Способ определения содержания витамина к1 в продуктах растительного происхождения

Изобретение относится к способам количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье и получаемых на его основе продуктах питания, а именно к способу определения содержания витамина К₁ в продуктах растительного происхождения, и может быть использовано в химической, фармацевтической и пищевой отраслях, медицине, в том числе гигиене питания. Способ определения содержания витамина К₁ в продуктах растительного происхождения включает количественное извлечение из продуктов растительного происхождения витамина К₁ (филлохинона) смесью пропанола-2 и гексана, отделение полученного экстракта, устранение влияния компонентов матрицы путем фильтрации экстракта через гидрофобную мембрану, упаривание экстракта в токе азота, перерастворение пробы в элюенте и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с математической обработкой хроматографических данных, что позволяет устанавливать абсолютную величину концентрации филлохинона в 100 г продукта растительного происхождения. Способ позволяет определять концентрацию витамина К₁ как без концентрирования, так и с 60-кратным концентрированием при использовании минимального количества реактивов и минимальной комплектации аналитической системы, а также в любом продукте растительного происхождения. 2 ил., 8 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам количественного определения биологически активных веществ в растительном сырье и получаемых на его основе продуктах питания, а именно к способу определения содержания витамина К₁ в продуктах растительного происхождения, и может быть использовано в химической, фармацевтической и пищевой отраслях, медицине, в том числе гигиене питания.

Уровень техники

В настоящее время существуют способы определения витаминов в различных объектах, в том числе продуктах и растительном сырье, позволяющие контролировать микро- и макроконцентрации биологически активных веществ и основанные в большинстве исследований на применении хроматографических методов.

В качестве аналогов способу определения содержания витамина К₁ (филлохинона) в продуктах растительного происхождения исходя из предъявляемых требований, основанных на принципах экономичности, рациональности и эффективности достижения результата, могут рассматриваться:

- «Определение витамина К₁ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015). Стандарт устанавливает метод определения витамина К₁ в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод применим к анализу молока, детских смесей и другой пищевой продукции. Определение витамина К₁ проводится путем его отделения в растворе пробы методом ВЭЖХ, последующего восстановления витамина в послеколоночном реакторе и определения восстановленной формы флуориметрическим методом. Для этого к 1 г порошкообразной / 10 г жидкой пробы добавляют 15/5 мл воды с температурой 40°С и перемешивают; добавляют 5 мл фосфатного буфера с pH 7,9-8,0 и перемешивают; добавляют 1,0 г липазы и перемешивают; закрывают пробкой и встряхивают в течение 2-3 мин; далее смесь выдерживают при температуре (37±2)°С в течение 2 часов (встряхивая вручную через равные промежутки времени); смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10 мл смеси этанол : метанол и 1,0 г карбоната калия, перемешивают; добавляют 30 мл н-гексана и встряхивают; оставляют в темноте до разделения фаз либо центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин; аликвоту гексанового экстракта переносят в виалу, удаляют растворитель в токе азота и растворяют осадок в 1 мл метанола; 20 мкл полученного раствора инжектируют в хроматографическую систему, включающую колонку с неподвижной фазой С18, 5 мкм, 150×3,9 мм, колонку для дериватизации из нержавеющей стали 20×4 мм, заполненную цинковым порошком, и флуориметр. В качестве элюента используется смесь дихлорметан : метанол : хлорид-ацетат цинка (9,95:89,55:0,50 об. %).

Недостатками данного способа являются: использование широкого перечня реактивов, а также включение в аналитическую систему дополнительного элемента в виде послеколоночного реактора, ввиду того что идентификация и количественная оценка витамина К₁ осуществляется путем измерения его восстановленной формы, все указанное приводит к увеличению времени анализа, затрат на реактивы и материалы.

- «Способ определения жирорастворимых витаминов A, D₂, Е и β-каротина при совместном присутствии методом тонкослойной хроматографии» (RU 2530620 С1, 30.07.2013). Изобретение относится к способам стандартизации биологически активных добавок, премиксов, лекарственного растительного сырья, растительных масел, масляных экстрактов, изделий пищевой, химической и косметической отраслей промышленности по содержанию основных жирорастворимых витаминов А, D₂, Е и β-каротина при совместном присутствии в одно- и многокомпонентных препаратах. Способ включает выделение жирорастворимых витаминов A, D₂, Е и β-каротина из субстанции экстракцией 96% этиловым спиртом, отделение спиртового экстракта витаминов с помощью делительной воронки, последовательное хроматографирование с использованием силикагелевых пластинок марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А на полимерной подложке при участии двух элюентов с различной величиной пробега (время насыщения камеры парами элюента - 20 мин, время элюирования - 55 мин, элюент 1 - гексан : хлороформ (19:1), элюент 2 - гексан : хлороформ (3:1)), высушивание при температуре не менее 80°С пластин в термостате в течение 3-5 мин, обработку пластины проявителем (5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты).

