Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения



Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения
G01N1/28 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2647451:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Нижегородский научно-исследовательский институт гигиены и профпатологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ННИИГП" Роспотребнадзора) (RU)

Изобретение относится к способам количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье и получаемых на его основе продуктах питания, а именно к способу определения содержания витамина К1 в продуктах растительного происхождения, и может быть использовано в химической, фармацевтической и пищевой отраслях, медицине, в том числе гигиене питания. Способ определения содержания витамина К1 в продуктах растительного происхождения включает количественное извлечение из продуктов растительного происхождения витамина К1 (филлохинона) смесью пропанола-2 и гексана, отделение полученного экстракта, устранение влияния компонентов матрицы путем фильтрации экстракта через гидрофобную мембрану, упаривание экстракта в токе азота, перерастворение пробы в элюенте и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с математической обработкой хроматографических данных, что позволяет устанавливать абсолютную величину концентрации филлохинона в 100 г продукта растительного происхождения. Способ позволяет определять концентрацию витамина К1 как без концентрирования, так и с 60-кратным концентрированием при использовании минимального количества реактивов и минимальной комплектации аналитической системы, а также в любом продукте растительного происхождения. 2 ил., 8 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье и получаемых на его основе продуктах питания, а именно к способу определения содержания витамина К1 в продуктах растительного происхождения, и может быть использовано в химической, фармацевтической и пищевой отраслях, медицине, в том числе гигиене питания.

Уровень техники

В настоящее время существуют способы определения витаминов в различных объектах, в том числе продуктах и растительном сырье, позволяющие контролировать микро- и макроконцентрации биологически активных веществ и основанные в большинстве исследований на применении хроматографических методов.

В качестве аналогов способу определения содержания витамина К1 (филлохинона) в продуктах растительного происхождения исходя из предъявляемых требований, основанных на принципах экономичности, рациональности и эффективности достижения результата, могут рассматриваться:

- «Определение витамина К1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015). Стандарт устанавливает метод определения витамина К1 в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод применим к анализу молока, детских смесей и другой пищевой продукции. Определение витамина К1 проводится путем его отделения в растворе пробы методом ВЭЖХ, последующего восстановления витамина в послеколоночном реакторе и определения восстановленной формы флуориметрическим методом. Для этого к 1 г порошкообразной / 10 г жидкой пробы добавляют 15/5 мл воды с температурой 40°С и перемешивают; добавляют 5 мл фосфатного буфера с pH 7,9-8,0 и перемешивают; добавляют 1,0 г липазы и перемешивают; закрывают пробкой и встряхивают в течение 2-3 мин; далее смесь выдерживают при температуре (37±2)°С в течение 2 часов (встряхивая вручную через равные промежутки времени); смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10 мл смеси этанол : метанол и 1,0 г карбоната калия, перемешивают; добавляют 30 мл н-гексана и встряхивают; оставляют в темноте до разделения фаз либо центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин; аликвоту гексанового экстракта переносят в виалу, удаляют растворитель в токе азота и растворяют осадок в 1 мл метанола; 20 мкл полученного раствора инжектируют в хроматографическую систему, включающую колонку с неподвижной фазой С18, 5 мкм, 150×3,9 мм, колонку для дериватизации из нержавеющей стали 20×4 мм, заполненную цинковым порошком, и флуориметр. В качестве элюента используется смесь дихлорметан : метанол : хлорид-ацетат цинка (9,95:89,55:0,50 об. %).

Недостатками данного способа являются: использование широкого перечня реактивов, а также включение в аналитическую систему дополнительного элемента в виде послеколоночного реактора, ввиду того что идентификация и количественная оценка витамина К1 осуществляется путем измерения его восстановленной формы, все указанное приводит к увеличению времени анализа, затрат на реактивы и материалы.

- «Способ определения жирорастворимых витаминов A, D2, Е и β-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии» (RU 2530620 С1, 30.07.2013). Изобретение относится к способам стандартизации биологически активных добавок, премиксов, лекарственного растительного сырья, растительных масел, масляных экстрактов, изделий пищевой, химической и косметической отраслей промышленности по содержанию основных жирорастворимых витаминов А, D2, Е и β-каротина при совместном присутствии в одно- и многокомпонентных препаратах. Способ включает выделение жирорастворимых витаминов A, D2, Е и β-каротина из субстанции экстракцией 96% этиловым спиртом, отделение спиртового экстракта витаминов с помощью делительной воронки, последовательное хроматографирование с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полимерной подложке при участии двух элюентов с различной величиной пробега (время насыщения камеры парами элюента - 20 мин, время элюирования - 55 мин, элюент 1 - гексан : хлороформ (19:1), элюент 2 - гексан : хлороформ (3:1)), высушивание при температуре не менее 80°С пластин в термостате в течение 3-5 мин, обработку пластины проявителем (5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты).

Недостатками данного способа являются: методика предполагает определение ряда жирорастворимых витаминов в объектах со сложной матрицей путем проведения анализа методом фронтальной тонкослойной хроматографии с использованием силикагелевых пластинок, которые после проведения хроматографирования требуется высушивать в термостате при температуре не менее 80°С. Подобный подход не может быть применим к определению витамина К1, поскольку данное вещество исключает возможность какой-либо температурной обработки вследствие своей неустойчивости при воздействии высоких температур.

- «Крапивы двудомной листья» (ФС.2.5.0019-15, 01.01.2016). Нормативно-технический документ устанавливает требования к качеству лекарственного растительного сырья - листьев двудомной крапивы - и методам его контроля. Одним из основных биологически активных веществ, содержание которых требуется контролировать согласно данному документу, являются витамин К1. Концентрацию витамина К1 регламентируется оценивать следующим образом: около 1 г сырья, измельченного до величины частиц не более 0,25 мм, помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл гексана и перемешивают на механическом встряхивателе в течение 3 часов; полученную суспензию фильтруют через бумажный фильтр, отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45° до объема 2-3 мл (испытуемый раствор); на линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером 10×15 см наносят 100 мкл испытуемого раствора и 10 мкл стандартного раствора витамина К1; пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 5-10 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 30 мин верхним слоем смеси гексан-хлороформ, и хроматографируют восходящим способом; когда фронт растворителей пройдет около 80-90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей и просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм. На хроматограмме стандартного раствора витамина К1 должна обнаруживаться зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета, а испытуемого раствора - такая же зона на уровне зоны адсорбции витамина К1.

