Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения, способ его модификации и его применение

Настоящее изобретение относится к производному гиалуроновой кислоты, способу его получения и применению в биомедицине. Предложено производное гиалуроновой кислоты согласно структурной формуле X или его гидратированная форма структурной формулы Y:

,

где R представляет собой Н, тетра-C₁-С₆-алкиламмоний или металлический катион, молекулярная масса от 1 до 500 кДа. Предложенное производное может быть получено путем дегидратации гиалуроновой кислоты, окисленной до альдегида в положении 6 глюкозаминового звена, в положениях 4 и 5 глюкозаминового звена в смеси воды/полярного апротонного растворителя при температуре от 30 до 80°С. Производное гиалуроновой кислоты можно модифицировать путем реакции с амином с общей формулой H₂N-R², где R² представляет собой линейный или разветвленный C₁-С₃₀-алкил; либо с аминокислотой или пептидом; либо с полимером. Предложены новые производные, которые могут эффективно применяться в качестве носителей биологически активных веществ в косметике и фармацевтике, для получения материалов для тканевой инженерии и биомедицинских применений. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 21 пр., 1 табл., 1 ил.

 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к получению и применению нового производного гиалуроновой кислоты, имеющего двойную связь в положениях 4 и 5 глюкозаминового звена полисахарида и альдегидную группу в положении 6 глюкозаминового звена полисахаридной цепи согласно формуле X, или его гидратированной формы с геминальным диолом в положении 6 глюкозаминового звена полисахарида и сохранившейся двойной связью в положениях 4 и 5 глюкозаминового звена полисахарида согласно формуле Y:

где R может представлять собой водород, любой металлический катион или органический катион.

Данное ненасыщенное производное альдегида гиалуронана подходит для связывания соединений, содержащих аминогруппу, главным образом в физиологических условиях. В случае, когда связанное соединение содержит две или больше аминогрупп, можно получать сшитые материалы.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Гиалуроновая кислота представляет собой гликозаминогликан, состоящий из двух повторяющихся единиц β-(1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина:

Она отличается высокой молекулярной массой от 5⋅10⁴ до 5⋅10⁶ г⋅моль^-1, которая зависит от пути ее выделения и от исходного материала. Этот очень гидрофильный полисахарид является растворимым в воде в форме соли во всем диапазоне pH. Он является частью соединительной ткани, кожи, синовиальной жидкости суставов, а также играет важную роль в ряде биологических процессов, таких как гидратация, формирование протеогликанов, клеточная дифференциация, пролиферация и ангиогенез. Поскольку этот полимер является природным для организма и, таким образом, биоразлагаемым, он становится подходящей подложкой для тканевой инженерии или носителем биологически активных веществ.

Модификация гиалуроновой кислоты в НА-альдегид

Наиболее часто НА-альдегид получают селективным окислением нативного гиалуронана. Окисление полисахаридов представляет собой процесс, в котором изменяется степень окисления функциональных групп полисахарида. В случае образования альдегида степень окисления увеличивается формально на одну степень. Также часто образуются карбоксильные группы (окисление на две степени), которые могут представлять собой побочный продукт окисления до альдегида. В случае гиалуроновой кислоты известно несколько подходов для получения гиалуронана с альдегидной группой, присоединенной к нему (НА-альдегид). Эти производные гиалуронана являются одними из наиболее используемых предшественников для получения биоматериалов из химически модифицированного гиалуронана. Основной причиной является то, что альдегидные группы очень стабильны при физиологических условиях, но в то же время они все еще достаточно реакционноспособны для быстрой и эффективной химической реакции, например, с аминами.

Основные способы получения НА-альдегидов показаны на следующей схеме 2.

Схема 2

Несомненно, наиболее часто используемым способом введения альдегидной группы на гиалуронан является окисление посредством NaIO₄ в воде (схема 2, структура 1) (Spiro Robert и соавт.: WO 99/01143, Aeschlimann Daniel, Bulpitt Paul: WO 2007/0149441). Эта модификация приводит к раскрытию сахаридного цикла и образованию двух альдегидных групп.

