Способ выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина g к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли

Изобретение относится к медицине и касается способа выделения подклассов иммуноглобулина G (IgG) аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF), заключающегося в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF. При этом выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с последующей нейтрализацией, объединением и диализом. Изобретение обеспечивает получение чистых фракций аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3. 1 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам выделения аутоантител подклассов иммуноглобулина G к фактору некроза опухоли (TNF) из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения.

Аутоантитела к цитокинам присутствуют как у здоровых индивидов, так и у больных различными нозологиями. Наличие различных антицитокиновых аутоантител в норме свидетельствует о том, что они участвуют в поддержании гомеостаза, стабилизируя воспаление и предотвращая повреждение тканей [Nielsen С.Н., Bendtzen К. Immunoregulation by naturally occurring and disease-associated autoantibodies: binding to cytokines and their role in regulation of T-cell responses. // Adv Exp Med Biol. - 2012. - V. 750. - P. 116-32].

В основном исследование содержания аутоантител к цитокинам проводится при измерении содержания общего иммуноглобулина G (IgG), специфичного к определенным молекулам, однако не менее важным является и содержание отдельных подклассов антицитокиновых аутоантител. Кроме того, существуют различия в свойствах каждого из подклассов антител класса IgG [Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. // Front Immunol. - 2014. - V. 20. - N. 5. - Р. 520]. В ряде работ [Sennikov S.V., Golikova E.A., Kireev F.D., Lopatnikova J.A. Purification of human immunoglobulin G autoantibodies to tumor necrosis factor using affinity chromatography and magnetic separation. // J Immunol Methods. - 2013. - V. 390. - N. 1-2. - P. 92-8. Golikova E.A., Lopatnikova J.A., Kovalevskaya-Kucheryavenko T.V., Nepomnyashih V.M., Sennikov S.V. Levels of TNF, TNF autoantibodies and soluble TNF receptors in patients with bronchial asthma. // J Asthma. - 2013. - V. 50. - N. 7. - P. 705-11. Lopatnikova J.A., Golikova E.A., Shkaruba N.S., Sizikov A.E., Sennikov S.V. Analysis of the levels of tumour necrosis factor (TNF), autoantibodies to TNF, and soluble TNF receptors in patients with rheumatoid arthritis. // Scand J Rheumatol. - 2013. - V. 42. - N. 6. - P. 429-32] показаны изменения в распределении подклассов IgG аутоантител к TNF при ревматоидном артрите и бронхиальной астме.

Авторами обнаружено увеличение содержания аутоантител подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 к TNF в сыворотках крови больных ревматоидным артритом и бронхиальной астмой в стадии обострения по сравнению со здоровыми индивидами, а также показано снижение содержания аутоантител подклассов IgG2 и IgG4 при ответе на терапию у больных ревматоидным артритом и снижение содержания аутоантител подклассов IgG2 и IgG4 и повышение уровня аутоантител подкласса IgG1 у больных бронхиальной астмой при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению заболевания [Lopatnikova J.A., Golikova Е.А., Shkaruba N.S., Sizikov А.Е., Sennikov S.V. Analysis of the levels of tumour necrosis factor (TNF), autoantibodies to TNF, and soluble TNF receptors in patients with rheumatoid arthritis. // Scand J Rheumatol. - 2013. - V. 42. - N. 6. - P. 429-32. Golikova E.A., Lopatnikova J.A., Kovalevskaya-Kucheryavenko T.V., Nepomnyashih V.M., Sennikov S.V. Levels of TNF, TNF autoantibodies and soluble TNF receptors in patients with bronchial asthma. // J Asthma. - 2013. - V. 50. - N. 7. - P. 705-11]. Полученные данные свидетельствуют, что различные подклассы IgG могут участвовать в патогенезе и, вероятно, обладают разной активностью в отношении медиатора. Для получения экспериментальных подтверждений этого необходимо изучить влияние подклассов аутоантител к TNF на реализацию его биологических эффектов. Существуют разные подходы к оценке биологических эффектов аутоантител к цитокинам. В большинстве исследований проводится оценка влияния кратных разведений сывороток больных различными нозологиями на биологическую активность цитокинов. Однако такой подход не позволяет дифференцировать эффекты аутоантител и растворимых рецепторов к цитокинам.

В литературе приводится достаточное количество отработанных протоколов выделения IgG человека из сыворотки крови, однако сведения о подходах к разделению IgG на подклассы в литературе крайне скудны. Все подклассы обладают высокой аффинностью к Protein G, поэтому использование аффинной колонки с данным сорбентом позволяет выделить все четыре подкласса IgG. При этом аффинность связывания с Protein А у разных подклассов IgG различается. Все подклассы, кроме IgG3, связываются с Protein А с высокой аффинностью. Вследствие низкой аффинности IgG3 к Protein А возможно отделить его от трех других подклассов [Kronvall G., Williams R.C. Jr. Differences in anti-protein A activity among subgroups. // J Immunol. - 1969. - V. 103. - N. 6. - P. 1405-10. Sviatenko O.V., Gorbatiuk O.B., Vasylchenko O.A. Application of immunoglobulin-binding proteins A, G, L in the affinity chromatography. // Biotechnologia Acta. - 2014. - V. 7. - N. 2. - Р. 34-45].