Недостатками данного способа являются: методика предполагает определение ряда жирорастворимых витаминов в объектах со сложной матрицей путем проведения анализа методом фронтальной тонкослойной хроматографии с использованием силикагелевых пластинок, которые после проведения хроматографирования требуется высушивать в термостате при температуре не менее 80°С. Подобный подход не может быть применим к определению витамина К₁, поскольку данное вещество исключает возможность какой-либо температурной обработки вследствие своей неустойчивости при воздействии высоких температур.

- «Крапивы двудомной листья» (ФС.2.5.0019-15, 01.01.2016). Нормативно-технический документ устанавливает требования к качеству лекарственного растительного сырья - листьев двудомной крапивы - и методам его контроля. Одним из основных биологически активных веществ, содержание которых требуется контролировать согласно данному документу, являются витамин К₁. Концентрацию витамина К₁ регламентируется оценивать следующим образом: около 1 г сырья, измельченного до величины частиц не более 0,25 мм, помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл гексана и перемешивают на механическом встряхивателе в течение 3 часов; полученную суспензию фильтруют через бумажный фильтр, отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45° до объема 2-3 мл (испытуемый раствор); на линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером 10×15 см наносят 100 мкл испытуемого раствора и 10 мкл стандартного раствора витамина К₁; пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 5-10 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение 30 мин верхним слоем смеси гексан-хлороформ, и хроматографируют восходящим способом; когда фронт растворителей пройдет около 80-90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей и просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм. На хроматограмме стандартного раствора витамина К₁ должна обнаруживаться зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета, а испытуемого раствора - такая же зона на уровне зоны адсорбции витамина К₁.

Недостатками этого способа являются: согласно указанию самих же авторов, витамин К₁ в анализируемой пробе может иметь отличные от стандарта зоны адсорбции, что говорит о неоднозначности идентификации определяемого соединения; методика основана на методе тонкослойной хроматографии, аналитические возможности которого находятся в зависимости от трудноконтролируемых внешних условий, а также субъективного фактора при проведении количественного определения, что приводит к росту погрешности измерения.

Принципиальным отличием предлагаемого изобретения от аналогов является то, что разработан способ, позволяющий: идентифицировать, количественно извлекать витамин К₁ из продуктов растительного происхождения, устранять влияние компонентов матрицы и определять содержание витамина К₁ в широком диапазоне концентраций: от 1,6 до 6400 мкг/100 г, с пределом обнаружения 0,53 мкг/100 г при погрешности измерения не более 10%.

Наиболее близким по техническому решению поставленных задач из числа рассмотренных аналогов является «Определение витамина К₁ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015), который был принят в качестве прототипа. Отмеченные для прототипа недостатки учтены и отсутствуют в предлагаемом способе.

Раскрытие сущности изобретения

К началу XXI века в связи с переменами в характере деятельности человека питание различных групп населения подверглось значительным изменениям. Исследования, проводимые в регионах Российской Федерации, показали, что рацион жителей нашей страны характеризуется высоким потреблением простых углеводов и животных жиров. При этом уровень потребления полиненасыщенных жирных кислот, пищевых волокон, витаминов, микро- и макроэлементов (нутриенты) остается низким.

В связи с этим в рамках реализации Закона РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов», принятого 2 января 2000 г., и второго этапа «Концепции государственной политики в области здорового питания населения Российской Федерации на период до 2005 г.» были разработаны Методические рекомендации «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ» [1]. Также в последние годы был проведен ряд мероприятий, направленных на улучшение в области питания населения: налажен выпуск продуктов питания, обогащенных биологически активными веществами, разработаны методики контроля за содержанием различных нутриентов в пищевой продукции, утверждены Методические рекомендации «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации» [2]. Несмотря на принятые меры питание многих жителей нашей страны остается нерациональным, что влечет возникновение заболеваний, связанных с дефицитом различных нутриентов.

Для сохранения и укрепления здоровья населения, профилактики заболеваний, обусловленных несбалансированным питанием, Правительством РФ были утверждены «Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 года». В связи с этим задача по разработке способов контроля качества продуктов питания остается по-прежнему актуальной и недостаточно решенной.

Одними из важнейших биологически активных веществ, необходимых организму человека, являются липофильные витамины группы К, участвующие в нормализации процессов свертывания крови путем обеспечения биосинтеза протромбина и факторов VII, IX и X. Кроме того, витамины группы К усиливают перистальтику и секрецию кишечника, снимают явления дискинезии кишечника, участвуют в процессах окислительного фосфорилирования [3, 4]. Дефицит данных нутриентов приводит к снижению карбоксилирования остеокальцина, основного структурного белка кости, что, в свою очередь, является причиной нарушения структуры костной ткани, повышения риска переломов костей [5]. В последнее время были открыты новые функции витаминов группы К, которые позволяют рассматривать данные нутриенты в качестве нейропротекторного препарата [6].

По химическому строению витамины данной группы представляют собой производные 2-метил-1,4-нафтохинона, которые в положении 3 имеют фитил, дигеранил, дифарнезил, фарнезилдигеранил, дифарнезилгеранил или соланезил в качестве заместителя [7].