Другой способ представляет собой окисление первичной гидроксильной группы в положении 6 глюкозаминового звена полисахарида до альдегида (схема 2, структура 2) посредством системы NaClO/TEMPO в воде (Buffa R., Kettou S., Velebný V. и соавт. WO 2011/069475) или посредством периодинана Десса-Мартина в DMSO (Buffa R., Kettou S., Velebný V. и соавт. WO 2011/069474). В отличие от структуры 1, альдегидная группа в этом положении сохраняет жесткость полимерной цепи.

Интересный способ введения альдегидной группы на гиалуронан представляет собой возможность связывания этой группы посредством линкера (схема 2, структура 3). Существуют различные возможные подходы в этом случае, такие как введение вицинального диола на карбоксильную группу гиалуронана посредством амида и последующее окисление диола посредством NaIO₄, что приводит к присоединению альдегида посредством линкера (Hilborn J. и соавт.: WO 2010/138074). Эта стратегия может предпочтительно заключаться в том, что альдегидная группа стерически более доступна для необязательных дополнительных модификаций.

В другой патентной заявке (Aeschlimann Daniel и Bulpitt Paul: WO 2007/0149441) упоминается возможность получения НА-альдегида посредством восстановления карбоксильной группы гиалуронана при помощи средства 9-ББН (9-борбицикло[3,3,1]нонана). Это дает гиалуронан с альдегидной группой в положении 6 глюкуронового звена полисахарида (схема 2, структура 4).

Конденсация НА-альдегида с N-нуклеофилами

Основное преимущество применения конденсации НА-альдегидов с N-нуклеофилами (аминами) состоит в том, что ее можно проводить при физиологических условиях. В общем, эта реакция описывается следующей схемой 3.

Схема 3

Гидролитическая устойчивость полученной иминной связи -CH=N- зависит в большой степени от характера группы X. При условии, что X представляет собой атом, который не несет никакой свободной электронной пары, такой как -CH₂-группа, образуется гидролитически очень неустойчивый имин HA-CH=N-CH₂-. При условии, что X представляет собой атом, который несет свободную электронную пару, образуется гидролитически более устойчивый конъюгат (оксим HA-CH=N-O-, гидразон HA-CH=N-NH-, семикарбазон HA-CH=N-NH-CO- и подобные), в котором иминная связь -CH=N- стабилизируется сопряжением со свободной электронной парой атома X. Во многих патентах, как известно, раскрывается связывание аминов с общей формулой NH₂-X-, где X представляет собой азот или кислород, с гиалуронаном, окисленным до альдегида, и где конечные материалы образуются при физиологически приемлемых условиях так, что они пригодны для широкого диапазона биомедицинских применений. Недавние включают патент (Bergman K., и соавт.: WO 2009/108100), в котором в общем заявлены материалы на основе гиалуроновой кислоты, модифицированной электрофильными группами, такими как альдегид, малеинимид, акрилат, акриламид, метакрилат, метакриламид, винилсульфон и азиридин. Гидразиды, семикарбазиды, тиосемикарбазиды, аминоокси-, тиольные и β-аминотиольные группы упомянуты как сшивающие нуклеофильные средства. Другая патентная заявка (Hilborn J. и соавт.: WO 2010/138074) аналогична и раскрывает связывание N-, S- или одновременно N- и S-нуклеофилов непосредственно с гиалуронаном, окисленным до альдегида посредством окисления при помощи периодата натрия.

В случае, когда X представляет собой алифатический углеводород (схема 3), общеизвестно, что полученные имины являются гидролитически неустойчивыми (связь -C=N- не имеет никакой пары для сопряжения) и обратимо превращаются в исходный альдегид и амин (Buffa R., Kettou S., Velebny V. и соавт. WO 2011/069474). Ситуация показана на схеме 4.

Схема 4

Другой возможностью для стабилизации указанных иминов является продление сопряжения с другой стороны, т.е. со стороны альдегида, что означает обеспечение полученного имина сопряжением, имеющим кратную связь -C=C-. Общая реакция показана на схеме 5.