Разделение IgG1, IgG2 и IgG4 может проводиться с учетом их различной аффинности к Protein А с использованием градиента рН в процессе хроматографии. Однако полное их разделение невозможно вследствие перекрывания интервалов рН диссоциации комплексов различных подклассов иммуноглобулинов с Protein A [Nikolayenko I.V., Galkin O.Yu., Grabchenko N.I., Spivak M.Ya. Preparation of highly purified human IgG, IgM, and IgA for immunization and immunoanalysis // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - V. 2. - P. 3-11. Leblebici P., Leblebici M.E., Ferreira-da-Silva F., Rodrigues A.E., Pais L.S. Separation of human immunoglobulin G subclasses on a protein A monolith column. // J Chromatography В Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2014. - V. 962. - P. 89-93]. В других работах для выделения чистых фракций подклассов IgG использовались сорбенты, полученные при связывании подкласс-специфических моноклональных антител с сефарозой [Bird P., Lowe J., Stokes R.P., Bird A.G., Ling N.R., Jefferis R. The separation of human serum IgG into subclass fractions by immunoaffinity chromatography and assessment of specific antibody activity. // J Immunol Methods. - 1984. - V. 71. - N. 1. - P. 97-105]. В работе Bird et al. использование позитивной и негативной хроматографии позволило выделить отдельные подклассы IgG из поликлонального IgG с содержанием примеси других подклассов менее 1%. Несмотря на то что в литературе описано получение препаратов IgG антицитокиновых аутоантител, к настоящему времени не предложено подходов к препаративному выделению подклассов IgG специфических аутоантител к цитокинам.

Таким образом, данные литературы об изменении содержания подклассов аутоантител к цитокинам при патогенетических состояниях свидетельствуют о возможных различиях в их биологических функциях. При этом в литературе последних лет не представлено работ, связанных с получением отдельных подклассов IgG человека аутоантител к цитокинам. Поэтому представлялось актуальным разработать современный методический подход для получения фракций подклассов аутоантител к TNF из препарата иммуноглобулина, включающий гель-фильтрацию, позитивную и негативную аффинную хроматографию и ультрафильтрацию по молекулярной массе для получения фракций подклассов аутоантител к TNF из препарата иммуноглобулина.

Известен способ разделения подклассов IgG путем жидкостной хроматографии с использованием в качестве твердой фазы пористого геля с пределом исключения выше молекулярной массы иммуноглобулина G и, в качестве подвижной фазы, буферного раствора со специфической ионной силой. В данном подходе применяется пористый гель, предпочтительно неорганической природы, со средним объемом частиц менее 50 мкм, несущий гидрофильные группы, такие как гидроксильные, и буферные растворы с ионной силой от 0.1 до 2.0 М, предпочтительно от 0.1 М до 1.0 М. Подход основан на различиях в гидрофобном взаимодействии геля и подклассов IgG в процессе жидкостной хроматографии, которые обусловливаются разным аминокислотным составом γ-цепей, определяющих принадлежность к соответствующему подклассу. В данном случае нет необходимости изменения рН элюирующего буфера, что обусловливает отсутствие влияния агрессивной среды рН на биологическую активность выделяемых антител (JPS6419024, А61К 39/395, 1989).

Недостатком данного способа является ограниченность его использования выделением подклассов IgG мыши. Кроме того, не указывается степень чистоты полученных фракций различных подклассов.

Наиболее близким к заявляемому является способ выделения фракций аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF) из сыворотки крови человека с использованием комплекса процедур аффинной хроматографии, проводят выделение антител класса IgG с использованием аффинного сорбента Protein G Sepharose, после проведения элюции, полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют, далее фракции аутоантител наносят на колонку со связанным с TNF аффинным сорбентом, после проведения элюции полученные фракции аутоантител к TNF нейтрализуют, объединяют и диализуют, после этого проводят их магнитную сепарацию с использованием магнитных частиц, причем магнитные частицы, покрытые стрептавидином, со-инкубируют с мечеными биотином поликлональными антителами к TNF и полученный комплекс инкубируют с фракциями аутоантител к TNF, затем собирают надосадочную жидкость, содержащую очищенные фракции аутоантител (RU 2501008, G01N 33/00, 2013).

В описанном способе аутоантитела класса IgG к TNF выделяют из сыворотки крови человека с использованием комплекса хроматографических процедур и процедуры магнитной сепарации. Используются следующие хроматографические сорбенты: Bio-Gel Р6 DG (Bio-Rad, США), Protein G Sepharose Fast Flow (GE Life Sciences, Швеция) и Affi-Gel 15 (Bio-Rad, США), связанный с TNF. Магнитную сепарацию проводят с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином, и поликлональных антител к TNF, меченых биотином.

Однако данным способом можно получить общую фракцию класса IgG аутоантител к TNF, включающую все четыре подкласса: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Для оценки биологической активности аутоантител к TNF, относящихся к конкретному подклассу IgG, требуется выделение отдельных подклассов IgG.

