Олигонуклеотиды для модулирования экспрессии генов и их применения

Изобретение относится к биохимии. Описан одноцепочечный олигонуклеотид антигена, комплементарный к антисмысловой нити ДНК целевого гена, содержащий 12-24 нуклеотида, причем указанный олигонуклеотид характеризуется последовательностью, содержащей по меньшей мере три группы по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов. Также описано применение указанных олигонуклеотидов, возможно химически модифицированных, для лечения заболеваний. Изобретение позволяет ингибировать экспрессию генов, что может быть использовано при лечении опухоли у субъекта. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 табл., 2 пр.

 

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам для модулирования экспрессии гена, в частности для модулирования гена, ответственного за патологию генетического, опухолевого или вирусного происхождения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанных олигонуклеотидов, возможно химически модифицированных, для лечения и/или диагностики указанных заболеваний.

Олигонуклеотиды представляют собой короткие последовательности встречающихся в природе нуклеиновых кислот РНК (рибонуклеиновая кислота) или ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или синтетических нуклеиновых кислот, например ПНК (пептиднуклеиновая кислота), ЗНК (запертая нуклеиновая кислота) и морфолино.

Экспериментально показали, что олигонуклеотиды являются очень эффективными при модулировании экспрессии гена как на уровне транскрипции, так и трансляции. Из-за данной способности олигонуклеотиды представляют надежное средство для лечения множественных патологий, в частности заболеваний генетического, опухолевого или вирусного происхождения.

Модулирование экспрессии гена может подразумевать его ингибирование или активирование.

Например, известны олигонуклеотиды, которые способны ингибировать транскрипцию гена путем образования комплементарной связи с антисмысловой нитью гена (Helene С, BiochBiophActa 1990, 109(2): 99-125) или модулирования состояния хроматина в регуляторных областях гена интереса (Rossi JJ, NatChemBiol 2007, 3(3): 136-7). Другие олигонуклеотиды способны ингибировать трансляцию гена, например, через комплементарную связь с целевой матричной РНК (мРНК). В случае одноцепочечных олигонуклеотидов данная связь вызывает ферментативный распад мРНК посредством комплекса РНКазы Н. В том случае, когда олигонуклеотиды представляют собой молекулы двухцепочечной "интерферирующей" РНК, комплементарная связь олигонуклеотидов с целевой мРНК вызывает распад мРНК под действием фермента "слайсер" комплекса RISC (РНК-индуцированный комплекс сайленсинга). В последнем случае олигонуклеотиды могут также представлять собой олигонуклеотиды, эквивалентные эндогенной микроРНК, способной к ассоциированию, вследствие неполной комплементарности, с 3ʹ-НТО (3ʹ-нетранслируемая область) целевой мРНК, вызывая блокирование трансляции данной мРНК.

Олигонуклеотиды могут также вызывать активацию гена или повышение уровня его транскрипции, например, посредством комплементарной связи с длинной антисмысловой некодирующей РНК (Morris KV, Epigenetics, 2009, 4(5): 296-301) или посредством ингибирования комплементарной микроРНК с последующим усилением трансляции целевой мРНК микроРНК.

Олигонуклеотиды могут быть химически модифицированы с целью повышения их эффективности с терапевтической и/или диагностической точки зрения. Например, олигонуклеотид можно модифицировать для улучшения его специфичности и/или силы, с которой он образует пары с комплементарной последовательностью, или же олигонуклеотид можно модифицировать для того, чтобы сделать его менее чувствительным к ферментативному распаду с улучшением его факмакокинетического/фармакодинамического профиля или с облегчением его прохождения через клеточные мембраны.

В дополнение к олигонуклеотидам встречающихся в природе нуклеиновых кислот (то есть коротким последовательностям ДНК и/или РНК), существуют олигонуклеотиды синтетических нуклеиновых кислот, например, пептиднуклеиновых кислот (ПНК) и запертых нуклеиновых кислотх (ЗНК), которые хорошо изучены и охарактеризованы главным образом с целью модулирования экспрессии гена посредством антигенной стратегии (то есть, сконструированы для атаки непосредственно гена). ПНК- и ЗНК-олигонуклеотиды, подобно всем модифицированным олигонуклеотидам, в целом гораздо более химически стабильны, чем ДНК- или РНК-олигонуклеотиды. Их стабильность может быть дополнительно улучшена в результате синтеза химерных олигонуклеотидов. Химерный олигонуклеотид, например, представляет собой олигонуклеотидную последовательность, в которую вставлены как классические мономеры (дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды), так и синтетические нуклеотидные основания (мономеры), например, ЗНК-мономеры.

ЗНК используют при антисмысловой стратегии для сайленсинга генов путем ингибирования транскрипта гена-мишени (Braasch DA, NuclAcidsRes, 2002, 30(23): 5160-7). В качестве альтернативы, ЗНК-олигонуклеотиды можно также использовать в антигенной стратегии, как было сделано Smith с коллегами (GeR, FasebJ, 2007, 1902-14), которые сконструировали олигонуклеотидную последовательность таким образом, чтобы сделать возможным взаимодействие на обеих нитях нуклеиновой кислоты посредством механизма "нитевой инвазии", таким образом, чтобы образовывалась "Z-образная" структура (определены, как олигонуклеотиды "Zorro"). ПНК-олигонуклеотиды являются более стабильными при воздействии ферментов, по сравнению с другими олигонуклеотидными структурами. ПНК могут связываться с двухцепочечными ДНК (дцДНК) посредством "нитевой инвазии" или могут комплементарно образовывать пары с молекулой одноцепочечной ДНК (оцДНК), или же они могут связываться с нитями РНК, способствуя образованию гибридной структуры ПНК/ДНК или РНК/РНК с двойной спиралью, которая термодинамически очень стабильна, по сравнению со структурами "гомодуплекс" (такими, как двойная нить ДНК/ДНК).

ПНК представляют высоко эффективную систему для модулирования экспрессии гена, главным образом с использованием антигенной стратегии. Фактически, было показано, что ПНК демонстрируют высокую специфичность по отношению к последовательностям-мишеням и таким образом позволяют эффективным образом ингибировать экспрессию белка.

Вследствие этого, ПНК представляют перспективный терапевтический подход к лечению генетических или вирусных заболеваний.

Единственным недостатком ПНК является тот факт, что они имеют ограниченную способность проходить через клеточные мембраны. Однако, данное ограничение было устранено путем сопряжения олигонуклеотидов в общем, и в частности ПНК, с молекулами, способными оказывать помощь в более эффективном прохождении через клеточные мембраны (носители).

Фактически, олигонуклеотиды, в частности ПНК, в общем можно вводить, используя носители (или "метки"), сопряженные с ними, например, пептидные последовательности длиной, варьирующей от 1 до 30 аминокислот.

Одно конкретное применение олигонуклеотидов относится к модулированию экспрессии генов, которые активируются или репрессируются в опухолях.

Хорошо известно, что опухоли вызваны дисрегуляцией разных генов. Как правило, повреждение воздействует на протоонкогены (или также просто онкогены), такие как гены MYC (MYC, MYCN, MYCL1), сурвивин (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK и PKM2, которые активируются или сверхэкспрессируются в опухоли. Кроме того, в опухоли противоопухолевые гены или гены-онкосупрессоры, такие как каспаза-8 и RASSF1, обычно также инактивируются.

В частности, онкогены семейства MYC вовлечены в развитие многочисленных человеческих опухолей и принадлежат к числу генов, наиболее ответственных за начало и развитие неоплазм. Амплификация и/или сверхэкспрессия данных генов почти всегда ассоциирована с опухолями, как детского типа (например, нейробластома, медуллобластома и рабдомиосаркома) и взрослого типа (например, мелкоклеточный рак легкого, или глиобластома) (PessionA, CurCancerDrugTarget, 2005, 5(4): 273-83). Фактически, они действуют посредством механизмов, которые являются фундаментальными для роста опухолей, таких как индукция пролиферации клеток, устойчивость к апоптозу, образование метастаза и устойчивость к лекарственным средствам химиотерапии.

В литературе известно много олигонуклеотидов с противоопухолевым эффектом.

Например, существуют олигонуклеотиды, которые направлены против генов MYC, MYCN, BCL2, BIRC5 при антисмысловых стратегиях (EVProchownik, ExpRevAnticTher 2004, 4(2): 289-302; Felsher DW, DrugNewsPersp, 2003, 16(6):370-4; CFBennet, ExpOpinInvestigDrugs, 1999, 8(3): 237-53), или олигонуклеотиды, направленные против MYCN и MYC с антигенным эффектом (LCBoffa, Oligonucleotides 2005, 15(2):85-93).

Также получены фосфоротиоатные антисмысловые олигонуклеотиды на основе ДНК с целью ингибирования трансляции гена MYCN в клетках нейробластомы (BurkhartCA, JNCI, 2003, 95(18): 1394-403), и антисмысловые олигонуклеотиды были получены через "малые интерферирующие РНК (миРНК)" для ингибирования трансляции гена MYCN в клетках нейробластомы (KangJH, BiochBiophResCom, 2006, 351(1): 192-197).

Однако все еще существует большая ощутимая потребность в идентификации дополнительных олигонуклеотидов, способных модулировать экспрессию гена все более и более специфичным и селективным образом так, чтобы быть способными иметь сильный терапевтический и/или противоопухолевый эффект.

