Способ получения липидных наночастиц для доставки лекарственного средства

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, в частности фармакологии, и раскрывает способ получения липидной наночастицы, инкапсулирующей молекулу siPHK и фармацевтическую композицию, содержащую липидную наночастицу, инкапсулирующую молекулу siPHK. Группа изобретений обеспечивает получение липидных наночастиц, имеющих индекс полидисперсности (PDI) менее 0,2 и размер частицы от 50 до 150 нм, который может осуществляться в больших объемах и использоваться при крупномасштабном производстве. Настоящие липидные наночастицы могут быть использованы для обеспечения носителей для доставки терапевтических молекул, в частности, молекул siPHK. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 13 табл., 7 пр, 6 ил.

 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/556,124, поданной 4 ноября 2011, которая включена в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения частиц на основе липидов и нуклеиновых кислот простым и репродуцируемым образом. Способ обеспечивает получение частиц, которые являются монодисперсными со средним размером 50-150 нм.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липиды являются потенциально полезными в качестве носителей для доставки терапевтических молекул, в частности для доставки нуклеиновых кислот. Липиды образуют липосомы, которые могут инкапсулировать, образовывать комплексы или захватывать молекулы нуклеиновых кислот, и таким образом улучшать доставку этого класса терапевтических молекул в клетки-мишени после введения, например, внутривенно для циркуляции. Их полезность в фармацевтических композициях ограничивается доступными методами для получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот воспроизводимым образом. Были разработаны различные методы для получения таких наночастиц.

Batzri et al., 1973, Biophys Biochem Acta 298:1015-19, и Kremer et al., 1977, Biochemistry 16:3932-35, описывают получение липидных везикул посредством растворения липидов в этаноле и впрыскивания этанольного раствора в водный раствор, в котором липиды самопроизвольно формируют липосомы. Hirota et al., 1999, BioTechniques 27:286-89, описывают получение липидных везикул, покрытых молекулами нуклеиновой кислоты, посредством растворения катионных липидов в этаноле и впрыскивания этанольного раствора в водный раствор, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты. Этот способ не позволяет получить липосомы, которые инкапсулируют нуклеиновую кислоту.

Maurer et al. в US 7094423 описывают получение липосом, которые инкапсулируют нуклеиновые кислоты, посредством сначала получения предварительно сформированных одностеночных везикул в водном растворе. Предварительно сформированные везикулы получают посредством растворения липидов в этаноле и впрыскивания липидной смеси в водный буфер. Способ получения пустых предварительно сформированных везикул включает установление размера посредством экструзии. Этанол добавляется в пустые предварительно сформированные везикулы после установления размера для дестабилизации их, и нуклеиновые кислоты в 40% этаноле добавляются для дестабилизации липидных везикул. После инкубации смесь диафильтруется для удаления этанола. Изменения процентного содержания этанола, температуры, времени инкубации, липидной композиции, отношения лекарственное средство/липид и начальной концентрации нуклеиновой кислоты все влияют на эффективность инкапсулирования и выход этого способа. Например, Maurer et al. раскрывает, что захват увеличивается при увеличении отношения олигонуклеотид:липид, с достижением максимума при более чем 0.16 мг антисмыслового нуклеотида на мг липида, с достижением увеличения числа липосом большего размера и их полидисперности.

Semple et al. в US 6858225 получали липосомы, инкапсулирующие РНК, применяя ионизируемый катионный липид. Липид растворяется в этаноле и объединяется с нуклеиновыми кислотами в водном буфере при низком pH. Этанол удаляется, и pH доводится до нейтрального значения pH с образованием липосом. Получение липосом является гетерогенным и требует гомогенизации или экструзии с получением монодисперсных липидных везикул. Согласно Maurer et al., Semple et al. раскрывают, что захват увеличивается при увеличении отношения олигонуклеотид:липид, с достижением максимума при более чем 0.16 мг антисмыслового олигонуклеотида на мг липида, с достижением увеличения числа липосом большего размера и их полидисперности.

MacLachlan et al. в US 7901708 описывают получение липидных везикул, инкапсулирующих РНК посредством смешивания липидов, растворенных в этаноле, с РНК в водном растворе в смесительной камере (Т-трубка), в которой липиды и РНК растворяются постепенно, таким образом, по существу мгновенно образуя везикулы.

Wheeler et al. в US 20100041152 описывают получение липосом, инкапсулирующих РНК, посредством растворения катионных липидов в этаноле и смешивания с РНК в 65-85% этаноле с получением растворимого заряд-нейтрализованного комплекса, добавления некатионных липидов к этому комплексу с образованием смеси липид - нуклеиновая кислота, и удаления этанола. Липосому нуждаются в гомогенизации или экструзии с получением монодисперсных липидных везикул.

Остается потребность в способе получения инкапсулированных нуклеиновых кислот без необходимости стадий интенсивной механической обработки для получения предварительно сформированных липосом и без необходимости стадии обработки для уменьшения частиц липид-нуклеиновая кислота до монодисперсной популяции.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одним объектом настоящего изобретения является способ получения липидной наночастицы, инкапсулирующей полианион, содержащий стадии добавления первого раствора, содержащего липиды, растворенные в смешивающемся с водой органическом растворителе, при постоянной скорости во второй раствор, содержащий полианион в водном буфере при перемешивании второго раствора с получением смеси, содержащей органический растворитель при 25-45% (об:об); и удаления органического растворителя из смеси посредством диафильтрации с применением водного буферизованного раствора при нейтральном pH. Добавление первого раствора ко второму раствору предпочтительно продолжается в течение 1-100 минут. Полианион может представлять собой нуклеиновую кислоту, например, молекулу РНК. Полианион предпочтительно присутствует при концентрации 0.08-0.8 мг/мл. Отношение липид: лекарственное средство (мас.:мас.) липидной наночастицы предпочтительно составляет от 0.06 до 0.16. Отношение зарядов липид: лекарственное средство липидной наночастицы предпочтительно составляет от 1:25:1 до 1:1.

Другим вариантом выполнения способа является применение полисахарида в водных растворах. Полисахарид предпочтительно выбирается из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, ксилита, лактозы, мальтозы и инулина. Другой вариант выполнения способа дополнительно содержит стадию лиофилизации липидной наночастицы, инкапсулирующей полианион.

В другом варианте выполнения способа органическим раствором предпочтительно является этанол. Предпочтительно, при завершении получения смеси липида и полианиона, смесь содержит этанол при 35% (об.:об.).

В другом варианте выполнения способа липиды содержат катионный липид, вспомогательный липид, стерол и ПЭГ липид. Предпочтительно, катионный липид составляет от 40 до 60 мольных процентов липидов. Предпочтительно, катионный липид выбирается из группы, состоящей из HEDC, HEDODC и HE-Et-DODC, более предпочтительно состоящего из ионизируемого или неионизируемого положительного заряда. Предпочтительно, липиды дополнительно содержат нацеливающий липид.

В другом варианте выполнения способа этанол и водные растворы смешиваются при 25-55°C, и буферизуются при pH 3.5-6.5, предпочтительно с применением цитрата.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая липидную наночастицу, инкапсулирующую полианион, полученную посредством способа, содержащего стадии добавления первого раствора, содержащего липиды, растворенные в смешивающемся с водой органическом растворителе, при постоянной скорости во второй раствор, содержащий полианион в водном буфере при перемешивании второго раствора с поучением смеси, содержащей органический растворитель при 25-45% (об.:об.); и удаления органического растворителя из смеси посредством диафильтрации с применением водного буферизованного раствора при нейтральном pH.

Вариант выполнения настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, молекулу РНК или двухнитиевую молекулу siPHK. Предпочтительно, отношение липид: лекарственное средство липидной наночастицы составляет от 0.06 до 0.16 (мас.:мас.), и отношение зарядов липид: лекарственное средство липидной наночастицы составляет от 1:25:1 до 1:1.

В другом варианте выполнения фармацевтической композиции липиды содержат катионный липид, вспомогательный липид, стерол и ПЭГ липид. Предпочтительно, катионный липид составляет от 40 до 60 мольных процентов липидов. Катионный липид предпочтительно выбирается из группы, состоящей из HEDC, HEDODC и HE-Et-DODC. Катионный липид может состоять из ионизируемого или неионизируемого положительного заряда. Липиды могут дополнительно содержать нацеливающий липид.

Другой вариант выполнения фармацевтической композиции дополнительно содержит полисахарид, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, ксилита, лактозы, мальтозы и инулина. Предпочтительно способ получения фармацевтической композиции дополнительно содержит лиофилизацию полианиона, инкапсулированного липосомой. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать цитрат. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать вспомогательные вещества, состоящие из полоксамеров, поверхностно-активных веществ, детергентов или полигидрокси или полигидроксиэтилен полимеров.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция состоит из липидных наночастиц, инкапсулирующих молекулы РНК, имеющих средний диаметр частицы 50-150 нм, более предпочтительно менее 100 нм, наиболее предпочтительно минимально поли дисперсных.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 схематически показывает способ, описанный в настоящей заявке для получения наночастиц на основе липидов и нуклеиновых кислот. Подробное описание каждой стадии способа описывается далее.

Фиг. 2 показывает средний размер частиц в нанометрах (нм) как функцию конечной концентрации РНК от 0.05 до 0.5 мг/мл. Подробное описание эксперимента приводится в Примере 1.

Фиг. 3 показывает средний размер частиц в нм как функцию pH буфера при смешивании липидов с РНК. Подробное описание эксперимента приводится в Примере 2.

Фиг. 4 показывает средний размер частиц, полученных с применением способа согласно Примеру 2 (NDT-0009) или способу Semple, как подробно описано в Примере 3. Столбики слева показывают измерение размера после смешивания. Столбики слева показывают измерение конечного продукта (для продукта по способу Semple, после экструзии и диафильтрации).

Фиг. 5 показывает эффективность инкапсуляции (ЕЕ) в процентах для частицы, полученной с применением способа согласно Примеру 2 (Способ по Примеру 2) или Примеру Semple, как описано в Примере 3. Столбики слева показывают измерение размера после смешивания. Столбики слева показывают измерение конечного продукта (для продукта по способу Semple, после экструзии и диафильтрации).