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного способа выделения аутоантител подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 к иммунорегуляторному цитокину TNF.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения подклассов иммуноглобулина G (IgG) аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF), заключающемся в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF, выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein A Sepharose, причем после выделения IgG3 проводят элюцию смеси IgG1, IgG2, IgG4 цитратным буфером с рН 3.0, с последующей нейтрализацией, объединением и диализом; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG2 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG1 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG4 Sepharose, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с использованием сорбента Affi Gel 15-TNF с последующей нейтрализацией, объединением и диализом.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Для переноса иммуноглобулинов препарата «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» в рабочий буфер используют колонку с сорбентом Bio-Gel Р6 DG. Далее для выделения антител класса IgG белки, собранные с колонки с сорбентом Bio-Gel Р6 DG, наносят на колонку с аффинным сорбентом Protein G Sepharose 4 Fast Flow. При проведении элюции полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют. Далее проводят очистку фракции общего IgG от аутоантигенов методом ультрафильтрации на центрифужных фильтрах Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices. После ультрафильтрации фракции IgG нейтрализуют, объединяют и диализуют. Для выделения IgG3 фракцию общего IgG наносят на колонку HiTrap Protein A HP 1 ml, содержащую аффинный сорбент Protein A Sepharose High Performance. Несвязавшуюся фракцию, которая представляет собой очищенный IgG3, собирают и проводят элюцию связавшейся фракции, содержащей IgG1, IgG2 и IgG4. При проведении элюции полученные фракции нейтрализуют, объединяют и диализуют. Элюат с колонки HiTrap Protein A HP 1 ml используют для дальнейшего разделения подклассов IgG. Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG1 используют колонку с анти-IgG2-Sepharose 4В аффинным сорбентом. Несвязавшуюся фракцию собирают. Процедуру хроматографии повторяют 7-кратно. Полученные фракции объединяют. Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG2 используют колонку с анти-IgG1-Sepharose 4 В аффинным сорбентом. Несвязавшуюся фракцию собирают. Процедуру хроматографии повторяют 7-кратно. Полученные фракции объединяют. Для очистки иммуноглобулинов подклассов IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 используют колонку с анти-IgG4-Sepharose 4 В аффинным сорбентом. Несвязавшуюся фракцию собирают, полученные фракции объединяют. Для выделения специфических аутоантител к TNF фракции подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 наносят на колонку с сорбентом Affi Gel 15-TNF. При проведении элюции полученные фракции аутоантител нейтрализуют, объединяют и диализуют.

Принципиальным отличием разработанного способа является выделение фракций аутоантител к TNF подклассов, относящихся к отдельным подклассам IgG1, IgG2 и IgG3, что позволит оценить их индивидуальную биологическую активность. Другим принципиальным отличием является использование процедуры ультрафильтрации для очистки фракции IgG от примеси TNF, для которой не требуются специфические антитела к медиатору. Для удаления контаминирующего цитокина была проведена очистка фракции общего IgG от аутоантигенов с молекулярной массой менее 100 kDa [Watanabe М., Uchida К., Nakagaki К., Kanazawa Н., Trapnell B.C., Hoshino Y., Kagamu H., Yoshizawa H., Keicho N., Goto H., Nakata K. Anti-cytokine autoantibodies are ubiquitous in healthy individuals. // FEBS Lett. - 2007. - V. 581. - N. 10. - Р. 2017-21]. Таким образом, все аутоантигены, как и TNF, проходили через мембрану и оказывались в фильтрате, а сверху мембраны оставалась фракция чистого IgG, не содержащего примесей аутоантигенов. По результатам иммуноферментного анализа до проведения ультрафильтрации содержание примеси TNF во фракции общего IgG составляло до 80 пг/мл, в то время как после ультрафильтрации было показано отсутствие примеси TNF.

Предлагаемое изобретение позволяет выделить чистые фракции аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, очищенные от примеси самого TNF, в связи с чем полученные фракции могут быть использованы в различных биологических тестах, предполагающих использование аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3.

Техническим результатом изобретения является получение чистых фракций аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3.

Изобретение осуществляется следующим образом.

В качестве источника человеческого IgG используется фармацевтический препарат «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» (Микроген, Россия). Перенос иммуноглобулинов препарата в соответствующий буферный раствор, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, осуществляется с помощью колонки с Bio-Gel Р6 DG (Bio-Rad, США). Фракции с Bio-Gel Р6 DG наносятся на колонку с аффинным сорбентом Protein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, США). Хроматографические процедуры проводятся в соответствии с инструкцией производителя. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0,15 М NaCl (рН 2.5), буфер для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 20 mM PBS, содержащий 0.1% Triton Х-100 (рН 7.4). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют до физиологических значений рН 1М Tris-HCl (рН 9.0). Выделенные фракции IgG объединяют и диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4).

Для ультрафильтрации диализованные антитела IgG смешивают с буфером 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5) в соотношении 1:9, инкубируют в течение 30 минут и вносят в центрифужный фильтр Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices (Merck Millipore, Ирландия) для ультрафильтрации. Центрифугирование проводят при 6.000 G. Фракции IgG, не прошедшие через мембрану центрифужного фильтра, объединяют и диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4). Определение примеси TNF во фракции IgG до и после проведения ультрафильтрации проводили методом иммуноферментного анализа с использованием набора «альфа-ФНО - ИФА - Бест» (Вектор-Бест, Россия).

Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG3 фракцию IgG наносят на колонку HiTrap Protein A HP 1 ml (GE Life Sciences, Швеция), содержащую аффинный сорбент Protein A Sepharose High Performance. Хроматографические процедуры проводятся в соответствии с инструкцией производителя. Собирают несвязавшуюся фракцию, которая представляет собой очищенный IgG3, и после падения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшейся фракции, которая содержит IgG1, IgG2 и IgG4. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 0.1 М PBS (рН 7.5), буфер для элюции - 0.1 М цитратный буфер (рН 3.0). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют титрованием 1М Tris-HCl (рН 9.0) до физиологических значений рН. После сбора элюированной фракции с колонки удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Элюированную фракцию антител диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4).

Для выделения IgG1 и IgG2 используют подкласс-специфичные моноклональные антитела, очищенные из следующих клонов: 2С11 (анти-IgG1), 52G1 (анти-IgG2) и 5С7 (анти-IgG4) (Биалекса, Россия). Связывание антител с аффинным сорбентом CNBr-activated Sepharose 4 В (GE Life Sciences, Швеция) и хроматографические процедуры проводят согласно инструкции производителя. Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG1 элюированную фракцию после хроматографии на колонке HiTrap Protein A HP 1 ml наносят на колонку с приготовленным аффинным сорбентом анти-IgG2-Sepharose 4В. Собирают несвязавшуюся фракцию и после снижения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшихся иммуноглобулинов, после чего удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Собранную несвязавшуюся фракцию вновь наносят на колонку с анти-IgG2-Sepharose 4В аффинным сорбентом и повторяют еще шесть аналогичных циклов хроматографии. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 M Gly-HCl/0.15 M NaCl (рН 2.5), буферы для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 0.1 М Tris-HCl/0.5 М NaCl, (рН 8.5) и 0.1 М натрия ацетат/0.5 М NaCl (рН 4.5).

Для выделения иммуноглобулинов подкласса IgG2 элюированную фракцию после хроматографии на колонке HiTrap Protein A HP 1 ml наносят на колонку с приготовленным аффинным сорбентом анти-IgG1-Sepharose 4 В. Собирают несвязавшуюся фракцию и после снижения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшихся иммуноглобулинов, после чего удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Собранную несвязавшуюся фракцию вновь наносят на колонку с анти-IgG1-Sepharose 4В аффинным сорбентом и повторяют еще шесть аналогичных циклов хроматографии. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5), буферы для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 0.1 М Tris-HCl/0.5 М NaCl, (рН 8.5) и 0.1 М натрия ацетат/0.5 М NaCl (рН 4.5).

Для очистки иммуноглобулинов подклассов IgGl и IgG2 от примеси IgG4 несвязавшиеся фракции после хроматографии на колонках с анти-IgG2-Sepharose 4В и анти-IgG1-Sepharose 4В аффинными сорбентами, соответственно, наносят на колонку с анти-IgG4-Sepharose 4В аффинным сорбентом. Собирают несвязавшуюся фракцию и после снижения оптической плотности до нулевого значения проводят элюцию связавшихся иммуноглобулинов, после чего удаляют неспецифически связавшиеся компоненты и проводят регенерацию колонки согласно рекомендациям производителя. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5), буферы для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 0.1 М Tris-HCl/0.5 М NaCl, (рН 8.5) и 0.1 М натрия ацетат/0.5 М NaCl (рН 4.5).

Порядок использования аффинных колонок для выделения подклассов IgG показан в таблице 1.

Определение количества выделенных подклассов IgG и подтверждение отсутствия примеси других подклассов проведено методом иммуноферментного анализа с использованием набора «Подклассы IgG - ИФА - БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия). Из 3,3 мг IgG было получено 43 мкг IgG1, из 10,8 мг IgG - 3 мкг IgG2, из 10 мг IgG - 58 мкг IgG3.

Связывание TNF с аффинным сорбентом Affi-Gel 15 (Bio-Rad, США) проводят согласно инструкции производителя. Для выделения аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 фракции выделенных подклассов IgG наносят на колонку с приготовленным сорбентом Affi-Gel 15-TNF. После снижения оптической плотности до нулевого значения удаляют неспецифически связавшиеся компоненты, затем промывают колонку рабочим буферным раствором и проводят элюцию связавшихся антител. После сбора целевой фракции колонку снова промывают рабочим буферным раствором. Используются следующие буферы: рабочий буфер - 20 mM PBS (рН 7.4), буфер для элюции - 0.1 М Gly-HCl/0.15 М NaCl (рН 2.5), буфер для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 1М гуанидин-HCl (рН 7.4). При проведении элюции полученную фракцию нейтрализуют титрованием 1М Tris-HCl (рН 9.0) до физиологических значений рН. Выделенные фракции антител диализуют против 20 mM PBS (рН 7.4). Содержание подклассов IgG во фракции аутоантител к TNF оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием набора «Подклассы IgG - ИФА - БЕСТ». Содержание соответствующих подклассов во фракциях анти-TNF антител составило: IgG1 - 500 нг/мл, IgG2 - 100 нг/мл, IgG3 - 150 нг/мл.