Для получения олигонуклеотидов, годных для использования в качестве терапевтических и/или диагностических средств, необходимо идентифицировать последовательности гена-мишени или матричной РНК-мишени и/или их соответствующие регуляторные последовательности, которые способны определять значительный и селективный эффект модуляции на экспрессию самого гена в отношении как транскрипции, так и трансляции.

Таким образом, также существует ощутимая потребность в определении общих правил, управляющих способом идентификации - в пределах последовательности гена или последовательности мРНК, или их регуляторных последовательностей - олигонуклеотидных последовательностей, которые являются наиболее обещающими в целях осуществления модулирования транстрипции/трансляции самого гена.

Потребности в данной области, как только что описано, удовлетворяются настоящим изобретением, которое согласно первому аспекту относится к олигонуклеотиду для модулирования экспрессии гена, содержащему 6-30 нуклеотидов (мономеров), предпочтительно 12-24 нуклеотида, при этом указанный нуклеотид характеризуется последовательностью, содержащей по меньшей мере одну группу по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов. Под олинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, понимается олигонуклеотид, который исключен из только что данного определения.

В случае встречающихся в природе нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), каждый мономер (нуклеотид) состоит из азотистого основания, сахара и трифосфата. Основание выбрано из аденина, гуанина, тимина, цитозина и урацила (только в РНК). Сахар представляет собой дезоксирибозу в случае ДНК и рибозу в случае РНК. Мономеры связаны в полимер посредством фосфодиэфирной связи.

Предпочтительно, олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит последовательность, содержащую по меньшей мере одну группу по меньшей мере из трех следующих друг за другом гуанинов. Под олинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, понимается олигонуклеотид, который исключен из данного определения.

Более предпочтительно, олигонуклеотид по настоящему изобретению содержит последовательность, содержащую по меньшей мере одну группу по меньшей мере из четырех следующих друг за другом гуанинов.

Даже более предпочтительно, олигонуклеотид по настоящему изобретению содержит последовательность, содержащую по меньшей мере одну группу по меньшей мере из пяти следующих друг за другом гуанинов.

Особенно предпочтительным в целях настоящего изобретения является олигонуклеотид, содержащий последовательность, содержащую по меньшей мере одну группу из по меньшей мере шести следующих друг за другом гуанинов.

В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид содержит последовательность, содержащую по меньшей мере одну группу, состоящую из двух-шести следующих друг за другом гуанинов.

В других воплощениях по меньшей мере одна группа гаунинов предпочтительно содержит по меньшей мере две группы по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов.

В качестве альтернативы, по меньшей мере одна группа гуанинов предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов и по меньшей мере одну группу по меньшей мере из трех следующих друг за другом гуанинов.

В других воплощениях по меньшей мере одна группа гаунинов предпочтительно содержит по меньшей мере три группы по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов.

В других воплощениях по меньшей мере одна группа гаунинов предпочтительно содержит по меньшей мере четыре, пять или шесть групп по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов.

В качестве альтернативы, по меньшей мере одна группа гуанинов предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов и по меньшей мере две группы по меньшей мере из трех следующих друг за другом гуанинов.

В качестве альтернативы, по меньшей мере одна группа гуанинов предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу по меньшей мере из трех следующих друг за другом гуанинов и по меньшей мере две группы по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов.

В качестве альтернативы, по меньшей мере одна группа гуанинов предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов, по меньшей мере одну группу по меньшей мере из трех следующих друг за другом гуанинов и/или по меньшей мере одну группу из шести следующих друг за другом гуанинов.

В общем, олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются предпочтительно комплементарными последовательности-мишени, и предпочтительно группы следующих друг за другом гуанинов могут следовать одна за другой так, что, например, три группы из 2-х следующих друг за другом гуанинов представляют собой группу из 6-ти следующих друг за другом гуанинов. В качестве альтернативы, группы следующих друг за другом гуанинов могут быть разделены по меньшей мере одним нуклеотидом.

В общем, по меньшей мере одна группа по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов согласно настоящему изобретению может быть расположена рядом с 5ʹ-концом олигонуклеотида или рядом с 3ʹ-концом олигонуклеотида, или же она может быть расположена в центре олигонуклеотидной последовательности.

В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения указанный нуклеотид сопряжен, предпочтительно на своем 3ʹ- и/или 5ʹ-конце, с последовательностью носителя, которая предпочтительно представляет собой короткую аминокислотную последовательность.

Указанная короткая аминокислотная последовательность (носитель) предпочтительно состоит из числа аминикислот, находящегося в интервале от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 10, даже более предпочтительно от 1 до 7. Аминокислоты могут быть представлены в L- или D-форме, предпочтительно в D-форме.

Носители, которые являются предпочтительными в целях настоящего изобретения, выбраны из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 47 (PKKKRKV); SEQ ID NO: 48 (VKRKKKP); SEQ ID NO: 49 (KKKKKK); SEQ ID NO: 50 (PKRKRKV); SEQ ID NO: 51 (KRKRKRK); SEQ ID NO: 52 (KKKRKV); SEQ ID NO: 53 (PKKKRK); SEQ ID NO: 54 (KKKRK); SEQ ID NO: 55 (RRRR) и SEQ ID NO: 56 (PKKKRKVHHHHH).

Носитель, который является особенно предпочтительным в целях настоящего изобретения, представляет собой пептид, имеющий SEQ ID NO: 47.

В контексте настоящего изобретения "носитель" означает пептид, способный успешно модифицировать факмакокинетический и/или фармакодинамический профиль и/или проникновение олигонуклеотида в клетку и/или ядро.

В контексте настоящего изобретения фраза "модулирование экспрессии гена" означает ингибирование или активацию (повышение уровня) экспрессии гена. Указанное ингибирование или активация (повышение в) экспрессии гена может происходить на транскрипционном или трансляционном уровне.

Ингибирование или активация экспрессии гена может быть достигнута на транскрипционном уровне посредством олигонуклеотидов, которые действуют на основе антигенного механизма (или антигенный олигонуклеотид, то есть направленный против антисмысловой нити гена, иными словами, антигенная стратегия). В качестве альтернативы, ингибирование экспрессии гена может быть достигнуто на трансляционном уровне с использованием олигонуклеотидов, которые действуют через антисмысловой механизм (или антисмысловой олигонуклеотид, то есть направленный против матричной РНК, иными словами, антисмысловая стратегия), тогда как повышение уровня экспрессии на трансляционном уровне может быть достигнуто в результате ингибирования микроРНК, которые разрушают матричную РНК.

Параметры или правила, или необходимые требования, которым олигонуклеотид должен соответствовать для того, чтобы эффективно модулировать экспрессию гена, идентифицированные заявителем и установленные выше, распространяются абсолютно на любой ген, и их можно таким образом применять, например, с целью идентификации последовательностей олигонуклеотидов, которые способны модулировать экспрессию гена(нов), ответственного(ных) за заболевания генетического и/или вирусного происхождения, или генов, вовлеченных в начало опухолевых патологий.

Олигонуклеотиды, идентифицированные таким образом, можно использовать, предпочтительно в качестве лекарственных средств, в терапевтических подходах к лечению конкретных генетических, вирусных или опухолевых заболеваний.

В качестве альтернативы, олигонуклеотиды можно использовать в диагностических целях.

Фактически, предмет настоящего изобретения дополнительно относится к применению олигонуклеотидов по изобретению, возможно химически модифицированных, в терапевтических и/или диагностических целях.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению представляют собой короткие олигонуклеотиды длиной от 6 до 30, предпочтительно от 12 до 24 остатка (нуклеотиды или мономеры). Олигонуклеотиды могут состоять из основания встречающейся в природе нуклеиновой кислоты, например ДНК или РНК, или основания синтетической нуклеиновой кислоты, например ПНК, ЗНК или морфолино. В качестве альтернативы, олигонуклеотиды могут содержать комбинацию ДНК, РНК и/или синтетические нуклеиновые кислоты, предпочтительно ПНК или ЗНК (гибридные или химерные олигонуклеотиды). Кроме того, олигонуклеотиды могут быть одно- или двухцепочечными.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения олигонуклеотиды могут быть химически модифицированными, например, в целях улучшения своей терапевтической и/или диагностической эффективности.

В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения олигонуклеотиды могут представлять собой молекулы ПНК с основной цепью, в которой углерод в альфа положении (С альфа) связан с заместителями, отличными от типичного атома водорода глицина. Например, вместо боковой цепи глицина может быть использована боковая цепь другой аминокислоты естественного или синтетического происхождения, предпочтительно выбранная из группы, состоящей из: аргинина, лизина, гистидина, лейцина, изолейцина, тирозина, аспарагина, серина, треонина, глутамина, валина, аланина, цистеина, метионина, фенилаланина, глутамата, аспартата, пролина, триптофана или орнитина. Указанная аминокислота может находиться в правовращающей конфигурации (D) или левовращающей конфигурации (L).

В других предпочтительных воплощениях изобретения олигонуклеотиды представляют собой: взаимно комплементарные молекулы одно- или двухцепочечной РНК (взаимно комплементарные молекулы двухцепочечной РНК определяются, как миРНК, сокращение от "малой интерферирующей РНК").