Фиг. 6 показывает восстановление siPHK в процентах для частицы, полученной с применением способа согласно Примеру 2 или Примеру Semple, как описано в Примере 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ВЫПОЛНЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описание настоящего изобретения относится к способу получения липид-инкапсулированных терапевтических молекул, включающих отрицательно-заряженные терапевтические полимеры, например, нуклеиновые кислоты, белки и пептиды. Приведенное описание настоящего изобретения включает способ получения липид-инкапсулированных молекул нуклеиновых кислот. Способ, в частности, делает возможным крупномасштабное производство частиц, состоящих из инкапсулированных липосомами молекул лекарственного средства. Способ обеспечивает неожиданный и удивительный результат, состоящий в том, что полученные частицы имеют распределение по размеру от 50 до 150 нм при индексе полидисперсности (PDI) менее 0.2. Этот способ обеспечивает средства инкапсуляции посредством объединения липидов, солюбилизированных в смешивающемся с водой органическом растворителе, таком как этанол, с отрицательно-заряженными терапевтическими полимерами, солюбилизированными в водном растворителе, и удаления органического растворителя. Абсолютные и относительные концентрации липидов и отрицательно-заряженных терапевтических полимеров достаточны для получения маленьких частиц. Частицы, полученные способов согласно описанию настоящего изобретения, не нуждаются в механической обработке, такой как экструзия, для получения популяции частиц с PDI менее 0.2.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущества по сравнению с ранее описанными способами благодаря легкости, с которой он может быть воспроизведен в больших объемах и надежности при осуществлении при широком диапазоне температур, растворителей, pH и продолжительности обработки.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущества по сравнению с ранее описанными способами благодаря воспроизводимости получения частиц с PDI менее 0.2, предпочтительно менее 0.1, и без излишних стадий, необходимых для получения предварительно сформированных везикул.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущества по сравнению с ранее описанными способами благодаря воспроизводимости получения равномерной популяции наночастиц без излишних стадий, необходимых для частиц, получаемых механически, при смешивании липидов и отрицательно заряженных терапевтических полимеров. Эти излишние стадии включают, например, обработку ультразвуком, гомогенизацию или экструзию, для уменьшения их размера и доведения равномерности до терапевтически приемлемого диапазона.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущество достижения эффективности инкапсуляции нуклеиновой кислоты, равной эффективности ранее описанных способов или улучшенной по сравнению с ними, без излишних стадий обработки наночастиц.

Другие преимущества способа согласно настоящему изобретению очевидны из приведенного далее подробного описания настоящего изобретения, касающегося липидных компонентов и условий.

Липидная смесь, применяемая в способе согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере положительно-заряженный липид (катионный липид) в комплексе с отрицательно-заряженными терапевтическими полимерами, и полиэтиленгликоль-содержащий липидный конъюгат (ПЭГ-липид) для предотвращения агрегации. Катионным липидом может быть перманентный катионный заряд для широкого диапазона условий pH, ионизируемый катионный липид, который заряжается при низком pH (менее чем pH 6) и без суммарного заряда при нейтральном pH (pH 6.5-8), или комбинация перманентного и ионизируемого катионных липидов. Липидная смесь также может содержать нацеливающий липид, полимер, стероид, фосфолипид, или член другой липидной группы, включающей жиры, воск, жирорастворимые витамины, моноглицериды или диглицериды, жирные ацилы, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, сахаролипиды и поликетиды. Этот способ может также применяться для формирования липосом с только нейтральными или отрицательно заряженными компонентами.

Предпочтительно компоненты липидной смеси могут быть выбраны из следующих групп.

Катионный липид

Настоящее изобретение охватывает катионные липиды формулы I

в которой

Z=алкильный линкер, C2-C4 алкил

Y=алкильный линкер, C1-C6алкил

R1 и R2 каждый независимо представляет собой C10-C30алкил, C10-C30алкенил, или C10-C30алкинил, C10-C30алкил, C10-C20алкил, C12-C18алкил, C13-C17алкил, C13алкил, C10-C30алкенил, C10-C20алкенил. C12-C18алкенил, C13-C17алкенил, C17алкенил; R3 и R4 каждый независимо представляет собой водород, C16алкил, или -CH2CH2ОН, C1-C6алкил, C1-C6алкил; n равно 1-6; и X представляет собой противоион, включая любой азотный противоион, причем этот термин легко понятен в данной области техники. Предпочтительные азотные противоионы включают галогены, причем хлорид и бромид являются особенно предпочтительными. Другим предпочтительным противоионом является мезилат (-SO3CH3).

Примерные соединения формулы I включают:

и

и

Другие катионные заряженные липиды при физиологическом pH включают, но без ограничения к этому, N,N-диолеил-N,N-диметиламмония хлорид ("DODAC"); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид ("DOTMA"); N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония бромид ("DDAB"); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид ("DOTAP"); N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмония бромид ("DMRIE"), 3β-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин ("DC-Chol"), диоктадециламидоглицил карбоксиспермидин ("DOGS"); и Н-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметиламмония трифторацетат ("DOSPA").

Ионизируемые катионные липиды

Настоящее изобретение охватывает ионизируемые катионные липиды формулы II

в которой

Z=алкильный линкер, С24алкил, -CH2SCH2CH2-

Y=алкильный линкер, C1-C6алкил

R1 и R2 каждый независимо представляет собой C10-C30алкил, C10-C30алкенил, или C10-C30алкинил, C10-C30алкил, C10-C20алкил, С1218алкил, С13-C17алкил, C13алкил, C10-C30алкенил, C10-C20алкенил. С1218алкенил, C13-C17алкенил, C17алкенил; R3 и R4 каждый независимо представляет собой водород, C1-C6алкил, или -CH2CH2ОН, C1-C6алкил, C1-C3алкил.

Некоторые положительно-заряженный липиды имеют рКа при или около физиологическом pH и являются катионными в мягких кислотных условиях и слабо катионными при физиологическом pH. Такие ионизируемые катионные липиды включают, но без ограничения к этому, ((2-((2-(диметиламино)этил)тио)ацетил)азандиил)бис(этан-2,1-диил) дитетрадеканоат ("S104"), (Z)-((3-(диметиламино)пропаноил)азандиил)бис(этан-2,1-диил)диолеат ("i-Et-DODC"), N-(2,3-диолеилокси)пропил)]N,N-диметиламмония хлорид ("DODMA") и 1,2-диолеил-3-диметиламмония-проан ("DODAP").

Обнаружено, что ионизируемые липиды могут облегчать связывание и/или высвобождение активного фармацевтического ингредиента (API), как показано ниже.

Природные липиды

Примеры природных липидов включают, но без ограничения к этому, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Природные липиды включают амфифатические липиды. Презентативные примеры фосфолипидов включают, но без ограничения к этому, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидиновую кислоту, пальмитоилолеоил фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин ордилинолеоилфосфати-дилхолин. Другие соединения, не содержащие фосфор, такие как сфинголипид, семейства гликосфинголипидов, диацилглицерины и 3-ацилокси кислоты, также входят в группу, обозначенную как амфифатические липиды. Кроме того, амфифатический липид, описанный выше, может быть смешан с другими липидами, включая триглицериды и стиролы.

ПЭГ-липиды

Стабилизирующий бислой компонент представляет собой полиэтиленгликоль («ПЭГ»), конъюгированный с липидной головной группой, например, фосфатидилэтаноламин. Другой стабилизирующий бислой компонент представляет собой ПЭГ, конъюгированный с церамидом. ПЭГ может быть конъюгирован с фосфатидилэтаноламином или, альтернативно, с церамидом, применяя стандартные реакции связывания, известные специалистам в данной области техники и применяемые ими. Кроме того, предварительно сформированные ПЭГ-фосфатидилэтаноламин ("ПЭГ-РЕ") конъюгаты являются коммерчески доступными.

ПЭГ с различными молекулярными массами могут применяться для формирования стабилизирующих бислой компонентов согласно настоящему изобретению. ПЭГ с различными молекулярными коммерчески доступны для получения из ряда различных источников или, альтернативно, они могут быть синтезированы с применением стандартных методик полимеризации, хорошо известных специалистам в данной области техники. В представленном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в интервале от 200 до 10000 Да, предпочтительно от 500 до 4000 Да, и наиболее предпочтительно от 1000 до 2000 Да. В общем, было обнаружено, что повышение молекулярной массы ПЭГ уменьшает концентрацию стабилизирующего бислой компонента, необходимой для достижения стабилизации.

Фосфатидилэтаноламин, имеющий многообразие с групп с ацильной цепью с различной длиной цепи и степенью насыщенности, может быть конъюгирован с ПЭГ с формированием стабилизирующего бислой компонента. Такие фосфатидилэтаноламины являются коммерчески доступными, или могут быть выделены или синтезированы с применением обычных методик, известных специалистам в данной области техники. Фосфатидилэтаноламины, содержащие насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеводородной цепи в интервале от С10 до С20, являются предпочтительными. Фосфатидилэтаноламины с моно- или диненасыщенными жирными кислотами и смеси насыщенных и ненасыщенных жирных кислот также могут применяться. Подходящие фосфатидилэтаноламины включают, но без ограничения к этому, следующие: димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) и дистеароилфосфатидил-этаноламин (DSPE).

Вышеуказанные композиции также могут включать ПЭГ-конъюгированные липиды, которые по существу известны в данной области техники, включая ПЭГ-фосфолипиды и ПЭГ-церамиды, включая одну или более молекул, выбранных из следующих: ПЭГ2000-DSPE, ПЭГ2000-DРРЕ, ПЭГ2000-DМРЕ, ПЭГ2000-DОРЕ, ПЭГ1000-DSPE, ПЭГ1000-DPPE, ПЭГ1000-DMPE, ПЭГ1000-DOPE, ПЭГ550-DSРЕ, ПЭГ550-DРРЕ, ПЭГ-550DMРЕ, ПЭГ-1000DOPE, ПЭГ-холестерин, ПЭГ2000-церамид, ПЭГ 1000-церамид, ПЭГ750-церамид, и ПЭГ550-церамид.

Кроме того, композиции также могут включать монодисперсные (md) ПЭГ-липиды, с общей формулой md ПЭГ-линкер-липид, с примерами, включающими, но без ограничениями к этому, 83-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,7275,78,81-гептакозаоксатриоктаконтил (2,3-бис(тетра-децилокси)пропил)карбамат ("НО-ПЭГ1251-сВТР") и 134-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75, 78, 81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132-тетратетраконтаоксатетратриконтагектил (2,3-бис(тет-радецилокси)пропил)карбамат ("НО-ПЭГ2000-сВТР") в качестве примеров.

Стероиды

Стероиды включают холестаны (например, холестерин), холаны и желчные кислоты (например, хенодеоксихолат и холат), эргостерол, ланостерол, кортикостероиды (например, глюкокортикоид), прегнан (например, прогестерон), и фитостиролы. Они могут быть включены также в форме конъюгата с гидрофильной составляющей, например, полиэтиленгликол. Предпочтительный стероид представляет собой холестерин.

Нацеливающий липид

Пример нацеливающего липида представляет собой соединение формулы (А),

в которой

- липид (L) выбирается из группы, состоящей из DSPE, DOPE, и DC;

- линкер (X) выбирается из группы, состоящей из ничего, ПЭГ550, ПЭГ2000, ПЭГ-глутамат (-Glu), Glu, С6, глицин, и GluNH, N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид; и

- ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноин, адапален, ретинол, 4-гидрокси(фенил)ретинамид (4-HPR), ретиноевая кислота (витамин А), 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановой кислоты, и любой частично или полностью насыщенный ретиноид или его производную.

Другой пример нацеливающего липида представляет собой соединение формулы (В),

в которой

- линкер (X) представляет собой N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид ("бисамидо-ПЭГ") или N1,N19-бис(16,20-диамино-15-оксо-4,7,10-триокса-14-азаикозил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид ("лиз-бисамидо-ПЭГ-лиз"); и

- ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноин, адапален, ретинол, 4-гидрокси(фенил)ретинамид (4-HPR), и ретиноевую кислоту (витамин А), 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановую кислоту, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановую кислоту, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановую кислоту, и любой частично или полностью насыщенный ретиноид или его производную.

Другие нацеливающие молекулы могут быть включены в липидную смесь, например, фолиевая кислота, витамин Е, пептидные лиганды и/или моноклональные антитела.