Недостатками этого способа являются: согласно указанию самих же авторов, витамин К1 в анализируемой пробе может иметь отличные от стандарта зоны адсорбции, что говорит о неоднозначности идентификации определяемого соединения; методика основана на методе тонкослойной хроматографии, аналитические возможности которого находятся в зависимости от трудноконтролируемых внешних условий, а также субъективного фактора при проведении количественного определения, что приводит к росту погрешности измерения.

Принципиальным отличием предлагаемого изобретения от аналогов является то, что разработан способ, позволяющий: идентифицировать, количественно извлекать витамин К1 из продуктов растительного происхождения, устранять влияние компонентов матрицы и определять содержание витамина К1 в широком диапазоне концентраций: от 1,6 до 6400 мкг/100 г, с пределом обнаружения 0,53 мкг/100 г при погрешности измерения не более 10%.

Наиболее близким по техническому решению поставленных задач из числа рассмотренных аналогов является «Определение витамина К1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015), который был принят в качестве прототипа. Отмеченные для прототипа недостатки учтены и отсутствуют в предлагаемом способе.

Раскрытие сущности изобретения

К началу XXI века в связи с переменами в характере деятельности человека питание различных групп населения подверглось значительным изменениям. Исследования, проводимые в регионах Российской Федерации, показали, что рацион жителей нашей страны характеризуется высоким потреблением простых углеводов и животных жиров. При этом уровень потребления полиненасыщенных жирных кислот, пищевых волокон, витаминов, микро- и макроэлементов (нутриенты) остается низким.

В связи с этим в рамках реализации Закона РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов», принятого 2 января 2000 г., и второго этапа «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации на период до 2005 г.» были разработаны Методические рекомендации «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ» [1]. Также в последние годы был проведен ряд мероприятий, направленных на улучшение в области питания населения: налажен выпуск продуктов питания, обогащенных биологически активными веществами, разработаны методики контроля за содержанием различных нутриентов в пищевой продукции, утверждены Методические рекомендации «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации» [2]. Несмотря на принятые меры питание многих жителей нашей страны остается нерациональным, что влечет возникновение заболеваний, связанных с дефицитом различных нутриентов.

Для сохранения и укрепления здоровья населения, профилактики заболеваний, обусловленных несбалансированным питанием, Правительством РФ были утверждены «Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 года». В связи с этим задача по разработке способов контроля качества продуктов питания остается по-прежнему актуальной и недостаточно решенной.

Одними из важнейших биологически активных веществ, необходимых организму человека, являются липофильные витамины группы К, участвующие в нормализации процессов свертывания крови путем обеспечения биосинтеза протромбина и факторов VII, IX и X. Кроме того, витамины группы К усиливают перистальтику и секрецию кишечника, снимают явления дискинезии кишечника, участвуют в процессах окислительного фосфорилирования [3, 4]. Дефицит данных нутриентов приводит к снижению карбоксилирования остеокальцина, основного структурного белка кости, что, в свою очередь, является причиной нарушения структуры костной ткани, повышения риска переломов костей [5]. В последнее время были открыты новые функции витаминов группы К, которые позволяют рассматривать данные нутриенты в качестве нейропротекторного препарата [6].

По химическому строению витамины данной группы представляют собой производные 2-метил-1,4-нафтохинона, которые в положении 3 имеют фитил, дигеранил, дифарнезил, фарнезилдигеранил, дифарнезилгеранил или соланезил в качестве заместителя [7].

Существуют две натуральные формы витаминов коагуляции. К одной из них относится группа менахинонов (витамин К2, 2-метил-1,4-нафтохинон с замещенным в положении 3 атомом водорода цепью из 2-13 пренильных групп), которые являются продуктами синтеза бактерий микрофлоры кишечника. Также источником витамина К2 служат продукты питания животного происхождения (мясо, молоко и др.), содержащие в небольших количествах менахинон-4, являющийся продуктом тканеспецифического преобразования филлохинона - другой формы витаминов группы К [8].

Филлохинон (витамин К1, 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон) принимает участие в процессах фотосинтеза и, следовательно, в больших количествах содержится в зеленых листовых овощах, фруктах, ягодах, корнеплодах и других продуктах питания растительного происхождения. Вследствие высокой концентрацией в растительной пище витамин К1 является основным пищевым источником нутриентов данной группы.

Следует заметить, что в связи с широкой распространенностью филлохина в продуктах питания у здоровых людей состояния К-гиповитаминоза или К-авитаминоза наблюдаются крайне редко. Однако К-витаминная недостаточность может возникнуть при обтурационной желтухе, фистулах желчного пузыря и других заболеваниях пищеварительной системы. Кроме того, развитию дефицита данного нутриента способствует прием антибиотиков, вызывающих угнетение образования витамина К бактериями кишечника, и антикоагулянтов - антагонистов витамина К. В связи с указанным крайне важен для поддержания здоровья контроль за содержанием данного нутриента в организме и своевременная корректировка рациона питания человека. Однако подобная корректировка невозможна без определения содержания витамина К в продуктах, употребляемых в пищу.

В настоящее время в сфере обеспечения рационального питания проводятся активные научные исследования, посвященные разработке способов определения витамина К1 в различных объектах: биологически активных добавках и премиксах, фармакопейном сырье, различных продуктах питания [9-12].

