Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение



Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
Новые белки, специфично связывающиеся с двумя мишенями -dll4 и vegf-, и их применение
C07K1/00 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2648154:

АБЛБИО (KR)

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело, экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид, трансформированную клетку СНО для экспрессии вышеуказанного антитела, способ получения вышеуказанного антитела, фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую терапевтическое эффективное количество антитела, композицию для диагностики рака, способ диагностирования рака и способ лечения рака, включающий этап введения вышеуказанного антитела. В одном из представлений антитело специфически связывается с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и со 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленного в SEQ ID NO: 21, и антитело специфически связывается с VEGF. Изобретение расширяет арсенал антител, связывающихся с VEGF и DLL4. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 10 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к новому белку, направленному на две мишени, который включает белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4), и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF).

Уровень техники

Как сообщалось, путь передачи сигналов Notch у позвоночных и беспозвоночных животных является эволюционно высоко консервативным, играя ключевую роль в определении судьбы клеток на начальной стадии развития. Известно, что путь передачи сигналов Notch служит основным путем регуляции дифференцировки нервных клеток, внутриглазных клеток, лимфоцитов, мышечных клеток, форменных элементов крови и некоторых других клеток, а также участвует в развитии кровеносных сосудов. У млекопитающих имеются четыре рецептора семейства Notch (Notch 1, 2, 3 и 4); каждый из них синтезируется как полипептид с молекулярной массой 300-350 кДа, который расщепляется в сайте S1 фуриноподобной конвертазой в аппарате Гольджи и образует гетеродимер на клеточной поверхности. Кроме того, у млекопитающих обнаружены четыре лиганда Notch: Jagged-1/2 и дельта-подобные лиганды (DLL) 1/3/4.

Установлено, что активированный сигнальный путь Notch вызывает образование и рост опухолей в различных моделях онкогенеза. Когда в гемопоэтических клетках крыс экспрессируется активированный внутриклеточный домен Notch (NICD), развивается Т-клеточный лейкоз/лимфома; активированный рецептор Notch 1 обнаружен в почти 50% случаев острого Т-клеточного лимфобластного лейкоза (T-ALL). Кроме того, обнаружено, что при раке молочной железы у крыс (Czech II), которым ввели вирус, вызывающий раковые опухоли молочных желез у мышей (MMTV), имеет место усиленная экспрессия рецептора Notch 4, и у этих крыс повышена частота опухолей молочных желез. Сообщалось также, что рецепторы Notch, их лиганды и мишени сигнального пути Notch активированы при различных раковых заболеваниях, например, при раке шейки матки, легких, поджелудочной железы, яичников, молочных желез и предстательной железы. Известно, что рецептор Notch 1 ассоциирован с плохим прогнозом у пациенток с раком молочной железы и с метастазированием рака предстательной железы.

Дельта-подобный лиганд 4 (DLL4) - это один из лигандов класса «дельта», связывающихся с белками Notch, уровень экспрессии которых повышен в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Известно, что он является одним из основных факторов регуляции ангиогенеза. В частности, DLL4 связывается с рецептором Notch 1 или Notch 4, уровень экспрессии которого повышен в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Известно, что высокий уровень экспрессии DLL4 имеет место в опухолевых кровеносных сосудах, хотя в нормальных кровеносных сосудах этот белок тоже экспрессируется. Ангиогенезом называют механизм формирования новых кровеносных сосудов из уже существующих кровеносных сосудов. В частности, в опухолях ангиогенез вызывается ангиогенными факторами, например, фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF), для того, чтобы обеспечить поступление кислорода и питательных веществ к области раковой ткани, где имеет место гипоксия. Как известно, ангиогенез в опухолях играет важную роль не только в опухолевом росте, но и в метастазировании. Когда сигнальный путь Notch с участием DLL4 в опухолях блокирован, регуляция ангиогенеза затруднена, и таким образом можно подавить опухолевый рост. Кроме того, когда сигнальный путь Notch с участием DLL4 подавлен, возможно лечение аутоиммунных заболеваний путем увеличения числа регуляторных Т-клеток (Treg) (см. патент США №2011-0189200). По этим причинам DLL4 стал новой мишенью при лечении раковых и аутоиммунных заболеваний.

Тем временем в 2004 г. было получено одобрение Управления по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) на применение противоракового антительного препарата авастин [Avastin® (Genentech/Roche)] для подавления ангиогенеза, мишенью которых является VEGF; этот препарат с успехом широко применялся в качестве противоракового терапевтического агента. Однако проведенные недавно клинические и доклинические исследования с использованием животных моделей показали, что не все солидные опухоли чувствительны к ингибиторам VEGF; также сообщалось о ряде случаев, когда некоторые опухоли после обработки ингибиторами VEGF на начальной стадии спустя какое-то время проявляли устойчивость к такой обработке. Также сообщалось о результатах исследований, свидетельствовавших о том, что введение ингибиторов VEGF приводит к превращению раковых клеток в более агрессивные и легче дающие метастазы. Под влиянием таких сообщений были предприняты исследования и разработки новых мишеней противораковой терапии, которые позволили бы обойти устойчивость к авастину или которые бы позволяли превысить эффективность этого препарата. В числе таких новых мишеней привлекают внимание белки, участвующие в сигнальном пути DLL4/Notch. Судя по полученным на сегодняшний день данным, ожидается, что, поскольку механизмы влияния сигнальных путей VEGF/VEGFR и DLL4/Notch на ангиогенез различны, то можно достичь более сильного синергического противоракового эффекта путем полного подавления этих двух путей передачи сигналов.

Раскрытие изобретения

Технические трудности

Авторы данного изобретения предприняли значительные усилия для разработки белка, направленного на две мишени, который способен специфично связываться с DLL4 и с VEGF человеческого происхождения с тем, чтобы эффективно подавлять сигнальные пути DLL4/Notch и VEGF/VEGFR, сводя к минимуму риск иммуногенности. В результате этой работы авторы данного изобретения создали новое моноклональное антитело человеческого происхождения, специфично связывающееся с человеческим VEGF и являющееся белком, направленным на две мишени, в котором новый одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv), специфично связывающийся с человеческим DLL4, соединен с С-концевой областью белка, сходного с авастином типа IgG; авторы изобретения также обнаружили, что такой белок, направленный на две мишени, эффективно подавляет взаимодействие не только между VEGF и рецептором VEGF, но также между DLL4 и белком Notch, и таким образом обладает превосходным противораковым действием, тем самым довершая данное изобретение.

Решение технических проблем

Цель данного изобретения - предложить белок, направленный на две мишени, который включает: белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, который содержит аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21; и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF).

Другая цель данного изобретения - предложить полинуклеотид, кодирующий описанный выше белок, направленный на две мишени, экспрессионный вектор, содержащий этот полинуклеотид, и трансформант, несущий указанный экспрессионный вектор.

Еще одна цель данного изобретения - предложить способ для получения указанного белка, направленного на две мишени.

Еще одна цель данного изобретения - предложить композицию, содержащую описанный выше, направленный на две мишени.

Еще одна цель данного изобретения - предложить фармацевтическую композицию для лечения рака, которая содержит описанный выше белок, направленный на две мишени.

Еще одна цель данного изобретения - предложить композицию для диагностирования рака, которая содержит описанный выше белок, направленный на две мишени.

Еще одна цель данного изобретения - предложить способ диагностирования рака с использованием описанного выше белка, направленного на две мишени.

Еще одна цель данного изобретения - предложить конформационный эпитоп дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), включающий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21.

Еще одна цель данного изобретения - предложить моноклональные антитела, специфично связывающиеся с DLL4, которые распознают описанный выше конформационный эпитоп.

Еще одна цель данного изобретения - предложить полинуклеотид, кодирующий указанное моноклональное антитело, экспрессионный, вектор, содержащий этот полинуклеотид, и трансформант, несущий указанный экспрессионный вектор.

Еще одна цель данного изобретения - предложить способ лечения рака, включающий этап введения описанного выше белка, направленного на две мишени, индивиду, у которого подозревается рак.

Полезный эффект изобретения

Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению способен лечить рак, связываясь как с VEGF, так и с DLL4, и обладает превосходным сродством связывания и противораковым действием, поскольку включает новый белок, специфично связывающийся с DLL4. Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению можно широко использовать в области лечения и диагностирования рака.

Краткое описание иллюстраций

Фиг. 1А и 1В изображают структуру белка, направленного на две мишени, который способен связываться как с DLL4, так и с VEGF.

Фиг. 2А изображает картину итогового гель-электрофореза, полученную в результате экспрессии белка, направленного на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, в клетках СНО, очистки экспрессированного белка и анализа очищенного белка путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).

Фиг. 2В изображает картину итоговой хроматографии, полученную в результате экспрессии белка, направленного на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, в клетках СНО, очистки экспрессированного белка и анализа очищенного белка путем эксклюзионной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC).

Фиг. 3 изображает результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), проведенного с целью изучить способность белка, направленного на две мишени, связываться с DLL4 и с VEGF.

Фиг. 4А изображает результаты анализа, проведенного с помощью оптической биосенсорной системы BIACORE, для определения равновесной константы диссоциации (KD) белка, направленного на две мишени, для DLL4, являющегося антигеном-мишенью этого белка.

Фиг. 4В изображает результаты анализа, проведенного с помощью оптической биосенсорной системы BIACORE, для определения равновесной константы диссоциации (KD) белка, направленного на две мишени, для VEGF, являющегося антигеном-мишенью этого белка.

Фиг. 5 изображает результаты определения способности белка, направленного на две мишени, нейтрализовать DLL4 и VEGF, проведенного методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Фиг. 6 демонстрирует образование комплекса человеческого DLL4 с антителом MLCK2 в присутствие и в отсутствие поперечной сшивки.

Фиг. 7 изображает модель, в которой фрагмент аминокислотной последовательности DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, состоящий из аминокислотных остатков 58-65 [FRVCLKHF]), и фрагмент, представленный SEQ ID NO: 22, образуют непрерывную молекулярную поверхность в домене С2 человеческого DLL4 С2 (аминокислотные остатки 27-174).

Фиг. 8 демонстрирует результаты изучения методом вестерн-блоттинга сродства связывания мутантных белков, содержащих делегируемый фрагмент внеклеточного домена DLL4, в сравнении с белком дикого типа.

Фиг. 9А демонстрирует, что в результате обработки клеток антителами, направленными против VEGF, (авастином) пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов подавлялась зависимым от концентрации антител образом безотносительно присутствия или отсутствия DLL4.

Фиг. 9В демонстрирует, что в результате обработки клеток антителами, направленными только против DLL4, пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов имела место только в группе с DLL4 зависимым от концентрации антител, направленных против DLL4, образом.

Фиг. 9С демонстрирует, что в результате обработки клеток белком, направленным на две мишени, в группе без DLL4 наблюдалось подавление клеточной пролиферации, сходное с тем, что имело место при обработке авастином (черные столбики), а в группе с DLL4 наблюдалось ослабление эффекта подавления клеточной пролиферации по сравнению с авастином (белые столбики).

Фиг. 10 изображает результаты анализа методом вестерн-блоттинга, свидетельствующие, что белок, направленный на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, обладает активностью, состоящей в подавлении путей передачи сигналов DLL4/Notch и VEGF/VEGFR в клетках эндотелия кровеносных сосудов вены пупочного канатика человека (HUVEC).

Фиг. 11 демонстрирует, что у голых мышей с ксенографтами человеческих клеток SCH рака желудка, устойчивых к авастину, белок, направленный на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, обладает более сильным противораковым действием, чем авастин.

Фиг. 12 демонстрирует, что у голых мышей с ксенографтами человеческих клеток А549 рака легких, устойчивых к авастину, белок, направленный на две мишени, который связывается с DLL4 и с VEGF, обладает более сильным противораковым действием, чем авастин.