Существуют две натуральные формы витаминов коагуляции. К одной из них относится группа менахинонов (витамин К₂, 2-метил-1,4-нафтохинон с замещенным в положении 3 атомом водорода цепью из 2-13 пренильных групп), которые являются продуктами синтеза бактерий микрофлоры кишечника. Также источником витамина К₂ служат продукты питания животного происхождения (мясо, молоко и др.), содержащие в небольших количествах менахинон-4, являющийся продуктом тканеспецифического преобразования филлохинона - другой формы витаминов группы К [8].

Филлохинон (витамин К₁, 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон) принимает участие в процессах фотосинтеза и, следовательно, в больших количествах содержится в зеленых листовых овощах, фруктах, ягодах, корнеплодах и других продуктах питания растительного происхождения. Вследствие высокой концентрацией в растительной пище витамин К₁ является основным пищевым источником нутриентов данной группы.

Следует заметить, что в связи с широкой распространенностью филлохина в продуктах питания у здоровых людей состояния К-гиповитаминоза или К-авитаминоза наблюдаются крайне редко. Однако К-витаминная недостаточность может возникнуть при обтурационной желтухе, фистулах желчного пузыря и других заболеваниях пищеварительной системы. Кроме того, развитию дефицита данного нутриента способствует прием антибиотиков, вызывающих угнетение образования витамина К бактериями кишечника, и антикоагулянтов - антагонистов витамина К. В связи с указанным крайне важен для поддержания здоровья контроль за содержанием данного нутриента в организме и своевременная корректировка рациона питания человека. Однако подобная корректировка невозможна без определения содержания витамина К в продуктах, употребляемых в пищу.

В настоящее время в сфере обеспечения рационального питания проводятся активные научные исследования, посвященные разработке способов определения витамина К₁ в различных объектах: биологически активных добавках и премиксах, фармакопейном сырье, различных продуктах питания [9-12].

На сегодняшний день проведена большая работа, которая показывает, что анализ филлохинона в растительном сырье возможен различными способами. Одним из первых является способ определения витамина К₁ с помощью фотоэлектроколориметра, основанный на предварительном разделении экстракта на прокаленной окиси алюминия [13]. Однако данный способ очень трудоемок и требует больших временных затрат, поэтому его применение для рутинного анализа нецелесообразно.

Исследователями из Томского государственного университета и Томского политехнического университета показана возможность газохроматографического определения витамина К₁ в настоях листьев зеленого чая с предварительным сорбционным концентрированием [14]. Недостатком данного способа является невысокий предел обнаружения - 5 мкг/мл, что делает невозможным применение описанного способа для определения содержания витамина К₁ в растительных продуктах с его низким содержанием.

Широкое распространение в последние годы получил способ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Он позволяет избежать разрушения нестабильного витамина К₁ в ходе осуществления эксперимента посредствам проведения анализа при температурах, близких к комнатным, и исключения взаимодействия определяемого соединения с воздухом. Разнообразие технического оснащения систем жидкостной хроматографии позволяет осуществлять идентификацию и количественное определение филлохинона с использованием различных детекторов.

В зарубежной практике для решения данной задачи наиболее часто применяется способ жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, возможности которого позволяют определять следовые количества филлохинона [12, 15, 16]. К преимуществам этого способа стоит отнести большую селективность и высокую скорость анализа, однако масс-спектрометрический детектор является весьма дорогостоящим, что обусловливает необходимость использования иных способов детектирования.

Другим вариантом определения витамина К₁ в продуктах питания является высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектированием. Исследования показали, что настоящий способ является чувствительным и подходит для анализа фармакопейного сырья [10, 17].

Еще один способ измерения массовой концентрации филлохинона в растительных объектах - это ВЭЖХ с флуориметрическим детектором [18], основанный на измерении флуоресцентного излучения света, поглощенного производным витамина К₁. Для проведения данного способа хроматографическая система должна быть оснащена дополнительным устройством для послеколоночной дериватизации целевого компонента.

Следует отметить, что в нашей стране для контроля содержания витамина К₁ в пищевой продукции был введен в действие межгосударственный стандарт, идентичный европейскому [19]. Он устанавливает метод анализа филлохинона в продуктах питания с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Данная методика прошла валидацию для молока и детского питания, однако сообщается, что некоторыми лабораториями показана возможность применения методики для других продуктов. Тем не менее, сохраняется необходимость разработки отечественного высокочувствительного, селективного, наименее затратного и технически доступного способа определения филлохинона в пищевой продукции.

Задачей настоящего изобретения является разработка и обоснование способа количественного определения витамина К₁ в продуктах растительного происхождения, включающего извлечение витамина К₁ из продуктов и устранение влияния компонентов матрицы путем выбора оптимальных условий анализа при минимальной комплектации аналитической системы.

Поставленная задача решается предлагаемым способом, в основу которого положена зависимость концентрации витамина К₁ в анализируемом продукте в мкг/100 г от величины высоты аналитического пика в мВ, полученного методом ВЭЖХ.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка алгоритма анализа, позволяющего количественно извлекать витамин К₁ из продуктов растительного происхождения, устранять влияние компонентов матрицы и определять содержание витамина К₁ в широком диапазоне концентраций с возможностью снижения предела обнаружения.