Схема 5

Этот подход упоминается очень редко в литературе, например, для реакций ароматических альдегидов с аминами с образованием так называемых оснований Шиффа, причем устойчивость поддерживается сопряжением с ароматическим циклом Ar-CHO+H₂N-R→Ar-CH=N-R. Однако в случае полисахаридов или полимеров, в общем, не был найден аналогичный пример. При такой модификации полимеров будет необходимо вводить ароматическую группу или, в общем, любые сопряженные кратные связи посредством линкера на альдегид, что является технологическим затруднением, и биосовместимость материала не гарантируется. Однако этот способ указывает на другое потенциальное затруднение. В случае наличия ароматической системы или нескольких сопряженных кратных связей материал может поглощать уже в видимой области спектра, таким образом, соединение будет окрашенным, что обычно является нежелательным (возможная фоточувствительность, затруднения при анализе при тестах in vitro).

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Объект настоящего изобретения представляет собой гиалуроновую кислоту с общей структурной формулой X или Y, у которой некоторые из ее глюкозаминовых циклов полисахарида модифицированы двойной связью в положениях 4 и 5, и в то же время присутствует альдегидная группа, или геминальным диолом (структура Y) в положении 6 глюкозаминового звена полисахарида:

где R может представлять собой водород, любой металлический катион или органический катион. Предпочтительно указанное производное характеризуется молекулярной массой в диапазоне от 1 до 500 кДа. R представляет собой катион натрия, калия, кальция или органический катион, выбранный из группы, содержащей тетра-C₁-C₆-алкиламмоний, протонированный C₁-C₆-алкиламин, предпочтительно тетрабутиламмоний или протонированный триэтиламин.

Данное решение обеспечивает стабилизацию конъюгатов гиалуронана с аминосоединениями посредством кратной связи со стороны альдегида так, что практически любое соединение, содержащее аминогруппу, можно присоединить к такому модифицированному гиалуронану при физиологических условиях:

Это является важным отличием от насыщенных альдегидов гиалуронана, которые при физиологических условиях способны сильно связывать соединения с общей формулой H₂N-X-, где X представляет собой атом, несущий свободную электронную пару, обычно кислород или азот. Поскольку только некоторые природные вещества содержат группировку H₂N-X-, решение, описанное в настоящей патентной заявке, привносит собой большое преимущество не только в качестве возможного носителя биологически активных веществ, но также в тканевой инженерии, где очень часто используют производные гиалуронана, сшитые при физиологических условиях с биологически приемлемыми аминосоединениями.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения производного согласно структурной формуле X или Y, где первая гиалуроновая кислота окислена до НА-альдегида в положении 6 глюкозаминового звена (здесь и далее называемая стадией 1), а затем НА-альдегид дегидратируют или в растворе, или простым нагреванием в отсутствие растворителей, оснований или других дополнительных веществ (здесь и далее называемая стадией 2). Эти две стадии поясняются подробнее ниже.

Стадия 1: Селективное окисление первичной гидроксильной группы гиалуроновой кислоты в положении 6 глюкозаминового звена полисахарида до альдегида. Реакцию можно проводить посредством, например, окислительной системы 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксильного радикала R¹-TEMPO / NaClO в воде, где R¹ представляет собой водород или группу N-ацетил:

Эта стадия проходит предпочтительно в воде при температуре от -5 до 10°C, молярное количество NaClO находится в диапазоне от 0,05 до 0,7 экв., а молярное количество R¹-TEMPO находится в диапазоне от 0,005 до 0,2 экв. относительно димера гиалуроновой кислоты. Исходная гиалуроновая кислота может характеризоваться молекулярной массой в диапазоне от 10 кДа до 5 МДа.

Стадия 2:

Вариант 1: Дегидратация НА-альдегида в полярном апротонном растворителе и воде при температуре от 30 до 80°C, предпочтительно при 50-60°C, или

Вариант 2: Нагревание чистого насыщенного НА-альдегида в сухом виде до температуры от 50 до 100°C, предпочтительно от 70 до 80°C.