На сегодняшний день проведена большая работа, которая показывает, что анализ филлохинона в растительном сырье возможен различными способами. Одним из первых является способ определения витамина К1 с помощью фотоэлектроколориметра, основанный на предварительном разделении экстракта на прокаленной окиси алюминия [13]. Однако данный способ очень трудоемок и требует больших временных затрат, поэтому его применение для рутинного анализа нецелесообразно.

Исследователями из Томского государственного университета и Томского политехнического университета показана возможность газохроматографического определения витамина К1 в настоях листьев зеленого чая с предварительным сорбционным концентрированием [14]. Недостатком данного способа является невысокий предел обнаружения - 5 мкг/мл, что делает невозможным применение описанного способа для определения содержания витамина К1 в растительных продуктах с его низким содержанием.

Широкое распространение в последние годы получил способ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Он позволяет избежать разрушения нестабильного витамина К1 в ходе осуществления эксперимента посредствам проведения анализа при температурах, близких к комнатным, и исключения взаимодействия определяемого соединения с воздухом. Разнообразие технического оснащения систем жидкостной хроматографии позволяет осуществлять идентификацию и количественное определение филлохинона с использованием различных детекторов.

В зарубежной практике для решения данной задачи наиболее часто применяется способ жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, возможности которого позволяют определять следовые количества филлохинона [12, 15, 16]. К преимуществам этого способа стоит отнести большую селективность и высокую скорость анализа, однако масс-спектрометрический детектор является весьма дорогостоящим, что обусловливает необходимость использования иных способов детектирования.

Другим вариантом определения витамина К1 в продуктах питания является высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектированием. Исследования показали, что настоящий способ является чувствительным и подходит для анализа фармакопейного сырья [10, 17].

Еще один способ измерения массовой концентрации филлохинона в растительных объектах - это ВЭЖХ с флуориметрическим детектором [18], основанный на измерении флуоресцентного излучения света, поглощенного производным витамина К1. Для проведения данного способа хроматографическая система должна быть оснащена дополнительным устройством для послеколоночной дериватизации целевого компонента.

Следует отметить, что в нашей стране для контроля содержания витамина К1 в пищевой продукции был введен в действие межгосударственный стандарт, идентичный европейскому [19]. Он устанавливает метод анализа филлохинона в продуктах питания с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Данная методика прошла валидацию для молока и детского питания, однако сообщается, что некоторыми лабораториями показана возможность применения методики для других продуктов. Тем не менее, сохраняется необходимость разработки отечественного высокочувствительного, селективного, наименее затратного и технически доступного способа определения филлохинона в пищевой продукции.

Задачей настоящего изобретения является разработка и обоснование способа количественного определения витамина К1 в продуктах растительного происхождения, включающего извлечение витамина К1 из продуктов и устранение влияния компонентов матрицы путем выбора оптимальных условий анализа при минимальной комплектации аналитической системы.

Поставленная задача решается предлагаемым способом, в основу которого положена зависимость концентрации витамина К1 в анализируемом продукте в мкг/100 г от величины высоты аналитического пика в мВ, полученного методом ВЭЖХ.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка алгоритма анализа, позволяющего количественно извлекать витамин К1 из продуктов растительного происхождения, устранять влияние компонентов матрицы и определять содержание витамина К1 в широком диапазоне концентраций с возможностью снижения предела обнаружения.

Предлагаемый способ в сравнении с прототипом имеет более простую, наименее затратную и доступную техническую базу, меньшее количество реактивов, что позволяет сокращать время приготовления необходимых для проведения анализа растворов, то есть обеспечивает снижение времени и материальных затрат на проведение исследования; одинаково эффективен при определении витамина К1 в различных продуктах растительного происхождения, поскольку позволяет проводить концентрирование филлохинона, снижая тем самым предел определения и расширяя диапазон определяемых концентраций.

Достижение технического результата обеспечивается тем, что в способе условно выделяют и выполняют следующие этапы алгоритма анализа:

1) физическим методом проводят гомогенизацию образца продукта;

2) проводят процесс экстракции витамина К1 из анализируемой пробы;

3) проводят фильтрацию полученного экстракта;

4) витамин К1 перерастворяют в элюенте;

5) проводят хроматографирование раствора витамина К1 и математическую обработку хроматографических данных;

6) в случае слишком низкого сигнала проводят процедуру концентрирования витамина К1 в элюенте.

Настоящее изобретение принципиально отличается от аналогов и прототипа тем, что создан оригинальный способ прямого определения витамина К1, позволяющий устанавливать концентрацию данного витамина как без концентрирования, так и с 60-кратным концентрированием; при использовании минимального количества реактивов, минимальной комплектации системы ВЭЖХ и обеспечении высокой чувствительности и эффективности исследования.

Осуществление изобретения

Разработку предлагаемого способа осуществляли в процессе исследования высушенных листьев зеленого чая. Реализация способа и оценка результатов предусматривали проведение следующих мероприятий (исследований), которые рассмотрены на примере.

1. Обоснование выбора экстрагента

В связи с растворимостью витамина К1 в растворителях органической природы в качестве экстрагентов исследовались гексан, этанол, петролейный эфир, трихлорметан, 1,2-дихлорэтан, пропанол-2 и их смеси в соотношении 1:1. Изучение спектров поглощения полученных экстрактов показало, что только десять из них имеют максимумы, которыми характеризуется спектр поглощения филлохинона (рис. 1) [7].

Фиг. 1 - Спектры поглощения экстрактов витамина К1 из листьев зеленого чая органическими растворителями и их смесями в соотношении 1:1 №1 - гексан; №2 - этанол; №3 - пропанол-2; №4 - пропанол-2 : 1,2-дихлорэтан; №5 - пропанол-2 : гексан; №6 - трихлорметан : гексан; №7 - этанол : трихлорметан; №8 - этанол : пропанол-2; №9 - трихлорметан : петролейный эфир; №10 - петролейный эфир : пропанол-2

Хроматографический анализ данных экстрактов витамина К1, показал, что наибольший отклик аналитического сигнала наблюдается при использовании в качестве экстрагентов этанола, пропанола-2 и их смеси в соотношении 1:1, а наименьший отклик - при использовании гексана и смесей трихлорметана с гексаном и петролейным эфиром.