В некоторых воплощениях указанная "малая интерферирующая РНК" содержит мономеры РНК (рибонуклеотиды) и по меньшей мере один модифицированный мономер в 2ʹ-положении рибозы, предпочтительно мономер 2ʹ-О-метоксиэтил, 2ʹ-О-раэтил или 2ʹ-фтор; или указанная "малая интерферирующая РНК" содержит мономеры РНК (рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер синтетической нуклеиновой кислоты, предпочтительно выбранной из: ЗНК, метилфосфоната ЗНК, МНК (нуклеиновая кислота с мостиковой связью), ННК (незапертая нуклеиновая кислота), ЭНК (нуклеиновая кислота с этиленовой мостиковой связью), АНК (арабинонуклеиновая кислота) и Ф-АНК (фтор-арабинонуклеиновая кислота).

В предпочтительных воплощениях указанная "малая интерферирующая РНК" сконструирована таким образом, чтобы на концах комплементарной двойной цепи только одна из двух цепей имела по меньшей мере один, предпочтительно два мономера встречающихся а природе или синтетических нуклеиновых кислот, которые выступают, то есть не образуют пару. В других воплощениях встречающиеся в природе или синтетические выступающие нуклеиновые кислоты предпочтительно выбраны из мономера 2ʹ-O-метоксиэтил, 2ʹ-O-метил и 2ʹ-фтор или мономера ЗНК, метилфосфоната ЗНК, МНК, ННК (незапертая нуклеиновая кислота), ЭНК (нуклеиновая кислота с этиленовой мостиковой связью), АНК (арабинонуклеиновая кислота) и Ф-АНК (фтор-арабинонуклеиновая кислота).

В других воплощениях олигонуклеотиды определены, как гибридные или химерные, и являются предпочтительно одно- или двухцепочечными, содержащими мономеры РНК (рибонуклеотиды) и мономеры ЗНК (данный олигонуклеотид представлен как РНК/ЗНК). В качестве альтернативы, гибридные олигонуклеотиды могут содержать мономеры РНК (рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер РНК, выбранный среди мономера 2ʹ-O-метоксиэтил (МОЭ), мономера 2ʹʹ-O-метил и 2ʹ-фтор-мономера; или гибридные олигонуклеотиды могут содержать мономеры РНК (рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер синтетической нуклеиновой кислоты, предпочтительно выбранной из: ЗНК, метилфосфоната ЗНК, ННК (незапертая нуклеиновая кислота), МНК, ЭНК (нуклеиновая кислота с этиленовой мостиковой связью), АНК (арабинонуклеиновая кислота) и Ф-АНК (фтор-арабинонуклеиновая кислота).

В другом воплощении олигонуклеотиды на основе одно- и двухцепочечной РНК могут содержать классические рибонуклеотиды (то есть химически не модифицированные) и рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, которые были модифицированы на уровне фофсодиэфирной связи, например, посредством фосфоротиоатной связи, или ДНГ (дезоксирибонуклеиновый гуанидин), РНГ (рибонуклеиновый гуанидин), ГНК (глицериннуклеиновая кислота), Г-ПНК (гамма-ПНК) или РМО (морфолино).

В предпочтительных воплощениях изобретения олигонуклеотиды представляют собой химерные одноцепочечные последовательности, содержащие мономеры ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и мономеры ЗНК.

В случае антигенной стратегии, которая подразумевает модулирование экспрессии гена на транскрипционном уровне, можно предпочтительно использовать следующее:

- олигонуклеотиды на основе ПНК, возможно сопряжены с носителем (обычно состоящим из 1-30 остатков), предпочтительно на 3ʹ-конце и/или 5ʹ; или

- олигонуклеотиды на основе ПНК, причем указанная ПНК содержит по меньшей мере один альфа углерод (С-альфа) основной цепи с заместителем, отличным от атома Н канонического глицина; или

- одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и возможно по меньшей мере один модифицированный нуклеотид (мономер) (например, мономер 2ʹ-O-метил-РНК, мономер 2ʹ-фтор-РНК) или по меньшей мере один мономер нуклеиновой кислоты, выбранной среди: ЗНК, метилфосфата ЗНК, МНК, ННК, ГНК, АНК, Ф-АНК, ЭНК, ДНГ и РНГ, или рибонуклеотид, модифицированный на уровне фосфодиэфирной связи; или

- олигонуклеотиды на основе взаимно комплементарной двухцепочечной РНК (миРНК); или

- частично комплементарные двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер ЗНК; или

- двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер 2ʹ-O-(2-метоксиэтил)-РНК; или

- одноцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК (классические дезоксирибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер ЗНК; или

- олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК (классические дезоксирибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер 2ʹ-фтор-РНК или по меньшей мере один мономер нуклеиновой кислоты, выбранной среди: ЗНК, метилфосфоната ЗНК, МНК, ННК, ГНК, ЭНК, АНК, Ф-АНК, ДНГ и РНГ.

В случае антисмысловой стратегии, которая подразумевает модулирование экспрессии гена на уровне трансляции, можно предпочтительно использовать следующее:

- взаимно комплементарные двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) (миРНК); или

- одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер РНК, модифицированный на уровне рибозы и/или на уровне фосфодиэфирной связи; или

- одноцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК (классические дезоксирибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер фосфоротиоатной ДНК; или

- двуцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер 2ʹ-O-(2-метоксиэтил) РНК; или

- двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер 2ʹ-O-метилата РНК; или

- двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер 2'-фтор-РНК; или

- двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер ЗНК; или

- двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК (классические рибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер арабинозид-РНК; или

- одноцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК (классические дезоксирибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер ЗНК; или

- одноцепочечные олигонуклеотиды, содержащие мономеры молфолино; или

- олигонуклеотиды на основе ПНК, причем указанная ПНК содержит по меньшей мере один альфа углерод (С-альфа) основной цепи с заместителем, отличным от атома Н канонического глицина; предпочтительно заместитель представляет собой боковую цепь аргинина или лизина; или

- олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК (классические дезоксирибонуклеотиды) и по меньшей мере один мономер нуклеиновой кислоты, выбранной среди: ПНК, ЗНК, метилфосфоната ЗНК, МНК, ННК, ГНК, ЭНК, ДНГ и РНГ.

Предпочтительно, олигонуклеотиды по настоящему изобретению направлены против гена, вовлеченного в развитие заболевания генетического и/или вирусного происхождения или опухоли. Указанный ген предпочтительно выбран из группы, состоящей из: генов семейства MYC (предпочтительно MYC, MYCN, MYCL1), генов сурвивина (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK, РКМ2, каспазы-8 и RASSF1.

В частности, олигонуклеотиды по настоящему изобретению направлены против генов семейства MYC, предпочтительно против MYCN.

Указанные олигонуклеотиды предпочтительно выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-15, 66-84, SEQ ID NO: 24, 25, 31 и 32, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 26 и 57, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 27 и 58, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 28 и 59, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 29 и 60, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 30 и 61, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 33 и 62, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 34 и 63, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 35 и 64 и пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 36 и 65.

В некоторых воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды ПНК, предпочтительно указанные ПНК направлены против MYCN.

В предпочтительных воплощениях ПНК выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-15.

В других предпочтительных воплощениях ПНК выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 66-84.

В других предпочтительных воплощениях ПНК выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-15, 66-84.

Предпочтительно, ПНК-олигонуклеотиды выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, более предпочтительно SEQ ID NO: 2-8, даже более предпочтительно SEQ ID NO: 2-6. Олигонуклеотид ПНК, который является особенно предпочтительным для целей настоящего изобретения, представляет собой SEQ ID NO: 5.

Предпочтительно, SEQ ID NO: 5 сопряжен на 5ʹ- или 3ʹ-конце с SEQ ID NO: 47. Более предпочтительно, SEQ ID NO: 47 состоит из аминокислот в D-форме.

SEQ ID NO: 2-15 ПНК предпочтительно направлены против MYCN и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию MYCN на основе антигенной стратегии.

SEQ ID NO: 66-69 ПНК также предпочтительно направлены против MYCN и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию MYCN на основе антигенной стратегии.

SEQ ID NO: 70-74 ПНК предпочтительно направлены против MYC и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию MYC на основе антигенной стратегии.

SEQ ID NO: 75, 76 ПНК предпочтительно направлены против BIRC5 и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию BIRC5 на основе антигенной стратегии.

SEQ ID NO: 77-79 ПНК предпочтительно направлены против ALK и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию ALK на основе антигенной стратегии.

SEQ ID NO: 80-82 ПНК предпочтительно направлены против BCL2 и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию BCL2 на основе антигенной стратегии.

SEQ ID NO: 83, 84 ПНК предпочтительно направлены против PLK4 и, более предпочтительно, они модулируют экспрессию PLK4 на основе антигенной стратегии.

В другом воплощении указанные олигонуклеотиды являются двухцепочечными и предпочтительно содержат мономеры РНК. Предпочтительно указанные олигонуклеотиды направлены против MYCN.

В качестве альтернативы, указанные двухцепочечные РНК-олигонуклеотиды выбраны из группы, состоящей из: пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 26 и 57, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 27 и 58, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 28 и 59, пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 29 и 60 и пары комплементарных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 30 и 61. Указанные олигонуклеотиды предпочтительно направлены против MYCN. Более предпочтительно, они модулируют экспрессию гена через антисмысловую стратегию.

В других воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой химерные олигонуклеотиды ДНК-ЗНК, предпочтительно указанные олигонуклеотиды направлены против MYCN.

В предпочтительных воплощениях указанные химерные олигонуклеотиды ДНК-ЗНК выбраны из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 24 и 25.

SEQ ID NO: 24 и 25 предпочтительно направлены против гена MYCN.