Предлагаемый способ в сравнении с прототипом имеет более простую, наименее затратную и доступную техническую базу, меньшее количество реактивов, что позволяет сокращать время приготовления необходимых для проведения анализа растворов, то есть обеспечивает снижение времени и материальных затрат на проведение исследования; одинаково эффективен при определении витамина К₁ в различных продуктах растительного происхождения, поскольку позволяет проводить концентрирование филлохинона, снижая тем самым предел определения и расширяя диапазон определяемых концентраций.

Достижение технического результата обеспечивается тем, что в способе условно выделяют и выполняют следующие этапы алгоритма анализа:

1) физическим методом проводят гомогенизацию образца продукта;

2) проводят процесс экстракции витамина К₁ из анализируемой пробы;

3) проводят фильтрацию полученного экстракта;

4) витамин К₁ перерастворяют в элюенте;

5) проводят хроматографирование раствора витамина К₁ и математическую обработку хроматографических данных;

6) в случае слишком низкого сигнала проводят процедуру концентрирования витамина К₁ в элюенте.

Настоящее изобретение принципиально отличается от аналогов и прототипа тем, что создан оригинальный способ прямого определения витамина К₁, позволяющий устанавливать концентрацию данного витамина как без концентрирования, так и с 60-кратным концентрированием; при использовании минимального количества реактивов, минимальной комплектации системы ВЭЖХ и обеспечении высокой чувствительности и эффективности исследования.

Осуществление изобретения

Разработку предлагаемого способа осуществляли в процессе исследования высушенных листьев зеленого чая. Реализация способа и оценка результатов предусматривали проведение следующих мероприятий (исследований), которые рассмотрены на примере.

1. Обоснование выбора экстрагента

В связи с растворимостью витамина К₁ в растворителях органической природы в качестве экстрагентов исследовались гексан, этанол, петролейный эфир, трихлорметан, 1,2-дихлорэтан, пропанол-2 и их смеси в соотношении 1:1. Изучение спектров поглощения полученных экстрактов показало, что только десять из них имеют максимумы, которыми характеризуется спектр поглощения филлохинона (рис. 1) [7].

Фиг. 1 - Спектры поглощения экстрактов витамина К₁ из листьев зеленого чая органическими растворителями и их смесями в соотношении 1:1 №1 - гексан; №2 - этанол; №3 - пропанол-2; №4 - пропанол-2 : 1,2-дихлорэтан; №5 - пропанол-2 : гексан; №6 - трихлорметан : гексан; №7 - этанол : трихлорметан; №8 - этанол : пропанол-2; №9 - трихлорметан : петролейный эфир; №10 - петролейный эфир : пропанол-2

Хроматографический анализ данных экстрактов витамина К₁, показал, что наибольший отклик аналитического сигнала наблюдается при использовании в качестве экстрагентов этанола, пропанола-2 и их смеси в соотношении 1:1, а наименьший отклик - при использовании гексана и смесей трихлорметана с гексаном и петролейным эфиром.

Решающим критерием выбора наиболее оптимальных для извлечения витамина К₁ из растительного сырья экстрагентов стала полнота разделения анализируемой пробы: выбирались только те экстрагенты, при хроматографическом анализе экстрактов которых пики компонентов матрицы пробы не мешали определению анализируемого вещества. Таким образом, для дальнейшего исследования были отобраны этанол, пропанол-2 и смеси пропанола-2 с гексаном, 1,2-дихлорэтаном, петролейным эфиром в соотношении 1:1.

Для исключения ложноположительного результата идентификации витамина К₁ проводили дополнительный анализ проб экстрактов с добавкой стандарта, стандартные растворы витамина К₁ готовили в диапазоне концентраций 0,3-2,1 мкг/мл. Пик витамина К₁ во всех пробах с добавкой стандарта при этом был приближен к Гауссовой кривой, не имел перегибов и пиков-наездников. Согласно полученным результатам (табл. 1) относительная погрешность определения витамина К₁ составила 13% в случае экстракции смесью пропанол-2 : петролейный эфир и не превышала 4% при использовании других исследуемых экстрагентов. Таким образом, все изучаемые органические растворители и их смеси являются приемлемыми для извлечения витамина К₁ из растительного сырья, однако в случае этанола и пропанола-2 наблюдается небольшой дрейф базовой линии, что может исказить результаты количественного анализа витамина К₁ при его низких концентрациях.

Следующим этапом исследования стало определение объемного отношения компонентов экстрагентов, при котором извлечение целевого соединения из продуктов растительного происхождения максимально. Были изучены двухкомпонентные экстрагенты в соотношении органических растворителей 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 2:1; 3:1; 4:1; 5:1.

Оптимальным соотношением степени извлечения витамина К₁ из растительного сырья и сходимости параллельных исследований при этом обладали смеси пропанола-2 с 1,2-дихлорэтаном и гексаном при составах 1:1 и 3:1 соответственно (табл. 2).

Дальнейшее изучение экстракционной способности экстрагентов указанного состава показало, что при использовании смеси пропанол-2: гексан наблюдается более высокая сходимость результатов - размах концентраций не превышает 1,9% (табл. 3). Кроме того, при использовании экстрагента состава пропанол-2 : гексан (3:1) наблюдается более полное извлечение витамина К₁.