Первый вариант представляет собой дегидратацию в водно-органической среде, где органический растворитель является смешиваемым с водой, а объемное соотношение растворитель/вода находится в диапазоне от 3/1 до 1/2. Предпочтительно на этой стадии основания, имеющие ограниченные нуклеофильные свойства, такие как органические основания, например, триэтиламин или N-диизопропил-N-этиламин, или неорганические основания, например, Ca(OH)₂, можно использовать. Количество основания в реакции составляет 0,01-20 эквивалентов относительно димера гиалуронана, предпочтительно 5-10 эквивалентов. Основание может поддерживать удаление путем отщепления протона в альфа-положении альдегида (положение 5 цикла), и полученный карбанион исключает гидроксигруппу в положении 4, образуя кратную связь. В качестве органических растворителей можно использовать апротонные полярные растворители, смешиваемые с водой, предпочтительно DMSO или сульфолан. Реакцию предпочтительно проводят в течение от 12 до 150 часов.

Второй, технологически очень привлекательный вариант реализации стадии 2 состоит в нагревании исходного насыщенного альдегида в его сухом состоянии в отсутствие любых дополнительных веществ до повышенной температуры, предпочтительно до температуры от 70 до 80°C в течение от 12 часов до 10 дней, предпочтительно от 4 до 5 дней.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению ненасыщенного НА-альдегида для связывания аминов. Более конкретно настоящее изобретение относится к способу модификации производного гиалуроновой кислоты в соответствии с формулой X или Y, причем производное реагирует с амином в соответствии с общей формулой H₂N-R², где R² представляет собой алкил, ароматический, гетероароматический радикал, линейную или разветвленную цепь С₁-С₃₀, необязательно содержащие атомы N, S или О. Указанный амин может представлять собой, например, аминокислоту, пептид или полимер, содержащий свободную аминогруппу, причем такой полимер может представлять собой, например, деацетилированную гиалуроновую кислоту, гиалуроновую кислоту с аминогруппой, присоединенной к ней посредством линкера, или желатин, или другой биологически приемлемый полимер. Количество амина, аминокислоты, пептида или свободных аминогрупп в полимере предпочтительно находится в диапазоне от 0,05 до 2 эквивалентов относительно димера гиалуронана.

Никаких специальных условий не требуется для получения указанных конъюгатов. Реакция может проходить в воде, в фосфатном буфере или в системе вода-органический растворитель при температуре в диапазоне от 20 до 60°C в течение от 10 минут до 150 часов. Органический растворитель можно выбирать из группы, содержащей смешиваемые с водой спирты, в частности изопропанол или этанол, и смешиваемые с водой полярные апротонные растворители, в частности диметилсульфоксид, причем содержание воды в смеси составляет по меньшей мере 50 об. %. Реакция протекает нормально при физиологических условиях, например, в фосфатном буфере при pH 7,4 и температуре 37°C, с широким разнообразием аминов, от простых аминокислот до сложных пептидов. При этих условиях также возможно без проблем связывать гидразины, гидроксиламины, гидразиды, семикарбазиды или тиосемикарбазиды. В случае, когда связывают соединения, содержащие две или больше аминогруппы, можно получать нерастворимые сшитые производные, характеризующиеся широким разнообразием вязкоупругих свойств:

Более высокая устойчивость связи амина и ненасыщенного НА-альдегида по сравнению с его насыщенным аналогом позволяет получение более стабильных и лучше сшитых нерастворимых биоматериалов на основе гиалуронана. Это положение описано более подробно в части Примеры, пример 21, где насыщенное и ненасыщенное производное НА-альдегида, имеющее аналогичную степень замещения и молекулярную массу, сравнивают в отношении конечных реологических свойств для сшивки с деацетилированным гиалуронаном.