SEQ ID NO: 24 и 25 предпочтительно модулируют экспрессию гена через антигенную стратегию.

В других воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой одноцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК и/или по меньшей мере один мономер фосфоротиоатной ДНК. Указанные олигонуклеотиды предпочтительно направлены против MYCN.

Особенно предпочтительными для целей настоящего изобретения являются химерные олигонуклеотиды, выбранные из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 31 и 32. SEQ ID NO: 31 и 32 предпочтительно направлены против гена MYCN. SEQ ID NO: 31 и 32, предпочтительно модулируют экспрессию MYCN посредством антисмысловой стратегии.

В других воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК и по меньшей мере один мономер, предпочтительно 2ʹ-O-(2-метоксиэтил) или 2ʹ-метил-РНК.

Указанные олигонуклеотиды предпочтительно направлены против MYCN. Особенно предпочтительной для целей настоящего изобретения является пара комплементарных химерных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 33 и 62. Указанная пара олигонуклеотидов предпочтительно модулирует экспрессию гена посредством антисмыслового механизма.

В других воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК и по меньшей мере один мономер, предпочтительно 2ʹ-фтор-РНК. Предпочтительно указанные олигонуклеотиды направлены против MYCN.

Особенно предпочтительной для целей настоящего изобретения является пара комплементарных химерных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 34 и 63. Указанная пара олигонуклеотидов предпочтительно модулирует экспрессию гена посредством антисмыслового механизма.

В других воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК и по меньшей мере один мономер ЗНК.

Указанные олигонуклеотиды предпочтительно направлены против MYCN. Особенно предпочтительной для целей настоящего изобретения является пара комплементарных химерных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 35 и 64. Указанная пара олигонуклеотидов предпочтительно модулирует экспрессию гена через антисмысловой механизм.

В других воплощениях указанные олигонуклеотиды представляют собой двухцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры РНК и по меньшей мере один мономер арабинозид-РНК.

Предпочтительно, указанные олигонуклеотиды направлены против MYCN. Особенно предпочтительной для целей настоящего изобретения является пара комплементарных химерных олигонуклеотидов, имеющих SEQ ID NO: 36 и 65. Указанная пара олигонуклеотидов предпочтительно модулирует экспрессию гена через антисмысловой механизм.

Другой аспект изобретения относится к применению описанных выше олигонуклеотидов в терапевтических и/или диагностических целях.

В частности, олигонуклеотиды можно использовать отдельно или комбинированными вместе для лечения заболеваний генетического и/или вирусного происхождения, в частности, для лечения генетических заболеваний, вызванных либо сверхэкспрессией, либо ингибированием гена, то есть генетических заболеваний, которые требуют модуляции экспрессии гена, который сверхэкспрессируется или ингибируется.

Олигонуклеотиды по изобретению применяют для терапевтического лечения генетического заболевания, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из следующих: синдром Горлина, синдром Дауна, синдром Фейнгольда, болезнь Гиршспрунга, синдром фон Гиппеля-Линдау, телеангиоэктатическая атаксия, синдром Ли-Фраумени, синдром Турко, семейные опухоли и болезнь Паркинсона.

Кроме того, олигонуклеотиды по изобретению применяют для терапевтического лечения опухолевых патологий у детей или взрослых. В частности, опухоли, на которые сделана ссылка, вызваны предпочтительно сверхэкспрессией гена или онкогена, выбранного из группы, состоящей из MYC, MYCN, MYCL1, сурвивина (BIRC5), BCL2, PLK4, ALK и PKM2.

В качестве альтернативы, опухоли вызваны предпочтительно ингибированием (инактивацией) онкосупрессора или противоопухолевого гена и предпочтительно выбранных из группы, состоящей из каспазы-8 и RASSF1.

Опухоли, на которые сделана ссылка, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из следующих: нейробластома, ретинобластома, медуллобластома, эпердимома, феохромоцитома, эмбриональная карцинома, герминогенная опухоль, альвеолярная рабдомиосаркома, эмбриональная рабдомиосаркома, опухоль Вильмса, светлоклеточная саркома почки, синовиальная саркома, гепатобластома, острый лимфоидный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, лимфома Беркитта, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый мегакариобластный лейкоз, В-хронический лимфоидный лейкоз, Т-клеточный лейкоз, лимфомы, мелкоклеточный рак легкого (микроцитома), легочная аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома легкого, типичный и атипичный первичный рак легкого, крупноклеточная карцинома легкого, крупноклеточная нейроэндокринная карцинома легкого, глиобластома, гепатокарцинома, базальноклеточная карцинома, опухоль яичника, опухоль молочной железы и рак толстой кишки.

Особенно предпочтительными для целей настоящего изобретения являются опухоли, выбранные из группы, состоящей из: нейробластомы, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, опухоли Вильмса, медуллобластомы, мелкоклеточного рака легкого и базальноклеточной карциномы.

Предмет настоящего изобретения дополнительно относится к композиции, содержащей по меньшей мере один олигонуклеотид согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один фармакологически приемлемый эксципиент. Предпочтительно, указанный по меньшей мере один олигонуклеотид представляет собой ПНК, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2-15, 66-84, предпочтительно SEQ ID NO: 2-13, более предпочтительно SEQ ID NO: 2-8, даже более предпочтительно SEQ ID NO: 2-6. Олигонуклеотид, который является особенно предпочтительным, представляет собой SEQ ID NO: 5. Предпочтительно, SEQ ID NO: 5 сопряжен на 5ʹ- или 3ʹ-конце с SEQ ID NO: 47. Более предпочтительно, SEQ ID NO: 47 состоит из аминокислот в D-форме.

Указанная ПНК предпочтительно сопряжена на 5ʹ- или 3ʹ-конце с носителем, который предпочтительно выбран, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47-56.

Предмет настоящего изобретения дополнительно относится к комбинации, содержащей по меньшей мере один олигонуклеотид согласно настоящему изобретению, включая олигонуклеотид, имеющий SEQ ID NO: 1, по меньшей мере одно соединение, предпочтительно по меньшей мере одно соединение с фармакологическим эффектом, более предпочтительно химиотерапевтический агент, и возможно по меньшей мере один фармакологически приемлемый эксципиент.

В предпочтительных воплощениях указанное по меньшей мере одно соединение представляет собой по меньшей мере один дополнительный антигенный и/или антисмысловой олигонуклеотид или по меньшей мере один факмакологический агент или по меньшей мере одно соединение биологического или биотехнологического происхождения или полученное в результате химического синтеза или их комбинации. Указанное соединение биологического или биотехнологического происхождения или полученное в результате химического синтеза предпочтительно выбрано из группы, состоящей из: моноклональонго антитела, химиотерапевтического агента, иммуномодулирующего агента, ростового фактора, цитокина, пептида, ингибитора ангиогенеза, ингибитора опухолевого роста, стероидного гормона и/или нестероидного гормона и витаминов.

Примеры соединений, которые являются особенно предпочтительными для целей настоящего изобретения, выбраны из группы, состоящей из: фактора роста нервов (NGF), соматостатина, ретиноевой кислоты, актиномицина D, аспарагиназы, блеомицина, бусульфана, капецитабина, карбоплатина, циклофосфамида, циклоспорина, цисплатина, цитарабина, клорамбуцила, дакарбазина, даунорубицина, доцетаксела, доксорубицина гидрохлорида, эпирубицина гидрохлорида, этопозида, флударабина фосфата, фторурацила, гемцитабина, идарубицина гидрохлорида, гидроксимочевины, ифофосфамида, иринотекана гидрохлорида, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, митомицина, митоксантрона, нутлина, оксалиплатина, паклитаксела, прокарбазина, ралтитрекседа, стрептозоцина, тегафур-урацила, темозоломида, тиогуанина, тиотепа, топотекана, винбластина, винкристина, виндезина и винорелбина и их комбинаций.

Более предпочтительно соединения выбраны из группы, состоящей из: карбоплатина, цисплатина, этопозида, винкристина, циклофосфамида и их комбинаций.

Заявитель обнаружил, что введение по меньшей мере одного олигонуклеотида согласно изобретению в комбинации с по меньшей мере одним соединением, предпочтительно по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом, как описано выше, делает возможным снижать концентрацию указанного соединения, подлежащего введению, вместе с тем одновременно гарантируя повышение терапевтической эффективности и более низкую токсичность.

Заявитель обнаружил, что в данных условиях снижение концентрации указанного соединения зависит от конкретной патологии: в частности, концентрация химиотерапевтического соединения зависит от типа опухоли. Для некоторых опухолей, таких как нейробластома, ретинобластома, медуллобластома, мелкоклеточный рак легкого, опухоль Вильмса, альвеолярная рабдомиосаркома и эмбриональная рабдомиосаркома, концентрация по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, вводимого в комбинации с по меньшей мере одним олигонуклеотидом согласно настоящему изобретению, может быть снижена вплоть до 10 раз, одновременно гарантируя такой же терапевтический эффект, как в случае нормальной дозы химиотерапевтического агента.

Особенно эффективным в качестве фармацевтической комбинации (с точки зрения улучшенного терапевтического эффекта) является комбинация по меньшей мере одной ПНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно по меньшей мере одной ПНК, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1-15, 66-84, предпочтительно SEQ ID NO: 1-13, более предпочтительно SEQ ID NO: 1-8, более предпочтительно SEQ ID NO: 1-6, даже более предпочтительно SEQ ID NO: 1 и/или 5, и по меньшей мере одного соединения, предпочтительно химиотерапевтического агента, более предпочтительно выбранного из группы, состоящей из: этопозида (VP16), карбоплатина, цисплатина или винкристина, циклофосфамида и их комбинаций.