2. Обоснование выбора соотношения массы продукта к объему экстрагента

Было проведено изучение следующих соотношений массы продукта растительного происхождения к объему экстрагирующей смеси: 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10. Результаты свидетельствуют о том, что для получения оптимального извлечения витамина К₁ достаточно использовать экстрагент объемом, в 4 раза превышающим массу продукта (табл. 4).

3. Обоснование кратности экстракции

С целью изучения степени извлечения витамина К₁ из продукта проводили многократную его экстракцию экстрагентом выбранного состава и оценивали концентрацию витамина К₁ в каждой последующей фракции. Результаты представлены в табл. 5.

Согласно полученным данным при проведении 4-кратной экстракции наблюдается 94%-ное извлечение витамина К₁ из продукта, что является приемлемой величиной. Проведение 5-го процесса экстракции значительно увеличит временные затраты на пробоподготовку, не увеличив при этом качество анализа, то есть данной экстракцией можно пренебречь.

4. Обоснование выбора состава элюента

В ходе эксперимента было установлено, что трехкомпонентный элюент состава ацетонитрил : метанол : хлористый метилен в соотношении 50:40:10 разделяет анализируемую пробу экстракта, при этом время удерживания витамина К₁ составляет 15-16 мин. Кроме того, метанол и ацетонитрил в элюотропном ряду расположены близко друг к другу. В связи с этим для оптимизации разделения было решено использовать двухкомпонентную подвижную фазу, содержащую большую объемную долю ацетонитрила и меньшую объемную долю менее полярных растворителей. Основными критериями оценки возможности использования конкретного элюента для поставленной задачи считались разрешение витамина К₁ относительно ближайших компонентов матрицы экстракта и время разделения пробы.

Сначала исследовалась подвижная фаза ацетонитрил (AcN) : хлористый метилен (CH₂Cl₂) в следующих объемных соотношениях: 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 и 70:30 (табл. 6).

Из полученных результатов следует, что достаточное разрешение (R≥1) достигается при использовании смесей состава 90:10, 85:15 и 75:25. Следует отметить, что при использовании элюента состава ацетонитрил : хлористый метилен 90:10 для разделения одной пробы экстракта витамина К₁ из продуктов растительного происхождения необходимо 96 мин. Это существенно увеличивает временные затраты.

Известно, что для симметричных пиков при разрешении, равном единице, перекрывается около 2% площадей двух пиков. Для подвижных фаз №3 и №5 разрешение близко к единице. Такая ситуация считается приемлемой для количественного определения, однако изменением состава элюента можно добиться лучшего разделения пиков, а значит, и более точного результата анализа.

На следующем этапе исследования было проведено хроматографическое разделение проб экстракта витамина К₁ с применением подвижной фазы на основе ацетонитрила с добавлением 10, 15, 20 и 25 об. % хлороформа (CHCl₃) (табл. 7).

Из представленных в таблице данных видно, что элюент состава ацетонитрил : хлороформ позволяет разделить компоненты пробы, т.е. исключить влияние матрицы на определение витамина К₁, только при соотношении 85:15.

Анализ хроматографических данных, полученных при использовании элюентов состава №3, №5 и №8, показал, что добавка хлороформа к ацетонитрилу обеспечивает улучшение разрешающей способности элюента по сравнению со смесью ацетонитрил : хлористый метилен. В связи с этим наиболее оптимальным элюентом был принят элюент состава ацетонитрил : хлороформ в соотношении 85:15, который позволяет добиться наилучшего разрешения, то есть исключения наложения пиков компонентов матрицы на пик витамина К₁, а значит улучшения качества анализа.

Последовательность проведения исследования

1. Перед проведением исследования готовят следующие растворы:

Элюент для хроматографии - ацетонитрил : трихлорметан (85:15 об. %). В колбу вместимостью 500 см³ помещают 425 см³ ацетонитрила и 75 см³ трихлорметана. Тщательно перемешивают раствор и дегазируют его с помощью блока автоматической дегазации и фильтрации растворителя.

Растворы витамина К₁:

Раствор А - основной раствор с массовой концентрацией витамина К₁ 500 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ вносят около 1/3 объема элюента и взвешивают, затем иглой вносят каплю (около 0,005 г) витамина К₁ и снова взвешивают. Тщательно перемешивают до полного растворения витамина, доводят элюентом до метки и снова перемешивают.

Раствор Б - рабочий раствор с массовой концентрацией витамина К₁ 20 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 10 см³ с помощью дозатора вносят 400 мм³ раствора А, доводят элюентом до метки и тщательно перемешивают.

Градуировочные растворы. В соответствии с таблицей 8 в мерные колбы вместимостью 10 см³ с помощью дозатора вносят определенный объем раствора Б, доводят элюентом до метки и тщательно перемешивают.

2. Перед выполнением измерений проводят подготовку хроматографической колонки: на хроматограф последовательно устанавливают картриджную защитную систему, аналитическую хроматографическую колонку, затем в систему подают подвижную фазу со скоростью 1 см³/мин до установления равновесия в колонке, которое определяется по стабильности нулевой линии детектора.