Композиции и составы на основе частиц лекарственное средство-липид

Описание включает композиции, содержащие липидные частицы с активным агентом или без него, в которых активный агент, когда присутствует, связан с липидной частицей. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения, активным агентом является терапевтическое средство. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения, активным агентом является отрицательно заряженный терапевтический полимер, инкапсулированный внутри внутренней водной среды липидной частицы. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, активный агент присутствует внутри одного или более липидных бислоев липидной частицы. В других вариантах выполнения настоящего изобретения активный агент связан с внешней частью или внутренней частью липидной поверхности липидной частицы.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения липидные частицы согласно настоящему изобретению связаны с нуклеиновой кислотой с образованием частиц нуклеиновая кислота-липид. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения нуклеиновая кислота полностью инкапсулирована в липидной частице. Как применяется в описании настоящего изобретения термин "нуклеиновая кислота», как означает, включает любой олигонуклеотид или полинуклеотид. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению составляют 15-50 нуклеотидов в длину.

Термины "полинуклеотид" (PNA) и "олигонуклеотид" согласно настоящему изобретению относятся к полимеру или олигомеру мономеров нуклеотида или нуклеозида, состоящих из оснований, сахаров и связей между сахарами (скелет) природного происхождения. Термины "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" также включают полимеры или олигомеры, содержащие мономеры неприродного происхождения или их части, которые функционируют подобным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительны по сравнению с природными формами благодаря свойствам, таким как, например, повышенное клеточное поглощение и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотидами могут быть как олигодеоксирибонуклеотиды или олигорибонуклеотиды. Олигодеоксирибонуклеотид состоит из деоксирибозы, соединенной ковалентно с фосфатом при 5' и 3' углеводородах этого сахара с формированием отрицательно заряженного чередующегося неразветвленного полимера. Олигорибонуклеотид состоит из подобной повторяющейся структуры, где каждый нуклеотид имеет рибозную сахарную группу. Модифицированные рибозные молекулы могут быть включены в олигорибонуклеотид.

Нуклеиновая кислота, которая присутствует в частице липид-нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению, включает любую форму нуклеиновой кислоты, которая известна. Нуклеиновые кислоты, применяемые в настоящей заявке, могут представлять собой однонитиевую ДНК или РНК, или двухнитиевую ДНК или РНК, или ДНК-РНК гибриды или РНК-РНК и/или ДНК-РНК гибриды или РНК дуплексы. Примеры двухнитиевой ДНК включают структурные гены, гены, включающие контролирующие и терминирующие области, и самореплицирующиеся системы, такие как вирусные или плазмидные ДНК. Примеры двухнитиевой РНК включают siPHK и другие реагенты РНК интерференции. Однонитиевые нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК, и триплекс-формирующие олигонуклеотиды.

Нуклеиновые кислоты могут иметь различную длину, как правило, в зависимости от конкретной формы нуклеиновой кислоты. Например, в конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения плазмиды или гены могут составлять от около 1,000 до 100,000 нуклеотидных остатков в длину. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотиды могут иметь от около 10 до 100 нуклеотидов в длину. В различных родственных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотиды, либо однонитиевые, либо двухнитиевые, либо трехнитиевые, могут иметь в длину от около 10 до около 50 нуклеотидов, от около 21 до около 50 нуклеотидов, от около 15 до около 30 нуклеотидов, от около 20 до около 30 нуклеотидов в длину. Полинуклеотиды из 50 нуклеотидов или менее в общем обозначаются "фрагменты".

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотид (или его нить) может быть специфически гибридизован или комплементарен с целевым полинуклеотидом. Термин «специфически гибридизованный" и «комплементарный" применяются для обозначения достаточной степени комплементарности, так что происходит стабильное и специфическое связывание между целевой ДНК или РНК и олигонуклеотидом. Понимается, что олигонуклеотид не должен быть на 100% комплементарен его целевой последовательности нуклеиновой кислоте, чтобы быть специфически гибридизуемым. Олигонуклеотид является специфически гибридизуемым, когда связывание олигонуклеотида с его целью нарушает нормальную функцию целевой молекулы, вызывая уменьшение или потерю ее функциональности или экспрессии, и имеется достаточная степень специфического спаривания оснований, чтобы избежать неспецифического связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых желательно специфическое связывание, т.е. при физиологических условиях в случае in vivo анализов или терапевтического лечения, или, в случае in vitro анализов, в условиях, при которых проводятся анализы. Таким образом, в других вариантах выполнения настоящего изобретения этот олигонуклеотид включает 1, 2 или 3 основных замещений по сравнению с областью гена или последовательности мРНК, которая является нацеливающей или с которой он специфически гибридизуется.

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения частицы нуклеиновая кислота-липид могут быть связаны с молекулами интерферирующих РНК (PHKi). Способы интерференции РНК с применением PHKi молекул могут применяться для нарушения экспрессии гена или полинуклеотида, представляющих интерес. siPHK представляют собой РНК дуплексы длиной, как правило, 15-30 нуклеотидов, которые могут связываться с цитоплазматическим мульти-белковым комплексом, известным как PHKi-индуцированный комплекс сайлесинга (RISC). RISC, загруженный siPHK, опосредует разрушение гомологичных мРНК транскриптов; поэтому siPHK может обозначатся как подавляющий экспрессию белка с высокой специфичностью. В отличие от других антисмысловых методик, siPHK функция в ходе природного механизма развивается с контролем генной экспрессии по некодирующей РНК. Это в общем рассматривается как причина, почему ее активность является более высокой in vitro и in vivo, чем у антисмыслового олигонуклеотида, либо рибозимов. PHKi реагенты могут включать ДНК смысловые: РНК антисмысловые гибриды, РНК смысловые: ДНК антисмысловые гибриды, и ДНК:ДНК гибриды способны опосредовать PHKi. Таким образом, PHKi молекулы, содержащие любой из этих различных типов двухнитиевых молекул, могут применяться. Кроме того, понимается, что PHKi молекулы могут применяться и вводиться в клетки во множестве различных форм. Соответственно, как применяется в описании настоящего изобретения, PHKi молекулы охватывают любую и все молекулы, способные индуцировать PHKi ответ в клетках, включая, но без ограничения к этому, двухнитиевые полинуклеотиды, содержащие две различные нити, т.е. смысловую нить и антисмысловую нить, например, малую интерферирующую РНК (siPHK); полинуклеотиды, содержащие петлю шпильку комплементарных последовательностей, которая образует двухнитиевую область, например, shPHKi молекулы, и экспрессионные вектора, которые экспрессируют один или более полинуклеотидов, способных образовывать двухнитиевый полинуклеотид сам по себе или в комбинации с другим полинуклеотидом.

РНК интерференция (PHKi) может применяться для специфического ингибирования целевых полинуклеотидов. Опосредованное двухнитиевой РНК подавление экспрессии гена и нуклеиновой кислоты может сопровождаться, согласно настоящему изобретению, введением dsPHK, siPHK или shPHK в клетки или организмы. siPHK может представлять собой двухнитиевую РНК, или гибридную молекулу, содержащую как РНК, так и ДНК, например, одну РНК нить и одну ДНК нить, или sisiPHK.

Нацеливающие PHKi молекулы специфические полинуклеотиды могут быть легко получены в соответствии с методиками, известными в данной области техники. Соответственно, специалисту в данной области техники будет понятно, что широкое многообразие различных молекул siPHK может применяться для нацеливания специфического гена или транскрипта. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения siPHK молекулы согласно настоящему изобретению представляют собой двухнитиевые и нуклеотиды длиной 16-30 или 18-25, включая каждое целое число между ними.

В общем, siPHK молекулы полностью комплементарны одной нити целевой молекуле ДНК. В других вариантах выполнения настоящего изобретения siPHK могут иметь модифицированный состав, такой как, например, 2'-деокси или 2-О-метил модификации. Однако, в предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения, не вся нить siPHK включает 2' деокси или 2'-O-модифицированные основания.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения изобретение относится к способам и композициям для получения частиц липид-инкапсулированной нуклеиновой кислоты, в которых нуклеиновые кислоты инкапсулированы внутри липидного слоя. Такие частицы нуклеиновая кислота-липид, включающие siPHK олигонуклеотиды, отличаются применением многообразия биофизических параметров, включая: (1) отношение нуклеиновой кислоты и липида; (2) эффективность инкапсуляции; и (3) размер частицы. Высокая эффективность инкапсуляции, хорошая нуклеазная устойчивость и сывороточная стабильность и контролируемый размер частиц, в общем менее 200 нм в диаметр, желательны. Кроме того, природа полимера нуклеиновой кислоты важна, так как модификация нуклеиновой кислоты для обеспечения нуклеазной устойчивости повышает стоимость терапевтического средства, тогда как во многих случаях обеспечивается лишь ограниченная устойчивость. Если иного не указано, эти критерии вычисляются согласно настоящему изобретению следующим образом:

Отношение липид: лекарственное средство представляет собой количество лекарственного средства в определенном объеме препарата, поделенное на количество липида в таком же объеме. Это может быть выражено как моль на моль основы или как масса на массу ocновы, или как масса на моль основы. Наконец, в случае готов для введения композиций, отношение липид: лекарственное средство вычисляется после диализа, хроматографии и/или ферментного (например, нуклеазного) расщепления, применяемых для удаления избыточного лекарственного средства.

Инкапсуляция

Для определения эффективности инкапсуляции (ЕЕ) siPHK, выражаемой в качестве процента инкапсулированной siPHK в частицах липид-нуклеиновая кислота, применяется анализ RiboGreen описанным далее образом. Эта методика может применяться для определения концентрации в растворе дуплекса и одноцепочечной РНК или ДНК.

Оборудование включает BioTek Instruments, Inc FLx800, пипетки с регулируемым объемом и вихревой смеситель. Реагенты включают воду, свободную от РНКазы (класс MilliQ или эквивалент), буфер 20хТЕ "RNase free" (Invitrogen, TI 1493, или эквивалент), Quant-iT RiboGreen реагент (Invitrogen, RI 1491) и 10% Тритон Х-100 в воде (Thermo Scientific, 28314, или эквивалент).

Получение IX ТЕ буфера включает перенос 38 мл воды, свободной от РНКазы, в центрифужную пробирку, объемом 50 мл, с помощью градуированного цилиндра, объемом 50 мл; и пипетирование 2 мл раствора 20Х ТЕ-буфере в пробирку для центрифугирования и смешивание с применением вортекса.

Получение 2% Тритон Х-100 и 1% Тритон Х-100 в IX ТЕ-буфере включает пипетирование 2 мл или 1 мл, соответственно, 10% Тритон Х-100 в коническую пробирку, объемом 15 мл, свободную от РНКазы, с добавлением 8 мл или 9 мл, соответственно, IX ТЕ-буфера, и перемешивание путем вращения для хорошего перемешивания.

Приготовление рабочего раствора RiboGreen включает извлечение замороженного сток-раствора RiboGreen реагента нагреванием до комнатной температуры и разбавлением в соотношении 1:200 с помощью ТЕ-буфера. Центрифужные пробирки заворачивали в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить избыточное освещение реакционного раствора.

Стандарт получают посредством получения раствора РНК в ТЕ-буфере и раскапывания в 96-луночный планшет. Образцы разводили до конечной концентрации около 80 мкг/мл siPHK и переносили в 96-луночный планшет, как показано на Фиг. 1. Рабочий раствор RiboGreen добавляли и смешивали с каждым образцом и стандартом. Образцы инкубировали в темноте в течение 1-2 минут перед анализом.