Особенно предпочтительной для целей настоящего изобретения является комбинация, выбранная из SEQ ID: NO 1 и карбоплатина, или этопозида, или цисплатина, или винкристина; или SEQ ID: NO 5 и карбоплатина, или этопозида, или цисплатина, или винкристина.

Указанная ПНК предпочтительно сопряжена на своем 3ʹ- и/или 5ʹ-конце с носителем, который предпочтительно выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 47-56.

Улучшенный эффект предпочтительно должен быть обнаружен как при единовременном введении комбинации, так и в том случае, когда указанное по меньшей мере одно соединение вводят последовательно, предпочтительно с интервалами, более предпочтительно с регулярными интервалами, составляющими 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов или 72 часа.

В других предпочтительных воплощениях по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению, включая олигонуклеотид, имеющий SEQ ID NO: 1, можно вводить сопряженным или в комплексе предпочтительно с по меньшей мере одной частицей носителя, по меньшей мере одним полимером-носителем или по меньшей мере одним самособранным олигонуклеотидом-носителем (также известны, как аптамеры).

В других предпочтительных воплощениях по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению, включая олигонуклеотид, имеющий SEQ ID NO: 1, можно сопрягать или включать в комплекс и вводить по меньшей мере с одной липосомальной мицеллой, по меньшей мере с одной микрочастицей или по меньшей мере с одной наночастицей, так чтобы способствовать проникновению в ткань-мишень.

Указанная частица, обычно сферической формы, и используемая в качестве средства специфичной доставки, может быть приготовлена со многими разными химическими соединениями. Например, указанная частица может представлять собой композицию или совместную композицию полимерных соединений, таких как: хитозан, гиалуроновая кислота, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленимин (ПЭИ), полимолочная кислота (ПМК), сополимер молочной и гликолевой кислот (ПМГК), гидроксиапатит (ГАП), полиненасыщенные жирные кислоты, насыщенные жирные кислоты, катионные липиды, ГАП-ПМК, ГАП-ПМК/ПГК и их производные. В других предпочтительных воплощениях по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению может быть введен сопряженным или в комплексе предпочтительно с по меньшей мере одной частицей ранее описанного типа, и по меньшей мере с одним лигандом или по меньшей мере одной частью лиганда, специфичного в отношении рецептора клеток-мишеней (такого как, например, CD2, фолиевая кислота, TRAIL, NGF), либо химического или биотехнологического происхождения, может находиться в полимерных мембранах в качестве адъюванта, полезного для способствования интернализации указанного олигонуклеотида по изобретению в клетки-мишени.

В других воплощениях по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению может быть сопряжен с по меньшей мере одним лигандом или частью лиганда (такого, как, например, GD2 (ганглиозид GD2), фолиевая кислота, TRAIL (TNF (фактор некроза опухоли)-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд), NGF (фактор роста нервов)), специфичного по отношению к рецептору клеток-мишеней.

В других предпочтительных воплощениях по меньшей мере один олигонуклеотид по изобретению, включая олигонуклеотид, имеющий SEQ ID NO: 1, можно вводить отдельно или в комбинации, совместно с по меньшей мере одним дополнительным медицинским применением для усиления их эффективности, предпочтительно также путем облегчения проникновения в клетки-мишени и/или ткани-мишени.

Указанное медицинское применение предпочтительно выбрано из группы, состоящей из: оксигенотерапии, магнитотерапии, термотерапии, электростимуляции, ультразвука, радиотерапии, химиотерапии и фототерапии.

Пример 1

Химический синтез олигонуклеотидов

Химический синтез олигонуклеотидов основан на применении ДНК-нуклеозид-фосфорамидитов, модифицированных защитной группой 4ʹ-диметокситритил (DMTr) на 5ʹ-ОН и β-цианоэтил на 3ʹ-фосфатной группе; защитные группы также применяют в случае первичных аминов (гетероциклы нуклеотидных оснований), которые в противном случае являются слишком реакционноспособными.

Химический синтез ДНК-олигонуклеотидов происходит в направлении 3ʹ-5ʹ. Применяют смолу на основе CPG (сокращение для стекла с контролируемым размером пор) или полистирольную подложку, функционализированную первым нуклеотидным основанием. Синтез начинается со стадии снятия защитной группы 5ʹ-диметокситритил с использованием раствора 3% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) в дихлорметане (ДХМ). За этим следует активация, с использованием этилтиотетразола (ЭТТ) или бензилтиотетразола (БТТ) 0,3 М, фосфорамидита, соответствующего второму основанию, подлежащему вставке в последовательность, который затем будет соединен с предварительно лишенным защитной группы 5-ОН с образованием таким образом фосфодиэфирной связи.

Следующая стадия представляет собой "кэппирование", которое служит для ацетилирования групп 5ʹ-ОН, которые не вступали в реакцию. Кэппирование проводят с использованием 2 растворов, причем один содержит тетрагидрофуран (ТГФ)/лутидин/уксусный ангидрид (8:1:1), и другой содержит 10% раствор метилимидазола в ТГФ. Нестабильную трехвалентную связь фосфиттриэфиров стабилизируют с помощью иодина в растворе ТГФ/пиридина, который окисляет их до пятивалентных фосфодиэфиров.

После окисления цикл повторяют, начиная с детритилирования вводимой второй единицы и так далее. Данный цикл повторяют необходимое число раз, в зависимости от того, как много оснований желательно вставить в последовательность. Наконец, конечную 5ʹ-DMTr-группу удаляют посредством обработки кислотой при комнатной температуре.

В зависимости от защитных групп, находящихся на основаниях (что в свою очередь зависит от химии выбранных оснований, РТО, 2ʹОМе и т.д.), это может быть оставлено при 55°С в течение 16 часов с гидроксидом аммония или при 55°С в течение 35 минут с раствором гидроксида аммония/метиламина (АМА) для снятия защитных групп с фосфорсодержащих групп посредством β-элиминирования цианоэтильных групп и удаления защитных групп на гетероциклах нуклеотидных оснований.

В качестве альтернативы, группу 5ʹ-DMTr могут поддерживать на протяжении фазы анализа (ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), МС (масс-спектрометрия)) и препаративной хроматографии для лучшей очистки конечного продукта от побочных продуктов и, в заключение, удалять посредством обработки уксусной кислотой.

Химический синтез РНК-олигонуклеотидов отличается от ДНК-олигонуклеотидов из-за 2ʹ-ОН-группы, присутствующей на рибозе и, таким образом, наличия дополнительной защитной группы для каждого фосфорамидита.

Следовательно, синтез РНК-олигонуклеотидов требует более продолжительного времени синтеза полимера и дополнительных стадий для снятия данной защитной группы.

Тот же протокол, как описан выше, применяют для синтеза олигонуклеотидов с химически модифицированными мономерами, такими как фосфоротиоаты (РТО), 2ʹ-O-метил (2ʹОМе), 2ʹ-фтор (2ʹ-F), арабинонуклеиновая кислота и запертая нуклеиновая кислота (ЗНК).

Подробности конкретных методик для каждого модифицированного основания обеспечены компанией, у которой приобретены молекулы мономеров (Link Technologies Ltd.).

Морфолино приобретали у изготовителя (Gene Tools, LLC).

Синтез ПНК-олигонуклеотидов проводили в 10 микромолярном диапазоне, и была включена стадия очистки и характеристики.

Синтез молекулы проводили в твердой фазе, используя смолу Rink Amide-Chemmatrix® и автоматическое синтезирующее устройство Syro (MultiSynTech). Первый мономер синтеза вручную связывают со смолой. Каждый цикл автоматического синтеза делят на три стадии. Первая стадия представляет собой снятие защитной группы, проводимое с использованием раствора 20% пиперидина в ДМФ (диметилформамид).

Вторая стадия представляет собой реакцию синтеза полимера между вступающим в реакцию мономером и растущей цепью. Данную реакцию проводят путем добавления 5 0,22 М эквивалентов (экв.) мономера (FMOC-ПНК-G(Bhoc)-OH, FMOC-ПНК-(Bhoc)-OH, FMOC-ПНК-С (Bhoc)-OH, FMOC-ПНК-T-OH) в NMP (N-метилпирролидон) и 4,5 0,32 М экв. активатора в DMF (диметилформамид) (в данном случае HATU (1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазола-[4,5-b]-пиридиний-3-оксид гексафторфосфат) в щелочной среде с 8% раствором 2,6-лутидина и DIPEA (N,N-диизопропилэтиламин) в DMF. Реакцию синтеза полимера повторяют, в двойной повторности, в точке присоединения первого и второго мономера на предварительно загруженной смоле, в месте перехода от пептидной цепи на цепь ПНК, и на последнем мономере.

Третья стадия представляет собой реакцию "кэппирования", которая служит для блокирования, путем ацетилирования, сайтов, которые не вступали в реакцию во время стадии синтеза полимера. Реакцию проводят, используя раствор, содержащий 6% 2,6-лутидин и 5% уксусный ангидрид в DMF. При завершении синтеза молекулы удаляют с твердой подложки.

Данную реакцию осуществляют с помощью раствора ТФУ (трифторуксусная кислота) и метакрезола в соотношении 4:1.

Молекулу, полученную таким образом, собирают посредством осаждения в диэтиловом эфире.