Наилучшее техническое выполнение изобретения

В одном из аспектов данного изобретения предлагается белок, направленный на две мишени, который включает: белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21; и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF).

В настоящем документе термин «белок, направленный на две мишени» относится к белку, который способен связываться с двумя различными антигенами (белками-мишенями). В частности, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению не существует в природе, а предпочтительно создается методами генетической инженерии или какими-либо иными методами.

Для целей данного изобретения белок, направленный на две мишени, способен связываться, с одной стороны, с VEGF, уровень экспрессии которого повышен в раковых клетках, а с другой стороны, - с DLL4, который экспрессируется в клетках эндотелия кровеносных сосудов. Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть в форме антитела. В настоящем документе термин «белок, направленный на две мишени» употребляется взаимозаменяемо с термином «антитело, направленное на две мишени», «биспецифичное антитело» или «биспецифичный антительный белок». Предпочтительно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть направлен на VEGF и на DLL4 как на антигены. Формы белка, направленного на две мишени, по данному изобретению включают белковую форму, в которой антитело типа IgG, специфично связывающееся с VEGF, и белок, специфично связывающийся с DLL4, соединены друг с другом посредством линкерной структуры (но не ограничиваются указанным здесь). Структура белка, направленного на две мишени, по данному изобретению схематически изображена на фиг. 1А.

Говоря конкретно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 1, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 20 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).

В настоящем документе термин «антитело» относится к белковым молекулам, которые представляют собой иммуноглобулины, иммунологически взаимодействующие с определенными антигенами, и которые служат рецепторами, специфично распознающими антигены. Этот термин включает все поликлональные антитела, моноклональные антитела, полноразмерные молекулы антител и фрагменты антительных молекул. Кроме того, термин «антитело» включает формы, получаемые путем генетической инженерии, например, химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела) и гетерогенные антитела (например, биспецифичные антитела). В полноразмерной молекуле антитела имеется две полноразмерных легких цепи и две полноразмерных тяжелых цепи, причем каждая легкая цепь соединена с одной из тяжелых цепей дисульфидной связью. Полноразмерная молекула антитела может быть иммуноглобулином (Ig) типа A, D, Е, М или G (подтипы IgG включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Кроме того, термин «антитело» может включать бивалентные молекулы, диантитела, триантитела и тетраантитела. В частности, антитела, специфично связывающиеся с VEGF, могут быть иммуноглобулинами типа G.

По данному изобретению белок, направленный на две мишени, может быть представлен формой, в которой молекула иммуноглобулина типа G (IgG), специфично связывающаяся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF), и полноразмерная молекула антитела или фрагмент Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG или белковая молекула типа scFv, специфично связывающаяся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4), соединены друг с другом линкерной структурой.

Как правило, в молекулах иммуноглобулинов и одноцепочечных антител (scFv) имеются легкие и тяжелые цепи, а каждая легкая или тяжелая цепь содержит константную и вариабельную области (области антительных молекул называют также доменами). Вариабельные области легких и тяжелых цепей содержат четыре каркасных участка (FR) и три гипервариабельные области, определяющих комплементарность (участки CDR). Участки CDR в основном отвечают за связывание с эпитопом антигена. В каждой цепи CDR обычно обозначают CDR1, CDR2, и CDR3 (нумерация последовательная, начиная от N-конца полипептидной цепи; каждый CDR обычно идентифицируется по той цепи, в которой он находится.

Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, который содержит белок, связывающийся специфично с DLL4, и антитело, специфично связывающееся с VEGF, проявляет высокое сродство к DLL4 и VEGF человеческого происхождения, эффективно подавляет связывание клеток, в которых экспрессируется DLL4 (например, раковых клеток или клеток эндотелия кровеносных сосудов), с рецепторами Notch 1 или Notch 4, а также подавляет процесс ангиогенеза, включающий активацию клеток эндотелия кровеносных сосудов, в которых экспрессируется рецептор VEGF, под действием VEGF, уровень экспрессии которого повышен в раковых клетках. Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может обладать мощным терапевтическим эффектом при лечении таких заболеваний, как рак.

Антитело, специфично связывающееся с VEGF, и белок, специфично связывающийся с DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению могут сохранять свою специфичность связывания и, в частности, могут ингибировать одновременно две мишени (антигена). Таким образом, указанные антитело и белок в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению могут быть эффективнее, чем белок или антитело, связывающиеся с единичной мишенью (и ингибирующие ее), и тем самым подавлять одновременно два сигнала.

В настоящем документе термин «фрагменты антител» относится к фрагментам, обладающим способностью связываться с антигеном, и включает формы антител, связывающие антиген, например, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG и scFv. В частности, термин «фрагменты антител» включает одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), бивалентные антительные молекулы или диантитела, триантитела и тетраантитела.

В настоящем документе термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент» (scFv) относится к минимальному фрагменту молекулы антитела, содержащему полностью сайт распознавания и связывания антигена и включающему домены VH и VL молекулы антитела, которые могут быть представлены единой полипептидной цепью.

В настоящем документе выражение «белок, направленный на две мишени, который включает: белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21; и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF)», может включать любой белок, направленный на две мишени, который способен одновременно подавлять два пути передачи сигналов, в которых участвуют DLL4 и VEGF. Антитело, специфично связывающее VEGF, и белок, специфично связывающий DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению могут быть в виде полноразмерных молекул антител или антительных фрагментов, описанных выше.

В настоящем документе выражение «белок, специфично связывающийся с дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и распознающий конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21» относится к белку, специфично связывающемуся с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21. Подразумевается, что этот белок может обладать противораковым терапевтическим действием, подавляя опухолевый рост. Этот белок способен связываться с указанным эпитопом с высоким сродством и может действовать таким образом, что активность DLL4 нейтрализуется. Этот белок может блокировать связывание DLL4 с рецептором Notch и подавлять сигнальный путь, опосредуемый DLL4. Белок, специфично связывающийся с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21 и 22, может быть представлен, в частности, полноразмерными антителами или антительными фрагментами Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG или scFv.

Белок, специфично связывающийся с конформационным эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, а именно белок, специфично связывающийся с DLL4, может включать: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7.

Конкретнее, тяжелая цепь, о которой идет речь, может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 8, а легкая цепь, о которой идет речь, может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 9. Однако обсуждаемым белком может быть также любой белок, содержащий указанные выше последовательности CDR и способный специфично связываться с DLL4, оказывая противораковое терапевтическое действие. Указанные тяжелая и легкая цепи могут быть соединены друг с другом линкерной структурой.

Кроме того, белок, специфично связывающийся с DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению может специфично связываться не только с человеческим DLL4, но также и с мышиным DLL4, и может подавлять взаимодействие между DLL4 и белком Notch.

В одном из примеров данного изобретения идентифицирован эпитоп антитела, специфично связывающегося с DLL4, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению, обладающий высокой биологической активностью, состоящей в ингибировании DLL4 и VEGF. А именно, по данному изобретению обнаружено, что указанное антитело связывается с непрерывным участком поверхности молекулы DLL4, состоящей из аминокислотных остатков с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности DLL4. Таким образом, аминокислотные остатки с 58-го по 65-й (SEQ ID NO: 22) и/или с 110-го по 115-й (SEQ ID NO: 23) аминокислотной последовательности DLL4 могут составлять эпитоп для антитела, специфично связывающегося с DLL4, по данному изобретению. Конкретнее, участок поверхности молекулы DLL4, состоящий из SEQ ID NO: 22 и 23, может быть конформационным эпитопом.

В настоящем документе термин «дельта-подобный лиганд 4 (DLL4)» относится к одному из лигандов класса «дельта», связывающихся с рецепторами Notch, и предпочтительно относится к белку, связывающемуся с Notch 1 или Notch 2 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). DLL4 может быть белком любого млекопитающего, но предпочтительно это человеческий или мышиный DLL4. Известно, что уровень экспрессии DLL4 повышен в различных опухолевых клетках, в том числе в клетках сосудистой сети опухолей, и что этот белок способствует опухолевому росту, вызывая увеличение числа аномальных сосудов, что было продемонстрировано на моделях с опухолевыми ксенографтами.

Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, который включает белок, специфично связывающийся с конформационным эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, можно эффективно использовать для лечения рака путем подавления функции DLL4. Информацию по DLL4 можно получить из известных баз данных, включая GenBank Национальных институтов здоровья США, например, по регистрационному номеру DLL4 GenBank NM_019074.3 (Gene ID: 54567 и NCBI Reference Sequence: NM_019074.3). DLL4 может содержать аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.

В настоящем документе термин «рецептор Notch» относится к белку, передающему сигнал по пути Notch; этот термин употребляется взаимозаменяемо с просто Notch. Рецептор Notch - это любой белок, передающий сигнал по пути Notch. Предпочтительно рецептор Notch - это рецептор Notch 1 или Notch 4 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).

В настоящем документе выражение «ингибирование взаимодействия между человеческим дельта-подобным лигандом 4 (DLL4) и рецептором Notch» означает, что белок, специфично связывающийся с DLL4, по данному изобретению, связываясь с DLL4, ингибирует взаимодействие между DLL4 и рецептором Notch. Предпочтительно это выражение означает, что направленный на две мишени белок, специфичный к конформационному эпитопу дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащему аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, связываясь с DLL4, ингибирует взаимодействие между DLL4 и рецептором Notch 1 или Notch 4 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Когда белок, направленный на две мишени, по данному изобретению специфично связывается с конформационным эпитопом дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленной SEQ ID NO: 21, он предотвращает структурное изменение рецепторов Notch, происходящее в результате связывания с ними DLL4. Таким образом предотвращается гидролиз белков Notch и тем самым подавляется передача сигналов по пути Notch. Известно, что при связывании DLL4 с рецептором Notch в опухолях увеличиваются размеры кровеносных сосудов и активируется передача сигналов между клетками эндотелия сосудов или передача сигналов по пути Notch между раковыми клетками и клетками эндотелия сосудов, что имеет значение в пролиферации опухолевых клеток и метастазировании рака.

Итак, когда в опухоли передача сигналов по пути Notch с участием DLL4 подавлена, затрудняется регуляция ангиогенеза и таким образом рост опухоли тормозится. Кроме того, при блокировании DLL4 утрата подавления клеточного роста в боковом направлении в концевом участке роста сосуда приводит к избыточным ответвлениям, в результате снижается продуктивность ангиогенных процессов и может ослабнуть снабжение кислородом, что вызовет гипоксию вокруг опухоли, а это даст противоопухолевый эффект даже в случае опухолей, проявляющих устойчивость к терапии, направленной против VEGF.

Соответственно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, содержащий белок, специфично связывающийся с DLL4, и эффективно подавляющий взаимодействие между DLL4 и Notch, может быть с успехом применен для лечения рака.

В настоящем документе выражение «антитело, специфично связывающееся с VEGF/антитело, специфичное в отношение VEGF» включает все антитела, которые специфично связываются с VEGF как с антигеном в опухолевых клетках. Конкретно говоря, этим антителом может быть используемое в терапевтических целях моноклональное антитело против VEGF, называемое бевацизумабом (авастином, Avastin®) (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Такие антитела, специфично связывающиеся с VEGF, включают полноразмерные молекулы антител или описанные выше антительные фрагменты; это могут быть иммуноглобулины типа G (IgG) (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). VEGF является лигандом, играющим важную роль в ангиогенезе; когда VEGF блокирован, ангиогенез не происходит, и таким образом возможно лечение рака. Препарат бевацизумаб (Avastin®, Genentech), получивший одобрение Управления по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA), является терапевтически применяемым антительным лекарственным средством со стабильным эффектом.