По сравнению с аналогами, упомянутыми в части "Предшествующий уровень техники настоящего изобретения", предлагаемый способ модификации является более предпочтительным в том, что он обеспечивает более сильное связывание значительно более широкого спектра содержащих аминогруппу соединений с гиалуроновой кислотой при физиологических условиях. Этот факт является большим преимуществом для применения, в частности в тканевой инженерии, где многие биосовместимые сшивающие аминолинкеры можно использовать при физиологических условиях, даже в присутствии живых клеток. Модифицированные производные можно использовать, например, для получения сшитых материалов и гидрогелей, для получения материалов для тканевой инженерии или для биомедицинских применений. Для сшивания также можно использовать полисахариды или, в общем, содержащие аминогруппы полимеры. Предпочтительно указанное изобретение можно также использовать в области носителей биологически активных веществ. Разработанный способ позволяет иммобилизацию более широкого диапазона биологически активных аминов (например, пептидов) на гиалуронане, которые могут затем свободно высвобождаться в их нативную (активную) форму. Было обнаружено, что при низком pH связь амин - ненасыщенный НА-альдегид гидролитически менее устойчива и, таким образом, полученные конъюгаты можно также использовать в качестве чувствительных к pH материалов (носители, гель). Было показано, что ненасыщенный НА-альдегид отдельно не является цитотоксическим, и, таким образом, его конъюгаты являются подходящим вариантом для различных биомедицинских применений. Несмотря на то, что специалист в данной области может предположить, что сопряжение со стороны альдегида посредством кратной связи -C=C- будет приводить к более высокой токсичности из-за того, например, что акролеин CH₂=CH-CHO является высокотоксичным и раздражающим веществом, это не так. Производное согласно настоящему изобретению имеет двойную связь прямо в структуре полимера (без какого-либо линкера), и готовая подложка не проявляла какие-либо токсичные свойства. Производные в соответствии с формулой X или Y можно использовать для получения материалов, имеющих противораковое действие, в качестве носителей биологически активных веществ в косметике и фармацевтике или в качестве носителей биологически активных веществ с регулируемым высвобождением посредством изменения значения pH.

Реализация решения, описанного в настоящей заявке, технологически несложная и не требует использования дорогих химических реагентов, растворителей или процессов выделения.

На фигуре 1 представлен упругий материал, полученный согласно примеру 20.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения

DS = степень замещения = 100% * (молярное количество заместителя связи или модифицированного димера) / (молярное количество всех димеров полисахарида)

Выражение эквивалент (экв.) при использовании в настоящем документе означает димер гиалуроновой кислоты, если иное не указано. Процентные отношения представляют собой массовые процентные отношения, если иное не указано.

Молекулярная масса исходной гиалуроновой кислоты (источник: CPN spol. s r.о., Dolní Dobrouč, CZ) является средневесовой и была определена посредством SEC-MALLS.

Пример 1. Получение НА-альдегида, окисленного в положении 6 глюкозаминового звена

Окисление гиалуроновой кислоты

Водный раствор NaClO (0,5 экв.) постепенно добавляли в 1-процентный водный раствор гиалуронана (1 г, 200 кДа), содержащий NaCl 1%, KBr 1%, TEMPO (0,01 экв.) и NaHCO₃ (20 экв.), в атмосфере азота. Смесь перемешивали в течение 12 часов при температуре -5°C, затем 0,1 г этанола добавляли и смесь перемешивали еще 1 час. Полученный раствор затем разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализировали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃) 3 раза 5 литрами (раз в день) и против дистиллированной воды 7 раз 5 литрами (дважды в день). Затем конечный раствор выпаривали и анализировали.

DS 10% (определенная при помощи ЯМР)

¹Н-ЯМР (D₂O) δ 5,26 (s, 1H, полимер-CH(ОН)₂)

HSQC (D₂O) кросс-сигнал 5,26 части на миллион (¹Н) - 90 частей на миллион (¹³С) (полимер-СН(ОН)₂)

Пример 2. Дегидратация НА-альдегида

6,7 мл DMSO и основание DIPEA (5 экв.) добавляли в трехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 40°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 6% (определенная при помощи ЯМР), Mw=110 кДа (определенная при помощи SEC-MALLS)

¹Н-ЯМР (D₂O) δ 9,24 (s, 1Н, -CH=O), 6,32 (m, 1Н, -CH=C-CH=O)