Фракции аутоантител к иммунорегуляторному цитокину TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 выделены из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения. Отсутствие примеси TNF во фракциях аутоантител подтверждено методом иммуноферментного анализа.

Использование колонок с сорбентами Bio-Gel Р6 DG, Protein G Sepharose Fast Flow, Protein A Sepharose High Performance, анти-IgG2-Sepharose 4B, анти-IgGI-Sepharose 4B, анти-IgG4-Sepharose 4B, и Affi-Gel 15, связанного с TNF, и процедуры очистки с использованием ультрафильтрации является эффективным способом получения фракций аутоантител к иммунорегуляторному цитокину TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, что подтверждается тестами на чистоту фракций. Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ выделения аутоантител подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 к иммунорегуляторному цитокину TNF, который может быть использован для выделения антител этих подклассов к другим цитокинам.

Способ выделения подклассов иммуноглобулина G (IgG) аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли (TNF), заключающийся в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF, отличающийся тем, что выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein A Sepharose, причем после выделения IgG3 проводят элюцию смеси IgG1, IgG2, IgG4 цитратным буфером с pH 3.0, с последующей нейтрализацией, объединением и диализом; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG2 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG1 Sepharose с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией с использованием сорбента анти-IgG4 Sepharose, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с использованием сорбента Affi Gel 15-TNF с последующей нейтрализацией, объединением и диализом.



 

Похожие патенты:

Изобретение используется в патологической анатомии, эндокринологии, хирургии. Способ дифференциальной диагностики заболеваний щитовидной железы заключается в том, что проводят гистоэнзиматическое исследование фермента тиреопероксидазы (ТПО) в щитовидной железе и по активности ТПО диагностируют диффузный токсический зоб, многоузелковый токсический зоб, фолликулярную аденому в состоянии эутиреоза, аденокарциному.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано для количественного определения серебряной соли сульфадимидина для стандартизации и контроля качества лекарственных средств.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в гинекологических стационарах и амбулаторных условиях женских консультаций и поликлиник для прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ-ассоциированным цервицитом.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния здоровья человека. В периферической крови обследуемого с помощью метода проточной цитофлюорометрии определяют процентное содержание Th17-лимфоцитов, а именно процент лимфоцитов с фенотипом CD3+CD4+CD161+CD45R0+ от гейта CD3+CD4+лимфоцитов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к наркологическим и инфекционным болезням, и может быть использовано для диагностики абстинентного синдрома при опийной наркомании, сочетанной с ВИЧ-инфекцией.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования эндометриопатии, отличающийся тем, что в образце менструальной крови определяют концентрации интерлейкина-6 (ИЛ-6), глутатионпероксидазы-1 (ГТП 1) и растворимой формы Е-селектина и определяют коэффициент вероятности эндометриопатии (Р) по формуле: гдеа=0,0002782; b=0,0381529; с=-0,1205126; d=-1,1189533; e - экспонента (константа) = 2,7; X3 - значение концентрации ИЛ-6, пг/мл; Х2 - значение концентрации растворимой формулы Е селектина, нг/мл; X1 - значение концентрации ГТП 1, нг/мл; и при значении Рэ > 0,29 прогнозируют наличие эндометриопатии.
Изобретение относится к области медицины, педиатрии, инфекционным болезням и касается способа оценки эффективности терапии инфекции, вызванной вирусом герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6), у детей.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для оценки нейропротекторных свойств веществ in vitro. Для этого используют дифференцированные в нейрональном направлении индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека путем репрограммирования фибробластов кожи человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