Антитела, специфично связывающиеся с VEGF, включают, в частности: вариабельную область тяжелых цепей, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 10, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 11, участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легких цепей, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 13, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 14, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 15. Конкретнее, антитела, специфично связывающиеся с VEGF, могут содержать аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 16, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 17. Однако антитело, специфично связывающееся с VEGF, может также быть любым антителом, содержащим описанные выше последовательности CDR и способным специфично связываться с VEGF, вызывая противораковый терапевтический эффект.

Антитело, специфично связывающееся с VEGF, в составе белка, направленного на две мишени, по данному изобретению способно специфично связываться с VEGF, усиленно экспрессирующимся в опухолевых клетках, и таким образом обеспечивать концентрацию белка, направленного на две мишени, по данному изобретению на опухолевых клетках, в которых экспрессируется VEGF. Также противораковая активность этого антитела обусловлена связыванием с VEGF.

В настоящем документе термин «фактор роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF)» относится к одному из факторов роста, усиливающему пролиферативную активность эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, который секретируется клетками различных типов, включая макрофаги, клетки гладких мышц и опухолевые клетки. VEGF играет важную роль в ангиогенезе у плода, а также действует как индуктор ангиогенеза для снабжения кислородом опухолевой ткани, характеризующейся быстрым ростом и интенсивным метаболизмом. Пути передачи сигналов с участием белка VEGF и его рецепторов изучались как мишени противораковых агентов у взрослых индивидов.

Кроме того, наличие сайта связывания VEGF в белке, направленном на две мишени, по данному изобретению означает подавление взаимодействия между человеческим VEGF и рецептором VEGF. Говоря конкретно, это означает, что направленный на две мишени белок, специфичный в отношении VEGF, связываясь с VEGF, подавляет взаимодействие между VEGF и VEGFR-2 (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).

Для целей данного изобретения рецептор VEGF может быть любым белком, связывающимся с VEGF млекопитающих. В частности, это может быть белок, связывающийся с человеческим VEGF.

Когда взаимодействие между VEGF и рецептором VEGF подавлено направленным на две мишени белком, специфичным в отношении VEGF, по данному изобретению, подавляется путь передачи сигналов с участием VEGF/VEGF, для которого нужно связывание VEGF с рецептором VEGF. Как известно, когда в опухоли VEGF и рецептор VEGF связываются друг с другом, путь передачи сигналов с участием VEGF и рецептора VEGF в стромальных/эндотелиальных клетках опухолевой ткани активируется таким образом, что ангиогенез значительно подавляется - в отличие от механизма сигнального пути с участием DLL4 и Notch; в результате число кровеносных сосудов уменьшается и функция сосудистого русла в опухоли слабеет, что угнетает пролиферацию опухолевых клеток и метастазирование рака.

Таким образом, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, специфичный в отношении DLL4 и VEGF, способен подавлять ангиогенез в опухолевой ткани путем различных механизмов, так что его можно использовать в качестве терапевтического агента с повышенной противораковой активностью.

В частности, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть представлен белком, в котором белок, специфично связывающийся с DLL4, и иммуноглобулин типа G (IgG), специфично связывающийся с VEGF, соединены друг с другом с помощью линкерной структуры.

В настоящем документе термин «линкер/линкерная структура» относится к любой структуре, которая может соединить две различные молекулы (например, биологических полимера) в одно целое с использованием водородной связи, электростатических сил, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, дисульфидной связи, солевого мостика, гидрофобных взаимодействий, ковалентной связи и проч. В частности, в линкерной структуре может иметься по меньшей мере один остаток цистеина, способный участвовать в образовании по меньшей мере одной дисульфидной связи в физиологических условиях или в иных условиях, обычно используемых применительно к пептидам (например, в условиях для очистки или хранения пептидов). Помимо того, что линкер осуществляет связь между объединяемыми молекулами, он может служить «спейсером», то есть пространственно разделять их, создавая промежуток между объединяемыми молекулами, или же действовать как шарнир для обеспечения гибкости либо жесткости продукта объединения (конъюгата). Линкерная структура может представлять собой пептидил или же не пептидную структуру. В объем роли линкерной структуры входит и прямое соединение конъюгируемых объектов пептидной или дисульфидной связью.

По данному изобретению линкер является предпочтительно полипептидом, соединяющим белок, специфично связывающий DLL4, с антителом, специфично связывающим VEGF (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Более предпочтительно, чтобы линкерная структура представляла собой пептидил, связующий С-конец области Fc антитела, специфично связывающегося с VEGF, с белком, специфично связывающимся с DLL4. Более предпочтительно, чтобы линкерная структура представляла собой пептидил, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую из трех повторов мотива GGGGS. Мотив GGGGS может повторяться 1-10 раз. Наиболее предпочтительно, чтобы линкерная структура содержала аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, или аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, нуклеотидная последовательность которого представлена SEQ ID NO: 19.

Линкерный пептид (SEQ ID NO: 18):

Линкерный полинуклеотид (SEQ ID NO: 19):

В настоящем документе термин «не пептидный линкер» относится к биологически совместимым линкерным структурам, состоящим из по меньшей мере двух одинаковых элементов, которые могут быть соединены друг с другом любой ковалентной связью, не являющейся пептидной связью.

Примеры не пептидных линкерных структур, используемых по данному изобретению, включают гомополимеры полиэтиленгликоля (PEG), гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированные многоатомные спирты, поливиниловые спирты, полисахариды, декстран, поливинилэтиловый эфир, полимеры, способные к биологической деградации, полимеризованные липиды, хитин, гиалуроновую кислоту и их комбинации. Не пептидный линкер по данному изобретению предпочтительно является гомополимером полиэтиленгликоля. В объем данного изобретения входят также производные, которые известны в данной области техники или которые могут быть получены на современном техническом уровне в данной области техники. Не пептидный линкер по данному изобретению более предпочтительно является гомополимером полиэтиленгликоля с молекулярной массой от 1 до 5 кДа. Наиболее предпочтительно, чтобы не пептидный линкер по данному изобретению имел молекулярную массу 3,4 кДа, содержал на обоих своих концах альдегидные группы и был способен соединить антитело, специфично связывающееся с VEGF, и белок, специфично связывающийся с DLL4. В частности, благодаря альдегидным функциональным группам на обоих концах линкерной структуры эффективно сводятся к минимуму неспецифичные взаимодействия.

Области соединяемых (непосредственно или через линкерную структуру) белков включают фрагменты Fc, Fab', F(ab')2, Fab, Fv и т.п. (но не ограничиваются перечисленным здесь). Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной молекулой антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью; или в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной молекулой антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью через линкерную структуру - пептидил; или в форме, являющейся сочетанием указанных (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).

Кроме того, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной тяжелой цепью антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью через пептидиловый линкер; или в такой форме, в которой цельная молекула белка, специфично связывающегося с DLL4, или ее часть соединена с цельной легкой цепью антитела, специфично связывающегося с VEGF, или ее частью через пептидиловый линкер; или в форме, являющейся сочетанием указанных.

В одном из примеров по данному изобретению белок, направленный на две мишени, представленный конъюгатом авастин-DLL4 BsAb, который специфично связывается с DLL4 и с VEGF, был создан путем соединения С-конца области тяжелой цепи авастина типа IgG с белком, связывающим DLL4, типа scFv посредством линкерной структуры; для этого был получен полинуклеотид, кодирующий такой направленный на две мишени белок, полученный полинуклеотид встроили в экспрессионный вектор, который ввели в животные клетки, и из этих клеток выделили направленный на две мишени белок, включающий авастин и связывающийся с DLL4. Полученный белок, направленный на две мишени, имел структуру, в которой молекула антитела (авастина типа IgG) соединена с scFv, связывающим DLL4, посредством линкера (см. фиг. 1). Экспрессировавшийся в животных клетках белок, направленный на две мишени, на основе авастина, связывающий DLL4, был выделен, и определили его чистоту (см. фиг. 2А и 2В). Кроме того, было установлено, что этот белок, направленный на две мишени, на основе авастина, связывающий DLL4, специфично связывается со своими мишенями - VEGF и DLL4 (см. фиг. 3). Также показано, что сродство связывания этого белка, направленного на две мишени, к каждому из указанных антигенов сходно с таковым контрольных антител. А именно, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению характеризовался KD=30 нМ в отношении человеческого DLL4 и KD=0,126 нМ в отношении человеческого VEGF (см. таблицы 2 и 3). Более того, было продемонстрировано, что обработка этим белком эффективно подавляет пути передачи сигналов, в которых нужны связывание DLL4 эндотелиальных клеток кровеносных сосудов с человеческим рецептором Notch 1 и связывание VEGF с рецептором VEGF (см. фиг. 10). Такие результаты позволяют полагать, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, специфичный в отношении DLL4 и VEGF, способен эффективно блокировать связывание DLL4 с рецептором Notch и связывание VEGF с рецептором VEGF, тем самым обеспечивая противораковый эффект. Обнаружено, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению оказывает противораковое действие в моделях с ксенографтами человеческих раковых клеток линий SCH (рак желудка) и А549 (рак легких) (см. фиг. 11 и 12).

В другом аспекте данного изобретения предлагаются полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, экспрессионный вектор, содержащий этот полинуклеотид, и трансформант, в который ввели указанный экспрессионный вектор.

Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, может быть (не ограничиваясь сказанным здесь) вектором, способным обеспечить репликацию и/или экспрессию указанного полинуклеотида в эукариотических или прокариотических клетках, включая клетки млекопитающих (например, человеческие, обезьяньи, кроличьи, крысиные, хомячьи или мышиные), растений, дрожжей, насекомых и бактерий (например, Esherichia coli). Предпочтительно это вектор, который содержит по меньшей мере один селективный маркер и функционально сопряжен с соответствующим промотором, так что указанный полинуклеотид может экспрессироваться в клетках-хозяевах. Более предпочтительно, чтобы указанный вектор содержал полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, в составе фага, плазмиды, космиды, минихромосомы, вирусного или ретровирусного вектора.

В экспрессионном векторе, содержащем полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, полинуклеотиды, кодирующие легкую или тяжелую цепь указанного белка, могут содержаться каждый в отдельности в своем векторе или же экспрессионный вектор содержит все полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи белка, направленного на две мишени, по данному изобретению.

Клетки, в которые вводится экспрессионный вектор по данному изобретению для образования трансформантов, включают клетки бактерий, например, E. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибов, например, дрожжей и Pichia pastoris; насекомых, например, Drosophila или Spodoptera (клетки Sf9); млекопитающих, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), миеломные клетки мыши SP2/0, лимфобластоидные клетки человека, клетки COS, миеломные клетки мыши NSO, клетки 293Т, клетки меланомы Боуэса, клетки НТ-1080, почечные клетки золотистого хомячка (BHK), человеческие эмбриональные клетки почки (HEK), человеческие клетки сетчатки (PERC.6) и др., а также растительные клетки. В одном из примеров данного изобретения в качестве клеток-хозяев использовались клетки CHO-S.

В настоящем документе термин «введение» применительно к экспрессионному вектору относится к мероприятиям, обеспечивающим попадание экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, в клетку-хозяина. Это введение может осуществляться различными методами, известными в данной области техники, включая трансфекцию с осаждением ДНК фосфатом кальция, с использованием диэтиламиноэтил-декстрана (DEAE-декстрана) или гексадиметрина бромида (полибрена) или липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосом, липофекцию и слияние протопластов. Также трансфекция означает обеспечение попадания желаемого материала внутрь клетки путем заражения вирусными частицами. Кроме того, вектор по данному изобретению может быть введен в клетку-хозяина путем бомбардировки микрочастицами. В контексте данного изобретения термины «введение» применительно к экспрессионному вектору и «трансфекция» употребляются взаимозаменяемо.