Решающим критерием выбора наиболее оптимальных для извлечения витамина К1 из растительного сырья экстрагентов стала полнота разделения анализируемой пробы: выбирались только те экстрагенты, при хроматографическом анализе экстрактов которых пики компонентов матрицы пробы не мешали определению анализируемого вещества. Таким образом, для дальнейшего исследования были отобраны этанол, пропанол-2 и смеси пропанола-2 с гексаном, 1,2-дихлорэтаном, петролейным эфиром в соотношении 1:1.

Для исключения ложноположительного результата идентификации витамина К1 проводили дополнительный анализ проб экстрактов с добавкой стандарта, стандартные растворы витамина К1 готовили в диапазоне концентраций 0,3-2,1 мкг/мл. Пик витамина К1 во всех пробах с добавкой стандарта при этом был приближен к Гауссовой кривой, не имел перегибов и пиков-наездников. Согласно полученным результатам (табл. 1) относительная погрешность определения витамина К1 составила 13% в случае экстракции смесью пропанол-2 : петролейный эфир и не превышала 4% при использовании других исследуемых экстрагентов. Таким образом, все изучаемые органические растворители и их смеси являются приемлемыми для извлечения витамина К1 из растительного сырья, однако в случае этанола и пропанола-2 наблюдается небольшой дрейф базовой линии, что может исказить результаты количественного анализа витамина К1 при его низких концентрациях.

Следующим этапом исследования стало определение объемного отношения компонентов экстрагентов, при котором извлечение целевого соединения из продуктов растительного происхождения максимально. Были изучены двухкомпонентные экстрагенты в соотношении органических растворителей 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 2:1; 3:1; 4:1; 5:1.

Оптимальным соотношением степени извлечения витамина К1 из растительного сырья и сходимости параллельных исследований при этом обладали смеси пропанола-2 с 1,2-дихлорэтаном и гексаном при составах 1:1 и 3:1 соответственно (табл. 2).

Дальнейшее изучение экстракционной способности экстрагентов указанного состава показало, что при использовании смеси пропанол-2: гексан наблюдается более высокая сходимость результатов - размах концентраций не превышает 1,9% (табл. 3). Кроме того, при использовании экстрагента состава пропанол-2 : гексан (3:1) наблюдается более полное извлечение витамина К1.

2. Обоснование выбора соотношения массы продукта к объему экстрагента

Было проведено изучение следующих соотношений массы продукта растительного происхождения к объему экстрагирующей смеси: 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10. Результаты свидетельствуют о том, что для получения оптимального извлечения витамина К1 достаточно использовать экстрагент объемом, в 4 раза превышающим массу продукта (табл. 4).

3. Обоснование кратности экстракции

С целью изучения степени извлечения витамина К1 из продукта проводили многократную его экстракцию экстрагентом выбранного состава и оценивали концентрацию витамина К1 в каждой последующей фракции. Результаты представлены в табл. 5.

Согласно полученным данным при проведении 4-кратной экстракции наблюдается 94%-ное извлечение витамина К1 из продукта, что является приемлемой величиной. Проведение 5-го процесса экстракции значительно увеличит временные затраты на пробоподготовку, не увеличив при этом качество анализа, то есть данной экстракцией можно пренебречь.

4. Обоснование выбора состава элюента

В ходе эксперимента было установлено, что трехкомпонентный элюент состава ацетонитрил : метанол : хлористый метилен в соотношении 50:40:10 разделяет анализируемую пробу экстракта, при этом время удерживания витамина К1 составляет 15-16 мин. Кроме того, метанол и ацетонитрил в элюотропном ряду расположены близко друг к другу. В связи с этим для оптимизации разделения было решено использовать двухкомпонентную подвижную фазу, содержащую большую объемную долю ацетонитрила и меньшую объемную долю менее полярных растворителей. Основными критериями оценки возможности использования конкретного элюента для поставленной задачи считались разрешение витамина К1 относительно ближайших компонентов матрицы экстракта и время разделения пробы.

Сначала исследовалась подвижная фаза ацетонитрил (AcN) : хлористый метилен (CH2Cl2) в следующих объемных соотношениях: 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 и 70:30 (табл. 6).

Из полученных результатов следует, что достаточное разрешение (R≥1) достигается при использовании смесей состава 90:10, 85:15 и 75:25. Следует отметить, что при использовании элюента состава ацетонитрил : хлористый метилен 90:10 для разделения одной пробы экстракта витамина К1 из продуктов растительного происхождения необходимо 96 мин. Это существенно увеличивает временные затраты.

Известно, что для симметричных пиков при разрешении, равном единице, перекрывается около 2% площадей двух пиков. Для подвижных фаз №3 и №5 разрешение близко к единице. Такая ситуация считается приемлемой для количественного определения, однако изменением состава элюента можно добиться лучшего разделения пиков, а значит, и более точного результата анализа.

На следующем этапе исследования было проведено хроматографическое разделение проб экстракта витамина К1 с применением подвижной фазы на основе ацетонитрила с добавлением 10, 15, 20 и 25 об. % хлороформа (CHCl3) (табл. 7).

Из представленных в таблице данных видно, что элюент состава ацетонитрил : хлороформ позволяет разделить компоненты пробы, т.е. исключить влияние матрицы на определение витамина К1, только при соотношении 85:15.

Анализ хроматографических данных, полученных при использовании элюентов состава №3, №5 и №8, показал, что добавка хлороформа к ацетонитрилу обеспечивает улучшение разрешающей способности элюента по сравнению со смесью ацетонитрил : хлористый метилен. В связи с этим наиболее оптимальным элюентом был принят элюент состава ацетонитрил : хлороформ в соотношении 85:15, который позволяет добиться наилучшего разрешения, то есть исключения наложения пиков компонентов матрицы на пик витамина К1, а значит улучшения качества анализа.