Изобретение относится к биотехнологии. Конкретно, изобретение относится к предупреждению феномена усиления токсичности глазных инстилляций при совместном применении комбинации лекарственных препаратов.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для диагностики репродуктивного респираторного синдрома свиней. Для этого диагностику репродуктивного респираторного синдрома свиней проводят непрямым иммуногистохимическим анализом на основании моноклональных антител.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано в клинической практике для оценки вероятности развития у пациента вариантов клещевых инфекций: безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза или сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции Для этого определяют значения лабораторных показателей пациента в остром периоде заболевания (в сроки 10-14 дней от начала заболевания): доли CD4+, CD8+ лимфоцитов, абсолютное количество CD4+ лимфоцитов, уровни IgM, ИЛ-8, гамма-глобулинов, фагоцитарный индекс (ФИ), количество фагоцитирующих нейтрофилов (ФН), индекс Кердо; определяют значения лабораторных показателей пациента в периоде реконвалесценции (в сроки 21-25 дней от начала заболевания): долю CD3+ лимфоцитов, абсолютное количество CD8+ лимфоцитов, уровень IgM, индекс Кердо. В остром периоде заболевания оценивают значения лабораторных показателей пациента в баллах: долю CD4+ лимфоцитов при значениях ≤34,1% - 4 балла, долю CD8+ лимфоцитов при значениях ≤24,01% - 1 балл, абсолютное количество CD4+ лимфоцитов при значениях ≤678,07 мкл-1 - 3 балла, уровни IgM при значениях >7,66 г/л - 6 баллов, ИЛ-8 при значениях >97,4 пг/мл - 6 баллов, гамма-глобулинов при значениях ≤16,88% - 4 балла, показатели ФИ при значениях >35,6% - 1 балл, ФН при значениях >1892,68 мкл-1 - 1 балл, индекс Кердо при значениях ≤-7,14 - 4 балла; иные значения показателей оценивают как 0 баллов; подсчитывают сумму баллов; при сумме >11 баллов оценивают вероятность развития сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции равной 82,25±0,06%; при сумме ≤11 баллов оценивают вероятность развития безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза равной 84,81±0,05%. В периоде реконвалесценции оценивают значения лабораторных показателей пациента острого периода заболевания в баллах: долю CD4+ лимфоцитов при значениях ≤34,1% - 4 балла, долю CD8+ лимфоцитов при значениях ≤24,01% - 1 балл, абсолютное количество CD4+ лимфоцитов при значениях ≤678,07 мкл-1 - 3 балла, уровни IgM при значениях >7,66 г/л - 6 баллов, ИЛ-8 при значениях >97,4 пг/мл - 6 баллов, гамма-глобулинов при значениях ≤16,88% - 4 балла; ФИ при значениях >35,6% - 1 балл, ФН при значениях >1892,68 мкл-1 - 1 балл, индекс Кердо при значениях ≤-7,14 - 4 балла; оценивают значения лабораторных показателей пациента периода реконвалесценции в баллах: долю CD3+ лимфоцитов при значениях ≤74,11% - 2 балла, абсолютное количество CD8+ лимфоцитов при значениях ≤480,45 мкл-1 - -1 балл, уровень IgM при значениях >1,59 г/л - 3 балла, индекс Кердо при значениях ≤-11,15 - 2 балла; иные значения показателей оценивают как 0 баллов. Подсчитывают сумму баллов; при сумме >14 баллов оценивают вероятность развития сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции равной 88,53±0,05%; при сумме ≤14 баллов оценивают вероятность развития безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза равной 86,80±0,05%. Использование данного способа позволяет проводить дифференцированную диагностику безэритемной формы иксодового клещевого боррелиоза или сочетанного течения боррелиозно-энцефалитной инфекции. 6 табл., 2 ил.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для измерения активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта. При этом проводят совместную инкубацию образца, включающего лимфоциты от субъекта, по меньшей мере, с двумя наборами пептидов, полученных из белкового антигена. Первый набор, распознающийся CD8+ лимфоцитами, содержит один пептид длиной от 7 до 14 аминокислотных остатков. Второй набор, распознающийся CD4+ лимфоцитами, содержит один пептид длиной от 16 аминокислотных остатков или больше. При этом пептиды охватывают весь указанный белковый антиген или его часть. Измеряют присутствие или повышение уровня иммунной эффекторной молекулы из эффекторных Т-клеток. Присутствие или уровень иммунной эффекторной молекулы для Т-клеток является показателем уровня клеточно-опосредованной отвечаемости субъекта. Также предложены применение и способ определения статуса активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта. Группа изобретений позволяет измерить общий клеточно-опосредованный иммунный ответ от CD4+ и от CD8+ лимфоцитов, за счет повышения чувствительности и специфичности способа измерения. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 9 табл., 2 ил.,5 пр.

Изобретение относится к новым соединениям N,N'-диэтил-N,N'-ди(2-бром-4-R-фенил)амидам 2,2'-бипиридил-6,6'-дикарбоновой кислоты и 6,6'-диэтил-9,9'-диR-3,3'-дибензо[ƒ]-1,7-нафтиридин-5,5'(6H,6'H)-дионам формулы (1) и (2) соответственно: .Изобретение также относится к способу их получения. Технический результат – получены новые соединения, которые могут найти применение в качестве органических лигандов для комплексообразования с ионами f-элементов, что может быть использовано во времяразрешенном иммунофлуоресцентном и других видах флуоресцентного анализа. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 25 пр.

Группа изобретений относится к способу определения результата реакции агглютинации, а также к микропланшету и устройству, используемым при осуществлении указанного способа. Способ определения реакции агглютинации включает этап реакции пробы с реагентом в лунке микропланшета, этап центрифугирования микропланшета, причем на этапе центрифугирования агглютинированный материал пробы отделяют от неагглютинированного материала пробы посредством сепарирующего материала, этап получения по меньшей мере одного изображения верхней стороны микропланшета и по меньшей мере одного изображения нижней стороны микропланшета и этап определения, на котором определяют положительный или отрицательный статус пробы в отношении реакции агглютинации путем сравнения интенсивности цвета и/или уровня серого на изображениях верхней стороны и нижней стороны микропланшета. Также раскрыты микропланшет для определения продуктов реакций агглютинаций и тестирующая установка для определения реакции агглютинации. Группа изобретений обеспечивает высокую надежность и высокую производительность определения результатов реакции агглютинации. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил.