3. Градуировочную характеристику устанавливают путем измерения высот пиков витамина К₁ в градуировочных растворах. Каждый из градуировочных растворов в количестве 0,1 см³ шприцем вводят в хроматографическую систему. С помощью петлевого дозатора отсекается 0,02 см³. Анализ введенного раствора проводят при следующих условиях:

Скорость потока подвижной фазы	1 см3/мин
Длина волны спектрофотометрического анализа	248 нм
Время удерживания витамина К1	14-15 мин

Для каждого градуировочного раствора проводят 5 параллельных измерений. По средним арифметическим значениям из пяти результатов измерения высот пиков в программе сбора и обработки хроматографических данных строится градуировочный график в координатах: «концентрация витамина К₁ (С_пр), мкг/см³» - «высота пика витамина (Н), мВ» (фиг. 2).

Фиг. 2 - Градуировочная зависимость

4. Продукты при необходимости очищают от загрязнителей, отделяют несъедобную часть, измельчают, гомогенизируют с помощью лабораторной мельницы, измельченную пробу дополнительно протирают через сито с диаметром ячеек 0,1 мм.

5. Проводят экстракцию витамина К₁ из исследуемых объектов. Во флакон из темного стекла вносят 1 г гомогенизированного продукта, добавляют 3 см³ пропанола-2 и 1 см³ гексана. Помещают флакон в ультразвуковую ванну, заполненную водой со льдом, и проводят экстракцию в течение 25 мин. Затем полученный экстракт аккуратно сливают в другой флакон из темного стекла. Процедуру экстракции проводят четыре раза.

После четвертой экстракции содержимое флакона вместе с гомогенизированным продуктом количественно переносят в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугируют 3 мин при 3000 об/мин. Экстракт аккуратно сливают к полученным ранее вытяжкам витамина К₁.

В инсулиновый шприц отбирают 1 см³ экстракта, устанавливают на шприц фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной и прокачивают отобранный экстракт через установленный фильтр. Шприц используют однократно.

Аликвоту отфильтрованного экстракта в количестве 0,5 см³ переносят в пробирку типа Эппендорф и упаривают в токе азота досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 см³ элюента. Для каждой пробы выполняют два параллельных измерения.

В случае необогащенной пробы проводят концентрирование. Для этого отфильтровывают 6 см³ экстракта и после его осушения перерастворяют в 0,1 см³ элюента.

6. После выхода хроматографа на режим в хроматографическую систему вводят 0,1 см³ градуировочного раствора с концентрацией, лежащей в середине рабочего диапазона, и анализируют в условиях, указанных в п. 3. По окончании хроматографического анализа производят определение времени удерживания и высоты пика витамина К₁. С целью корректировки градуировочной характеристики величину полученной высоты наносят на градуировочный график.

7. В хроматографическую систему вводят 0,1 см³ анализируемого раствора и проводят анализ при указанных ранее условиях. По окончании анализа производят ручную разметку и идентификацию обнаруженных пиков. Витамин К₁ определяют по времени удерживания. Совпадение времени удерживания витамина К₁ в пробе со временем удерживания витамина К₁ в градуировочном растворе (с ошибкой не более 5%) свидетельствует о правильной идентификации.

8. С помощью программы сбора и обработки хроматографических данных осуществляют количественный расчет массовой концентрации витамина К₁. При этом используют метод абсолютной градуировки. Концентрация витамина К₁ (С_пр, мкг/см³) в пробе рассчитывается автоматически.

9. Вычисляется среднее арифметическое двух параллельных измерений C_пр1, С_пр2, расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения:

С_пр - массовая концентрация витамина К₁ в экстракте, мкг/см³.

9.1. В обогащенном продукте массовую концентрацию витамина К₁ рассчитывают по формуле:

С - концентрация витамина К₁ в продукте, мкг/100 г;

С_пр - массовая концентрация витамина К₁ в экстракте, мкг/см³;

16 - объем экстракта, см³;

1 - масса продукта, г;

100 - переводной коэффициент.

9.2. В случае необогащенного продукта и проведения предварительного концентрирования пробы массовую концентрацию витамина К₁ рассчитывают по формуле:

С - концентрация витамина К₁ в продукте, мкг/100 г;

С_пр - массовая концентрация витамина К₁ в экстракте, мкг/см³;

60 - коэффициент, учитывающий 60-кратное концентрирование пробы;

16 - объем экстракта, см³;

1 - масса продукта, г;

100 - переводной коэффициент.

Пример №1. Определение витамина К₁ без концентрирования на примере продукта растительного происхождения - листового черного чая

В случае предполагаемого высокого содержания витамина в растительном сырье проводится анализ филлохинона без концентрирования.

Предположим, что требуется определить содержание витамина К₁ в листовом черном чае. Известно, что в чае витамин К₁ содержится в больших количествах, следовательно, анализ можно проводить без концентрирования.

Перед проведением анализа листовой черный чай гомогенизируем с помощью лабораторной мельницы и дополнительно просеиваем через сито с диаметром ячеек 0,1 мм.