В другом аспекте данного изобретения предлагается способ получения белка, направленного на две мишени. Предпочтительно, способ получения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению состоит в получении белка, направленного на две мишени, который содержит белок, специфично связывающийся с DLL4, и антитело, специфично связывающееся с фактором роста эндотелия кровеносных сосудов (VEGF), и включает следующие этапы: (а) культивирование трансформанта для получения белка, направленного на две мишени, и (b) выделение белка, полученного на этапе (а).

Более предпочтительно, когда способ получения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению включает следующие этапы: (а) получение полинуклеотида, кодирующего антитело, специфично связывающееся с VEGF, и полинуклеотида, кодирующего белок, специфично связывающийся с DLL4, включая вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7; (b) соединение посредством линкерной структуры 3'-конца той части полученного на этапе (а) полинуклеотида, кодирующего антитело, специфично связывающееся с VEGF, которая кодирует область Fc, с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего белок, специфично связывающийся с DLL4, в результате чего получается полинуклеотид, кодирующий белок, направленный на две мишени, по данному изобретению; (с) клонирование полученного на этапе (b) полинуклеотида, кодирующего белок, направленный на две мишени, в результате чего получается экспрессионный вектор; (d) введение экспрессионного вектора, полученного на этапе (с), в клетки-хозяева, в результате чего получаются клетки-трансформанты, и культивирование этих клеток-трансформантов; и (е) выделение белка, направленного на две мишени, из клеток-трансформантов, полученных на этапе (d).

Кроме того, способ получения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению может включать следующие этапы: (а) получение полинуклеотида, кодирующего антитело, специфично связывающееся с VEGF, и полинуклеотида, кодирующего белок, специфично связывающийся с DLL4, включая вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7; (b) клонирование полинуклеотида полученного на этапе (а), в результате чего получается экспрессионный вектор; (с) введение экспрессионного вектора, полученного на этапе (b), в клетки-хозяева, в результате чего получаются клетки-трансформанты, и культивирование этих клеток-трансформантов; и (d) выделение антител, специфично связывающихся с VEGF, и белка, специфично связывающегося с DLL4, из клеток-трансформантов, полученных на этапе (с), и соединение посредством линкерной структуры С-конца области Fc антитела, специфично связывающего VEGF, с N-концом белка, специфично связывающего DLL4.

Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть получен рекомбинационным или биохимическим путем методами, известными в данной области техники, и указанные антитела могут быть введены в подходящие клетки-хозяева, и выделены из культуральной среды клеток-трансформантов.

В частности, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может быть выделен любым известным методом, применяемым для выделения белков. Например, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению удобно выделять из культуральной среды, применяя обычные методы очистки белков, например, хроматографию с использованием сефарозы А или гидроксиапатита, гель-электрофорез, диализ или аффинную хроматографию (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера).

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается композиция, содержащая белок, направленный на две мишени, по данному изобретению.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая белок, направленный на две мишени, по данному изобретению.

Белок, направленный на две мишени, по данному изобретению способен связываться как с DLL4, так и с VEGF, в результате чего подавляется связывание DLL4 и VEGF с рецептором типа Notch и рецептором VEGF соответственно, и таким образом подавляется опухолевый рост. Рецепторы для DLL4 (Notch) и для VEGF (VEGFR) описаны выше. Когда композиция по данному изобретению, содержащая белок, направленный на две мишени, который специфично связывается с DLL4 и с VEGF, вводят в организм in vivo, она может подавить развитие, пролиферацию и метастазирование раковых клеток или предотвратить прогрессирование ракового заболевания и таким образом лечить рак.

В настоящем документе термин «рак» включает все раковые заболевания без ограничения, примерами которых могут быть раковые поражения пищевода, желудка, толстого кишечника, прямой кишки, полости рта, гортани, глотки, легких, толстой кишки, молочной железы, шейки матки, эндометрия, яичника, предстательной железы, яичка, мочевого пузыря, почки, печени, поджелудочной железы, костей, соединительной ткани, кожи, головного мозга, щитовидной железы, а также лейкозы, болезнь Ходжкина, лимфому и множественную миелому.

В настоящем документе термин «лечение» относится ко всем мероприятиям, которые купируют или положительным образом изменяют симптомы ракового заболевания путем введения индивиду композиции по данному изобретению.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать также фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителям или разбавителям, которые не нарушают биологическую активность и свойства вводимого в организм вещества и не вызывают раздражения. В качестве фармацевтически приемлемого носителя для композиции по данному изобретению, которая имеет форму жидкого раствора, используются стерильные биологически совместимые носители. Это может быть физиологический солевой раствор, стерильная вода, раствор Рингера, забуференный солевой раствор, раствор альбумина для инъекций, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этиловый спирт или смесь двух или более из указанных здесь субстанций. Кроме того, композиция по данному изобретению при необходимости может содержать другие обычно используемые в фармацевтических композициях дополнительные ингредиенты, в том числе антиоксиданты, забуферивающие вещества и бактериостатические агенты. Композиция по данному изобретению может быть составлена в форме для инъекций, а именно в виде водного раствора, суспензии или эмульсии, с помощью разбавителей, диспергирующих агентов, поверхностно-активных веществ, связующих агентов и веществ, улучшающих скольжение. Кроме того, композиция по данному изобретению может быть представлена такими лекарственными формами, как пилюли, капсулы, гранулы или таблетки.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут быть составлены различным образом, например, в форме препаратов для перорального или парентерального применения. При этом используются обычно применяемые в таких составах разбавители или эксципиенты, например, наполнители, разжижители, связующие вещества, увлажняющие агенты, дезинтегрирующие агенты, поверхностно-активные вещества и др. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по данному изобретению, составляется с использованием обычно применяемых в таких случаях разбавителей или эксципиентов, например, наполнителей, разжижителей, связующих веществ, увлажняющих агентов, дезинтегрирующих агентов и поверхностно-активных веществ. Твердые препараты для перорального применения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и др. Такие препараты изготавливаются путем смешивания соединения по данному изобретению с по меньшей мере одним эксципиентом, например, с крахмалом, карбонатом кальция, сахарозой, лактозой, желатином и др.

Помимо простых средств, могут добавляться агенты, улучшающие скольжение, например, стеарат магния, тальк и др. Жидкие препараты для перорального применения, например, суспензии, растворы для приема внутрь, эмульсии, сиропы и др., могут включать простые разбавители, например, воду или жидкий парафин, а также различные иные эксципиенты, например, увлажняющие агенты, подсластители, ароматизаторы, консерванты и др. Препараты для парентерального введения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизованные агенты, суппозитории и др. Неводные растворы и суспензии могут быть изготовлены с использованием пропиленгликоля, полэтиленгликоля, растительных масел (например, оливкового), эфиров, пригодных для введения путем инъекций (например, этилолеата). В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин (Tween-61), масло какао и его заменители (лауриновые жиры), глицериножелатин и др.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть представлена любым препаратом, выбираемым из группы, состоящей из таблеток, пилюлей, порошков, гранул, капсул, суспензий, растворов для приема внутрь, эмульсий, сиропов, стерилизованных водных растворов, неводных растворов, лиофилизованных агентов и суппозиториев.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению вводится в организм в фармацевтически эффективном количестве. В настоящем документе термин «фармацевтически эффективное количество» относится к такому количеству, которое достаточно для лечения данного заболевания с разумным соотношением риска и пользы, применимым к любому лечебному мероприятию. Эффективная дозировка композиции по данному изобретению определяется в зависимости от типа индивида, его возраста и пола, типа и степени тяжести заболевания, активности лекарственного препарата, чувствительность к нему индивида, времени и пути введения препарата, скорости его выведения из организма, продолжительности лечения, других лекарственных препаратов, принимаемых данным индивидом параллельно с композицией по данному изобретению, и других факторов, известных в области медицины. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может вводиться индивиду в отдельности или же в сочетании с другими терапевтическими агентами, последовательно или одновременно с обычно принимаемыми данным индивидом терапевтическими агентами. Композиция по данному изобретению может вводиться как единичная дозированная лекарственная форма или же как дозированная лекарственная форма, образованная множественными структурно обособленными единицами. Важно вводить композицию по данному изобретению в количестве, минимальном для достижения максимального эффекта без побочных явлений, с учетом всех описанных выше факторов; это количество может легко определить специалист в данной области техники.

В одном из примеров данного изобретения было обнаружено, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению может связываться как с VEGF, так и с DLL4 (см. фиг. 3, 4А и 4В), способен нейтрализовать DLL4 (фиг. 5), и обладает противораковым действием в моделях с ксенографтами человеческих раковых клеток линий SCH (рак желудка) и А549 (рак легких) (см. фиг. 11 и 12), устойчивых к авастину; все это свидетельствует, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению можно использовать в качестве активного ингредиента в композициях для лечения рака.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ лечения рака с использованием фармацевтической композиции, содержащей белок, направленный на две мишени, по данному изобретению. Этот способ включает введение индивиду фармацевтически эффективного количества указанной фармацевтической композиции. При этом белок, направленный на две мишени, по данному изобретению и фармацевтически эффективное количество такие, как описано выше.

Указанный способ лечения рака включает введение фармацевтической композиции, содержащей белок, направленный на две мишени, по данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем индивиду, у которого диагностирован или подозревается раковое заболевание. Здесь имеются в виду фармацевтически приемлемый носитель и раковое заболевание, описанные выше. Примеры индивидов, подлежащих такому лечению, включают млекопитающих, в том числе крупный рогатый скот, свиней, овец, кур, собак и людей. Пациент по данному изобретению может быть любым индивидом, у которого раковое заболевание нужно лечить путем введения в организм композиции по данному изобретению.

При этом композицию по данному изобретению можно вводить в виде жидкости, порошка, аэрозоля, капсул, таблеток с кишечнорастворимой оболочкой или суппозиториев. Композицию по данному изобретению можно вводить индивиду внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, чрескожно, перорально, местно, интраназально, внутрилегочно или интраректально (не ограничиваясь перечисленным здесь). Однако, поскольку при пероральном введении пептиды расщепляются в пищеварительном тракте, в композиции по данному изобретению, предназначенной для введения через рот, активный ингредиент должен быть защищен оболочкой или иным образом от переваривания в желудке. Кроме того, фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить индивиду при помощи любого устройства или приспособления, обеспечивающего поступление активного ингредиента к клеткам-мишеням.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается композиция для диагностирования рака, содержащая белок, направленный на две мишени, по данному изобретению. При этом белок, направленный на две мишени, по данному изобретению и раковое заболевание такие, как описано выше.

В настоящем документе термин «диагностирование» означает определение наличия или признака патологического состояния. Для целей данного изобретения термин «диагностирование» означает определение начала ракового заболевания.

Композиция для диагностирования рака по данному изобретению может использоваться следующим образом. С помощью белка, направленного на две мишени, по данному изобретению измеряют уровень белка VEGF или DLL4 в образце, взятом у индивида, у которого подозревают раковое заболевание; и если измеренный уровень VEGF или DLL4 выше, чем в контрольном образце, взятом из нормальной ткани, то считается, что данный индивид болен раком.

Применяемые для этой цели аналитические методы измерения количества белка включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг), метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунологический метод (RIA), метод радиоиммунодиффузии, в том числе двойной радиоиммунодиффузии по Оухтерлони, ракетный иммуноэлектрофорез, иммуногистохимическое окрашивание, иммунопреципитацию, метод фиксации комплемента, метод проточной цитофлуорометрии (FACS) и метод иммунопреципитации хроматина (ChiP). Применяя эти аналитические методы, сравнивают уровень белка VEGF или DLL4 в контрольном образце из нормальной ткани и в образце, взятом у индивида с подозрением на рак, и таким образом можно реально диагностировать начало ракового заболевания у данного индивида.