Группа изобретений относится к способу определения результата реакции агглютинации, а также к микропланшету и устройству, используемым при осуществлении указанного способа. Способ определения реакции агглютинации включает этап реакции пробы с реагентом в лунке микропланшета, этап центрифугирования микропланшета, причем на этапе центрифугирования агглютинированный материал пробы отделяют от неагглютинированного материала пробы посредством сепарирующего материала, этап получения по меньшей мере одного изображения верхней стороны микропланшета и по меньшей мере одного изображения нижней стороны микропланшета и этап определения, на котором определяют положительный или отрицательный статус пробы в отношении реакции агглютинации путем сравнения интенсивности цвета и/или уровня серого на изображениях верхней стороны и нижней стороны микропланшета. Также раскрыты микропланшет для определения продуктов реакций агглютинаций и тестирующая установка для определения реакции агглютинации. Группа изобретений обеспечивает высокую надежность и высокую производительность определения результатов реакции агглютинации. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и касается прогнозирования неблагоприятных перинатальных исходов при синдроме задержки внутриутробного роста плода у женщин с реактивацией хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности, осложненной ретроплацентарной гематомой. Предлагаемый способ отличается тем, что у беременных определяют титр антител IgM к ЦМВ и рост титров антител IgG к ЦМВ при авидности IgG к ЦМВ более 65% в баллах (1 балл - титры антител IgG к ЦМВ 1:200-1:200; 2 балла - титры антител IgG к ЦМВ 1:400-1:400; 3 балла - титры антител IgG к ЦМВ 1:200-1:800; 4 балла - титры антител IgG к ЦМВ 1:400-1:1600) (А), концентрацию суммарных антифосфолипидных антител (Ед/мл) (В), количество ретроплацентарных гематом в плаценте в баллах: (1 балл - 1 гематома; 2 балла - 2 гематомы; 3 балла - 3 и более гематомы) (С). Затем с помощью дискриминантного уравнения рассчитывают величину дискриминантной функции D: D=-2,454×А-1,217×В-3,404×С, где D - дискриминантная функция с граничным значением равным -21,55. При D, равной или больше граничного значения дискриминантной функции, прогнозируют отсутствие неблагоприятных перинатальных исходов, а при D, меньшей граничного значения дискриминантной функции, прогнозируют развитие неблагоприятных перинатальных исходов при синдроме задержки внутриутробного роста плода у женщин с реактивацией хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности, осложненной ретроплацентарной гематомой. Изобретение обеспечивает возможность обоснованного и своевременного проведения лечебных мероприятий, направленных на профилактику неблагоприятных перинатальных исходов при синдроме задержки внутриутробного роста плода у женщин с реактивацией хронической цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности, осложненной ретроплацентарной гематомой. Вероятность правильного прогноза составляет 88,5%. 2 пр.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа прогнозирования выхода из бессознательного состояния травматического или метаболического генеза у субъекта, включающего получение биологического образца от указанного субъекта; по меньшей мере однократный анализ указанного биологического образца для определения уровня антител к одному или нескольким фрагментам каинатных рецепторов GluR6 и/или GluR7; сравнение этого уровня с уровнем соответствующих антител в образцах, взятых у здоровых субъектов; при низком уровне антител в образце субъекта, находящегося в бессознательном состоянии, не превышающем контрольный уровень, зафиксированный в образцах здоровых субъектов, прогнозирование благоприятного выхода из бессознательного состояния; при повышенном уровне антител в образце субъекта, находящегося в бессознательном состоянии, превышающем контрольный уровень, зафиксированный в образцах здоровых субъектов, прогнозирование неблагоприятного исхода развития болезни. Группа изобретений также касается способа прогнозирования выхода из бессознательного состояния травматического или метаболического генеза у субъекта, включающего получение по крайней мере двух биологических образцов от указанного субъекта в интервале от 1 часа до 90 дней; анализ указанных биологических образов для определения уровня антител к одному или нескольким фрагментам каинатных рецепторов GluR6 и/или GluR7; сравнение уровней соответствующих антител, определенных в разных образцах одного субъекта, друг с другом и с уровнем соответствующих антител в образцах, взятых у здоровых субъектов. Группа изобретений обеспечивает прогнозирование как восстановления сознания субъекта при благоприятном исходе, так и вероятности перехода в хроническое вегетативное состояние или летального исхода. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использована для мониторинга состояния пациентов с эндогенными психозами, а также для оценки остроты психического состояния. Способ оценки психического состояния пациентов с эндогенными психическими расстройствами включает клиническое наблюдение и психометрическое обследование. Дополнительно осуществляют комплексную оценку состояния иммунной системы, при этом в качестве иммунологических показателей используют энзиматическую активность лейкоцитарной эластазы (ЛЭ), функциональную активность α1-протеиназного ингибитора (α1-ПИ) и уровень аутоантител к нейроантигенам - основному белку миелина (ОБМ) и белку S100B. Оценку психического состояния пациентов осуществляют путем сравнения степени отклонения определяемых иммунологических показателей сыворотки крови от аналогичных показателей образцов сыворотки крови здоровых лиц. Группа изобретений относится также к оценки состояния иммунной системы пациентов с эндогенными психическими расстройствами. Диапазон