Последовательность проведения исследования

1. Перед проведением исследования готовят следующие растворы:

Элюент для хроматографии - ацетонитрил : трихлорметан (85:15 об. %). В колбу вместимостью 500 см3 помещают 425 см3 ацетонитрила и 75 см3 трихлорметана. Тщательно перемешивают раствор и дегазируют его с помощью блока автоматической дегазации и фильтрации растворителя.

Растворы витамина К1:

Раствор А - основной раствор с массовой концентрацией витамина К1 500 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят около 1/3 объема элюента и взвешивают, затем иглой вносят каплю (около 0,005 г) витамина К1 и снова взвешивают. Тщательно перемешивают до полного растворения витамина, доводят элюентом до метки и снова перемешивают.

Раствор Б - рабочий раствор с массовой концентрацией витамина К1 20 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 с помощью дозатора вносят 400 мм3 раствора А, доводят элюентом до метки и тщательно перемешивают.

Градуировочные растворы. В соответствии с таблицей 8 в мерные колбы вместимостью 10 см3 с помощью дозатора вносят определенный объем раствора Б, доводят элюентом до метки и тщательно перемешивают.

2. Перед выполнением измерений проводят подготовку хроматографической колонки: на хроматограф последовательно устанавливают картриджную защитную систему, аналитическую хроматографическую колонку, затем в систему подают подвижную фазу со скоростью 1 см3/мин до установления равновесия в колонке, которое определяется по стабильности нулевой линии детектора.

3. Градуировочную характеристику устанавливают путем измерения высот пиков витамина К1 в градуировочных растворах. Каждый из градуировочных растворов в количестве 0,1 см3 шприцем вводят в хроматографическую систему. С помощью петлевого дозатора отсекается 0,02 см3. Анализ введенного раствора проводят при следующих условиях:

Скорость потока подвижной фазы 1 см3/мин
Длина волны спектрофотометрического анализа 248 нм
Время удерживания витамина К1 14-15 мин

Для каждого градуировочного раствора проводят 5 параллельных измерений. По средним арифметическим значениям из пяти результатов измерения высот пиков в программе сбора и обработки хроматографических данных строится градуировочный график в координатах: «концентрация витамина К1пр), мкг/см3» - «высота пика витамина (Н), мВ» (фиг. 2).

Фиг. 2 - Градуировочная зависимость

4. Продукты при необходимости очищают от загрязнителей, отделяют несъедобную часть, измельчают, гомогенизируют с помощью лабораторной мельницы, измельченную пробу дополнительно протирают через сито с диаметром ячеек 0,1 мм.

5. Проводят экстракцию витамина К1 из исследуемых объектов. Во флакон из темного стекла вносят 1 г гомогенизированного продукта, добавляют 3 см3 пропанола-2 и 1 см3 гексана. Помещают флакон в ультразвуковую ванну, заполненную водой со льдом, и проводят экстракцию в течение 25 мин. Затем полученный экстракт аккуратно сливают в другой флакон из темного стекла. Процедуру экстракции проводят четыре раза.

После четвертой экстракции содержимое флакона вместе с гомогенизированным продуктом количественно переносят в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 3000 об/мин. Экстракт аккуратно сливают к полученным ранее вытяжкам витамина К1.

В инсулиновый шприц отбирают 1 см3 экстракта, устанавливают на шприц фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной и прокачивают отобранный экстракт через установленный фильтр. Шприц используют однократно.

Аликвоту отфильтрованного экстракта в количестве 0,5 см3 переносят в пробирку типа Эппендорф и упаривают в токе азота досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 элюента. Для каждой пробы выполняют два параллельных измерения.

В случае необогащенной пробы проводят концентрирование. Для этого отфильтровывают 6 см3 экстракта и после его осушения перерастворяют в 0,1 см3 элюента.

6. После выхода хроматографа на режим в хроматографическую систему вводят 0,1 см3 градуировочного раствора с концентрацией, лежащей в середине рабочего диапазона, и анализируют в условиях, указанных в п. 3. По окончании хроматографического анализа производят определение времени удерживания и высоты пика витамина К1. С целью корректировки градуировочной характеристики величину полученной высоты наносят на градуировочный график.

7. В хроматографическую систему вводят 0,1 см3 анализируемого раствора и проводят анализ при указанных ранее условиях. По окончании анализа производят ручную разметку и идентификацию обнаруженных пиков. Витамин К1 определяют по времени удерживания. Совпадение времени удерживания витамина К1 в пробе со временем удерживания витамина К1 в градуировочном растворе (с ошибкой не более 5%) свидетельствует о правильной идентификации.

8. С помощью программы сбора и обработки хроматографических данных осуществляют количественный расчет массовой концентрации витамина К1. При этом используют метод абсолютной градуировки. Концентрация витамина К1пр, мкг/см3) в пробе рассчитывается автоматически.

9. Вычисляется среднее арифметическое двух параллельных измерений Cпр1, Спр2, расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения:

Спр - массовая концентрация витамина К1 в экстракте, мкг/см3.

9.1. В обогащенном продукте массовую концентрацию витамина К1 рассчитывают по формуле:

С - концентрация витамина К1 в продукте, мкг/100 г;

Спр - массовая концентрация витамина К1 в экстракте, мкг/см3;

16 - объем экстракта, см3;

1 - масса продукта, г;

100 - переводной коэффициент.

9.2. В случае необогащенного продукта и проведения предварительного концентрирования пробы массовую концентрацию витамина К1 рассчитывают по формуле:

С - концентрация витамина К1 в продукте, мкг/100 г;

Спр - массовая концентрация витамина К1 в экстракте, мкг/см3;

60 - коэффициент, учитывающий 60-кратное концентрирование пробы;

16 - объем экстракта, см3;

1 - масса продукта, г;

100 - переводной коэффициент.