Композиция для диагностирования рака по данному изобретению может также содержать в дополнение к белку, направленному на две мишени, известные в данной области компоненты, требующиеся для того, чтобы применять методы определения содержания белка.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ для диагностирования рака, включающий следующие этапы: (а) определение уровня белка VEGF или DLL4 в образце, взятом у индивида с подозрением на раковое заболевание, с помощью белка, направленного на две мишени, по данному изобретению; и (b) установление того факта, что у данного индивида имеется раковое заболевания, если уровень белка VEGF или DLL4, определенный на этапе (а), выше, чем в контрольном образце из нормальной ткани. При этом белок, направленный на две мишени, раковое заболевание, индивид, диагностирование и способ (этап) определения уровня белка такие, как описано выше.

В настоящем документе подразумевается, что термин «образец» включает цельную кровь, сыворотку крови, кровь, плазму крови, слюну, мочу, мокроту, лимфу, спинномозговую жидкость и тканевую жидкость, в которых у больных раком уровень экспрессии VEGF или DLL4 отличается от нормального (сказанное здесь не имеет ограничительного характера).

В другом аспекте данного изобретения предлагается конформационный эпитоп DLL4, содержащий аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и с 110-го по 115-й аминокислотной последовательности дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), представленного SEQ ID NO: 21.

В одном из примеров данного изобретения аминокислотные остатки в последовательности SEQ ID NO: 21 DLL4, участвующие в поперечной сшивке, идентифицированы путем реакции образования поперечной сшивки и масс-спектрометрии. Обнаружено, что, как показано на фиг. 7, два фрагмента, а именно аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 58-го по 65-й [FRVCLKHF], и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 110-го по 115-й (SEQ ID NO: 23), образуют непрерывную молекулярную поверхность, тем самым формируя эпитоп DLL4.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются моноклональные антитела, специфично связывающиеся с DLL4, которые распознают указанный конформационный эпитоп.

В частности, такое моноклональное антитело может содержать: вариабельную область тяжелой цепи, включающую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 тяжелой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, включающую участок CDR1 легкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO: 7. Более конкретно, тяжелая цепь указанного антитела может содержать аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 8, и вариабельная область легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 9.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий указанное моноклональное антитело, экспрессионный вектор, включающий этот полинуклеотид, и трансформант, в который введен указанный экспрессионный вектор. Здесь DLL4, моноклональные антитела, экспрессионный вектор, трансформант и проч. по данному изобретению такие, как описано выше.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается способ для лечения рака, включающий этап введения белка, направленного на две мишени, по данному изобретению индивиду, у которого подозревается раковое заболевание.

Индивид, о котором идет речь, - это нуждающийся в предотвращении или лечении ракового заболевания индивид, который выбирается (не ограничиваясь перечисленным здесь) из млекопитающих, включая человека, крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней, коз, верблюдов, антилоп, собак и кошек, нуждающихся в лечении рака и сходных проявлений.

В настоящем документе термин «введение» означает введение в организм индивида фармацевтической композиции по данному изобретению любым подходящим способом. Фармацевтическую композицию по данному изобретению можно вводить в организм индивида различными путями - как перорально, так и парентерально, если только это позволяет указанной композиции достигнуть нужной ткани.

Способ лечения рака по данному изобретению включает введение индивиду белка, направленного на две мишени, по данному изобретению или содержащей его композиции в терапевтически эффективном количестве. Для специалиста в данной области техники ясно, что подходящую суточную дозу композиции по данному изобретению может определить лечащий врач/ветеринар, исходя из результатов тщательной медицинской оценки. Кроме того, введение композиции по данному изобретению может осуществляться однократно или же многократно в пределах предпочтительного диапазона ее эффективного количества. Однако в виду задач данного изобретения конкретное терапевтически эффективное количество для данного индивида зависит от различных факторов, включая тип и выраженность желаемой реакции организма, конкретный состав композиции (используются ли в ней или вместе с ней другие агенты), возраста, пола, массы тела, общего состояния здоровья и питания индивида, времени и пути введения, скорости выведения композиции из организма, продолжительности лечения, а также от того, применяются ли в сочетании с композицией по данному изобретению или параллельно с ней другие лекарственные средства, и от других факторов, известных в области медицины.

Примеры

Далее данное изобретение описывается подробнее на примерах. Рядовому специалисту в данной области техники должно быть понятно, что эти примеры служат только для иллюстрации, и их не следует считать ограничивающими объем данного изобретения. Таким образом, основной объем данного изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и эквивалентными утверждениями.

Пример 1. Получение белка, направленного на две мишени - DLL4 и VEGF

Пример 1-1. Получение антигена DLL4

В качестве антигена внеклеточного домена человеческого DLL4 использовали белок DLL4 человека (производство R&D System, номер по каталогу 1506-D4/CF). Антигенный белок DLL4 содержит аминокислотные остатки с 27-го по 524-й аминокислотной последовательности DLL4 (регистрационный номер Q9NR61). На С-конце этого белка имеется метка из 10 остатков гистидина (10-His).

Был получен антиген, соответствующий определенной области внеклеточного домена DLL4. Эта область содержит аминокислотные остатки с 27-го по 251-й. Она включает мотив, называемый DSL (delta/Serrate)/lag-2), о котором известно, что он связывается с рецептором Notch 1. Применяя стандартные процедуры технологии рекомбинантных ДНК, получали плазмидный экспрессионный вектор для клеток млекопитающих, включающий промотор CMV, расположенный в направлении 5'-конца полинуклеотида, кодирующего делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, слитый с белком Fc. Аналогичным путем получали дополнительную конструкцию, кодирующую делегируемый фрагмент DLL4, которая представляла собой гибрид - человеческий DLL4, слитый с белком Fc. Полученные конструкции ввели (временная трансфекция) в клетки HEK 293Е для экспрессии рекомбинантных слитых белков, содержащих последовательность из аминокислотных остатков с 27-го по 251-й аминокислотной последовательности человеческого DLL4, слитую с белком Fc. Для того, чтобы выделить антигенный белок, каждые 72 часа собирали кондиционированную среду; это повторяли 4 раза. Антигенный белок очищали из кондиционированной среды путем аффинной хроматографии с протеином А.

Пример 1-2. Получение фаговой библиотеки

Клетки библиотеки человеческих одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), культивировали в количестве 2,7×1010 клеток в среде (3 л), содержащей 17 г смеси 2Х YT СМ [триптон (CONDA, 1612.00), дрожжевой экстракт (CONDA, 1702.00) 10 г; NaCl (Sigma, S7653-5 кг) 5 г; хлорамфеникол (Sigma, С0857) 34 мг/мл], 2% глюкозы (Sigma, G5400) и 5 мМ MgCl2 (Sigma, М2393) при температуре 37°C в течение 2-3 часов до оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,5-0,7. После этого клетки заражали фагом-помощником и культивировали в среде 2Х YT СМК [2Х YT СМ; канамицин (Sigma, K1876) 70 мкг/мл; изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG; ELPISBIO, IPTG025) 1 мМ] при температуре 30°C в течение 16 часов. Культивированные клетки центрифугировали при 4500 об/мин в течение 15 минут при температуре 4°C. К супернатанту прибавляли раствор полиэтиленгликоля (PEG-6000; Fluka, 81253; 4%) и NaCl (Sigma, S7653; 3%), после чего инкубировали на льду в течение 1 часа. Затем этот раствор центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 минут при температуре 4°C; полученный осадок разводили в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (PBS), и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°C. Полученный супернатант, содержащий фаговую библиотеку, помещали в чистую пробирку и хранили при температуре 4°C.

Пример 1-3. Пэннинг с фаговым дисплеем

Для скрининга антител, направленных против DLL4, которые связываются с человеческим DLL4, проводили три цикла пэннинга с антигеном человеческого DLL4.

В иммунологическую пробирку помещали раствор (10 мкг/мл) рекомбинантного человеческого DLL4 (R&D System), и адсорбция белка на поверхности пробирки происходила в течение ночи при температуре 4°C; затем в пробирку прибавляли раствор бычьего сывороточного альбумина (1%) для защиты поверхности, на которой не адсорбировался DLL4. Пробирку опорожняли и добавляли в нее фаговую библиотеку антител (1012 КОЕ) в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, чтобы связать антиген. Неспецифично связавшиеся фаги отмывали физиологическим раствором, забуференным фосфатом, содержавшим 0,05% Tween-20 (PBS-T). Оставшихся фагов с специфичными к антигену антителами элюировали раствором триэтиламина (100 мМ).

Элюированные фаги нейтрализовали буферным раствором (Tris 1М, рН 7,4) и заражали ими клетки Е. coli ER2537 при температуре 37°C в течение 1 часа. Инфицированные бактериальные клетки высевали на агар Лурия-Бертани (LB), содержащий карбенициллин, и культивировали в течение ночи при температуре 37°C. Нас следующий день культивированные клетки Е. coli суспендировали в 4 мл среды «Супербульон» (SB), содержащей карбенициллин, и прибавляли туда 15%-ный глицерин. Часть этой суспензии держали при температуре -80°C, а 50 мкл культивировали в среде SB с карбенициллином, содержащей 2% глюкозы, при температуре 37°C.

Когда оптическая плотность культуральной среды при 600 нм (OD600), достигала 0,6, среду отделяли путем центрифугирования, а оставшийся материал снова суспендировали в среде SB с карбенициллином, и прибавляли к нему фаг-помощник VCSM13 (1012 КОЕ), после чего инкубировали при температуре 37°C с медленным перемешиванием. На следующий день культуральную среду собирали путем центрифугирования и осаждали с полиэтиленгликолем (PEG8000, 4%) и хлоридом натрия (NaCl, 3%) при температуре 4°C в течение 30 минут, после чего центрифугировали. Супернатант отделяли, а осажденные фаги суспендировали в 1 мл PBS. Описанную выше процедуру пэннинга повторяли, используя суспендированные фаги как библиотеку, таким образом амплифицируя и концентрируя клоны, специфичные к антигену.

Для скрининга антител, связывающихся с сайтом связывания Notch 1 человеческого белка DLL4, были проведены циклы перекрестного пэннинга с человеческим белком DLL4 и делегируемым фрагментом (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й), соответствующим определенной области человеческого DLL4. Затем клетки, содержащие ген антитела, высевали и культивировали на среде LB с карбенициллином для получения единичных колоний, которые инокулировали и инкубировали в 400 мкл среды SB с карбенициллином, после чего вызывали экспрессию белка типа scFv в периплазме Е. coli, добавляя IPTG. Клетки Е. coli суспендировали в растворе TES, содержавшем 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол (Tris), этилендиаминтетраацетат (EDTA) и сахарозу, и оставляли при температуре 4°C на 1 час. Затем суспензию центрифугировали, чтобы экстрагировать периплазму, в которой определяли связывание антигена рекомбинантного человеческого DLL4 и scFv методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Связанный scFv выявляли, используя антитела против гемагглютинина (НА), конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) и тетраметилбензидин (ТМВ) в качестве субстрата. Выявленные клоны специфичных к антигену антител секвенировали. Результаты секвенирования обнаруженных scFv представлены в таблице 1, приведенной ниже.

Антитела против DLL4, в которых имелась приведенная выше последовательность, получили название "MLCK-2".

Пример 1-4. Получение антител, направленных на две мишени - _DLL4 и VEGF (биспецифичных антител)

Антитела типа scFv, связывающие человеческий DLL4, полученные в примере 1-3, соединяли с антителами типа IgG, а именно с авастином, с помощью линкерной структуры; таким образом получался белок, направленный на две мишени, т.е. способный связываться также с человеческим VEGF (см. фиг. 1В).