Во флакон из темного стекла вносим 1 г гомогенизированных листьев чая, добавляем 3 см³ пропанола-2 и 1 см³ гексана. Помещаем флакон в ультразвуковую ванну, заполненную водой со льдом, и проводим экстракцию в течение 25 мин. Затем полученный экстракт аккуратно сливаем в другой флакон из темного стекла и повторяем процедуру экстракции еще тир раза.

После последней экстракции содержимое флакона вместе с гомогенизированной пробой количественно переносим в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугируем 3 мин при 3000 об/мин. Экстракт аккуратно сливаем к полученным ранее вытяжкам витамина К₁.

В инсулиновый шприц отбираем 1 см³ экстракта, устанавливаем на шприц фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной и прокачиваем отобранный экстракт через установленный фильтр.

Аликвоту отфильтрованного экстракта в количестве 0,5 см³ переносим в пробирку типа Эппендорф и упариваем в токе азота досуха. Сухой остаток растворяем в 0,5 см³ элюента. Выполняем два параллельных измерения.

В хроматографическую систему вводим 0,1 см³ анализируемого раствора и проводим анализ. Идентифицируем витамин К₁ по времени удерживания стандартного раствора:

Т_уд (вит. К₁ в стандартном растворе) = 14,310 мин;

Т_уд (вит. К₁) = 14,435 мин.

Расхождение времен удерживания не превышает 0,9%, следовательно, витамин можно считать идентифицированным.

Количественный расчет массовой концентрации витамина К₁ осуществляем с помощью программы сбора и обработки хроматографических данных. При этом используем метод абсолютной градуировки. Концентрация витамина К₁ (С_пр, мкг/см³) в пробе рассчитывается автоматически и составляет:

C_пр1 = 0,595 мкг/мл;

С_пр2 = 0,607 мкг/мл.

Расхождение между параллельными результатами составляет 2%. Вычисляем среднее арифметическое двух параллельных измерений: С_ср = 0,601 мкг/мл. Рассчитываем массовую концентрацию витамина К₁ в листовом черном чае по формуле:

С (вит. К₁) = 1600⋅0,601 мкг/мл = 961,6 мкг/100 г.

Пример №2. Определение витамина К₁ с концентрированием на примере продукта растительного происхождения - ягодах клюквы

В случае предполагаемого низкого содержания витамина в растительном сырье проводится анализ филлохинона с концентрированием.

Предположим, что требуется определить содержание витамина К₁ в ягодах клюквы. Известно, что в ягодах клюквы витамин К₁ содержится в низких количествах, следовательно, перед проведением анализа необходимо концентрирование пробы.

Тщательно моем ягоды клюквы, осушаем с помощью бумажного полотенца, гомогенизируем с использованием лабораторной мельницы и дополнительно протираем через сито с диаметром ячеек 0,1 мм.

Во флакон из темного стекла вносим 1 г гомогенизированной массы, добавляем 3 см³ пропанола-2 и 1 см³ гексана. Помещаем флакон в ультразвуковую ванну, заполненную водой со льдом, и проводим экстракцию в течение 25 мин. Затем полученный экстракт аккуратно сливаем в другой флакон из темного стекла и повторяем процедуру экстракции еще тир раза.

После последней экстракции содержимое флакона вместе с гомогенизированной пробой количественно переносим в пластиковую центрифужную пробирку и центрифугируем 3 мин при 3000 об/мин. Экстракт аккуратно сливаем к полученным ранее вытяжкам витамина К₁.

В шприц на 10 см³ отбираем 6 см³ экстракта, устанавливаем на шприц фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной и прокачиваем отобранный экстракт через установленный фильтр.

Отфильтрованный экстракт количественно переносим в пробирку типа Эппендорф путем поэтапного приливания и упаривая в токе азота досуха. Сухой остаток растворяем в 0,1 см³ элюента. Выполняем два параллельных измерения.

В хроматографическую систему вводим 0,1 см³ анализируемого раствора и проводим анализ. Идентифицируем витамин К₁ по времени удерживания стандартного раствора:

Т_уд (вит. К₁ в стандартном растворе) = 14,217 мин;

Т_уд (вит. К₁) = 14,128 мин.

Расхождение времен удерживания не превышает 0,6%, следовательно, витамин можно считать идентифицированным.

Количественный расчет массовой концентрации витамина К₁ осуществляем с помощью программы сбора и обработки хроматографических данных. При этом используем метод абсолютной градуировки. Концентрация витамина К₁ (С_пр, мкг/см³) в пробе рассчитывается автоматически и составляет:

С_пр1 = 0,064 мкг/мл;

С_пр2 = 0,061 мкг/мл.

Расхождение между параллельными результатами составляет 4,8%. Вычисляем среднее арифметическое двух параллельных измерений: С_ср = 0,0625 мкг/мл. Рассчитываем массовую концентрацию витамина К₁ в ягодах клюквы по формуле:

С (вит. К₁) = 26,67-0,0625 мкг/мл = 1,67 мкг/100 г.