1% Тритон Х-100 в ТЕ-буфере затем добавляли для дублирования образцов, а затем добавляли рабочий раствор RiboGreen.

Эффективность инкапсуляции определяют на основе флуоресцентных измерений с применением среднего значения результатов флуоресценции для каждого образца с поправкой на измерения базовой линии среднего значения внешних образцов (флуоресценция RiboGreen реагента в отсутствие РНК), и после коррекции на 8% уменьшения интенсивности сигнала вследствие присутствия Тритон Х-100. Эффективность инкапсуляции затем рассчитывается по следующей формуле:

ЕЕ=(Тритоновый образец - образец липосом)/(Тритоновый образец)

Таким образом, эффективность инкапсуляции представляет собой разницу между значением общей РНК (измеренной после растворения липосом с детергентами) и значением интактных липосом, поделенную на значение общей РНК. Флуоресценция, полученная от интактного образца липосом, будет состоять из свободной РНК в растворе плюс РНК, абсорбированной на внешней поверхности липосомы.

Размер

Размер показывает размер (диаметр) полученных частиц. Распределение по размеру может быть определено с применением устройства динамического рассеяния света (DLS) Malvern Zetasizer Nano-ZS.

Эта методика применяется для измерения среднего диаметра по объему, Z-среднего диаметра и полидисперсности для образцов липосом в процессе. Полидисперсность представляет собой числовое значение для распределения частиц по размерам.

Измерения проводились при комнатной температуре. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры. Определяли средневзвешенный диаметр частиц и индекс полидисперсности.

Способ получения

Получение липосом

Липидную смесь можно солюбилизировать в смешивающемся с водой органическом растворителе, предпочтительно абсолютном этаноле. В большинстве вариантов выполнения настоящего изобретения органический растворитель применяют в том виде, в котором он является коммерчески доступным.

В одном примерном варианте выполнения настоящего изобретения смесь липидов представляет собой смесь катионных аминолипидов, нейтральных липидов (отличных от аминолипидов), стероидов (например, холестерина), а ПЭГ-модифицированные липиды (например, ПЭГ-S-DMG, ПЭГ-C-DOMG или ПЭГ DМА) представляют собой со-солюбилизаторы в органическом растворителе. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения липидная смесь по существу состоит из катионного аминолипида, нейтрального липида, холестерина и ПЭГ-модифицированного липида. В других предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения липидная смесь состоит из катионного липида, DOPE (или другого вспомогательного липида, либо ионизируемого, либо с перманентным катионным зарядом), холестерина и ПЭГ-конъюгированного липида при различных молярных соотношениях. Предпочтительные мольные диапазоны составляют от 40 до 60 мол. % катионного липида, от 10 до 30% нейтрального липида, от 20 до 40% холестерина и от 1 до 10% ПЭГ-модифицированного липида.

Нацеливающий липид может быть добавлен к липидной смеси, например, diVA-ПЭГ750-diVА (или другой VA-конъюгированный нацеливающий липид) в мольном соотношении от 0,1 до 5 (нацеливающий липид: общий липид).

Общая концентрация липидов составляет менее 25 мг/мл, предпочтительно менее 5 мг/мл. Липидную смесь фильтруют через мембранный фильтр, размером, например, 0,45 или 0,2 мкм.

Согласно настоящему изобретению липидную смесь объединяют с буферизированным водным раствором. Буферизированный водный раствор может представлять собой раствор, в котором буфер имеет pH меньше чем рКа протонированного липида в липидной смеси. Примеры подходящих буферов включают цитратный, фосфатный и ацетатный. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительными будут буфера с диапазоном концентрации 1-1000 мМ аниона, в зависимости от химического состава нуклеиновых кислот, которые будут инкапсулированы, и оптимизация концентрации буфера может быть важна для достижения высоких уровней загрузки. Для этого может быть удобным добавить криозащитное средство и/или неионное растворенное вещество, которые будут уравновешивать осмотический потенциал через мембрану частиц, например, когда частицы диализуют для удаления этанола, повышения pH, или фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Количество нуклеиновой кислоты в буфере составляет от около 0,08 до 0,8 мг/мл.

В процессе добавления этанола температура водного раствора составляет от 25 до 45°C, предпочтительно от 30 до 40°C. Раствор этанола добавляется к водному раствору либо посредством распыления на границу раздела фаз воздух-вода, в узком потоке, либо через границу раздела фаз жидкость-жидкость между этанолом, доставляемым через трубку, которая погружена, и водным раствором.

Органический раствор добавляется самотеком или с помощью насоса, доставляющего органический раствор к водному раствору с контролируемой скоростью, предпочтительно с постоянной скоростью. Доставка органического раствора может быть завершена в течение от 1 мин до 100 мин, предпочтительно от 1 до 25 минут. Органический раствор может добавляться через одно распыление или струю, через трубку или сопло, или через многосопельные устройства. Во время добавления органического раствора в водный раствор, получающийся раствор может перемешиваться посредством вихревого движения, встряхивания или рециркуляции. Дополнительная стадия приводит к конечной концентрации, которая предпочтительно составляет от 25 до 45% этанола, наиболее предпочтительно 35% этанола.

Конечный раствор обрабатывают с целью удаления органического растворителя, посредством диализа или фильтрации, предпочтительно посредством диафильтрации. По мере того как этанол удаляется, водный раствор преобразуется в раствор, буферизированный при нейтральном pH, от pH 6,8 до pH 7,5, предпочтительно, pH 7,2, например фосфатным или HEPES буфером. Получающийся водный раствор предпочтительно стерилизуют перед хранением или применением, например, посредством фильтрования через фильтр 0,22 мкм.

Липосомы, инкапсулирующие отрицательно заряженные терапевтические полимеры

Описанные в настоящей заявке способы могут применяться для получения частиц липидов с отрицательно заряженным терапевтическим полимером, например, молекулой РНК. В способах, описанных в настоящей заявке, смесь липидов объединяется с водным раствором полимера. Полимер эффективно инкапсулируется в полученных липидных частицах.

Наночастицы могут включать полианионное активное вещество или терапевтический агент, например РНК, и один, два или три биосовместимых полимеров. Типичные терапевтические агенты включают нуклеиновые кислоты, противоопухолевые агенты, такие как таксаны.

Суммарный заряд отрицательно заряженного полимера, который должен быть меньше или равен числу положительных зарядов в липидной смеси, в момент добавления составляет предпочтительно от 0,06 до 0,16 (по массе). Например, когда применяется РНК, инкапсулированные нуклеиновые кислоты присутствуют в конечном соотношении РНК: липид от 0,06 до 0,16, заряд: заряд (-/+), предпочтительно от 1:2,5 до 1:1.

Когда смесь липидов содержит катионный липид с зарядом, липидные везикулы могут образовываться в присутствии отрицательно заряженного полимера, чтобы инкапсулировать и захватить полимер. Полученные частицы могут быть нейтрализованы посредством повышения pH среды до физиологического pH или выше. Полученные таким образом везикулы обеспечивают композиции с одинаковым размером везикул с высоким содержанием нуклеиновых кислот.

В любом случае, везикулы, инкапсулирующие полимер (наночастицы), имеют размер в интервале от 50 до 150 нм.

В соответствии со способом, описанным в настоящей заявке, липидную смесь объединяют с буферизированным водным раствором, который может содержать отрицательно заряженный полимер. Буферизированный водный раствор может представлять собой раствор, в котором буфер имеет pH менее чем рКа протонированного липида в липидной смеси. Примеры подходящих буферов включают цитратный, фосфатный, ацетатный и MES. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительными будут буфера с диапазоном концентрации 1-1000 мМ аниона, в зависимости от химического состава полимера, который подлежит инкапсуляции, и оптимизация концентрации буфера может быть важна для достижения высоких уровней загрузки.

Может быть подходящим добавление криозащитного средства и/или неионного растворенного вещества, которое будет уравновешивать осмотический потенциал через мембрану частиц, когда частицы диализуют для удаления этанола, повышения pH, или при смешении с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем.

Для РНК схема описанного в настоящей заявке способа показана на Фиг. 1. Растворы получаются растворением лиофилизованного или твердого материала в воде, предпочтительно буферизированной при pH 3,5-4,5, например, с 50 мМ цитрата. Количество нуклеиновой кислоты в буфере составляет от 0,08 до 0,8 мг/мл. Во время добавления этанола температура водного раствора поддерживается от 25 до 45°C, предпочтительно от 30 до 40°C. При применении одноцепочечной нуклеиновой кислоты краткосрочное нагревание при повышенной температуре может быть благоприятно, например, 1-2 минут при 65°C.

Этанольный раствор добавляют к водному раствору либо посредством распыления на границу раздела фаз воздух-вода, в узком потоке, либо через границу раздела фаз жидкость-жидкость между этанолом, доставляемым через трубку, которая соединена с контейнером, и водным раствором.

Органический раствор добавляется посредством доставки органического раствора к водному раствору с контролируемой скоростью, предпочтительно с постоянной скоростью. Доставка органического раствора может быть завершена в течение от 1 мин до 100 мин, предпочтительно от 1 до 25 минут. Органический раствор может быть добавлен через одно распыление или струю, через трубку или сопло или через многосопельное устройство. Во время добавления органического раствора в водный раствор, полученный раствор может перемешиваться посредством вихревого движения, встряхивания или рециркуляции. Дополнительная стадия приводит к конечной концентрации достаточной, чтобы разрушить структуру липосомального бислоя, предпочтительно от 25 до 45% этанола, наиболее предпочтительно 35% этанола.

Для частиц липидов и нуклеиновых кислот конечная концентрация РНК составляет от 0,001 до 1 мг/мл, предпочтительно от 0,01 до 0,5 мг/мл, наиболее предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/мл. Окончательное соотношение лекарственное средство/липиды, составляет от 0,06 до 0,16 масса:масса (от 2,5:1 до 1:1, отношение заряд:заряд).

Полученный раствор обрабатывают для удаления органического растворителя, посредством диализа или фильтрации, предпочтительно посредством диафильтрации. В то время как этанол удаляется, водный раствор преобразуется в раствор, буферизированный при нейтральном pH, от pH 6,8 до pH 7,5, предпочтительно, pH 7,2, например фосфатный буфер. Полученный водный раствор предпочтительно стерилизуют перед хранением или применением, например, фильтрованием через фильтр размера 0,22 мкм.

Окончательная эффективность инкапсуляции получается более 85%. Окончательный средний диаметр частиц составляет от 50 до 150 нм. Индекс пол и дисперсности ПДИ получают менее 0,2, предпочтительно менее 0,1.