В полученном белке, направленном на две мишени, имелась аминокислотная последовательность тяжелой цепи (тяжелая цепь VEGF-DLL4 BsAb), представленная SEQ ID NO: 1, и аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная SEQ ID NO: 20. Указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую участок CDR1 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 2, участок CDR2 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 3, и участок CDR3 тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, включающую участок CDR1 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 5, участок CDR2 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 6, и участок CDR3 легкой цепи, представленный SEQ ID NO: 7.

Для получения продукции желаемых антител в клетках СНО с помощью экспрессионного вектора, кодирующего белок, направленный на две мишени, по данному изобретению проводили трансфекцию соответствующего гена в животные клетки с использованием полимера для увеличения эффективности проникновения гена внутрь клеток. Трансфицированные клетки культивировали в 500-миллилитровых колбах Эрленмейера (Corning Costar) по 200 мл в колбе (общий объем 1 л). Смесь (1 л) среды RPMI (Invitrogen Corp.), содержащей фетальную телячью сыворотку с очень низкой концентрацией IgG (Invitrogen Corp.), и культуральной среды клеток СНО инкубировали в инкубаторе (Sanyo) в течение 4 суток; в результате образовывался рекомбинантный белок. Среду, в которой культивировались клетки, собирали и центрифугировали, чтобы отделить супернатант, содержавший рекомбинантный белок, от суспендированных клеток; супернатант фильтровали один раз с помощью вакуумного фильтра (0,22 мкм; Millipore).

Для очистки биспецифичные антитела авастин-DLL4 BsAb вначале выделяли из культуральной среды, используя колонку с сефарозой и рекомбинантным протеином А (Hitrap MabSelect Sure, 5 мл, GE healthcare). А именно, профильтрованную культуральную среду загружали на колонку с сефарозой и рекомбинантным протеином А. Колонку промывали 20-кратным объемом буферного раствора (50 мМ Tris-Cl, рН 7,5;100 мМ NaCl) и затем 10-кратным объемом буферного раствора цитрата натрия (50 мМ; рН 5,0) для удаления загрязнений. Антитела элюировали буферным раствором (5 мМ цитрата натрия, 10 мМ NaCl; рН 3,4) и нейтрализовали буферным раствором (1 М Tris-HCl (рН 8,0).

На второй стадии очистки удаляли агрегаты направленных на две мишени антител авастин-DLL4 BsAb путем гель-фильтрации, используя колонку HiLoad ТМ 26/60 Superdex 200 Prep grade GL (GE Healthcare). Колонку уравновешивали двукратным объемом буферного раствора (фосфат натрия 50 мМ; рН 6,0), содержавшего L-Arg (20 мМ), и пропускали через нее направленные на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb, которые в результате разделялись по молекулярному размеру.

Фракции, полученные в результате очистке на указанной колонке, анализировали путем гель-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) (см. фиг. 2); нужные фракции концентрировали, используя центрифужное фильтрующее устройство Amicon Ultra (30,000 MWCO, Millipore). На том же устройстве проводили буферный обмен (фосфатный буферный раствор) и дальнейшее концентрирование. Наконец, антитела фильтровали в стерильных условиях, используя шприцевый фильтр с порами размером 0,22 мкм, и измеряли поглощение при 280 нм (А280), чтобы определить концентрацию антител.

Пример 2. Определение сродства связывания белка, направленного на две мишени, с DLL4 и с VEGF методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)

Сродство связывания белка, направленного на две мишени, с DLL4 и с VEGF определяли путем гомогенного конкурентного ELISA. А именно, на 96-луночный планшет (Nunc-Immuno Plate, NUNC, Рочестер, шт. Нью-Йорк, США) наносили hVEGF (R&D Systems, номер по каталогу 293-VE) в концентрации 50 нг/мл и rhDLL4 (R&D Systems, номер по каталогу 1506-D4/CF) в концентрации 200 нг/мл в объеме 100 мкл на лунку и оставляли на ночь при температуре 4°C. Сайты неспецифичного связывания блокировали бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 2 часов. Антитела на 96-луночном микропланшете разводили 1:5 начиная с 128 нм и 64 нм и по 100 мкл каждого разведения помещали в лунки планшета, покрытого белками hDLL4 и hVEGF. Планшет инкубировали в течение 2 часов и затем промывали пять раз PBS, содержавшим Tween-20 (0,05%). Для выявления связавшихся на планшете антител использовали антитела против Fab, конъюгированные с пероксидазой хрена (Pierce, номер по каталогу 31414), которые разводили 1:40000, наносили на промытый 96-луночный микропланшет и давали реакции протекать в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем проводили окрашивание, используя в качестве субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Sigma-Aldrich). Ферментативную реакцию останавливали раствором серной кислоты (0,5 мол/л) и измеряли поглощение при 450 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра (ридера) SpectraMax 190 (Molecular Devices, Inc).

Как видно на фиг. 3, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению действительно специфично связывается со своими мишенями - VEGF и DLL4.

Пример 3. Определение равновесной константы диссоциации (KD) для связывания белка, направленного на две мишени (DLL4/VEGF), с DLL4 и с VEGF

Белок, направленный на две мишени (биспецифичное антитело), который был очищен, как описано в примере 1, получил название «авacтин-DLL4 BsAb». Сродство этого очищенного антитела к соответствующим антигенам определяли следующим образом. Разницу в сродстве связывания направленного на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb с DLL4 и с VEGF определяли с помощью оптической биосенсорной системы BIACORE.

А именно, применяли метод плазмонного поверхностного резонанса, используя прибор Biacore Т200 с рабочим буферным раствором HBS-EP (10 мМ HEPES, рН 7,4; 150 мМ NaCl; 3 мМ EDTA; 0,15% поверхностно-активный агент Р20). Подготовку поверхности осуществляли согласно алгоритму для иммобилизации мишени мастера подготовки поверхности программного обеспечения прибора (условия: температура 25°C, скорость потока 5 мкл/мин). Лиганды (hVEGF и hDLL4) разводили буферным раствором (ацетат натрия 10 мМ; рН 4,5) до конечной концентрации 5 мкг/мл и 4 мкг/мл соответственно. Затем иммобилизовали их на поверхности чипа СМ5 до соответствующего уровня. При этом две проточные ячейки объединяли, так что первая и третья ячейки служили контролем, во второй ячейке на поверхности был иммобилизован hVEGF, а в четвертой - hDLL4 Первая и третья проточные ячейки служили для сравнения, чтобы учесть вариабельность эксперимента из-за неспецифичного связывания и буферного эффекта; при анализе результатов величины сдвига угла возникновения резонанса (RU) вычитались (Fc2-Fc1 и Fc4-Fc3). Направленные на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb, связывающиеся с hVEGF и с hDLL4, разводили рабочим буферным раствором до конечной молярной концентрации 100 нМ (серийные разведения 1:2) и каждое из пяти разведений подвергали анализу. Предназначенные для анализа образцы были высоко очищенными и высоко концентрированными - в достаточной степени, чтобы разводить их по меньшей мере в 100 раз; тем самым нивелировался буферный эффект. Во всех случаях при анализе использовались соответствующие мастера программного обеспечения, каждый образец дублировался и после каждой инжекции проводили регенерацию, так что стандарты эксперимента оставались неизменными.

Для анализа результатов использовали программу Biaevaluation (версия 4.0). При определении величин сдвига угла возникновения резонанса (RU) (Fc2-Fc1 и Fc4-Fc3), базовый уровень брали как нулевой, контрольная сенсограмма (инжекция буферного раствора, анализ 0 нМ) вычиталась из сенсограммы каждой пробы. Для определения сродства связывания полученные значения (RU) анализировали по модели бивалентного связывания. Определяли следующие показатели: ka (M-1c-1), kd-1) и KD (М). Уточним, что ka - это константа ассоциации, отражающая сродство связывания (распознавание), a kd - константа диссоциации, отражающая стабильность.

В приведенной ниже таблице 2 представлены результаты определения сродства связывания белка, направленного на две мишени, по данному изобретению с hVEGF, а в таблице 3 - результаты определения сродства связывания белка, направленного на две мишени, по данному изобретению с hDLL4.

Как можно видеть из таблиц 2 и 3, равновесная константа диссоциации KD(M) рассчитывается путем деления kd на ka (kd/ka). Результаты анализа сродства связывания с hVEGF показывают, что KD составляет около 0,126 нМ, что сходно с равновесной константой диссоциации для авастина IgG (см. фиг. 4А и таблицу 2), а результаты анализа сродства связывания с hDLL4 показывают, что KD составляет около 30 нМ (см. фиг. 4В и таблицу 3). Из этого следует, что сродство связывания белка, направленного на две мишени, по данному изобретению с каждым из указанных антигенов сохранилось на высоком уровне без изменений.

Пример 4. Определение эффекта нейтрализации для белка, направленного на две мишени (DLL4/VEGF)

Эффект нейтрализации для направленного на две мишени антитела авастин-DLL4 BsAb, определяли методом гомогенного конкурентного ELISA. А именно, проделывали следующее. В каждую лунку 96-луночного микропланшета (Nunc-Immuno Plate, NUNC, Рочестер, шт. Нью-Йорк, США) вносили 100 мкл белка hNotch-1-hFc (R&D Systems), разведенного PBS до концентрации 500 нг/мл, и оставляли на ночь при температуре 4°C, после чего обрабатывали BSA в течение 2 часов, чтобы блокировать сайты неспецифичного связывания.

На 96-луночном микропланшете антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb (очищенный белок) предварительно смешивали с серийными разведениями антигенного белка (человеческий DLL4-His, 600 нг/мл) при концентрациях антител от 0 нМ до 140 нМ. Смесь антиген/антитело инкубировали в течение 30 минут, затем переносили на микропланшет, предварительно покрытый белком - рецептором DLL4 hNotch-1 (50 нг на лунку), чтобы определить количество свободных антител. Планшет инкубировали в течение 2 часов, после чего промывали пять раз раствором PBS, содержащим твин (Tween-20; 0,05%). Для выявления антигена DLL4, связавшегося на планшете, использовали разведенные 1:800 поликлональные антитела против мышиного IgG с гистидиновой меткой, конъюгированные с пероксидазой хрена (Roche applied science); промытый микропланшет обрабатывали указанным разведенным антительным реагентом и давали реакции протекать в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем проводили окрашивание, используя в качестве субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (Sigma-Aldrich Co.). Ферментативную реакцию останавливали раствором серной кислоты (0,5 мол/л) и измеряли поглощение при 450 нм. Полученные результаты представлены на фиг. 5. Количество антител, требующееся для достижения 50%-ного снижения количества человеческого DLL4-His, связавшегося на планшете, покрытом белком Notch 1-hFc, (IC50) показано ниже в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, белок, направленный на две мишени, по данному изобретению обладал низким IC50 в отношении DLL4, а именно 1,12 нМ, откуда следует, что его способность подавлять DLL4 сравнима с таковой антител, направленных только против DLL4.

Пример 5. Картирование эпитопа путем поперечного сшивания и масс-спектрометрии

Чтобы идентифицировать конформационный эпитоп, состоящий из множества не соседних последовательностей, образующих благодаря конформации молекулы единую поверхность, применили метод определения положений образования поперечных сшивок и масс-спектрометрический анализ.

