С и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до указанной концентрации тромбоцитов. Трехкратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С. Осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования при 3130 g в течение 40 минут при 20°С, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов с последующим его микроскопическим контролем при увеличении ×200 на наличие в поле зрения не более 3-х фрагментов тромбоцитов. При этом стандартизацию проводят путем пулирования равных по объему индивидуальных образцов лизата, полученных из тромбоцитарной массы не менее 12 доноров обеих тендерных групп, и полученный лизат тромбоцитов центрифугируют при 3130 g в течение 40 минут при 20°С, с последующей ультрафильтацией на фильтрах 0,45 мкм или 0,22 мкм, полученную ростовую добавку делят на аликвоты требуемого объема и замораживают до -80°С. Изобретение позволяет получить стандартизованные образцы нексеногенной ростовой добавки для культивирования клеток человека разных типов с функциональной активностью образцов, определяемой по скорости прироста тест-культур, различающейся не более чем на 10,0%. 3 ил., 8 табл., 2 пр.

Комбинированная терапия для стабильного и долговременного приживления трансплантата с использованием конкретных протоколов для т/в-клеточной деплеции // 2648354

Группа изобретений относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использована для лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате. Для этого способ включает (а) трансплантацию субъекту дозы незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками. Причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат меньше чем 5×105 CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и указанная доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×106 CD34+ клеток на кг массы тела субъекта. Незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают путем сепарации указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из: (I) способа, включающего; (i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем указанное антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства; (ii) иммобилизацию указанных незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с указанным антителом, меченным указанным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля; (iii) отмывку указанной матрицы для удаления несвязанных клеток; и (iv) удаление указанного магнитного поля для элюирования связанных клеток из указанной матрицы; (II) на основании продукта, секретируемого указанными Т-клетками; и (III) на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β. Далее субъекту вводят терапевтически эффективное количество циклофосфамида, причем указанное терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела субъекта. Циклофосфамид вводится субъекту после трансплантации, тем самым обеспечивая лечение субъекта. Группа изобретений относится также к вариантам лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, и к способу индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате. Использование данной группы изобретений обеспечивает долгосрочный смешанный химеризм, успешное приживление трансплантата гемопоэтических стволовых клеток путем комбинации без Т-клеточного костного мозга и введения циклофосфамида в высокой дозе после трансплантации. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 табл., 7 ил.

Демпфирующий элемент микрофлюидного чипа и микрофлюидный чип // 2648444

Группа изобретений относится к области биохимии, а именно к микрофлюидным устройствам с замкнутой микроциркуляцией питательной среды, предназначенным для культивирования и исследования клеток или клеточных моделей. Демпфирующий элемент, интегрированный в замкнутый микрожидкостный контур микрофлюидного чипа, включает демпфирующую камеру, закрытую сверху мембраной, подводящий и отводящий каналы, связанные с демпфирующей камерой. При этом мембрана выполнена сообщающейся сверху с открытым воздухом; демпфирующая камера в проекции на плоскость мембраны выполнена в форме круга, а подводящий и отводящий каналы выполнены формой, обеспечивающей ламинарное движение среды через демпфирующий элемент. Также раскрыт микрофлюидный чип для культивирования клеток или клеточной модели, включающий замкнутый микрофлюидный контур, соединяющий перистальтический микронасос, по меньшей мере один демпфирующий элемент и ячейку для культивирования. Группа изобретений обеспечивает оптимальные условия жизнедеятельности культивируемых клеток за счет сглаживания пульсаций скорости и давления питательной среды при подводе ее к клеткам на частотах, соответствующих физиологическим условиям, что позволяет проводить исследования на клетках, минимизируя пагубное влияние перистальтического насоса. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 1 пр.

Клеточная линия колоректального рака человека 485 colo can // 2650757

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к клеточной линии колоректального рака человека 485 colo can. Указанная клеточная линия предназначена для создания противоопухолевых вакцин и тестирования активности различных фармацевтических препаратов. Полученная клеточная линия 485 colo can обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 740Д. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для создания противоопухолевых вакцин. 2 пр.

Клеточная линия рака яичника человека 533 oos // 2650759

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к клеточной линии рака яичника человека 533 OOS. Указанная клеточная линия предназначена для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования активности различных фармацевтических препаратов. Полученная клеточная линия 533 OOS обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 742Д. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для создания противоопухолевых вакцин. 2 пр.

Использование лигандов эпинефрина для дифференцирования клеток панкреатической эндодермы // 2650813

Изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно к получению клеток, экспрессирующих инсулин и индукции экспрессии инсулина в клетках панкреатической энтодермы. Способ включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток, выбранных из группы, состоящей из клеточных линий Н1, Н7, SA002, индуцибельных плюрипотентных клеток и перепрограммированных плюрипотентных стволовых клеток, в клетки дефинитивной эндодермы, дифференцировку клеток дефинитивной энтодермы в клетки первичной кишечной трубки, дифференцировку клеток первичной кишечной трубки в клетки передней кишки, дифференцировку клеток передней кишки в клетки-предшественники панкреатических клеток, дифференцировку клеток-предшественников панкреатических клеток в клетки панкреатической эндодермы и культивирование клеток панкреатической энтодермы с эфриновым лигандом. Изобретение позволяет повысить эффективность и направленность дифференцировки. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил., 3 пр.

Способ изоляции микровезикул из крови // 2651521

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ изоляции микровезикул из крови, включающий разделение крови на плазму и клеточную фракции центрифугированием при 300 g. Клеточную фракцию обрабатывают буферным раствором PBS, затем центрифугируют 20 мин при 400 g. Клеточный дебрис удаляют ультрафильтрацией под давлением 2 атм через ультрафильтрационную ячейку с мембраной МФАС-ОС-1, затем фильтрат повторно подвергают ультрафильтрации через мембрану УПМ-50. Изобретение позволяет повысить выход целевого продукта. 1 табл., 4 пр.