Лиофилизация

Настоящее изобретение в частности относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, которая при восстановлении имеет минимальное количество крупных агрегатов. Такие большие агрегаты могут иметь размер более около 0,2 мкм, более около 0,5 мкм или более около 1 мкм, и могут быть нежелательными в восстановленном растворе. Размеры агрегатов могут быть измерены с применением различных методов, включая те, которые указаны в Фармакопее США 32 <788>, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Исследования могут включать подсчет количества частиц в режиме светотени, тест подсчета микроскопических частиц, лазерную дифракцию и оптическое зондирование одиночных частиц. В одном варианте выполнения настоящего изобретения размер частиц в данном образце измеряется с помощью лазерной дифракции и/или оптического зондирования одиночных частиц. Динамическое рассеяние света (DLS) может быть использовано для измерения размера частиц, но оно основано на броуновском движении, таким образом, методика не может обнаружить некоторые крупные частицы. Лазерная дифракция основана на различиях в показателе преломления между частицей и суспензионной средой. Методика способна обнаруживать частицы от субмикронного до миллиметрового диапазона. Относительно небольшие (например, около 1-5% по массе) количества более крупных частиц могут быть определены в суспензии наночастиц. Оптическое зондирование одиночных частиц (SPOS) включает исследование частиц методом затенения разбавленных суспензий для подсчета отдельных частиц около 0,5 мкм. Зная концентрацию частиц измеряемого образца, можно вычислить массовый процент агрегатов или концентрацию агрегатов (частицы/мл).

Образование агрегатов может происходить при замораживании и/или на стадии высушивания лиофилизации, например, в результате дегидратации поверхности частиц. Процесс замораживания оказывает концентрирующий эффект, который может уменьшать расстояние между частицами, так как образуется лед (Alison et al., Biochim Biophys Acta. 2000 Sep 29; 1468 (1-2): 127-38; Armstrong and Anchordoquy, J Pharm Sci. 2004 Nov; 93 (11): 2698-709). Это обезвоживание можно избежать с помощью лиопротекторов, таких как полисахариды, в суспензии перед лиофилизацией. Подходящие полисахариды включают сахарозу, лактулозу, лактозу, мальтозу, трегалозу или целлюлозу, койибиозу, нигерозу, изомальтозу, трегалозу, софорозу, ламинарибиозу, гентиобиозу, туранозу, мальтулозу, палатинозу, генциобиулозу, маннобиозу, мелибиозу, мелибиулозу, рутинозу, рутинулозу и ксилобиозу. В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиция содержит полисахарид, который представляет собой сахарозу. В другом варианте выполнения композиция содержит полисахарид, который представляет собой трегалозу. Результаты заявителей показывают, что, если сравнивать с исходной суспензией, при восстановлении получаются эквивалентные распределения по размерам, определенные методом DLS..

Ранее полагали, что витрификация, процесс иммобилизации макромолекул в стеклообразном наполнителе, не является фактором, вносящем вклад в предотвращение агрегации липосом, и что необходимы гипертонические растворы сахара (Alison et al.). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что результаты стадий замораживания и высушивания лиофилизации зависят от определенного соотношения липид: полисахарид (масса:масса), которое обеспечивает средства для предотвращения этой агрегации липосом, нарушения липосомального диффузионного барьера и высвобождения инкапсулированных РНК с образованием липоплексов нуклеиновых кислот. В одном варианте выполнения настоящего изобретения композиция содержит от 12 до 15% (масса:масса) сахарозы и от 5 до 20 мг/мл липида, предпочтительно 12% сахарозы и 9 мг/мл липида. Более предпочтительно, чтобы композиция также содержала буфер, наиболее предпочтительно HEPES при нейтральном pH.

Стадии лиофилизации проводятся в подходящей стеклянной емкости, предпочтительно цилиндрическом стеклянном флаконе, объемом 10 мл. Стеклянный флакон должен выдерживать резкие изменения температуры от менее чем -40°C до выше комнатной температуры за короткие периоды времени и равномерно уменьшаться. Композиция, содержащая наполнитель и липосомы, инкапсулирующие нуклеиновую кислоту, добавляется во флакон, предпочтительно в объеме 3 мл, предпочтительно с 9 мг/мл липида.

Стадия лиофилизации может включать замораживание композиции при температуре более около -40°C, или, например, менее около -30°C, образуя замороженную композицию; и высушивание замороженной композиции с образованием лиофилизованной композиции. Стадия замораживания предпочтительно приводит к линейному уменьшению температуры до конечной в течение около 6 минут, предпочтительно при 1°C/мин от 20 до -40°C. Более предпочтительно может применяться сахароза при 12-15%, и стадия высушивания при около 50-150 мТорр, сначала при низкой температуре от около -15 до около -35°C, а затем при более высокой температуре от комнатной температуры до около 25°C, и завершается в течение от трех до семи дней. В другом варианте выполнения настоящего изобретения может применяться трегалоза и стадия высушивания при около 50-100 мТорр, сначала при низкой температуре от около 0 до около -15°C, а затем при более высокой температуре.

Другим объектом настоящего изобретения является способ предотвращения существенной агрегации частиц в фармацевтической композиции наночастиц, включающий добавление сахара и соли в лиофилизируемую композицию для предотвращения агрегации и высвобождения нуклеиновой кислоты из внутренней части липосомы.

Фармацевтические композиции

Липидные частицы, раскрытые в настоящей заявке, в частности при связывании с терапевтическим средством, могут быть получены в виде фармацевтической композиции, например, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый разбавитель, эксципиент или носитель, как например, физиологической соляной раствор или фосфатный буфер, выбранные в соответствии с путем введения и стандартной фармацевтической практикой. Как очевидно специалисту в данной области техники, носители могут быть выбраны на основе пути введения, как описано далее, расположения целевого высвобождения, лекарственного средства, которое подлежит доставке, периода доставки лекарственного средства и т.д.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут вводиться пациенту любыми средствами, известными в данной области техники, включая пероральный и парентеральный пути введения. Термин "пациент," как применяется в описании настоящего изобретения, относится к людям, а также к не принадлежащим к человеческому роду организмам, включая, например, млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб. Например, не принадлежащими к человеческому роду организмами могут быть млекопитающие (например, грызун, мышь, крыса, кролик, обезьяна, собака, кошка, примат или свинья). В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения парентеральные пути введения являются желательными, так как они позволяют избежать контакта с пищеварительными ферментами, которые присутствуют в пищеварительном тракте. Согласно таким вариантам выполнения настоящего изобретения, композиции согласно настоящему изобретению могут вводиться посредством инъекции (например, внутривенно, подкожно или внутримышечно, посредством внутрибрюшинной инъекции), ректально, вагинально, местно (посредством порошков, кремов, мазей или капель), или посредством ингаляции (в виде спреев).

В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения, наночастицы согласно настоящему изобретению вводятся субъекту, нуждающемуся в этом, системно, например, парентерально, или посредством внутривенного вливания или инъекции.

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения фармацевтические композиции, содержащие частицы липид-нуклеиновая согласно настоящему изобретению получают в соответствии со стандартными методиками, и они дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. В общем, в качестве фармацевтически приемлемого носителя применяется соляной раствор. Другие подходящие носители включают, например, воду, буферизированную воду, 0.9% соляной раствор, 0.3% глицин, сахар или полисахарид, например, сахарозу, мальтозу, трегалозу, каррагенин, ксантановую камедь, маннит, фруктан (например, инулин), циклодекстрин, ксилит, сорбит или полиэтиленгликоль (ПЭГ), включая гликопротеины для усиления стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин. Объемообразующие агенты, криозащитные средства и/или лиопротекторы, а также захватывающие металлы вещества, например, EDTA, могут быть включены. В композициях, содержащих соляной раствор или другие носители, содержащие соли, носитель предпочтительно добавляется после образования липидной частицы. Таким образом, После формирования композиций липид-нуклеиновая кислота, композиции могут быть разбавлены фармацевтически приемлемыми носителями, такими как нормальный соляной раствор.

Полученные фармацевтические препараты могут быть стерилизованы посредством обычных хорошо известных методик стерилизации. Водные растворы могут затем быть упакованы для применения или отфильтрованы при асептических условиях и лиофилизиорваны, причем лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным раствором до введения. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для условий, приближенных к физиологическим, как например агенты для установление pH и буферизующие агенты, агенты для установления тоничности, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия или хлорид кальция. Кроме того, липидная суспензия может включать липид-защитные агенты, которые защищают липиды от свободнорадикальных и липидных перокислительных повреждений при хранении. Липофильные свободнорадикальные гасители, такие как а-токоферолд и водорастворимые специфичные к железу хелатирующие агенты, такие как ферриоксамин, являются подходящими.

Концентрация липидной частицы или частицы липид-нуклеиновая кислота в фармацевтических композициях может широко варьироваться, т.е., от менее около 0.01%, как правило при или по меньшей мере около 0.05-5%, до самое большее от 10 до 30 мас. %, и выбирается прежде всего на основе жидких объемов, вязкостей и т.д., в соответствии с конкретным выбранным путем введения. Например, концентрация может быть увеличена для более низкой загрузки жидкости согласно лечению. Это может быть особенно желательно в случае пациентов, имеющих связанную с атеросклерозом сердечную недостаточность с застойными явлениями или тяжелую гипертензию. Альтернативно, комплексы, состоящие из раздражающих липидов, могут быть разбавлены до низких концентраций для уменьшения воспаления в месте введения. В одной группе вариантов выполнения настоящего изобретения, нуклеиновая кислота будет иметь прикрепленную метку и будет применяться для диагностики (посредством указания присутствия комплементарной нуклеиновой кислоты). В этом случае количество вводимых комплексов будет зависеть от конкретной применяемой метки, тяжести заболевания, подлежащего диагностике, и решения клинициста, но в общем будет составлять от около 0.01 до около 50 мг на кг массы тела, предпочтительно от около 0.001 до около 5 мг на кг массы тела.

Способ применения

Липидные частицы, описанные в настоящей заявке, могут применяться для доставки отрицательно заряженного терапевтического полимера, такого как нуклеиновая кислота в клетку, in vitro или in vivo. Хотя последующее описание различных методов с применением липидных частиц и связанных с ними фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению иллюстрируются посредством описания частиц липидов и нуклеиновых кислот, следует понимать, что эти способы и композиции могут быть легко адаптированы для доставки любого терапевтического средства для лечения любого заболевания или расстройства, которая может быть благоприятной для такого лечения.

В некоторых вариантах выполнения настоящее изобретение обеспечивает способы введения нуклеиновой кислоты в клетку. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами для введения в клетки являются siPHK, иммуностимулирующие олигонуклеотиды, плазмиды, антисмысловые и рибозимы. Эти способы могут осуществляться посредством контакта частиц или композиций согласно настоящему изобретению с клетками в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошла внутриклеточная доставка.

Композиции согласно настоящему изобретению могут адсорбироваться на почти любом типе клеток. Сразу после адсорбции частицы липид-нуклеиновая кислота могут быть либо эндоцитированы частью клеток, обменом липидов с клеточными мембранами, либо слиться с клетками. Перенос или включение нуклеиновой кислоты как части комплекса может происходить посредством любого из этих путей. Без намерения ограничения объема изобретения, можно полагать, что в случае частиц, поглощенных клеткой посредством эндоцитоза, частицы затем взаимодействуют с эндосомальной мембраной, что приводит к дестабилизации эндосомальной мембраны, возможно, посредством формирования небислойных фаз, что приводит к введению инкапсулированной нуклеиновой кислоты в клеточную цитоплазму. Аналогичным образом, в случае прямого слияния частиц с плазматической мембраной клетки, если имеет место слияние, липосомальная мембрана включается в клеточную мембрану, и содержимое липосомы смешивается с внутриклеточной жидкостью. Контакт между клетками и композициями липидов и нуклеиновых кислот, если осуществляется in vitro, будет происходить в биологически совместимой среде. Концентрация композиции может широко варьировать в зависимости от конкретного применения, но обычно составляет от 1 мкмоль до 10 ммоль. В некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения обработка клеток композициями липидов и нуклеиновых кислот обычно будет осуществляться при физиологических температурах (37°C) в течение периода от 1 до 24 часов, предпочтительно от 2 до 8 часов. В случае применения in vitro, доставка нуклеиновых кислот может быть осуществлена в любую клетку, выращенную в культуре, будь она растительного или животного происхождения, позвоночных и беспозвоночных, и из любой ткани или типа. В предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения клетками будут животные клетки, более предпочтительно клетки млекопитающих и наиболее предпочтительно клетки человека.