Пример 5-1. Образование поперечно-сшитого комплекса

Антигенный белок - дельта-подобный лиганд 4 (человеческий DLL4, hDLL4, R&D Systems) и антитела MLCK2, полученные, как описано в примере 1-3, смешивали в молярном соотношении 2:1 и добавляли в эту смесь поперечно-сшивающий агент K200 (CovalX AG) до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 3 часа, чтобы образовался комплекс антиген-антитело, после чего определяли молекулярную массу продукта реакции с помощью спектрометра Ultraflex II MALDI ToF (Bruker Daltonics). Как показано на фиг. 6, при использовании поперечно-сшивающего агента человеческий DLL4 и антитела MLCK2 образовывали комплекс в соотношении 1:1 и 2:1, чего не наблюдалось в контрольном опыте, в котором поперечно-сшивающего агента не было. Однако можно видеть, что в том случае, когда человеческий DLL4 или антитела MLCK2 по отдельности находились в присутствии поперечно-сшивающего агента, ни мультимеров, ни комплексов не обнаруживалось; из этого следует, что образование комплекса hDLL4/MLCK2 происходит в результате специфичного взаимодействия DLL4 и MLCK2.

Пример 5-2. Образование фрагментов с помощью протеаз

Чтобы идентифицировать поперчено-сшитые пептидные фрагменты, использовали дисукцинимидилсуберат - d0-DSS и d12-DSS, которые смешивали друг с другом в соотношении 1:1 и растворяли в N-диметилформамиде так, чтобы концентрация была 2 мг/мл. Этот раствор прибавляли к смеси DLL4 и MLCK2, находящихся в соотношении 2:1, до конечной концентрации 0,2 мг/мл и проводили реакцию поперечного сшивания при комнатной температуре в течение 3 часов. Продукт реакции модифицировали путем восстановления и алкилирования, используя дитиотреитол (DTT) и иодацетамид, для более эффективного расщепления, и обрабатывали протеазой, например, трипсином, альфа-химотрипсином или эндопротеиназой ASP-N. Полученные фрагменты анализировали путем жидкостной нанохроматографии с помощью системы Ultimate 3000 (Dionex) и масс-спектрометрии с помощью прибора с орбитальной ионной ловушкой LTQ Orbitrap XL (Thermo). Спектрометрические данные анализировали, используя программы Xquest (версия 2.0) и Stavrox (версия 2.1), что позволило выявить пары поперечно-сшитых пептидов. В результате, как показано в приведенной ниже таблице 5, удалось определить пары пептидов, образующиеся при поперечном сшивании hDLL4 и MLCK2.

Как выяснилось, поперечные сшивки образовывались с участием аминокислотных остатков в положениях 59, 63, 64 и 110 аминокислотной последовательности DLL4. Два фрагмента полипептидной цепи - один, состоящий из аминокислотных остатков с 58-го по 65-й [FRVCLKHF] (SEQ ID NO: 22), и второй, состоящий из аминокислотных остатков с 110-го по 115-й [TWPGTF] (SEQ ID NO: 23), образуют непрерывную молекулярную поверхность в домене С2 (27-174) молекулы человеческого DLL4 (см. изображение модели на фиг. 7). Таким образом, можно считать, что эти две аминокислотные последовательности оставляют эпитоп человеческого DLL4, для антитела MLCK2.

Пример 6. Изучение карты эпитопа путем вестерн-блоттинга

Был получен набор мутантных (замена на аланин) форм человеческого DLL4, а именно аминокислотные остатки в положениях 64 (гистидин), 65 (фенилаланин) и 69 (валин) в аминокислотной последовательности внеклеточной области человеческого DLL4 были заменены на аланин. В качестве экспрессионного вектора для получения мутантов с аланиновыми заменами использовали вектор, который служил для получения антигена, соответствующего определенной области внеклеточного домена DLL4, как описано в примере 1-1. Конкретно говоря, этот вектор содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам с 27-го по 251-й аминокислотной последовательности определенной области человеческого DLL4, и эта область содержит мотив, называемый «DSL» (delta/serrate)/lag-2), о котором известно, что он связывается с рецептором Notch 1.

Применяя стандартные методы технологии рекомбинантных ДНК, получили плазмидный экспрессионный вектор для клеток млекопитающих, содержащий промотор CMV в направлении 5' от полинуклеотида, кодирующего делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, слитый с белком Fc. Для изменений в указанном экспрессионном векторе, обеспечивающих замену аминокислотных остатков в положениях 64, 65 и 69 на аланин, применили метод сайт-направленного мутагенеза с помощью набора QuikChange Site-Directed Mutagenesis, (Agilent). Полученными мутантными векторами трансфицировали животные клетки HEK293E, используя липофектамин (Lipofectamine-2000, Invitrogen) и инкубировали в течение 4 суток, после чего выделяли продукт экспрессии из культуральной среды. В качестве контроля использовали белок, содержавший делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, дикого типа.

Инкубированную в течение 4 суток среду с продуктом экспрессии центрифугировали при 1000 об/мин и комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы удалить суспендированный материал; затем супернатант фильтровали через шприц (размер пор фильтровальной насадки 0,45 мкм). Для проведения вестерн-блоттинга в полученном фильтрате определяли концентрацию белка с помощью системы Octet® (ForteBio), чтобы нагружать SDS-гели одинаковым количеством. Затем по 20 мкл каждого образца среды, содержавшей мутантный белок, наносили на два полиакриламидных геля (4-12%; Bis/Tris; Novex) и проводили электрофорез, используя морфолинопропансульфонатный буферный раствор (MOPS), при напряжении 140 В в течение 50 минут. В качестве контроля брали белок, содержавший делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, дикого типа. По окончании электрофореза полосы белков с гелей переносили на поливинилидендифторидную мембрану. Далее осуществляли две процедуры. В одной из них для того, чтобы проверить, одинаковыми ли были количества мутантного белка и белка дикого типа, когда на гели с додецилсульфатом натрия нагружали делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4, мембрану с перенесенными белками обрабатывали антителами против человеческого Fc, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (1:10000) (Pierce Cat: 31413), после чего мембрану промывали три раза раствором PBS-T. Другая процедура служила для определения сродства связывания антител MLCK2 с мутантными белками; при этом вначале антитела MLCK2 (1 мкг/мл) связывали с мембраной, на которую были перенесены белки, и мембрану промывали три раза раствором PBS-T, а потом ее обрабатывали антителами против человеческого Fc, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (1:10000) и промывали три раза раствором PBS-T. Наконец, проводили детекцию с усиленной хемилюминесценцией (ECL) с помощью набора производства Amersham (GE Healthcare) и системы для визуализации гелей ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).

Как показано на фиг. 8, результаты, полученные путем вестерн-блоттинга, свидетельствуют, что мутантные белки, содержащие делегируемый фрагмент (аминокислотные остатки с 27-го по 251-й) внеклеточного домена DLL4 дикого типа, нагружались в одинаковом количестве. Кроме того, при определении сродства связывания антител MLCK2 с мутантными белками, обнаружилось, что при мутации в положении 64 аминокислотной последовательности сродство связывания антител MLCK2 утрачивалось, а при мутации в положении 65 сродство связывания антител MLCK2 значительно уменьшалось. Было также показано, что мутация в положении 69 аминокислотной последовательности не влияла на сродство связывания антител MLCK2.

Пример 7. Изучение влияния антител, направленных на две мишени (DLL4/VEGF), на пролиферацию эндотелиальных клеток вены пупочного канатика человека (HUVEC)

Для изучения влияния направленных на две мишени антител, связывающихся с DLL4 и с VEGF, на пролиферацию эндотелиальных клеток вены пупочного канатика человека (HUVEC) использовались клетки HUVEC, приобретенные в компании Lonza.

Для культивирования клеток HUVEC флаконы типа Т (Nunc) покрывали буферным раствором PBS (Gibco), содержащим желатин (1%; Sigma), при комнатной температуре в течение 4-6 часов, после чего промывали PBS. В качестве культуральной среды брали среду ЕВМ-2 с EGM-2 Single Quot (Lonza); плотность клеток в культуре поддерживалась не выше 80%; культивирование проводилось при температуре 37°C в CO2 (5%)-инкубаторе. В данном эксперименте использовали клетки до 6-го пассажа. Определение влияния на пролиферацию клеток HUVEC проводили следующим образом. Вначале готовили планшет, покрытый hDLL4: за сутки до эксперимента на 96-луночном планшете (BD) rhDLL4 (R&D Systems) разводили карбонатным буферным раствором до конечной концентрации 1 мг/мл и в каждую лунку вносили по 100 мл разведенного rhDLL4, после чего планшет инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. Также клетки HUVEC культивировали в минимальной среде ЕВМ-2 с добавлением 0,1% FBS в течение 24 часов, чтобы свести к минимуму эффект сыворотки. В первый день эксперимента каждую лунку планшета, покрытого rhDLL4, промывали два раза PBS, и для каждой из четырех групп hVEGF (50 нг/мл) и антитела (авастин 20 мг/мл; антитела против DLL4 20 мг/мл; антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb 26 мг/мл) разводили минимальной средой ЕВМ-2 и добавляли в лунку, повторяя каждую пробу по три раза; затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Культуру HUVEC, голодавшую в течение 24 часов, разделяли на отдельные клетки и разводили минимальной средой ЕВМ-2 так, чтобы получалось 4×103 клеток на лунку. Разведенные клетки вводили в лунки, обработанные антителами, и инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение 96 часов. По завершении размножения клеток в каждую лунку добавляли 10 мкл набора для подсчета клеток ССК-8 (Dojino), и планшет инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение 5 часов. Определяли поглощение при 450 нм с помощью устройства для считывания с микропланшетов SpectraMax 190 (Molecular Devices) и сравнивали уровни пролиферации клеток в разных группах.

Как видно из фиг. 9 по результатам для группы с обработкой PBS, при активации пути передачи сигналов DLL4/Notch пролиферация клеток эндотелия сосудов подавляется на около 30% - в отличие от случая, когда пролиферация клеток эндотелия сосудов активирована VEGF. Выше говорилось, что, как известно, в механизмах, действующих in vivo, антитела против VEGF подавляют ангиогенез в опухолях, тем самым подавляя опухолевый рост и метастазирование, в то время как антитела против DLL4 вызывают избыточное образование аномальных кровеносных сосудов (неактивных кровеносных сосудов) в опухолях, тем самым подавляя опухолевый рост. Можно сказать, что результаты, представленные на фиг. 9, отражают различные ангиогенные механизмы с участием VEGF и DLL4 in vitro.

Как видно из фиг. 9А, когда VEGF, его рецептор и путь передачи сигналов с участием VEGFR, который играет важную роль в пролиферации клеток эндотелия кровеносных сосудов, оказываются в присутствии антител, направленных против VEGF (авастина), пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов подавляется зависимым от концентрации образом невзирая на присутствие или отсутствие DLL4. Однако, как видно из фиг. 9В, демонстрирующей результаты, полученные в эксперименте с обработкой антителами, направленными только на DLL4, в той группе, в которой DLL4 не присутствовал, концентрация антител существенно не влияла на пролиферацию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, а в группе, в случае которой DLL4 присутствовал, пролиферация эндотелиальных клеток кровеносных сосудов происходила опять-таки зависимым от концентрации антител, направленных на DLL4, образом. В том случае, когда для обработки брали белок, направленный на две мишени, по данному изобретению в той группе, в случае которой DLL4 не присутствовал, белок, направленный на две мишени, оказывал подавляющее действие на пролиферацию клеток, сходное с наблюдавшимся в случае обработки авастином (фиг. 9С, черные столбики), а в той группе, в случае которой DLL4 присутствовал, подавление пролиферации клеток под влиянием белка, направленного на две мишени, было ослаблено (фиг. 9А и 9С; белые столбики).

Из того факта, что в группе, в случае которой для обработки брали антитела, направленные на DLL4, не наблюдалось подавления пролиферации клеток, сравнимого с тем, что имело место в случае обработки только антителами, направленными на VEGF, можно заключить, что антитела, направленные на две мишени, по данному изобретению эффективно подавляют оба пути передачи сигналов - и с участием VEGF, и с участием DLL4.