Сразу после восстановления в воде, ее очищают посредством ВЭЖХ. Колонка, используемая для очистки, представляет собой С18 300А 5u Jupiter (© Phenomenex, Inc.). Очистку проводят с использованием линейного градиента от 100% А (вода 95%; ацетонитрил 5%; 0,1% ТФУ) - 0% В (вода 60%; ацетонитрил 40%; 0,1% ТФУ) до 60% А-40% В за 30 минут. Полный используемый градиент представляет собой 0-5 минут 0% В; 5-35 минут 40% В; 35-37 100% В; 37-42 100% В; 42-44 0% В.

Наконец, очищенный продукт анализируют с помощью масс-спектрометрии с ESI (электрораспылительная ионизация) (© Waters).

Антигенные олигонуклеотиды для блокирования транскрипции гена. Для того, чтобы продемонстрировать тот факт, что олигонуклеотиды по изобретению, выбранные и сконструированные согласно параметрам, описанным в настоящем изобретении, осуществляют селективное блокирование транскрипции гена, конструировали и синтезировали олигонуклеотиды на основе ПНК, направленные против гена MYCN; они показаны в таблице 1.

ПНК-олигонуклеотиды тестировали как отдельно, так и сопряженными с носителем на 3ʹ- и/или 5ʹ-конце с целью облегчения проникновения через клеточную мембрану. В частности, олигонуклеотиды сопрягали на 3ʹ-конце с карбоксильным концом аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43, то есть пролин-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин.

Олигонуклеотид, имеющий SEQ ID NO: 1, представляет собой последовательность, которая представляла собой предмет патента ЕР 1618195 и представляет собой контрольную последовательность и последовательность, используемую для сравнения.

Олигонуклеотиды, имеющие SEQ ID NO: 2-15, содержат группу из двух следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 14, 15) или группу из трех следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 13), или две группы из двух следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 12), или группу из двух гуанинов и группу из трех следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 11, 10, 9, 8 и 7), или две группы из двух следующих друг за другом гуанинов и группу из трех следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 6 и 4) и группу из двух следующих друг за другом гуанинов и две группы из трех следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 5), или группу из шести следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 3), или группу из шести следующих друг за другом гуанинов, группу из трех следующих друг за другом гуанинов и группу из двух следующих друг за другом гуанинов (SEQ ID NO: 2).

Группы следующих друг за другом гуанинов показаны подчеркиванием в таблице 1.

Олигонуклеотиды, имеющие SEQ ID NO: 16-23, не имеют групп следующих друг за другом гуанинов, представляя собой отрицательные контроли.

Более того, в целях селективного модулирования транскрипции гена также конструировали и синтезировали олигонуклеотиды, имеющие SEQ ID NO: 24-25; они показаны в таблице 2.

В частности, конструировали и синтезировали одноцепочечные химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК и мономеры ЗНК (SEQ ID NO: 24 и 25).

Основания ДНК в олигонуклеотидной последовательности показаны в виде оснований, выделенных жирным шрифтом, тогда как мономеры ЗНК подчеркнуты. Каждую молекулу химерного олигонуклеотида конструировали и синтезировали путем вставки мономеров ЗНК, разделенных 1, 2 или 3 основаниями ДНК, для того, чтобы избежать быстрого распада под действием эндогенных нуклеаз, как сообщалось в литературе (Koch Т, Biochem J 2001, 354 (Pt 3):481-4; Koji Nagahama, Bioorg Med ChemLett, 2.009, 19(10): 2707-9). Антисмысловые олигонуклеотиды для блокирования трансляции гена.

С целью демонстрации того факта, что олигонуклеотиды по изобретению, выбранные и сконструированные согласно параметрам, описанным в настоящем изобретении, осуществляют селективное блокирование трансляции гена-мишени, конструировали, синтезировали и экспериментально анализировали in vitro антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие SEQ ID NO: 26-36, направленные против гена MYCN. Они показаны в таблице 3.

Комплементарные двухцепочечные олигонуклеотиды на основе РНК (малые интерферирующие РНК (миРНК) (SEQ ID NO: 26-30) получали для селективной модуляции трансляции гена-мишени, MYCN.

Более того, получали олигонуклеотиды на основе ДНК SEQ ID NO: 31 и 32, у которых фосфодиэфирная связь была модифицирована в фосфоротиоатную.

Также получали двухцепочечные химерные олигонуклеотиды: на основе мономеров РНК и мономеров 2ʹO-метил (SEQ ID NO: 33); на основе мономеров РНК и 2ʹ-фтор-мономеров (SEQ ID NO: 34); на основе мономеров РНК и мономеров ЗНК (SEQ ID NO: 35) и на основе мономеров РНК и мономеров арабинозид-РНК (SEQ ID NO: 36). В олигонуклеотидных последовательностях SEQ ID NO: 33-36 2ʹ-О-метил-, 2ʹ-фтор-, ЗНК- и арабинозид (АНК)-мономеры показаны жирным шрифтом, тогда как каждая группа из по меньшей мере двух следующих друг за другом гуанинов подчеркнута.

Так как миРНК олигонуклеотидов являются двухцепочечными, химеру конструировали и синтезировали таким образом, чтобы оставить два мономера 2ʹO-Ме или два 2ʹ-фтор-мономера, или два мономера ЗНК, или два мономера арабинозид-РНК, как на 3ʹ, так и на 5ʹ, не спаренными с комплементарной цепью и, таким образом, избежать быстрого распада по действием клеточных ферментов.

Обработки олигонуклеотидами - количественная ПЦР (полимеразная цепная реакция)

В целях оценки способности олигонуклеотидов по настоящему изобретению модулировать экспрессию генов-мишеней, анализировали их способность снижать количество матричной РНК с использованием метода ПЦР в реальном времени.

С данной целью использовали 24-луночные планшеты, которые засевали клетками в концентрации 5,0×10⁴ с 0,3 мл среды OPTI-MEM (GIBCO BRL), 4% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 2 мМ L-глутамином (эксперименты в трехкратной повторности) на лунку.

Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C, в атмосфере, содержащей 5% CO₂, для обеспечения адгезии на дне лунок.

Каждый анализируемый олигонуклеотид, за исключением ПНК-олигонуклеотидов, предварительно инкубировали с 2 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen), с 0,3 мл среды OPTI-MEM (GIBCO BRL), не содержащей сыворотку.

Для каждой лунки олигонуклеотиды анализировали при следующих конечных концентрациях:

- антисмысловые миРНК-олигонуклеотиды и миРНК-гэпмер (то есть олигонуклеотиды, содержащие один или более мономеров химически модифицированных нуклеиновых кислот на 3ʹ- или 5ʹ-конце, в то время как в центральной части они содержат мономеры нуклеиновых кислот, которые не были модифицированы или были модифицированы на уровне фосфодиэфирной связи в виде фосфоротиоатной связи), использовали в концентрации 200 нМ;

- антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие мономеры фосфоротиоатной ДНК, РНК-антигенные олигонуклеотиды (агРНК) и олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК и мономеры ЗНК, использовали в концентрации 10 мкМ;

- морфолиноолигонуклеотиды использовали в концентрации 1 мкМ, и

- ПНК-нуклеотиды вводили в концентрации 1 мкМ.

Клетки обрабатывали олигонуклеотидами, добавляя FBS вплоть до 4% через 6 часов после их введения. Спустя 24 часа тотальную РНК экстрагировали из каждой лунки и очищали с использованием набора RNeasy Mini (QIAGEN).

Анализы проводили на 8 клеточных линиях, полученных из 5 разных человеческих опухолей, которые коррелируют с экспрессией MYCN, то есть:

- в качестве модели нейробластомы использовали клеточные линии Kelly, IMR-32 (где ген MYCN амплифицируется и суперэкспрессируется) и SKNBE2c и LANI (где ген MYCN амплифицируется и суперэкспрессируется, и ген р53 мутирован);

- в качестве модели рабдомиосаркомы использовали клеточную линию RH30, где ген MYCN амплифицируется и суперэкспрессируется;

- в качестве модели опухоли Вильямса использовали клеточную линию WiT49, где ген MYCN амплифицируется и суперэкспрессируется;

- в качестве модели ретинобластомы использовали клеточную линию Y79, где ген MYCN амплифицируется и суперэкспрессируется; и

- в качестве модели мелкоклеточного рака легкого использовали клеточную линию Н69, где ген MYCN амплифицируется и суперэкспрессируется.

В качестве контроля использовали те же клеточные линии, которые перечислены выше, обработанные стерильной водой вместо олигонуклеотидов. Каждый образец РНК определяли количественно (в двухкратной повторности) с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies). Первую нить кДНК (комплементарная ДНК) получали с использованием набора для синтеза кДНК для ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) (Roche). Для реакции синтеза кДНК использовали всего 1 г РНК. Для ПЦР в реальном времени использовали 10 нг кДНК в конечном объеме 20 мкл с SYBR Green Master Mix 2Х (Applied Biosystems) (3 идентичных эксперимента проводили в трехкратной повторности). Последовательности и концентрации праймера, используемого для проведения ПЦР в реальном времени, показаны в таблице. Два гена "домашнего хозяйства" использовали в качестве положительных контролей: GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) и бета-актин (АСТВ).

Условия реакции количественной ПЦР были следующими: 10 мин при 95°C, 20 сек при 95°C и 30 сек при 60°С, за 50 циклов.

Обработки олигонуклеотидами. Анализ пролиферации клеток.