УФ-видимый спектр (D₂O) 252 нм, π-π* переход α,β-ненасыщенного альдегида

Пример 3. Дегидратация НА-альдегида

7,5 мл DMSO и основание DIPEA (5 экв.) добавляли в четырехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 50°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 5% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 4. Дегидратация НА-альдегида

2,5 мл DMSO и основание DIPEA (5 экв.) добавляли в трехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 50°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 2% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 5. Дегидратация НА-альдегида

6,7 мл сульфолана добавляли в трехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 60°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 1% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 6. Дегидратация НА-альдегида

6,7 мл сульфолана и основание Et₃N (5 экв.) добавляли в трехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 50°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 5% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 7. Дегидратация НА-альдегида

6,7 мл сульфолана и основание DIPEA (2 экв.) добавляли в трехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 12 часов при температуре 80°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 2% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 8. Дегидратация НА-альдегида

6,7 мл сульфолана и основание Ca(OH)₂ (1 экв.) добавляли в трехпроцентный раствор НА-альдегида (0,1 г, степень окисления, пример 1) в воде. Смесь перемешивали в течение 150 часов при температуре 30°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 2% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 9. Дегидратация НА-альдегида

НА-альдегид (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) нагревали в его твердом состоянии в течение 5 дней при 80°C. Затем его анализировали посредством ЯМР.

DS 3% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 10. Дегидратация НА-альдегида

НА-альдегид (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) нагревали в его твердом состоянии в течение 12 часов при 100°C. Затем его анализировали посредством ЯМР.

DS 2% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 11. Дегидратация НА-альдегида

НА-альдегид (0,1 г, степень окисления DS=10%, пример 1) нагревали в его твердом состоянии в течение 10 дней при 50°C. Затем его анализировали посредством ЯМР.

DS 2% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 2)

Пример 12. Связывание аминов с α,β-ненасыщенным НА-альдегидом

H-бутиламин (2 экв.) добавляли в однопроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,1 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 5 часов при температуре 37°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 5% (определенная при помощи ЯМР)

¹Н-ЯМР (D₂O) δ 7,74 (s, 1H, -CH=N-Bu), 5,68 (m, 1Н, -CH=C-CH=N-Bu)

HSQC (D₂O) кросс-сигнал 7,74 части на миллион (¹Н) - 158 частей на миллион (¹³C) -CH=N-Bu

кросс-сигнал 5,68 части на миллион (¹Н) - 112 частей на миллион (¹³C) -CH=C-CH=N-Bu

Пример 13. Связывание аминов с α,β-ненасыщенным НА-альдегидом

H-бутиламин (0,05 экв.) добавляли в однопроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,1 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 150 часов при температуре 20°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 2% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 12)

Пример 14. Связывание аминов с α,β-ненасыщенным НА-альдегидом

H-бутиламин (0,3 экв.) добавляли в однопроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,1 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в воде. Смесь перемешивали в течение 10 минут при температуре 60°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 5% (определенная при помощи ЯМР, более подробно в примере 12)

Пример 15. Связывание лизина с α,β-ненасыщенным НА-альдегидом

Лизин (0,3 экв.) добавляли в однопроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,1 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°C. Конечный раствор затем осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 5% (определенная при помощи ЯМР)

¹H-ЯМР(D₂O) δ 7,76 (s, 1H, -CH=N-лизин), 5,65 (m, 1Н, -СН=С-СН=N-лизин)

Пример 16. Связывание пентапептида pal-KTTKS (пальмитоил-лиз-тре-тре-лиз-сер) с α,β-ненасыщенным НА-альдегидом

5 мл IPA и затем раствор замещенного пентапептида pal-KTTKS (0,1 экв.) в 5 мл изопропилового спирта добавляли в однопроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,1 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 72 часов при температуре 20°C. Конечный раствор выпаривали во вращающемся вакуумном испарителе до одной трети объема, затем его осаждали посредством смеси изопропанол/гексан и твердую фракцию сушили в вакууме.

