Способ исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры in vitro молочнокислой кормовой добавкой, содержащей культуру микроорганизмов lactobacillus acidophilus la-5
Владельцы патента RU 2647761:
Швыдков Александр Николаевич (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Способ исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры пробиотиком Lactobacillus acidophilus LA-5 in vitro предусматривает использование супернатанта молочнокислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5, полученного в разные сроки роста культуры в 1, 10, 20 и 30 день. К 0,5 мл среды МПБ добавляют 0,5 мл супернатанта молочно-кислой кормовой добавки, после чего вносят 0,5 мл МПБ суточной культуры одного из штаммов условно-патогенной микрофлоры. Полученный раствор инкубируют 18-24 ч при Т=37,0±0,5°С. Затем проводят определение антибиотикочувствительности микроорганизмов на МПА с 24 видами антибактериальных препаратов дискодиффузионным методом. Изобретение позволяет расширить арсенал способов исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры in vitro. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано в лабораторной работе при изучении антибиотикочувствительности микроорганизмов.
Повышение антибиотикочувствительности in vitro необходимо для научно-исследовательских задач в целях изучения возможных изменений генетических структур и обменных процессов в культуре микроорганизмов обеспечивающих антибиотикорезистентность. ВОЗ ООН (World Health Organization. WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance. Geneva, 2001. WHO/CDS/CSR/DRS/2001.2.) считает проблему антибиотикорезистентности микроорганизмов наиболее важной в современной микробиологии.
Известен способ повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры молочно-кислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Bifidobacter longum Б-41 in vitro (RU 2562590 C1, 10.09.2015), избранный нами в качестве аналога. Предлагаемый нами способ отличается от предложенного аналога различным влиянием супернатанта Lactobacillus acidophilus LA-5 на показатели антибиотикочувствительности отдельных изучаемых видов микроорганизмов. Так, у S. enteritidis 182 при воздействии Lactobacillus acidophilus LA-5 к 1 дню культивирования увеличился диаметр задержки роста на 40,9%, а при воздействии Bifidobacter longum Б-41 на 31,8%.
Оценку антибиотикочувствительности микроорганизмов проводили в соответствии с методическими указаниями «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК №4.2.1890-04, 2004 г.). Способ включает выращивание культуры тест-штамма микроорганизма на мясопептонном бульоне (МПБ) в течение 18-20 ч при Т=37,0±0,5°C, с последующим инкубированием на мясопептонном агаре (МПА) с дисками пропитанными различными видами антибактериальных препаратов в течение 18-20 ч при Т=37,0±0,5°C.
Состав молочно-кислой кормовой добавки описан в диссертации кандидата с/х наук Матасова А.А. «Использование молочно-кислой кормовой добавки при выращивании крупного рогатого скота» www.dissercat.com/content/ispolzovanie-molochnokisloi-kormovoi-dobavki-pri-vyrashchivanii-molodnyaka-krupnoqo-rogatogo.
В состав молочно-кислой кормовой добавки включен штамм Lactobacilus acidophilis №LA-5 содержащий 23*108 КОЕ / на 1 мл при рН=3,46, изготовленный по ТУ 9224-001-014185347608.
Задача изобретения - способ исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры.
Указанная задача решается тем, что в способе повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры in vitro молочно-кислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5, используется супернатант молочно-кислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5, включающий использование супернатанта, полученного в разные сроки роста в 1, 10, 20 и 30 день. В состав супернатанта входят: молочная кислота, перекись водорода, лизоцим и вещества с антибиотической активностью: реутерин, плантарицин, лактоцидин, лактолин. Супернатант (надосадочная жидкость) получают после центрифугирования культивируемых микроорганизмов при 3000 об/мин.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры in vitro молочно-кислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5, используют супернатант молочно-кислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов, где к 0,5 мл среды МПБ добавляют 0,5 мл супернатанта молочно-кислой кормовой добавки, затем вносят 0,5 мл МПБ суточной культуры условно-патогенной микрофлоры, после чего, полученный раствор инкубируют 18-24 ч при Т=37,0±0,5°C, затем проводят определение антибиотикочувствительности микроорганизмов на МПА с 24 видами антибактериальных препаратов дискодиффузионным методом (тетрациклин, стрептомицин, тилан, апромицин, амоксиклав, офлоксацин, окситетрациклин, оксициллин, левомицетин, гентомицин, неомицин, ампициллин, линкомицин, пенициллин, сульфетрин, энрофлоксацин, канамицин, корбенециллин, амикацин, цефазолин, цефатоксим, ципрофлоксацин, цефуроксим, рифампицин).
Пример 1. Анализ изменения зоны задержки роста микроорганизмов при определении антибиотикочувствительности после контакта с молочно-кислой кормовой добавкой, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5 разных сроков культивирования, показал разную чувствительность у исследуемых представителей условно-патогенной микрофлоры. Так, наибольший рост антибиотикочувствительности микроорганизмов отмечается после культивирования с десяти и тридцати дневными культурами (табл. 1).
Р<0,05
Рост антибиотикочувствительности Е. cloaceae 200, St. albus АТСС 25923, S. enteritidisl82, E. coli АТСС 25222, Pr. vulgaris 192, Kl. pneumonia 71 после контакта с супернатантом молочно-кислой кормовой добавки Lactobacillus acidophilus LA-5 первого дня культивирования составил от 9,1 до 40,9%, десятого дня - от 19,1 до 75%, двадцатого дня от 19,6 до 32,3% и тридцатого дня от 49,3 до 73,8% соответственно.
Наибольшее увеличение антибиотикочувствительности (на 75,0%) отмечено у E. cloaceae 200 после контакта с десятидневной культурой молочно-кислой кормовой добавки Lactobacillus acidophilus LA-5.
Наименьшее изменение диаметра задержки роста антибиотика после контакта с молочно-кислой кормовой добавкой Lactobacillus acidophilus LA-5 после 30-ти дней культивирования отмечено у Pr. vulgaris 192 (49,3%) и Kl. pneumonia 71 (53,1%).
Пример 2. Установлено, что супернатант молочно-кислой кормовой добавки Lactobacillus acidophilus LA-5 разного срока культивирования вызывает устойчивый рост количества антибактериальных препаратов, к которым чувствительны изучаемые штаммы условно-патогенной микрофлоры. Кроме того, увеличение срока инкубирования пробиотика совпадает со снижением количества малочувствительных препаратов у штаммов условно-патогенной микрофлоры (табл.2).
Примечание: количество препаратов, к которым микрофлора устойчива - У (зона задержки роста менее 10 мм), малочувствительна - М (зона задержки роста менее 15 мм), чувствительна - Ч (зона задержки роста более 15 мм).
Способ исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры in vitro молочно-кислой кормовой добавкой, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5, предусматривающий использование супернатанта молочно-кислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Lactobacillus acidophilus LA-5, полученного в разные сроки роста в 1, 10, 20 и 30 день, при этом к 0,5 мл МПБ добавляют 0,5 мл супернатанта молочно- кислой кормовой добавки, после чего вносят 0,5 мл суточной культуры условно-патогенной микрофлоры на МПБ, далее полученный раствор инкубируют 18-24 ч при Т=37,0±0,5°C, затем проводят определение антибиотикочувствительности микроорганизмов на МПА с 24 видами антибактериальных препаратов дискодиффузионным методом.