С целью оценки способности олигонуклеотидов по настоящему изобретению модулировать экспрессию гена, определяли эффект от их введения, оказываемый на жизнеспособность клеток.

С данной целью клетки в концентрации 5×10³ на лунку засевали в 96-луночные планшеты для культуры клеток (эксперименты, проводимые в трехкратной повторности) с 100 мкл среды OPTI-MEM (GIBCO BRL), содержащей 4% FBS и 2 мМ L-глутамина.

ПНК-олигонуклеотиды вводили в разных концентрациях (1 мкМ-2, 5 мкМ-5 мкМ-10 мкМ) для наблюдения за зависимостью "доза-эффект".

В отношении всех других олигонуклеотидов, концентрации, в которых их вводили, перечислены в разделе "Обработки олигонуклеотидами количественная ПЦР".

Жизнеспособность обработанных клеток определяли через 48, 72, 96 и 168 часов после обработки.

Жизнеспособность клеток оценивали посредством анализа ATP-Lite (Система анализа для детекции люминесценции на основе АТФ (аденозинтрифосфат), PerkinElmer), и она выражена отношением усредненного сигнала от обработанных лунок к среднему значению сигнала от лунок с необработанными контрольными клетками. Клетки обрабатывали согласно инструкциям, предложенным с набором.

Анализы проводили на тех же клеточных линиях, используемых для определения уровней мРНК гена MYCN, и они перечислены в разделе "Обработки олигонуклеотидами - количественная ПЦР".

РЕЗУЛЬТАТЫ

По мере рассмотрения ПНК-олигонуклеотидов, результаты, касающиеся их способности ингибировать транскрипцию гена MYCN и пролиферацию клеток Kelly, показаны в таблице 1. В таблице 6 показаны значения (в процентах) пролиферирующих клеток Kelly при разных концентрациях анализируемых ПНК.

Результаты демонстрируют то, что ингибирующий эффект данных ПНК на транслируемый белок генов-мишеней является высоко селективным и специфичным. Более того, наблюдали, что задержка роста опухолевых клеток, используемых в качестве модели (характеризующихся амплификацией гена MYCN) непосредственно сопровождалась апоптозом после введения антигенных ПНК.

В общем, антигенные олигонуклеотиды ПНК, имеющие SEQ ID: 2 - SEQ ID NO: 13 (содержащие одну или более чем одну группу G), имеют большую антигенную эффективность (то есть ингибирование мРНК MYCN и пролиферации опухолевых клеток с экспрессией MYCN), по сравнению с ПНК-олигонуклеотидами, лишенными групп G (SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 23).

В частности, результаты, показанные в таблице 1 и в таблице 5, демонстрируют, что последовательности SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 13 имеют большую антигенную эффективность, чем последовательность SEQ ID NO: 1, предмет патента ЕР 1618195.

Последовательности SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 12 (содержащие две группы из двух или трех следующих друг за другом G) демонстрируют большую антигенную эффективность, чем последовательность SEQ ID NO: 1, и SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 15 (содержащие только одну группу из двух или трех следующих друг за другом G).

Последовательности SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 6 (содержащие три группы из двух или трех следующих друг за другом G) демонстрируют большую антигенную эффективность, чем SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 12 (содержащие две группы из двух или трех следующих друг за другом G).

SEQ ID NO: 3, содержащая группу из шести следующих друг за другом G, демонстрирует большую антигенную эффективность, чем последовательности SEQ ID NO: 1 и последовательности SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 12, содержащие одну или две, или три группы G (у которых каждая группа состоит не более чем из двух или трех следующих друг за другом G).

Последовательность SEQ ID NO: 2, содержащая три группы из следующих друг за другом G, которая помимо двух групп из двух и трех следующих друг за другом G, также содержит группу из шести следующих друг за другом G, демонстрирует большую антигенную эффективность, чем как SEQ ID NO: 3, содержащая только одну группу из шести G, так и последовательности SEQ ID NO: 1 и последовательности SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 12, содержащие одну или две, или три группы G (у которых каждая группа состоит не более чем из двух или трех следующих друг за другом G).

Более того, олигонуклеотиды, имеющие SEQ ID NO: 1-23, вводили в линии клеток фибробластоидного типа (NIH-3T3 и Phoenix), и результаты показаны в таблице 1 (последние два столбца).

Результаты явно демонстрируют то, что анализируемые олигонуклеотиды не являются специфично эффективными по отношению к данным клеткам и не являются токсичными для них (то есть клетки, которые не экспрессируют целевой ген, который в данном случае представляет собой MYCN).

Фактически, не наблюдали изменений в пролиферации клеток в данных двух линиях неопухолевых фибробластах, и данный результат означает, что ПНК-олигонуклеотиды оказывают специфичный эффект ингибирования экспрессии MYCN, тогда как они не оказывают неспецифичного, токсичного эффекта в клетках, которые не экспрессируют MYCN.

Поэтому, можно сделать вывод, что ПНК-олигонуклеотиды, сконструированные на основе параметров, описанных в настоящем изобретении, действуют специфично и эффективно на целевой ген и, вследствие этого, на клетки, которые экспрессируют/сверхэкспрессируют данный ген.

ПНК, имеющие SEQ ID NO: 1-12, также тестировали на разных клеточных линиях, которые сверхэкспрессируют MYCN (Kelly, SKNBE2c, RH30, WiT49, WERI-Rb 1 и H69). Результаты показаны в таблице 6 и подтверждают селективность и специфичность ингибирующего эффекта ПНК на продукт трансляции белка гена MYCN.

Антигенный ПНК-олигонуклеотид, имеющий SEQ ID NO: 5, анализировали более подробно.

В частности, модифицированные олигонуклеотиды, у которых группы из следующих друг за другом гуанинов, находящиеся в последовательности, были модифицированы (группы следующих друг за другом гуанинов подчеркнуты, тогда как модифицированные нуклеотиды выделены жирным шрифтом) так, чтобы прервать непрерывность гуанинов, синтезировали и анализировали in vitro на клетках Kelly (которые сверхэкспрессируют MYCN).

Результаты (суммированные в таблице 7) явно демонстрируют, что факт того, что гуанины следуют за другом, имеет исключительно большое значение для реализации активности модулирования экспрессии гена. Фактически, ПНК, имеющие SEQ ID NO: 43, у которых все группы из следующих друг за другом гуанинов ПНК, имеющих SEQ ID NO: 5, были мутированы, вызывают потерю ингибирующей активности ПНК, тогда как мутация одной или двух из трех групп следующих друг за другом гуанинов значительно снижает, но не полностью подавляет ингибирующую активность молекулы.

Химерные олигонуклеотиды, содержащие мономеры ДНК и мономеры ЗНК, и имеющие ген MYCN в качестве своей мишени, тестировали in vitro на клетках альвеолярной рабдомиосаркомы (RH30). Результаты приведены в таблице 8 и демонстрируют, что данные олигонуклеотиды имеют интенсивную, специфичную антигенную активность.

Антисмысловые олигонуклеотиды, сконструированные и синтезированные заявителем согласно параметрам, описанным в настоящей заявке, анализировали in vitro на клетках рабдомиосаркомы (RH3). Результаты приведены в таблице 9 и показывают, что олигонуклеотиды способны ингибировать транскрипт MYCN специфичным и эффективным образом; более того, они также способны селективно ингибировать пролиферацию опухолевых клеток более эффективным образом, чем стандартные антисмысловые олигонуклеотиды, в настоящее время имеющиеся в наличии для гена MYCN (Chung DH, BiochBioph Res Commun, 2006, 351(1): 192-7). В частности, миРНК, идентифицированные заявителем и направленные против мРНК MYCN, описанные в таблице 11, проявляют антисмысловую активность с ингибированием мРНК MYCN, находящимся в интервале от минимум 70% до максимум 85%.

С целью проверки того, способны ли олигонуклеотиды по настоящему изобретению снижать концентрации химиотерапевтических агентов, в настоящее время применяемых в терапевтических протоколах против рака, те же олигонуклеотиды вводили вместе с химиотерапевтическими лекарственными средствами.

Проводили исследования на предмет воздействия ассоциаций между ПНК и химиотерапевтическими лекарственными средствам (карбоплатин, этопозид (VP16), цисплатин и винкристин) на разные линии опухолевых клеток нейробластомы человека и мыши (SMS-KAN, LAN 1, IMR-32, SMS-KCN, Kelly, NH02A, SKNBE2c).

Терапевтическая схема, используемая при проводимых обработках, предусматривала клетки, подлежащие обработке ПНК, и затем, в заранее установленное время (это могло быть 6 или 12 часов), вводили химиотерапевтический агент.

Результаты демонстрируют, что ассоциация данных соединений с олигонуклеотидами по изобретению определяет, в конкретных диапазонах концентрации, больший терапевтический эффект, чем отдельные обработки теми же компонентами.

В частности, можно наблюдать, что обработка, будь она единовременной и одновременной или в разные интервалы времени (3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа и т.д.), комбинацией, состоящей из олигонуклеотидов по изобретению и других соединений с фармакологическим эффектом, служит для усиления желательного терапевтического эффекта.

Поэтому, комбинирование одного или более чем одного олигонуклеотида, идентифицированного заявителем, с химиотерапевтическими лекарственными средствами делает возможным снижать концентрацию химиотерапевтического лекарственного средства вплоть до 10 раз, по сравнению с настоящей стандартной терапевтической концентрацией, в то же время все еще с получением такого же эффекта.