В одной группе вариантов выполнения настоящего изобретения суспензия частиц липидов и нуклеиновой кислоты добавляется к клеткам с конфлюентностью 60-80%, имеющим плотность клеток от около 103 до около 105 клеток/мл, более предпочтительно около 2×104 клеток/мл. Концентрация суспензии, добавляемой к клеткам, предпочтительно составляет от около 0,01 до 20 мкг/мл, более предпочтительно около 1 мкг/мл.

Типичные области применения включают применение хорошо известных методик для обеспечения внутриклеточной доставки siPHK для нокдауна или сайленсинга конкретных клеточных мишеней. В качестве альтернативы, применения включают доставку последовательностей ДНК или мРНК, которые кодируют терапевтически полезные полипептиды.

Способы согласно настоящему изобретению могут быть осуществлены in vitro, ex vivo или in vivo. Например, композиции согласно настоящему изобретению могут также применяться для доставки нуклеиновых кислот в клетки в живом организме с применением способов, которые известны специалистам в данной области техники.

В случае in vivo введения фармацевтические композиции предпочтительно вводить парентерально, т.е. внутрисуставно, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения фармацевтические композиции вводятся внутривенно или внутрибрюшинно с помощью болюсной инъекции.

В других способах фармацевтические препараты можно вводить в контакт с тканью-мишенью посредством непосредственного нанесения препарата на ткань. Нанесение может осуществляться посредством местной, «открытой» или «закрытой» методики. Термин «местная» означает непосредственное нанесение фармацевтического препарата на ткань, подвергающуюся воздействию условий среды, такую, как кожа, ротовая часть глотки, наружный слуховой проход и тому подобное. «Открытые» методики представляют собой такими методики, которые включают надрезание кожи пациента и непосредственную визуализацию основной ткани, на которую наносятся фармацевтические препараты. Это обычно достигается посредством хирургического вмешательства, такого как торакотомии для доступа к легким, брюшная лапаротомии для доступа к брюшной полости или другого прямого хирургического подхода к ткани-мишени. «Закрытые» методики являются инвазивными методиками, в которых внутренние ткани-мишени не визуализируются непосредственно, но становятся доступными с помощью проникающих инструментов через небольшие раны на коже. Например, препараты могут быть введены в брюшину с помощью лаважной иглы. Кроме того, фармацевтические препараты могут быть введены к мозговым оболочкам или к спинному мозгу посредством инфузии во время люмбальной пункции с последующим соответствующим позиционированием пациента, как обычно практикуется при спинномозговой анестезии или метризамидной визуализации спинного мозга. Кроме того, препараты могут вводиться с помощью эндоскопических устройств.

Композиции липид-нуклеиновая кислота также могут быть введены в виде аэрозоля, вдыхаемого в легкие, или посредством прямой инъекции в месте заболевания.

Способы согласно настоящему изобретению могут быть осуществлены на различных субъектах или хозяевах. Предпочтительные субъекты или хозяева включают виды млекопитающих, таких как люди, нечеловекообразные приматы, собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы и тому подобное. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения субъектом является млекопитающее, такое как человек, нуждающийся в лечении или профилактике заболевания или расстройства, например, субъект с диагнозом или рассматриваемый как с повышенным риском заболевания или расстройства.

Дозы для частиц липидов и терапевтического агента согласно настоящему изобретению будут зависеть от соотношения терапевтического агента и липидов и от мнения лечащего врача, основанного на возрасте, массе и состояния пациента.

В одном варианте выполнения настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. Эти методы обычно включают контакт клетки с липидной частицей согласно настоящему изобретению, которая связана с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Как применяется в описании настоящего изобретения, термин «модулировать» относится к изменению экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. В разных вариантах выполнения модулирование может означать увеличение или усиление, или может означать, уменьшение или ослабление. Способы измерения уровня экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида известны и доступны в данной области техники и включают, например, способы на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR) и иммуногистохимических способов. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения уровень экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида увеличивается или уменьшается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, или более чем на 50% по сравнению с соответствующей контрольной величиной.

Например, если желательно повысить экспрессию полипептида, нуклеиновая кислота может представлять собой экспрессионный вектор, который включает в себя полинуклеотид, который кодирует желаемый полипептид. С другой стороны, если желательно снизить экспрессию полинуклеотида или полипептида, тогда нуклеиновая кислота может представлять собой, например, антисмысловой олигонуклеотид, siPHK, или микроРНК, которые содержат полинуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует целевой полипептид, таким образом нарушая экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Альтернативно, нуклеиновой кислотой может быть плазмида, которая экспрессирует такой антисмысловой олигонуклеотид, siPHK или микроРНК.

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения активный агент нуклеиновая кислота или терапевтическое средство выбирается из siPHK, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать siPHK, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и в которой siPHK, микроРНК или антисмысловая РНК содержит олигонуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или его комплемент, таким образом, что экспрессия полипептида уменьшается.

В других вариантах выполнения настоящего изобретения нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или фрагмент, таким образом, что экспрессия полипептида или функционального варианта или фрагмента увеличивается.

В родственных вариантах выполнения настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или расстройства, характеризующихся избыточной экспрессией полипептида у субъекта, включающему введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, в которой терапевтическое средство выбирается из siPHK, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать siPHK, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид и в которой siPHK, микроРНК или антисмысловая РНК содержит олигонуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или его комплемент.

В другом родственном варианте выполнения настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или расстройства, характеризующиеся сверхэкспрессией полипептида у субъекта, включающему введение субъекту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, в которой терапевтическое средство представляет собой плазмиду, кодирующую полипептид или его функциональный вариант или его фрагмент.

Анализ срока хранения

Термин "срок хранения", как применяется в настоящей заявке, относится к периоду времени, в течение которого наночастицы липид:РНК могут храниться (при определенныхи условиях, например, в буфере при 4°C.) до потери их биологической активности.. Биологическая активность, проанализированная для определения сролка хранения согласно настоящему изобретению, представляет собой способность наночастиц липид:РНК трарнсфектировать клетки млекопитающих in vivo после внутривенного введения.

В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения срок хранения определяется посредством хранения наночастиц липид:РНК в течение различных периодов времени, инъекции одному или более тестируемым животным и анализа взятых у животного тканей на трансфекцию (например, экспрессия репортерного гена), как описано выше и как показано в примерах.

Очевидно, что срок хранения может быть выражен в абсолютном выражении, то есть продолжительность времени, в течение которого композиция может храниться до потери активности. Альтернативно, срок хранения может быть выражен в относительном выражении посредством ссылки на другую композицию. Таким образом, например, когда наночастицы липид:РНК показывают трансфекционную активность после фексированного периода хранения, и эта активность больше активности другого комплекса, подобным образом хранящегося в течение такого же периода времени, рассматриваемый комплекс, как говорят, имеет увеличенный срок хранения по сравнению с отличным комплексом.

Наборы, содержащие полианионное терапевтическое средство, инкапсулированное в липосомах

Настоящее изобретение также обеспечивает наборы для получения наночастиц липид:РНК, описанных в настоящей заявке. Такие наборы могут быть получены из легко доступных веществ и реагентов, как описано выше. Например, такие наборы могут содержать любое одно или более из следующих веществ: липосомы, нуклеиновая кислота (РНК, ДНК, одно- или двухнитиевая), гидрофильные полимеры, гидрофильные полимеры с нацеливающими составляющими, такими как Fab' фрагменты, и инструкции. Широкое многообразие наборов и компонентов может быть получено согласно настоящему изобретению, в зависимости от предназначения набора и конкретных потребностей потребителя. Например, набор может содержать любую одну из ряда нацеливающих составляющих для нацеливающих для нацеливания комплекса на специфический тип клетки, как описано выше.

Набор при необходимости может содержать инструкции, включающие руководства (т.е. протоколы) по применению наночастиц липид:РНК для трансфекции клеток in vivo, ex vivo, или in vitro. Как правило, в инструкции описывается методика получения наночаситц липид:РНК из липосом и нуклеиновой кислоты, как описано выше. В инструкции также описывается как смешивать гидрофильный полимер с наночастицами липид:РНК. Кроме того, в инструкции может описываться методика трансфекции клеток наночастицами липид:РНК.

Примеры

Пример 1: Влияние концентрации на размер частиц РНК-липиды.

Этот пример показывает влияние концентрации siPHK и липидов на размер частиц.

Для получения наночастиц способом, описанным в настоящей заявке, катионный липид, DOPE, холестерин, PEG-BML и DIVA-PEG750-DIVA солюбилизировали в абсолютном этаноле при молярном соотношении 50:10:38:2:5, соответственно. siPHK солюбилизировали в 50 мМ цитратном буфере при pH 4,5.

Буфер, содержащий siPHK, довели до 35-40°C при непрерывном перемешивании в сосуде для смешивания. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхности буфера, содержащего siPHK, с применением коллектора/сопловой решетки для спонтанного образования липосом, загруженных siPHK. Концентрации липидов и РНК доводили до конечного диапазона концентраций siPHK от 0,05 до 0,5 мг/мл, до отношения лекарственное средство: липид 0,08 (масса:масса), а также концентрации этанола 35%. Соотношение липидов и siPHK поддерживали постоянным для всех исследуемых условий.

Липосомы, загруженные siPHK, разбавляли до ~10% этанола, чтобы стабилизировать частицы, и подвергали диафильтрации относительно 10-кратных объемов PBS (pH 7,2) для удаления этанола и замены буфера. Конечный продукт фильтровали через PES фильтр размера 0,22 мкм, стерилизующего класса, для снижения общего количества микробов. Объемный средний размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS). Результаты показаны в Таблице 1 и на Фиг. 2.

Результаты показывают, что размер частиц возрастает с увеличением концентрации siPHK (в мг/мл). Снижение концентраций липидов и siPHK (при том же относительном показателе) уменьшает размер частиц, а при увеличении концентрации увеличивается размер частиц. Конечные концентрации siPHK от 0,05 до 0,5 мг/мл обеспечивают наночастицы со средним диаметром частиц от 96,7 до 141,9 нм, менее 150 нм, и с индексом полидисперсности менее 0,2 во всех случаях.

Частицы размера менее 150 нм с PDI менее 0,2 образуются с помощью способа, описанного в настоящей заявке, без получения предварительно сформированных пустых липидных везикул и/или без механической обработки.

Пример 2: Влияние параметров процесса на образование частиц РНК-липиды

Этот пример показывает влияние различных параметров процесса на образование частиц РНК-липиды. Некоторые параметры подвергались проверке во время этого эксперимента, в том числе температура, концентрация этанола, буфера, соотношения липид: siPHK, и тип сопла, применяемого для диспергирования липидного раствора.