активности лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) -(201-250) нмоль/мин × мл характеризуют как слабое повышение, диапазон - (251-300) нмоль/мин × мл - умеренное повышение, а повышение активности (ЛЭ) более 300 нмоль/мин × мл - выраженное повышение при нормальной активности ЛЭ в сыворотке крови человека - (150-200) нмоль/мин × мл. Сниженная или нормальная активность α1-протеиназного ингибитора (α1-ПИ) при повышенной активности ЛЭ свидетельствует о недостаточности антипротеолитической активности сыворотки крови при нормальной активности α1-ПИ -(28 - 32) ИЕ/мл; а повышение уровня аутоантител (аАТ) к основному белку миелина (ОБМ) и белку S100B, при норме (0,6-0,9) ед. опт. пл. характеризует наличие аутоиммунного компонента патологического процесса в мозге. Использование данной группы изобретений позволяет проводить комплексную оценку психического состояния пациентов с эндогенными психическими расстройствами с учетом патологического процесса в головном мозге на определенном временном отрезке развития заболевания, отражая степень активности (остроты) психотического состояния. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 табл., 2 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и предназначено для качественного определения стоматологического статуса пациента с воспалением слизистой оболочки альвеолярного отростка челюсти. Для качественного определения стоматологического статуса пациента с воспалением слизистой оболочки альвеолярного отростка челюсти осуществляют исследование ротовой жидкости пациента. Забор ротовой жидкости у пациента производят до или не ранее чем через 30 мин после приема пищи пациентом. Ротовую жидкость центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, разбавляют физиологическим раствором в соотношении 1:100 и повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Готовый для исследования материал ротовой жидкости размещают в кювету и выполняют стандартный метод иммуноферментного анализа на плашке на основе моноклональных антител с количественным определением матриксной металлопротеиназы 8/matrix metalloproteinase 8 (ММП 8/ММР 8) и тканевого ингибитора металлопротеиназы 2/tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (ТИМП 2/TIMP 2). В группе клинического контроля уровень ММП 8/ММР 8 составляет 16,28-27,28 нг/мл, а ТИМП 2/TIMP 2 составляет 5,59-9,31 нг/мл. При содержании ММП 8/ММР 8 в количестве 167,2-276,8 нг/мл и ТИМП 2/TIMP 2 в количестве 21,9-39,8 нг/мл диагностируют гингивит слизистой оболочки альвеолярного отростка челюсти. При этом содержании ММП 8/ММР 8 в количестве 55,6-80,4 нг/мл и ТИМП 2/TIMP 2 в количестве 12,4-15,3 нг/мл диагностируют пародонтит слизистой оболочки альвеолярного отростка челюсти. По полученным результатам определения содержания указанных биомаркеров в ротовой жидкости пациента прогнозируют тактику лечения пациента. Использование изобретения позволяет значительно повысить точность определения стоматологического статуса пациента с воспалением слизистой оболочки альвеолярного отростка челюсти, значительно повысить чувствительность дифференциальной экспресс-диагностики с достижением высокой вероятности выявления процессов, определяющих стоматологического статуса пациента с воспалением слизистой оболочки альвеолярного отростка челюсти. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу экспресс-диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота (КРС). Способ экспресс-диагностики вируса нодулярного дерматита КРС включает отбор проб патологического материала из очага инфекционного заболевания от всех животных, находящихся в очаге инфекционного заболевания, и проведение экспресс-диагностики полученного патологического материала в течение суток методом ПЦР с флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени с применением термоциклера типа RotorGene для выявления животных-носителей вируса нодулярного дерматита на начальной стадии инфицирования, при этом учет результатов ПЦР проводят по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, если наблюдают рост специфического сигнала, то образец считают положительным - вирус нодулярного дерматита КРС присутствует, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы, если не наблюдают рост специфического сигнала, то образец считают отрицательным - вирус нодулярного дерматита крупного рогата скота отсутствует, и значения контрольных образцов также находятся в пределах нормы. 3 табл., 1 ил.

Изобретение относится к медицине и касается способа выделения подклассов иммуноглобулина G аутоантител к иммунорегуляторному цитокину фактору некроза опухоли, заключающегося в получении общей фракции IgG аффинной хроматографией с использованием сорбента Protein G Sepharose с последующей нейтрализацией, объединением и диализом IgG, очистке полученной фракции IgG от примеси TNF. При этом выделение подклассов IgG производят из фармацевтического препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, после получения фракции IgG осуществляют ее очистку от примеси TNF ультрафильтрацией с использованием центрифужных фильтров, затем проводят этап выделения антител IgG3 и получения смеси IgG1, IgG2, IgG4 аффинной хроматографией; затем выделяют антитела IgG1 многократной негативной аффинной хроматографией с последующим объединением и диализом, затем выделяют антитела IgG2 многократной негативной аффинной хроматографией с последующим объединением и диализом, затем проводят очистку антител IgG1 и IgG2 от примеси IgG4 негативной аффинной хроматографией, после чего проводят выделение специфических аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2, IgG3 аффинной хроматографией с последующей нейтрализацией, объединением и диализом. Изобретение обеспечивает получение чистых фракций аутоантител к TNF подклассов IgG1, IgG2 и IgG3. 1 пр., 1 табл.

Наверх