В частности, результаты данного исследования демонстрируют, что SEQ ID NO: 1 имеет синергический эффект в отношении ингибирования пролиферации клеток, когда его вводят в комбинации с винкристином или этопозидом, или карбоплатином, или цисплатином, по сравнению с эффектами, полученными при обработках олигонуклеотидами или вышеупомянутыми химиотерапевтическими агентами отдельно.

Пример 2

С целью подтверждения настоящего изобретения также синтезировали олигонуклеотиды, приведенные в таблице 10. В частности, в таблице 10 показаны последовательности олигонуклеотидов, SEQ ID NO, значение содержания (G+C) в процентах и ген, против которого направлены синтезированные олигонуклеотиды. Синтез олигонуклеотидов осуществляли, как в примере 1.

В частности синтезировали следующее: SEQ ID NO: 66-69, направленные против MYCN, SEQ ID NO: 70-74, направленные против MYC, SEQ ID NO: 75, 76, направленные против BIRC5, SEQ ID NO: 77-79, направленные против ALK, SEQ ID NO: 80-82, направленные против BCL2, и SEQ ID NO: 83, 84, направленные против PLK4.

Олигонуклеотиды тестировали in vitro (в концентрации 2,5 мкМ) для определения их способности ингибировать транскрипцию гена, против которого они направлены, путем измерения уровней мРНК гена в клеточных моделях, в которых сверхэкспрессируется ген интереса. Используемые способы представляют собой способы, описанные в примере 1.

В частности, SEQ ID NO: 66-69 (направленные против MYCN) тестировали in vitro в клеточных линиях Kelly и Н69; SEQ ID NO: 70-74 (направленные против MYC) тестировали in vitro в клеточных линиях Н82 и RD, SEQ ID NO: 75, 76 (направленные против BIRC5) тестировали in vitro в клеточной линии Kelly, SEQ ID NO: 77-79 (направленные против ALK) тестировали in vitro в клеточной линии Kelly, SEQ ID NO: 80-82 (направленные против BCL2) тестировали in vitro в клеточной линии Kelly, и SEQ ID NO: 83, 84 (направленные против PLK4) тестировали in vitro в клеточной линии Kelly.

Способность тестируемых олигонуклеотидов ингибировать мРНК гена интереса измеряли, и также оценивали пролиферативную способность клеток после введения олигонуклеотидов. Результаты представлены в таблице 11.

Данные демонстрируют сильную ингибирующую активность по отношению к мРНК гена-мишени и ингибирование пролиферации клеток, которое увеличивается с возрастанием числа групп G, присутствующих в последовательности олигонуклеотида.

Наконец, олигонуклеотиды, имеющие SEQ ID NO 66-84, вводили в клеточные линии фибробластоидного типа (Phoenix и NIH-3T3). В данных клетках тестируемые олигонуклеотиды не демонстрировали токсичность.

Данные результаты указывают на то, что ПНК-олигонуклеотиды действуют через специфичный ингибирующий эффект на экспрессию гена интереса, при этом они не оказывают какого-либо неспецифичного, токсичного действия в клетках, которые не экспрессируют ген.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что ПНК-олигонуклеотиды, сконструированные на основе параметров, описанных в настоящем изобретении, действуют специфично и эффективно на целевой ген и, вследствие этого, на клетки, которые экспрессируют/сверхэкспрессируют данный ген.

1. Одноцепочечный олигонуклеотид антигена, комплементарный к антисмысловой нити ДНК целевого гена, содержащий 12-24 нуклеотида, причем указанный олигонуклеотид характеризуется последовательностью, содержащей по меньшей мере три группы по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов.

2. Олигонуклеотид по п. 1, где группы по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов непрерывно следуют друг за другом или разделены по меньшей мере одним нуклеотидом, причем указанный нуклеотид не является гуанином.

3. Олигонуклеотид по п. 1, где число групп по меньшей мере из двух следующих друг за другом гуанинов равно по меньшей мере четырем, пяти или шести.

4. Олигонуклеотид по п. 1, где указанный олигонуклеотид сопряжен с последовательностью носителя на 3' - и/или 5'-конце указанного олигонуклеотида.

5. Олигонуклеотид по п. 1, где указанный олигонуклеотид представляет собой по меньшей мере одну молекулу встречающейся в природе нуклеиновой кислоты или синтетической нуклеиновой кислоты, или комбинацию указанной встречающейся в природе нуклеиновой кислоты и указанной синтетической нуклеиновой кислоты.

6. Олигонуклеотид по п. 5, где 1) указанная по меньшей мере одна молекула ДНК содержит по меньшей мере одну ЗНК (запертая нуклеиновая кислота), метилфосфонат ЗНК, МНК (мостиковая нуклеиновая кислота), РНГ (рибонуклеиновый гуанидин), ДНГ (дезоксирибонуклеиновый гуанидин), ГНК (глицериннуклеиновая кислота), ННК (незапертая нуклеиновая кислота), ЭНК (нуклеиновая кислота с этиленовой мостиковой связью), АНК (арабинонуклеиновая кислота), Ф-АНК (фтор-арабинонуклеиновая кислота), ПНК, Г-ПНК (гамма-ПНК) или морфолинонуклеотид; или содержит 2'-O-метил, 2'-O-метоксиэтил или 2'-фтор-РНК-нуклеотид, или 2) указанная по меньшей мере одна молекула РНК содержит по меньшей мере один нуклеотид РНК, выбранный из: 2'-О-метилнуклеотида, 2'-O-метоксиэтилнуклеотида, 2'-фторнуклеотида; или по меньшей мере один нуклеотид нуклеиновой кислоты, выбранной из: ЗНК, метилфосфоната ЗНК, МНК, РНГ, ДНГ, ГНК, ННК, ЭНК, АНК, Ф-АНК, ПНК, Г-ПНК или морфолино.

7. Олигонуклеотид по п. 6, где указанная по меньшей мере одна молекула ДНК или указанная по меньшей мере одна молекула РНК содержит по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный на уровне фосфодиэфирной связи в виде фосфоротиоатной связи.

8. Олигонуклеотид по п. 5, где указанная ПНК имеет модифицированную основную цепь, при этом альфа-углерод имеет боковую цепь из аргинина или лизина в качестве заместителя.

9. Олигонуклеотид по п. 1, где указанный олигонуклеотид направлен против по меньшей мере одного гена, ответственного за заболевание генетического или вирусного происхождения или против по меньшей мере одного опухолевого гена.

10. Олигонуклеотид по п. 1, где указанный ген выбран из группы, состоящей из: по меньшей мере одного гена, принадлежащего семейству MYC, предпочтительно MYC, MYCN или MYCL1, BIRC5, BCL2, PLK4, ALK, РКМ2, CASP8 и RASSF1.

11. Олигонуклеотид по п. 1, где указанный олигонуклеотид выбран из: SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 46 и SEQ ID NO: 68-84.

12. Олигонуклеотид по п. 11, где SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 68 и 69 направлены против гена MYCN, SEQ ID NO: 70-74 направлены против гена MYC, SEQ ID NO: 75, 76 направлены против гена BIRC5, SEQ ID NO: 77-79 направлены против гена ALK, SEQ ID NO: 80-82 направлены против гена BCL2, SEQ ID NO: 83, 84 направлены против гена PLK4.

13. Композиция, содержащая по меньшей мере один олигонуклеотид по п. 1 и по меньшей мере один фармакологически приемлемый эксципиент.

14. Композиция по п. 13, дополнительно содержащая соединение с фармакологическим действием, выбранное из группы, состоящей из: NGF (фактор роста нервов), соматостатина, ретиноевой кислоты, актиномицина D, аспарагиназы, блеомицина, бусульфана капецитабина, карбоплатина, циклофосфамида, циклоспорина, цисплатина, цитарабина, клорамбуцила, дакарбазина, даунорубицина, доцетаксела, доксорубицина гидрохлорида, эпирубицина гидрохлорида, этопозида, флударабина фосфата, фторурацила, гемцитабина, идарубицина гидрохлорида, гидроксимочевины, ифофосфамида, иринотекана гидрохлорида, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, митомицина, митоксантрона, оксалиплатина, паклитаксела, прокарбазина, ралтитрекседа, стрептозоцина, тегафурурацила, темозоломида, тиогуанина, тиотепе, топотекана, винбластина, винкристина сульфата, виндезина и винорелбина.

15. Олигонуклеотид по п. 1 или композиция по п. 13 для применения в качестве лекарственного средства.

16. Олигонуклеотид или композиция для применения по п. 15 для лечения опухоли, причем указанная опухоль представляет собой опухоль взрослых или детей, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из: нейробластомы, ретинобластомы, медуллобластомы, эпендимомы, феохромоцитомы, эмбриональной карциномы, герминогенной опухоли, альвеолярной рабдомиосаркомы, эмбриональной рабдомиосаркомы, опухоли Вильмса, светлоклеточной саркомы почки, синовиальной саркомы, гепатобластомы, острого лимфоидного лейкоза, хронического лимфоидного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, лимфомы Беркитта, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, острого мегакариобластного лейкоза, В-хронического лимфоидного лейкоза, Т-клеточного лейкоза, лимфомы, мелкоклеточного рака легкого (микроцитома), легочной аденокарциномы, плоскоклеточной карциномы легкого, типичного и атипичного первичного рака легкого, крупноклеточной карциномы легкого, крупноклеточной нейроэндокринной карциномы легкого, глиобластомы, гепатокарциномы, базальноклеточной карциномы, опухоли яичника, опухоли молочной железы и рака толстой кишки.