Пример №1. Определение витамина К1 без концентрирования на примере продукта растительного происхождения - листового черного чая

В случае предполагаемого высокого содержания витамина в растительном сырье проводится анализ филлохинона без концентрирования.

Предположим, что требуется определить содержание витамина К1 в листовом черном чае. Известно, что в чае витамин К1 содержится в больших количествах, следовательно, анализ можно проводить без концентрирования.

Перед проведением анализа листовой черный чай гомогенизируем с помощью лабораторной мельницы и дополнительно просеиваем через сито с диаметром ячеек 0,1 мм.

Во флакон из темного стекла вносим 1 г гомогенизированных листьев чая, добавляем 3 см3 пропанола-2 и 1 см3 гексана. Помещаем флакон в ультразвуковую ванну, заполненную водой со льдом, и проводим экстракцию в течение 25 мин. Затем полученный экстракт аккуратно сливаем в другой флакон из темного стекла и повторяем процедуру экстракции еще тир раза.

После последней экстракции содержимое флакона вместе с гомогенизированной пробой количественно переносим в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугируем 3 мин при 3000 об/мин. Экстракт аккуратно сливаем к полученным ранее вытяжкам витамина К1.

В инсулиновый шприц отбираем 1 см3 экстракта, устанавливаем на шприц фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной и прокачиваем отобранный экстракт через установленный фильтр.

Аликвоту отфильтрованного экстракта в количестве 0,5 см3 переносим в пробирку типа Эппендорф и упариваем в токе азота досуха. Сухой остаток растворяем в 0,5 см3 элюента. Выполняем два параллельных измерения.

В хроматографическую систему вводим 0,1 см3 анализируемого раствора и проводим анализ. Идентифицируем витамин К1 по времени удерживания стандартного раствора:

Туд (вит. К1 в стандартном растворе) = 14,310 мин;

Туд (вит. К1) = 14,435 мин.

Расхождение времен удерживания не превышает 0,9%, следовательно, витамин можно считать идентифицированным.

Количественный расчет массовой концентрации витамина К1 осуществляем с помощью программы сбора и обработки хроматографических данных. При этом используем метод абсолютной градуировки. Концентрация витамина К1пр, мкг/см3) в пробе рассчитывается автоматически и составляет:

Cпр1 = 0,595 мкг/мл;

Спр2 = 0,607 мкг/мл.

Расхождение между параллельными результатами составляет 2%. Вычисляем среднее арифметическое двух параллельных измерений: Сср = 0,601 мкг/мл. Рассчитываем массовую концентрацию витамина К1 в листовом черном чае по формуле:

С (вит. К1) = 1600⋅0,601 мкг/мл = 961,6 мкг/100 г.

Пример №2. Определение витамина К1 с концентрированием на примере продукта растительного происхождения - ягодах клюквы

В случае предполагаемого низкого содержания витамина в растительном сырье проводится анализ филлохинона с концентрированием.

Предположим, что требуется определить содержание витамина К1 в ягодах клюквы. Известно, что в ягодах клюквы витамин К1 содержится в низких количествах, следовательно, перед проведением анализа необходимо концентрирование пробы.

Тщательно моем ягоды клюквы, осушаем с помощью бумажного полотенца, гомогенизируем с использованием лабораторной мельницы и дополнительно протираем через сито с диаметром ячеек 0,1 мм.

Во флакон из темного стекла вносим 1 г гомогенизированной массы, добавляем 3 см3 пропанола-2 и 1 см3 гексана. Помещаем флакон в ультразвуковую ванну, заполненную водой со льдом, и проводим экстракцию в течение 25 мин. Затем полученный экстракт аккуратно сливаем в другой флакон из темного стекла и повторяем процедуру экстракции еще тир раза.

После последней экстракции содержимое флакона вместе с гомогенизированной пробой количественно переносим в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугируем 3 мин при 3000 об/мин. Экстракт аккуратно сливаем к полученным ранее вытяжкам витамина К1.

В шприц на 10 см3 отбираем 6 см3 экстракта, устанавливаем на шприц фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной и прокачиваем отобранный экстракт через установленный фильтр.

Отфильтрованный экстракт количественно переносим в пробирку типа Эппендорф путем поэтапного приливания и упаривая в токе азота досуха. Сухой остаток растворяем в 0,1 см3 элюента. Выполняем два параллельных измерения.

В хроматографическую систему вводим 0,1 см3 анализируемого раствора и проводим анализ. Идентифицируем витамин К1 по времени удерживания стандартного раствора:

Туд (вит. К1 в стандартном растворе) = 14,217 мин;

Туд (вит. К1) = 14,128 мин.

Расхождение времен удерживания не превышает 0,6%, следовательно, витамин можно считать идентифицированным.

Количественный расчет массовой концентрации витамина К1 осуществляем с помощью программы сбора и обработки хроматографических данных. При этом используем метод абсолютной градуировки. Концентрация витамина К1пр, мкг/см3) в пробе рассчитывается автоматически и составляет:

Спр1 = 0,064 мкг/мл;

Спр2 = 0,061 мкг/мл.

Расхождение между параллельными результатами составляет 4,8%. Вычисляем среднее арифметическое двух параллельных измерений: Сср = 0,0625 мкг/мл. Рассчитываем массовую концентрацию витамина К1 в ягодах клюквы по формуле:

С (вит. К1) = 26,67-0,0625 мкг/мл = 1,67 мкг/100 г.

Таким образом, материалы приведенных примеров демонстрируют возможность использования данного способа для количественного определения витамина К1 в любых продуктах растительного происхождения.

Источники информации

1. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации MP 2.3.1.1915-04 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2004. - 25 с.

2. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации MP 2.3.1.2432-08 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2008. - 25 с.

3. Бременер С.М. Витамины и их клиническое применение. - М.: Медицина, 1966. - 420 с.

4. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

5. Громова О.А., Торшин. И.Ю., Лиманова О.А. Многогранная роль макро- и микроэлементов в построении костной ткани // Гинекология, 2014. - №2. - С. 50-56.