HEDC, DOPE, холестерин, ПЭГ-BML, и diVA-n3T750-diVA растворяли в абсолютном этаноле при молярном соотношении 40:30:25:5:2. Буфер, содержащий siPHK, доводили до указанной температуры при непрерывном перемешивании в сосуде для смешивания. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхности буфера, содержащего siPHK, с применением сопла для спонтанного образования липосом, загруженных siPHK. Липиды объединяли с siPHK так, чтобы достичь конечной концентрации siPHK 0,1 мг/мл при указанном соотношении лекарственное средство/липиды и указанном конечном проценте этанола.

siPHK солюбилизировали в цитратном буфере, концентрация которого варьировалась от 25 до 100 мМ, и pH варьировался от 3,5 до pH 6,5. Температура смеси варьировалась от 25 до 45°C. Конечная концентрация этанола варьировалась от 25 до 45%. Соотношение лекарственное средство: липид (масса/масса) варьировалось от 0,07 до 0,11. Внутренний диаметр (ID) гидратационного сопла варьировался от 0,005 до 0,125 дюйма. Каждое условие принимали в виде измерения для сравнения влияния каждого параметра процесса. Если не указано иное, каждое условие осуществляли в 50 мМ цитратном буфере, pH 4,5, 35°C, 35% конечной концентрации этанола, при соотношение лекарственное средство: липиды 0,07 и при внутреннем диаметре сопла 0,005 дюйма.

Липосомы, загруженные siPHK, разбавляли до 10% этанола, чтобы стабилизировать частицы, и подвергали диафильтрации относительно 10-кратных объемов PBS (pH 7,2) для удаления этанола и замены буфера. Конечный продукт фильтровали через PES фильтр, размера 0,22 мкм, стерилизующего класса, для снижения общего количества микробов.

Таблица 2 и Фиг. 3 показывают влияние pH на средний диаметр и PDI наночастиц липидов и нуклеиновых кислот. Увеличение буфера pH приводило к увеличению размера частиц, который, однако, составлял менее 150 нм среднего размера частиц.

Таблица 3 показывает влияние концентрации буфера на различные параметры. Результаты показали, что увеличение концентрации буфера снижает восстановление siPHK. Средний диаметр частиц и PDI оказался неизмененным. Минимальный размер частиц наблюдался при pH 3,5, и максимум восстановления siPHK наблюдался для 25 мМ цитратного буфера.

Таблица 4 показывает, что увеличение температуры гидратации от 25 до 45°С, уменьшило размер частиц от 135,7 до 102,2 нм при одновременном повышении восстановления siPHK с 80% до 87%. Увеличение конечного процента этанола увеличило размер частиц при отсутствии влияния на восстановление siPHK, но снизило эффективность инкапсуляции до 88%.

Таблица 5 показывает, что при увеличении пониженного отношения лекарственное средство: липид, восстановление siPHK увеличилось 80 до 87%. Максимальное восстановление наблюдалось при соотношении лекарственное средство: липиды 0,07 (масса:масса). Все остальные измеряемые свойства не изменялись при изменении соотношения лекарственное средство: липиды. Этот результат является удивительным и неожиданным с точки зрения сведений, раскрытых в Maurer et al. и Semple et al., где описывается, что оптимальное восстановление составляет при отношении лекарственное средство: липиды (масса:масса) равным или более 0,16 (отношение липид: лекарственное средство (масса:масса) равно или менее 6,25). Полученные результаты подтверждают, что способ, описанный в настоящей заявке, приводит к противоположной тенденции.

Таблица 6 показывает, что увеличение внутреннего диаметра сопла в 25 раз не повлияло на размер частиц, эффективность инкапсуляции или восстановление siPHK. Существует значительная вариабельность в значении отверстии сопла, используемого для добавления этанола/липидов к поверхности буфера. Такая вариабельность может обеспечить большое преимущество при масштабировании.

Пример 3: Сравнение раскрытого способа с контрольными способами серийного получения липосом

Эти результаты сравнения способа, описанного в настоящей заявке для получения частиц липид/нуклеиновая кислота, со способом, описанным в патенте США 6,858,225. Semple, et al. (контрольный способ или контрольная композиция, применяемая в контрольном способе) получали с применением композиции, полученной в примере 2. или применяя контрольный способ.

Композицию, полученную в Примере 2, состоящую из катионного липида, DOPE, холестерина, ПЭГ-конъюгированного липида и нацеливающего липида, совместно солюбилизировали в молярном соотношении 40:30:25:5:2 (смотрите пример 2 выше).

Контрольную композицию, состоящую из DODAP, DSPC, холестерина и ПЭГ-ССВ-14, совместно солюбилизировали в молярном соотношении 25:20:45:10.

В способе согласно Примеру 2 липиды солюбилизировали при 4,32 мг/мл в абсолютном этаноле, тогда как siPHK солюбилизировали при 0,163 мг/мл в 50 мМ цитрата, pH 4,5. Раствор siPHK доводили до 35 до 40°C при непрерывном перемешивании в сосуде для смешения. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхность буфера, содержащего siPHK, с применением устройства коллектор/сопло. Конечная концентрация этанола составляла 35%, и конечное соотношение липид/siPHK составляло 14:1 (масса:масса). Полученные частицы затем разбавляли до 10% этанола, а затем подвергали диафильтрации относительно 10-кратного объема PBS (pH 7,2).

В контрольном способе липиды солюбилизировали при 25 мг/мл в абсолютном этаноле, a siPHK солюбилизировали при 4,17 мг/мл в 300 мМ цитрата, pH 4,0. Буфер, содержащий siPHK, выдерживали при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в сосуде для смешения. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхность буфера, содержащего siPHK, с применением единственного сопла для спонтанного образования липосом, загруженных siPHK. Конечная концентрация этанола составила 40%, а конечное соотношение липид/siPHK составило 6:1 (масса:масса). После смешивания суспензию липид/siPHK переносили в экструдер на 10 мл, снабженный двумя 100 нм поликарбонатными мембранами, и предварительно инкубировали при 65°C. Суспензию подвергали экструзии с применением десяти проходов при 300 фунтов на кв. дюйм. Получающиеся частицы подвергали диафильтрации относительно 10-кратных объемов PBS, pH 7,2.

Частицы, полученные каждым способом, пропускали через фильтр размера 0,22 мкм. Средний размер частиц, PDI и ЕЕ измеряли, как описано в настоящей заявке.

Способ в соответствии с примером 2 обеспечивал более мелкие липидные наночастицы, чем контрольнйы способ без стадии экструзии (Фиг. 4). Размер частиц, полученных контрольным способом, измеряли перед экструзией. Частицы, полученные из композиции NDT-0009 с применением контрольного способа, имели средний размер частиц более 250 нм. После экструзии и диафильтрации средний размер частиц уменьшается до 128 нм. Способ в соответствии с примером 2 обеспечивал частицы со средним размером частиц менее 150 нм без экструзии. Аналогичная тенденция наблюдалась для контрольной композиции.

Способ в соответствии с примером 2 оказался более эффективным при инкапсуляции siPHK в липидные наночастицы, чем контрольный способ (Фиг. 5). Эффективность инкапсуляции (ЕЕ) частицами, полученными способом согласно примеру 2, выше, чем у частиц, образованных посредством контрольного способа (измеряли до диафильтрации в обоих продуктах). ЕЕ частиц, полученных способом в соответствии с примером 2, более чем на 95% выше, чем ЕЕ, определенная для частиц, образованных контрольным способом. В контрольном способе большая часть свободной siPHK удаляется после диафильтрации, что приводит к улучшению ЕЕ конечного продукта.

Способ в соответствии с примером 2 обеспечивает наночастицы с более высокой эффективностью инкапсуляции, чем контрольный способ (Фиг. 6). Окончательное восстановление siPHK способом в соответствии с примером 2 было более чем в два раза больше, по сравнению с восстановлением, которое получается согласно контрольному способу (72% против 33%), где измерения проводили диафильтрации для обоих продуктов. Эти данные отражают улучшение ЕЕ, а также отсутствие стадии экструзии в способе в соответствии с примером 2. Способ в соответствии с примером 2 обеспечивает лучшее восстановление siPHK, потому что дополнительная стадия экструзии в случае контрольного способа структурно изменяет липосомы, и при этом по-видимому siPHK диссоциирует из частиц. Эти результаты показывают, что способ, описанный в настоящей заявке, обеспечивает некоторые преимущества по сравнению с контрольным способом благодаря уменьшению количества стадий процесса при одновременном повышении эффективности инкапсуляции и выхода наночастиц со средним размером частиц менее 150 нм.

Пример 4: Сравнение вариабельности при масштабировании серийного производства липосом

Способ, который описан в примере 2, осуществляли с различными композициями липидов, которые включали комбинацию перманентно заряженного (HEDC) катионного липида и ионизируемого (S104) катионной липидной молекулы. HEDC, S104, DOPE, холестерин, ПЭГ - BML и DIVA - ПЭГ 750-DIVA растворяли в абсолютном этаноле при молярном соотношении 20:20:30:25:5:2. При масштабировании оценивали различные молекулы siPHK, различные объемы партий и различные соотношения siPHK (лекарственное средство)/липиды. Таблица 7 обобщает результаты, характеризующие наночастицы, полученные при ряде условий.

Таблица 7

Полученные результаты показывают, что способ, описанный в настоящей заявке, является достаточно надежным. Похожие размер частиц и PDI были получены при масштабировании, охватывающем до 50-кратный диапазон. Размер частиц систематически был менее 100 нм, с выходами продукта >90%. Значения индекса полидисперсности находились в очень низком диапазоне, что свидетельствует о почти монодисперсной популяции везикул.

Пример 5: Сравнение вариабельности при масштабировании серийного производства липосом для композиций, содержащих сахарозу

Способ, который описан в примере 2, осуществляли с HEDC, S104, DOPE, холестерином, ПЭГ -BML и DIVA- ПЭГ 750-DIVA, растворенными в этаноле при молярном соотношении 20:20:30:25:5:2. Сахарозу включали в препарат везикул, как описано в настоящей заявке. Партии различных объемов оценивали и подвергали замораживанию-оттаиванию. В Таблице 8 приведены результаты, характеризующие образованные наночастицы при ряде условий.

Приведенные результаты показывают, что замораживание-оттаивание не изменяет свойства липидных наночастиц. Результаты также показали, что вариабельность между партиями является довольно низкой, и что способ воспроизводимо обеспечивает однородные наночастицы.

Условия были установлены для стабилизации частиц лекарственное средство: липид посредством лиофилизации. Частицы лекарственное средство: липид, полученные в соответствии с примером 2, могут быть лиофилизированы без потери активности. Конечная концентрация сахарозы, при которой были сформированы частицы лекарственное средство: липид, составила 8% (масса/объем). Лиофилизированные препараты восстанавливали посредством добавления дистиллированной воды и измеряли их трансфекционную активность в легких мышей после внутривенной инъекции. Замораживание и оттаивание восстановленного препарат не влияло на активность. Результаты, приведенные в Таблице 9, демонстрируют, что частицы, полученные при использовании настоящего способа, описанные в настоящей заявке, сохраняют свои свойства во время лиофилизации и, следовательно, являются стабильными. В частности, размер частиц является стабильным и сохраняется до, в ходе и после лиофилизации.