DS 1% (определенная при помощи ЯМР)

¹Н-ЯМР (D₂O) δ 7,75 (s, 1H, -CH=N-пептид), 5,66 (m, 1H, -CH=C-CH=N-пептид)

Пример 17. Сшивание α,β-ненасыщенного НА-альдегида лизином

Однопроцентный раствор лизина в воде (0,1 экв.) добавляли в пятипроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,1 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°C. Наблюдали увеличение вязкости конечного раствора.

Пример 18. Сшивание α,β-ненасыщенного НА-альдегида адипатом дигидразида

Однопроцентный раствор адипата дигидразида в воде (0,1 экв.) добавляли в пятипроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,015 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°C. Наблюдали увеличение вязкости конечного раствора.

Пример 19. Получение деацетилированного гиалуронана

65 мл сульфолана добавляли в трехпроцентный раствор гиалуронана (1 г, 830 кДа) в гидрате гидразина, содержащем 30 г сульфата гидразина, и смесь нагревали в течение 48 часов при 70°C. Конечный раствор разбавляли дистиллированной водой до 0,2% и диализировали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO₃) 3 раза 5 литрами (раз в день) и против дистиллированной воды 7 раз 5 литрами (дважды в день). Конечный раствор затем выпаривали и анализировали.

DS 32% (определенная при помощи ЯМР), Mw 37 кДа (определенная при помощи SEC-MALLS)

¹Н-ЯМР (1% NaOD в D₂O) δ 2,75 (s, 1H, -CH-NH₂)

Пример 20. Сшивание α,β-ненасыщенного НА-альдегида посредством деацетилированного гиалуронана

Трехпроцентный раствор деацетилированного гиалуронана (0,015 г, пример 19) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4 (0,1 экв.) добавляли в трехпроцентный раствор ненасыщенного НА-альдегида (0,025 г, степень замещения DS=6%, пример 2) в 0,1 М водном фосфатном буфере при pH 7,4. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°C. Наблюдали увеличение вязкости конечного раствора.

Пример 21. Сравнение механических и вязкоупругих свойств гидрогелей на основе сшитого α,β-ненасыщенного НА-альдегида и сшитого насыщенного НА-альдегида

- сшивание при помощи деацетилированного гиалуронана

Материал 1: Ненасыщенный НА-альдегид (0,06 г, DS=6%, Mw=110 кДа, пример 2) 3% раствор в PBS pH 7,4 + деацетилированный гиалуронан (0,02 г, пример 19) 3% раствор в PBS pH 7,4.

Материал 2: Насыщенный НА-альдегид (0,06 г, DS=7%, Mw=100 кДа) 3% раствор в PBS pH 7,4 + деацетилированный гиалуронан (0,02 г, пример 19) 3% раствор в PBS pH 7,4.

Образцы гидрогелей получали из вышеуказанных материалов смешиванием и полной гомогенизацией обоих их компонентов (3% раствора ненасыщенного НА-альдегида в PBS/3% раствора насыщенного НА-альдегида и 3% раствора деацетилированного гиалуронана в PBS). Образцы всегда оставляли для дозревания на 240 минут при комнатной температуре, после чего образуется однородный прозрачный гель. Все образцы были с одинаковыми пропорциями, и их измеряли при постоянных лабораторных условиях (температура, давление, влажность).

Определяли механические свойства образцов. Более конкретно, модуль упругости при сжатии Юнга, показывающий жесткость/эластичность материала, модуль ударной вязкости, показывающий сопротивление образца, и какую энергию материал способен поглощать без возникновения какой-либо постоянной деформации. Кроме того, напряжение сжатия при разрушении, показывающее максимальную нагрузку, которую материал способен поглощать без возникновения какой-либо постоянной деформации, и, в наборе вязкоупругих свойств, модуль накопления в угле потерь сдвига фаз.

Результаты, полученные в этом примере, показывают преимущество применения ненасыщенного НА-альдегида по сравнению с насыщенным НА-альдегидом относительно получения более жестких и более вязких (лучше сшитых) материалов, подходящих для тканевой инженерии.

1. Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное двойной связью в положениях 4 и 5 глюкозаминового звена полисахарида и одновременно окисленное до альдегида в положении 6 глюкозаминового звена полисахарида согласно структурной формуле X, или его гидратированная форма согласно структурной формуле Y:

,

где R представляет собой водород, тетра-C₁-С₆-алкиламмоний или любой металлический катион,

при этом производное характеризуется молекулярной массой от 1 до 500 кДа.

2. Производное гиалуроновой кислоты по п. 1, отличающееся тем, что R представляет собой катион натрия, калия, кальция или органический катион, который представляет собой тетрабутиламмоний.

3. Способ получения производного гиалуроновой кислоты, определенного в п. 1 или 2, отличающийся тем, что гиалуроновую кислоту, окисленную до альдегида в положении 6 глюкозаминового звена, дегидратируют в положениях 4 и 5 глюкозаминового звена в смеси воды/полярного апротонного растворителя при температуре от 30 до 80°С.

4. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что смесь дополнительно содержит основание в количестве от 0,01 до 20 эквивалентов, предпочтительно от 5 до 10 эквивалентов, относительно димера гиалуроновой кислоты, причем основание выбирают из группы, содержащей органические основания, например, триэтиламин или диизопропилэтиламин, или неорганические основания, например, Са(ОН)₂.

5. Способ получения по п. 3, характеризующийся тем, что апротонный растворитель является смешиваемым с водой и содержит, например, DMSO или сульфолан, а объемное соотношение растворитель/вода находится в диапазоне от 3/1 до 1/2.

6. Способ получения по любому из пп. 3-5, характеризующийся тем, что реакцию проводят в течение 12-150 часов.

7. Способ получения производного гиалуроновой кислоты, определенного в п. 1 или 2, характеризующийся тем, что гиалуроновую кислоту, окисленную до альдегида в положении 6 глюкозаминового звена, дегидратируют в положениях 4 и 5 глюкозаминового звена в твердом состоянии без использования растворителей или других дополнительных веществ путем нагревания до температуры от 50 до 100°С в течение от 12 часов до 10 дней.

8. Способ получения по любому из пп. 3-5 или 7, характеризующийся тем, что исходная гиалуроновая кислота характеризуется молекулярной массой в диапазоне от 1⋅10⁴ г моль^-1 до 5⋅10⁶ г-моль^-1.

9. Способ модификации производного гиалуроновой кислоты, определенного в п. 1 или 2, отличающийся тем, что производное приводят в реакцию с амином с общей формулой H₂N-R², где R² представляет собой линейный или разветвленный C₁-С₃₀-алкил;

либо с аминокислотой или пептидом;

либо с полимером, который содержит свободную аминогруппу и выбран из группы, содержащей деацетилированную гиалуроновую кислоту, гиалуроновую кислоту с аминогруппой, присоединенной к ней посредством линкера, или желатин.

10. Способ модификации по п. 9, характеризующийся тем, что количество амина, аминокислоты, пептида или свободных аминогрупп полимера находится в диапазоне от 0,05 до 2 эквивалентов относительно димера гиалуронана.

11. Способ модификации по п. 9, характеризующийся тем, что реакцию с амином, аминокислотой, пептидом или полимером, содержащим свободную аминогруппу, проводят в воде, в фосфатном буфере или в системе вода-органический растворитель при температуре в диапазоне от 20 до 60°С в течение от 10 минут до 150 часов.

12. Способ модификации по п. 11, характеризующийся тем, что органический растворитель выбирают из группы, содержащей смешиваемые с водой спирты, в частности изопропанол или этанол, и смешиваемые с водой полярные апротонные растворители, в частности диметилсульфоксид, причем содержание воды в смеси составляет по меньшей мере 50% по объему.

13. Применение производных, определенных в любом из пп. 1, 2, в качестве носителей материалов, имеющих противораковое действие.

14. Применение производных, определенных в любом из пп. 1, 2, в качестве носителей биологически активных веществ в косметике и фармацевтике или в качестве носителей биологически активных веществ с регулируемым высвобождением посредством изменения значения рН.

15. Применение производных, полученных способом, определенным в любом из пп. 9-12, для получения сшитых материалов и гидрогелей, для получения материалов для тканевой инженерии или для биомедицинских применений.