6. Поварова О.В., Медведев О.С. Нейропротекторное действие витамина К // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2015. - Т. 78. - №10. - С. 40-44.

7. Березовский В.М. Химия витаминов. Изд. 2-е. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - 632 с.

8. Booth S.L. Vitamin K: food composition and dietary intakes // Food & Nutrition Research. 2012. - V. 56. - 5505 - DOI: 10,3402/fnr.v56i0.5505.

9. Биологически активные добавки и премиксы. Измерение массовой концентрации витаминов К1 (филлохинона) и D3 (холекальциферола). МУК № свидетельства об аттестации 18/143-01.00259-2013/2014

10. Лукша Е.А., Погодин И.С., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э., Величко Г.Н. Разработка методики количественного определения филлохинона (витамина К1) в растительных объектах // Современные проблемы науки и образования. 2014. - №3. http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=13736 (дата обращения: 20.05.2016).

11. Park J.-S., Ryu Е.-С, Park J.-W., Kim H.-S. Determination of Vitamin K1 in infant formula in Korean domestic market // Journal of preventive veterinary medicine. 2016. - V. 40 (3). - P. 90-95.

12. R.B., Jakobsen J. Analysis of vitamin K1 in fruits and vegetables using accelerated solvent extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization. 2016. - V. 192. - P. 402-408.

13. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Изд. 2-е, перераб. и доп. - Л.: Колос. Ленингр. отделение, 1972. - 456 с.

14. Гавриленко М.А., Слижов Ю.Г., Бурметьева М.С., Билялов А.А., Гавриленко Н.А. Концентрирование филлохинона на дипропилдитиокарбамате меди // Фундаментальные исследования. 2013. - №8. - С. 575-579.

15. Huang В., Wang Z., Yao J., Ke X., Xu J., Pan X.-D., Xu X., Lu M., Ren Y. Quantitative analysis of vitamin K1 in fruits and vegetables by isotope dilution LS-MS/MS // Analytical Methods. 2016. - №8. - P. 5707-5711.

16. Gentili A., Miccheli A., Tomai P., Baldassarre M.E., Curini R., Perez-Fernandez V. Liquid chromatography - tandem mass spectrometry method for the determination of Vitamin K homologues in human milk after overnight cold saponification. 2016. - V. 47. - P. 21-30.

17. Юнусходжаева H.A., Абдуллабекова B.H. Исследование химического состава травы Polygoni avicularis L. // Химия растительного сырья. 2012. - №4. - С. 187-191.

18. Indyk Н.Е., Woollard D.C. Vitamin K in milk and infant formulas: determination and distribution of Phylloquinone and menaquinone-4 // Analyst. 1997. - V. 122(5) - P. 465-469.

19. ГОСТ EN 14148-2015. Продукция пищевая. Определение витамина К1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Способ определении содержания витамина К1 в продуктах растительного происхождения, включающий следующие этапы алгоритма анализа: количественно извлекают витамин К1 путем 4-кратной обработки 1 г гомогенизированного продукта с размером частиц не более 0,1 мм смесью пропанол-2 : гексан (3:1) на ультразвуковой бане при охлаждении; объединяют полученные экстракты; устраняют влияние компонентов матрицы путем фильтрации 1 см3 экстракта при проведении анализа без концентрирования и 6 см3 экстракта в случае необогащенного продукта через фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной; упаривают 0,5 см3 экстракта при проведении анализа без концентрирования и 6 см3 экстракта в случае необогащенного продукта в токе азота; перерастворяют высушенный остаток в 0,5 см3 элюента состава ацетонитрил : трихлорметан (85:15 об. %) при проведении анализа без концентрирования и в 0,1 см3 элюента того же состава в случае необогащенного продукта; готовят серию градуировочных растворов витамина К1 путем растворения определенной массы чистого вещества в элюенте; устанавливают градуировочную зависимость путем измерения высот пиков витамина К1 в градуировочных растворах и построения градуировочного графика в координатах: «концентрация витамина К1пр), мкг/см3» - «высота пика витамина (Н), мВ»; инжектируют в хроматографическую систему 0,02 см3 исследуемого раствора пробы и анализируют его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием при длине волны 248 нм; идентифицируют витамин К1 по времени удерживания компонента и проводят количественную обработку методом абсолютной градуировки; выполняют математическую обработку хроматографических данных, позволяющую установить абсолютную величину витамина К1 в 100 г растительного сырья.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области электроэнергетики, системам оценки технического состояния трансформаторного оборудования электрических станций и подстанций, в частности к способам оценки состояния бумажной изоляции маслонаполненных электрических аппаратов, например силовых трансформаторов.

Изобретение относится к области медицины. Способ прогнозирования течения острого панкреатита включает забор венозной крови, получение сыворотки, затем сыворотку крови дважды экстрагируют этилацетатом, экстракты объединяют, упаривают досуха в токе инертного газа, а остаток растворяют в метаноле, полученный метанольный экстракт образца сыворотки крови подвергают хроматографическому анализу с одновременным спектральным анализом хроматографических пиков в ультрафиолетовой области на 8 длинах волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм, далее на полученной хроматограмме проводят разметку хроматографических пиков, определяют их спектральные отношения и объемы удерживания, после чего проверяют наличие в образце патологических пиков из таблицы 1, и при обнаружении 2 и более патологических пиков из таблицы 1 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания с возможностью развития некроза.

Изобретение относится к области медицины, а именно к патофизиологии, фармакологии и токсикологии, и касается определения 2,2,6,6-тетраметил-N-{1-[5-(4-метил-3-хлоранилино)-1,2,4-тиадиазол-3-ил]пропан-2-л}пиперидин-4-амина дигидрохлорида в различных биологических средах, в частности в плазме крови у больных в условиях различных неблагоприятных воздействий, включая побочное действие лекарственных средств.