Таким образом, материалы приведенных примеров демонстрируют возможность использования данного способа для количественного определения витамина К₁ в любых продуктах растительного происхождения.

Источники информации

1. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации MP 2.3.1.1915-04 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2004. - 25 с.

2. Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации. Методические рекомендации MP 2.3.1.2432-08 / Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - М., 2008. - 25 с.

3. Бременер С.М. Витамины и их клиническое применение. - М.: Медицина, 1966. - 420 с.

4. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

5. Громова О.А., Торшин. И.Ю., Лиманова О.А. Многогранная роль макро- и микроэлементов в построении костной ткани // Гинекология, 2014. - №2. - С. 50-56.

6. Поварова О.В., Медведев О.С. Нейропротекторное действие витамина К // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2015. - Т. 78. - №10. - С. 40-44.

7. Березовский В.М. Химия витаминов. Изд. 2-е. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - 632 с.

8. Booth S.L. Vitamin K: food composition and dietary intakes // Food & Nutrition Research. 2012. - V. 56. - 5505 - DOI: 10,3402/fnr.v56i0.5505.

9. Биологически активные добавки и премиксы. Измерение массовой концентрации витаминов К₁ (филлохинона) и D₃ (холекальциферола). МУК № свидетельства об аттестации 18/143-01.00259-2013/2014

10. Лукша Е.А., Погодин И.С., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э., Величко Г.Н. Разработка методики количественного определения филлохинона (витамина К₁) в растительных объектах // Современные проблемы науки и образования. 2014. - №3. http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=13736 (дата обращения: 20.05.2016).

11. Park J.-S., Ryu Е.-С, Park J.-W., Kim H.-S. Determination of Vitamin K1 in infant formula in Korean domestic market // Journal of preventive veterinary medicine. 2016. - V. 40 (3). - P. 90-95.

12. R.B., Jakobsen J. Analysis of vitamin K1 in fruits and vegetables using accelerated solvent extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization. 2016. - V. 192. - P. 402-408.

13. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Изд. 2-е, перераб. и доп. - Л.: Колос. Ленингр. отделение, 1972. - 456 с.

14. Гавриленко М.А., Слижов Ю.Г., Бурметьева М.С., Билялов А.А., Гавриленко Н.А. Концентрирование филлохинона на дипропилдитиокарбамате меди // Фундаментальные исследования. 2013. - №8. - С. 575-579.

15. Huang В., Wang Z., Yao J., Ke X., Xu J., Pan X.-D., Xu X., Lu M., Ren Y. Quantitative analysis of vitamin K1 in fruits and vegetables by isotope dilution LS-MS/MS // Analytical Methods. 2016. - №8. - P. 5707-5711.

16. Gentili A., Miccheli A., Tomai P., Baldassarre M.E., Curini R., Perez-Fernandez V. Liquid chromatography - tandem mass spectrometry method for the determination of Vitamin K homologues in human milk after overnight cold saponification. 2016. - V. 47. - P. 21-30.

17. Юнусходжаева H.A., Абдуллабекова B.H. Исследование химического состава травы Polygoni avicularis L. // Химия растительного сырья. 2012. - №4. - С. 187-191.

18. Indyk Н.Е., Woollard D.C. Vitamin K in milk and infant formulas: determination and distribution of Phylloquinone and menaquinone-4 // Analyst. 1997. - V. 122(5) - P. 465-469.

19. ГОСТ EN 14148-2015. Продукция пищевая. Определение витамина К₁ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Способ определении содержания витамина К₁ в продуктах растительного происхождения, включающий следующие этапы алгоритма анализа: количественно извлекают витамин К₁ путем 4-кратной обработки 1 г гомогенизированного продукта с размером частиц не более 0,1 мм смесью пропанол-2 : гексан (3:1) на ультразвуковой бане при охлаждении; объединяют полученные экстракты; устраняют влияние компонентов матрицы путем фильтрации 1 см³ экстракта при проведении анализа без концентрирования и 6 см³ экстракта в случае необогащенного продукта через фильтрующую насадку с гидрофобной мембраной; упаривают 0,5 см³ экстракта при проведении анализа без концентрирования и 6 см³ экстракта в случае необогащенного продукта в токе азота; перерастворяют высушенный остаток в 0,5 см³ элюента состава ацетонитрил : трихлорметан (85:15 об. %) при проведении анализа без концентрирования и в 0,1 см³ элюента того же состава в случае необогащенного продукта; готовят серию градуировочных растворов витамина К₁ путем растворения определенной массы чистого вещества в элюенте; устанавливают градуировочную зависимость путем измерения высот пиков витамина К₁ в градуировочных растворах и построения градуировочного графика в координатах: «концентрация витамина К₁ (С_пр), мкг/см³» - «высота пика витамина (Н), мВ»; инжектируют в хроматографическую систему 0,02 см³ исследуемого раствора пробы и анализируют его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием при длине волны 248 нм; идентифицируют витамин К₁ по времени удерживания компонента и проводят количественную обработку методом абсолютной градуировки; выполняют математическую обработку хроматографических данных, позволяющую установить абсолютную величину витамина К₁ в 100 г растительного сырья.