Стабильность частиц является функцией липидной композиции, значений липид: РНК (масса:масса) и выбора полисахарида, применяемого в композиции. Методический подход, описанный в настоящей заявке для получения стабильных композиций комплексов липид: РНК, обладающих высокой биологической активностью in vivo, обеспечивает преимущества получения фармацевтически приемлемых препаратов, и, таким образом, облегчает доставку РНК на основе липосом.

Пример 6: Погруженное впрыскивание липидов

Способ, как описано в примере 2, был проведен модифицированным образом посредством получения везикул с применением погруженного впрыскивания. HEDC, S104, DOPE, холестерин, ПЭГ - BML и DIVA - ПЭГ750-DIVA растворяли в этаноле при молярном соотношении 20:20:30:25:5:2. В Таблице 10 приводятся результаты, характеризующие наночастицы, полученные в результате способа погруженного впрыскивания, по сравнению со способом добавления на поверхность. Полученные результаты показывают удивительный и неожиданный результат: средний размер частиц существенно уменьшается, когда липиды добавляются к водной фазе посредством погруженного впрыскивания.

Замороженные (содержащие сахарозу) композиции, полученные с применением полуодноразовой последовательности производства

Такой же способ применяли для полученных липосом, содержащих сахарозу в буфере. В Таблице 11 приводятся результаты, характеризующие наночастицы, полученные при различном времени добавления, а в Таблице 12 приводятся результаты, характеризующих наночастицы, полученные с применением поверхностного добавления, по сравнению с погруженной инжекцией.

Приведенные результаты показывают удивительный и неожиданный результат: средний размер частиц существенно уменьшался, когда липиды добавлялись к водной фазе посредством погруженного впрыскивания с временем добавления менее 2 минут. Приведенные результаты также показывают удивительные результаты: средний размер частиц существенно уменьшался, когда липиды добавляли к водной фазе посредством погруженного впрыскивания.

1. Способ получения липидной наночастицы, инкапсулирующей молекулу siPHK, включающий стадии:

получение первого раствора, содержащего катионный липид, нейтральный липид, стерол и ПЭГ липид, растворенные в этаноле;

получение второго раствора, содержащего молекулу siPHK в концентрации от 0.08 до 0.8 мг/мл и водный буфер при рН 3,5-6,5;

впрыскивание первого раствора во второй раствор при постоянной скорости в течение 1-100 минут, до тех пор, пока смесь, содержащая 25-45% (об.:об.) этанола, не будет получена, с получением липидной наночастицы, имеющей отношение siPHK: общее количество всех липидов от 0.06 до 0.16 (мас.:мас.) и отношение зарядов siPHK: катионного липида от 1:2,5 до 1:1; и

удаление этанола из смеси посредством диафильтрации относительно водного раствора, буферизированного при рН 6-8.

2. Способ по п. 1, где водный раствор дополнительно содержит полисахарид.

3. Способ по п. 2, где полисахарид выбирается из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, ксилита, лактозы, мальтозы и инулина.

4. Способ по п. 1, дополнительно содержащий стадию лиофилизации липидной наночастицы, инкапсулирующей молекулу siPHK.

5. Способ по п. 1, где катионный липид составляет от 40 до 60 мольных процентов от липидов.

6. Способ по п. 1, где катионный липид выбирается из группы, состоящей из HEDC, HEDODC и HE-Et-DODC:

и

7. Способ по п. 1, где катионный липид имеет ионизируемый или перманентный положительный заряд.

8. Способ по п. 1, где первый раствор дополнительно содержит соединение, содержащее молекулу ретиноида, фолиевую кислоту, витамин Е, пептидный лиганд и/или моноклональное антитело.

9. Способ по п. 1, где второй раствор и первый раствор находятся при 25-55°С.

10. Способ по п. 1, где второй раствор содержит цитрат.

11. Способ по п. 1, где первый раствор добавляется ко второму раствору посредством впрыскивания через многосопловое устройство на границу раздела фаз воздух-вода.

12. Способ по п. 1, где первый раствор добавляется ко второму раствору посредством погруженного впрыскивания.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая липидную наночастицу, инкапсулирующую молекулу siPHK, полученную способом по любому из пп. 1-12, где липидная наночастица, инкапсулирующая молекулу siPHK, имеет индекс полидисперсности, равный менее 0,2.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, где способ дополнительно содержит лиофилизацию липидной наночастицы, инкапсулирующей молекулу siPHK.

15. Фармацевтическая композиция по п. 13, дополнительно содержащая полисахарид.

16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где полисахарид выбирается из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, ксилита, лактозы, мальтозы и инулина.

17. Фармацевтическая композиция по п. 13, где средневзвешанный диаметр липидной наночастицы, инкапсулирующей молекулу siPHK, составляет 50-100 нм.

18. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 14-17, где катионный липид имеет структурную формулу I:

в которой

Z представляет собой алкильный линкер, С24алкил

Y представляет собой алкильный линкер, C16алкил

R1 и R2 каждый независимо представляет собой С1230алкил или С1230алкенил;

R3 и R4 каждый независимо представляет собой водород, С16алкил или -СН2СН2ОН;

n равно 1-6; и

X представляет собой противоион.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу модификации целевого геномного локуса путем гомологичной рекомбинации в мышиной эмбриональной стволовой (ES) клетке.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен аптамер, специфичный к внеклеточному гликозилированному домену человеческого рецептора CD47, способный блокировать его взаимодействие с природным лигандом SIRP-alpha.

Настоящее изобретение относится к биохимии. Описана молекула L-нуклеиновой кислоты, способная связываться с C5a человека, где молекула L-нуклеиновой кислоты содержит центральный участок нуклеотидов, где центральный участок нуклеотидов содержит нуклеотидную последовательность 5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 61], где n1 представляет собой U или dU, n2 представляет собой G или dG, n3 представляет собой A или dA, n4 представляет собой U или dU, n5 представляет собой U или dU, и G, A, U, C, H, K и R являются рибонуклеотидами, и dU, dG и dA являются 2'-дезоксирибонуклеотидами.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу борьбы с личинками металловидки серой, включающему использование инсектицида на основе нуклеиновой кислоты, с использованием короткого одноцепочечного антисмыслового фрагмента генома бакуловируса из консервативного домена RING гена IAP.

Представлены полинуклеотидная библиотека для получения спаренных последовательностей антител, способ получения представляющего интерес полинуклеотида и способ анализа и использования данных секвенирования.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к композиции для ингибирования роста и стимуляции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака путем блокирования функции генов МСМ4 и Livin.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенной конструкции нуклеиновой кислоты для борьбы с западным кукурузным жуком, также к молекуле РНК, кодируемой вышеуказанной конструкцией.

Настоящие изобретения относятся к полицистронной экспрессии у грамположительной бактерии и касаются молочнокислой бактерии для экспрессии одного или нескольких экзогенных генов, фармацевтической композиции, содержащей такую молочнокислую бактерию, нуклеиновой кислоты и вектора.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу одновременной детекции множества последовательностей нуклеотидов при проведении одной полимеразной цепной реакции.

Представлен способ выявления ракового биомаркера у субъекта in vitro. Охарактеризованный способ включает получение от субъекта биологического образца; измерение уровня RISC-белка во фракции экзосом образца и/или активности процессинга первичной микроРНК или активности процессинга предшественника микроРНК во фракции экзосом образца и эталонного образца; идентификацию того, что субъект обладает раковым биомаркером, на основании (i) выявления RISC-белка во фракции экзосом образца, полученного от субъекта, или (ii) выявления активности процессинга микроРНК во фракции экзосом образца, которая отсутствует в эталонном образце.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к средству для фотодинамической терапии, которое включает: 13(1)-N-{2-[N-(клозо-монокарбадодекаборан-1-ил)-метил]аминоэтил}амид-15(2),17(3)-диметилового эфир хлорина е6 – 0,047 мас.%, фосфатидилхолин – 7,808 мас.%, холестерин – 1,401 мас.%, DSPE-PEG-2000 – 0,129 мас.%, сахарозу – 11,4 мас.%, DSPE-PEG(5000) Folate – 0,59 мас.%, деионизированную воду до 100 мас.% с допустимым отклонением от указанных значений на ±5%; а также к лиофильно высушенному порошку, полученному из указанного средства.

Изобретение относится к конъюгату хитозана для стабилизации липосомальных суспензий и способу его получения, которые могут быть использованы в фармацевтической промышленности.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, в частности фармакологии, и раскрывает систему для стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот и способ стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к липосомальному препарату для лечения рака, содержащему суспензию липосом в водной фазе, при этом указанные липосомы содержат, по меньшей мере, одну липосомальную мембрану, в которой присутствует до 5 моль%, по меньшей мере, одного терапевтически активного вещества, имеющего log Р более 1 и представляющего собой таксан, а в водной фазе присутствует, по меньшей мере, одно осмотически активное вещество, причем осмолярность водной фазы внутри липосом, Овн, выше осмолярности водной фазы снаружи липосом, Онар, и разница между Онар и Овн составляет, по меньшей мере, 10 мОсм и до 2000 мОсм.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу доставки терапевтического агента субъекту, а также к набору для доставки терапевтического агента субъекту.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению липосом с пептидом основного белка миелина (ОБМ), и может быть использовано в медицине для лечения рассеянного склероза.
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и представляет собой гемостатическое покрытие в форме губки или пленки, содержащее основу и активное вещество цеолит, отличающееся тем, что в качестве основы содержит альгинат натрия, пластификатор и воду, а в качестве активного вещества природный цеолит (Na2+, K2+)О⋅Al2O3⋅8SiO2⋅10Н2О, причем компоненты в гемостатическом покрытии находятся в определенном соотношении, в масс.

Настоящее изобретение относится к носителю для доставки вещества в продуцирующие внеклеточный матрикс клетки в почке, причем носитель состоит из липидной структуры, содержащей ретиноид в качестве нацеливающего агента, где носитель имеет форму липосомы.

Изобретение относится к соединениям формулы I, которые могут найти применение для улучшения доставки терапевтических лекарственных средств и усиления их активности.

Изобретение относится к медицине, в частности к композиции для лечения злокачественной опухоли мозга - глиобластомы. Композиция представляет собой ниосомальный гель, содержащий инкапсулированное в ниосомы синтезированное вещество N-гидрокси-2-(2-(нафтален-2-ил)-1H-индол-3-ил)-2-фенилацетамид.
Изобретения относятся к химико-фармацевтической промышленности и представляют собой лиофилизированную липосомальную композицию в гелевой фазе для доставки терапевтического и/или диагностического агента, а также способ приготовления данной композиции. Композиция содержит внешний криопротектор, по отношению к указанным липосомам, и внутренний, концентрация которого меньше чем 125 мМ, и демонстрирует превосходные профили удерживания лекарственного средства и сохраняет распределение размеров после лиофилизации и воспроизведения. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 3 пр.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, в частности фармакологии, и раскрывает способ получения липидной наночастицы, инкапсулирующей молекулу siPHK и фармацевтическую композицию, содержащую липидную наночастицу, инкапсулирующую молекулу siPHK. Группа изобретений обеспечивает получение липидных наночастиц, имеющих индекс полидисперсности менее 0,2 и размер частицы от 50 до 150 нм, который может осуществляться в больших объемах и использоваться при крупномасштабном производстве. Настоящие липидные наночастицы могут быть использованы для обеспечения носителей для доставки терапевтических молекул, в частности, молекул siPHK. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 13 табл., 7 пр, 6 ил.

Наверх