Группа изобретений относится к формированию и анализу составной пробы текучей среды. Устройство содержит входное отверстие, выполненное с возможностью приема части текучей среды, протекающей по трубопроводу; клапан, подсоединенный к входному отверстию; насос, соединенный с клапаном; резервуар, соединенный с клапаном; и газовый хроматограф, соединенный с клапаном.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения метанола в воде методом газожидкостной хроматографии. Для этого проводят подготовку газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором к работе.

Изобретение относится к области геологии, включая поисковую геохимию на нефть и газ. При осуществлении способа в пределах первой половины мезокатагенеза анализируют органическое вещество, растворимое в органических растворителях (битумоид), полученное экстракцией полярным органическим растворителем (наиболее распространенные хлороформ, дихлорметан, смесь спирта и бензола).

Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа определения пуринов и пиримидинов в сыворотке крови человека. Сущность способа заключается в том, что проводят приготовление стандартного раствора биомаркеров метаболизма пуринов и пиримидинов.

Изобретение относится к газовой хроматографии и может быть использовано при подготовке пробы для парофазного анализа (ПФА) различного лекарственного сырья (ЛРС) в медицине, фармакологии, здравоохранении, пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии. Способ диагностики гнойного холангита (ГХ) у больных механической желтухой (МЖ) путем обследования больного заключается в том, что газохроматографическим методом определяют в крови уксусную, пропионовую, масляную и изовалериановую кислоту и при концентрации уксусной кислоты больше 0,33 ммоль/л устанавливают наличие холангита, а при концентрации любой из трех кислот: пропионовой больше 0,012 моль/л, масляной больше 0,0039 ммоль/л, изовалериановой больше 0,00034 ммоль/л - устанавливают наличие гнойного холангита с активным развитием анаэробной инфекции, требующего одного из вариантов предоперационной билиарной декомпрессии.

Изобретение относится к способу определения качества и подлинности лекарственного сырья зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.). Способ заключается в том, что приготавливают водно-спиртовой экстракт травы зверобоя (Hypericum perforatum L.), который анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии, в частности к гистологическим исследованиям, и предназначено для микроскопических исследований полутонких срезов органов и тканей, залитых в смесь эпона и аралдита.

Изобретение относится к области промысловой геологии и может быть использовано в процессе добычи углеводородов из подземных геологических формаций. В данном документе описан способ измерения вязкости неньютоновской жидкости для поточного измерения и управления процессом.

Изобретение относится к пробоотборным системам и предназначено для отбора проб с поверхности почвы и различных поверхностей производственных помещений. Устройство содержит корпус с тангенциальным заборным патрубком и эжекторной трубкой, циклон, выходной патрубок и отверстие для слива в корпусе.

Изобретение относится к технике измерения обводненности скважинной нефти, то есть оценки доли нефти и воды в добываемой пластовой жидкости. Техническим результатом является отсечение пробы в трубке.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, гинекологии, репродуктологии и иммунологии, и предназначено для прогнозирования результативности программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Изобретение относится к области медико-биологических исследований, а именно к способам заполнения ингаляционной камеры аэрозолем при исследовании ингаляционной токсичности веществ.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии. Предложен способ выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин.

Изобретение относится к области спортивной медицины и предназначено для определения наследственной предрасположенности человека к спортивной деятельности. Осуществляют забор биологического материала, выделение ДНК, генотипирование по локусам ACE, PPPARGC1A, PPARGC1B, PPARG2, PPARA, PPARD, VDR, CALCR, VEGFA, GNB3, NOS3, AGT 704, AGT 521, IL6.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования эндометриопатии, отличающийся тем, что в образце менструальной крови определяют концентрации интерлейкина-6 (ИЛ-6), глутатионпероксидазы-1 (ГТП 1) и растворимой формы Е-селектина и определяют коэффициент вероятности эндометриопатии (Р) по формуле: гдеа=0,0002782; b=0,0381529; с=-0,1205126; d=-1,1189533; e - экспонента (константа) = 2,7; X3 - значение концентрации ИЛ-6, пг/мл; Х2 - значение концентрации растворимой формулы Е селектина, нг/мл; X1 - значение концентрации ГТП 1, нг/мл; и при значении Рэ > 0,29 прогнозируют наличие эндометриопатии.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для анализа структур межклеточного вещества соединительной ткани в гистологических срезах шейки матки у животных.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для диагностики метастазов рака толстой кишки. Из тканевых проб толстой кишки выделяют тотальную ДНК. Осуществляют бисульфитную конверсию препаратов ДНК и последующую амплификацию и пиросеквенирование. Используют высокоспецифичные праймеры для регуляторных последовательностей гена CDH13. Вычисляют медиану метилирования Met (%) CpG-сайтов. В случае превышения Met установленной нормы по генетическому локусу CDH13 подтверждают наличие метастазов. Изобретение обеспечивает создание эффективного способа выявления метастазов у больных раком толстой кишки, не требующего дополнительных инвазивных процедур. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к способам количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье и получаемых на его основе продуктах питания, а именно к способу определения содержания витамина К1 в продуктах растительного происхождения, и может быть использовано в химической, фармацевтической и пищевой отраслях, медицине, в том числе гигиене питания. Способ определения содержания витамина К1 в продуктах растительного происхождения включает количественное извлечение из продуктов растительного происхождения витамина К1 смесью пропанола-2 и гексана, отделение полученного экстракта, устранение влияния компонентов матрицы путем фильтрации экстракта через гидрофобную мембрану, упаривание экстракта в токе азота, перерастворение пробы в элюенте и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с математической обработкой хроматографических данных, что позволяет устанавливать абсолютную величину концентрации филлохинона в 100 г продукта растительного происхождения. Способ позволяет определять концентрацию витамина К1 как без концентрирования, так и с 60-кратным концентрированием при использовании минимального количества реактивов и минимальной комплектации аналитической системы, а также в любом продукте растительного происхождения. 2 ил., 8 табл., 2 пр.

Наверх