Пример 8. Изучение подавления путей передачи сигналов DLL4/Notch и VEGF/VEGFR антителами, направленными на две мишени (DLL4/VEGF)

Чтобы изучить подавляющую активность антител, направленных на две мишени, которые связываются с DLL4 и с VEGF, в отношении путей передачи сигналов DLL4/Notch и VEGF/VEGFR, использовали клетки HUVEC, действуя, как описано в примере 4. А именно, за сутки до эксперимента рекомбинантный человеческий DLL4 (rhDLL4, R&D Systems) разводили карбонатным буферным раствором до конечной концентрации 1 мг/мл и в каждую лунку 96-луночного планшета (BD) вносили по 1 мл разведенного rhDLL4, после чего планшет инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. В контрольной группе, в которой не делали обработку планшета rhDLL4, в лунки помещали только карбонатный буферный раствор (1 мл на лунку), после чего планшет инкубировали при температуре 4°C в течение ночи. На следующий день доставали планшет, покрытый DLL4, из холодильника, промывали один раз PBS и в каждую лунку прибавляли 1 мл среды EGM-2. Затем вносили в лунки следующие субстанции: авастин 20 мг/мл; дибензазепин (DBZ) 0,08 мМ; антитела, направленные на DLL4, 20 мг/мл; антитела, направленные на DLL4 (OncoMed), 20 мг/мл; антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb 26 мг/мл. Конечный объем среды в каждой лунке составлял 2 мл, антитела добавлялись в объеме, вдвое превышающим объем среды. Планшет инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. В процессе обработки антителами брали планшет 75Т, содержащий клетки HUVEC 2-го - 5-го пассажей, среду удаляли и культуру разделяли на отдельные клетки, которые промывали путем центрифугирования и вновь суспендировали в свежей среде EGM-2. Клетки подсчитывали, затем разводили до концентрации 5×105 клеток/мл и полученную клеточную суспензию вносили в лунки планшета по 1 мл в лунку, после чего инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение одних суток. По истечении этого времени среду из лунок удаляли, клетки промывали один раз PBS и обрабатывали (2 мл на лунку) минимальной средой ЕВМ-2, содержащей 0,2% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Также каждую лунку обрабатывали антителами в тех же концентрациях (авастин 20 мг/мл; дибензазепин (DBZ) 0,08 мМ; антитела, направленные на DLL4, 20 мг/мл; антитела, направленные на DLL4 (OncoMed), 20 мг/мл; антитела, направленные на две мишени, авастин-DLL4 BsAb 26 мг/мл), которые использовались днем ранее, и клетки инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение одних суток. Затем каждую лунку, содержащую клетки HUVEC, обработанные тем или иным антителом, обрабатывали hVEGF (R&D Systems) в концентрации 100 нг/мл и инкубировали в CO2 (5%)-инкубаторе при температуре 37°C в течение 5 минут. После этого планшет вынимали и быстро удаляли среду. Клетки промывали один раз PBS и в каждую лунку вносили 150 мкл буферного раствора для лизиса [1% NP-40; 20 мМ Tris; 137 мМ NaCl; 10% глицерин; 2 мМ EDTA, 1 мМ ортованадат натрия; смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз (готовый «коктейль») 1х]; планшет встряхивали, чтобы этот раствор распределился.

Затем планшет ставили на лед, из каждой лунки собирали клетки с помощью клеточного скребка, помещали их в 1,5-миллилитровые пробирки и оставляли на льду. Каждые 5 минут пробирки с клетками брали со льда, три раза встряхивали и ставили обратно на лед, чтобы протекал лизис. Затем образцы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4°C, полученный супернатант переносили в чистую пробирку и взвешивали. Для проведения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) к супернатанту прибавляли буферный раствор для образцов с SDS (5х) и кипятили при температуре 100°C в течение 10 минут, после чего проводили SDS-PAGE. Полученные образцы белка пропускали через 4-12%-ный гель (BIS-TRIS), и с разделившимися по молекулярному размеру белками проводили вестерн-блоттинг, используя следующие антитела (см. фиг. 10): NICD (клеточный сигнальный путь), P-ERK (клеточный сигнальный путь), ERK (клеточный сигнальный путь), VEGFR2 (клеточный сигнальный путь), P-VEGFR2 (клеточный сигнальный путь) и актин (Santa Cruz).

Как видно из фиг. 10, антитела, направленные на две мишени, по данному изобретению могут подавлять сигнальные пути DLL4/Notch и VEGF/VEGFR до уровня, сходного с тем, что наблюдается в случае антител, направленных только против DLL4, и антител, направленных только против VEGF.

Пример 9. Изучение противораковой активности антител, направленных на две мишени, в модели с ксенографтами клеток SCH (раковые клетки желудка человека), устойчивых к авастину

По литературным данным, человеческие раковые клетки желудка SCH устойчивы к авастину. В описываемом в данном примере эксперименте, проведенном с целью оценить противораковый эффект антител, направленных на две мишени, использовались голые мыши с ксенографтами клеток SCH.

Конкретно говоря, проделывали следующее. Раковые клетки желудка человека SCH, устойчивые к авастину, вводили самкам голых мышей, и когда размеры опухоли достигали в среднем 200 мм3, животным вводили раз в неделю один из взятых для данного эксперимента антительных препаратов (см. фиг. 11), чтобы проверить противораковую активность антител, направленных на две мишени, по данному изобретению in vivo. В этих опытах в качестве антител, направленных на две мишени, вместо антител авастин-DLL4, направленных против человеческого DLL4, использовали биспецифичные антитела авастин-мышиный DLL4, которые связываются с эпитопом мышиного DLL4 (домен DSL), эквивалентным эпитопу человеческого DLL4 (домен DSL); в итоге был продемонстрирован превосходный противораковый эффект антител, направленных на две мишени.

Как видно из фиг. 11, результаты эксперимента in vivo свидетельствуют, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, обладает существенно повышенной противораковой активностью в отношении раковых клеток желудка, устойчивых к авастину.

Пример 10. Изучение противораковой активности антител, направленных на две мишени, в модели с ксенографтами клеток А549 (раковые клетки легких человека), устойчивых к авастину

Голым мышам вводили клетки А549 и затем в течение 3 месяцев давали авастин (2,5 мг/кг массы тела в неделю), чтобы получить раковые клетки А549, устойчивые к авастину и дающие опухоли, рост и размеры которых не уменьшаются даже после лечения авастином. У этих животных брали опухоли и инкубировали устойчивые к авастину клетки А549 ex vivo, чтобы изучить эффект антител, направленных на две мишени.

Конкретно говоря, проделывали следующее. Раковые клетки легких человека А549, устойчивые к авастину, вводили самкам голых мышей, и когда размеры опухоли достигали в среднем 200 мм3, животным вводили два раза в неделю один из взятых для данного эксперимента антительных препаратов (см. фиг. 12), чтобы проверить противораковую активность антител, направленных на две мишени, по данному изобретению in vivo. В этих опытах в качестве антител, направленных на две мишени, вместо антител авастин-DLL4 направленных против человеческого DLL4, использовали биспецифичные антитела авастин-мышиный DLL4, которые связываются с эпитопом мышиного DLL4, эквивалентным эпитопу человеческого DLL4; в итоге был продемонстрирован превосходный противораковый эффект антител, направленных на две мишени.

Как видно из фиг. 12, результаты эксперимента in vivo свидетельствуют, что белок, направленный на две мишени, по данному изобретению, обладает существенно повышенной противораковой активностью в отношении раковых клеток легких, устойчивых к авастину.

Из всего, сказанного выше, специалистам в данной области техники, которым адресовано настоящее изобретение, должно быть ясно, что оно может быть представлено другими конкретными воплощениями без изменения его технической сущности и существенных признаков. В этой связи следует учесть, что приведенные выше примеры являются во всех отношениях иллюстративными и не носят ограничительного характера. Объем данного изобретения следует считать включающим не подробное описание, а смысловое содержание и объем прилагаемой формулы изобретения, а также все изменения и модифицированные формы, происходящие от равнозначных по смыслу ее пунктов.

1. Антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, где антитело специфически связывается с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и со 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4 (дельта-подобного лиганда 4), представленного в SEQ ID NO: 21, и антитело специфически связывается с фактором роста клеток эндотелия кровеносных сосудов (VEGF),

где антитело, специфически связывающееся с DLL4, включает:

вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, и

вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или

где антитело, специфически связывающееся с VEGF, включает:

вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, и

вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, и CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15.

2. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с DLL4, и антитело типа IgG, специфически связывающееся с VEGF, соединены друг с другом посредством линкерной структуры.

3. Антитело по п. 2, в котором пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:18.

4. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с DLL4, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную SEQ ID NO: 8, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную SEQ ID NO: 9.

5. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с VEGF, содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.

6. Антитело по п. 5, в котором антитело, специфически связывающееся с VEGF, является бевацизумабом.

7. Антитело по п. 1, в котором антитело, направленное на две мишени, содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.

8. Антитело по п. 1, в котором антитело, специфически связывающееся с DLL4, представлено полноразмерной антительной молекулой либо фрагментом Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG или scFv (одноцепочечным вариабельным фрагментом).

9. Полинуклеотид, кодирующий антитело, направленное на две мишени, по п. 1.

10. Экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид по п. 9.

11. Трансформированная клетка СНО для экспрессии антитела, направленного на две мишени, по п. 1, в которую введен экспрессионный вектор по п. 10.

12. Способ получения антитела, направленного на две мишени, содержащего антитело, специфически связывающееся с DLL4, и антитело, специфически связывающееся с фактором роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов (VEGF), который включает следующие этапы: (а) культивирование клеток-трансформантов для экспрессии биспецифического антитела по любому из пп. 1-8, для получения антитела, направленного на две мишени; и (b) выделение антитела, направленного на две мишени, которое получено на этапе (а).

13. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая терапевтически эффективное количество антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8, и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, в котором раковое заболевание выбирают из группы, состоящей из рака пищевода, желудка, толстого кишечника, прямой кишки, полости рта, гортани, глотки, легких, толстой кишки, молочной железы, шейки матки, эндометрия, яичника, предстательной железы, яичка, мочевого пузыря, почки, печени, поджелудочной железы, костей, соединительной ткани, кожи, головного мозга, щитовидной железы, лейкозов, болезни Ходжкина, лимфомы и множественной миеломы.

15. Композиция для диагностирования рака, содержащая эффективное количество антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8.

16. Способ диагностирования рака, включающий следующие этапы:

(а) измерение содержания VEGF или DLL4 в образце, взятом у индивида, у которого подозревается раковое заболевание, с использованием антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8; и

(b) установление факта наличия рака у данного индивида, если содержание белка VEGF или DLL4, определенное на этапе (а), выше, чем в контрольном образце из нормальной ткани.

17. Способ лечения рака, включающий этап введения антитела, направленного на две мишени, по любому из пп. 1-8 индивиду, у которого подозревается раковое заболевание.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, такой как антитело, где способ включает культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлено одноцепочечное антитело для лечения или диагностики, содержащее один полипептид, содержащий следующие домены, расположенные относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу следующим образом: VL1-CL1-CLH линкер1-VH1-CH11-шарнир1-CH21-CH31-HD линкер-VL2-CL2-CLH линкер2-VH2-CH12-шарнир2-CH22-CH32, где каждый из CLH линкера1, CLH линкера2 и HD линкера содержит аминокислотную последовательность, расщепляемую эндопептидазой на N- и C-концах.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам определения комбинации антигенсвязывающих сайтов и получения биспецифического антитела, что может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения антител, подходящих для применения у собаки, которые специфично связываются с собачьим фактором роста нервов (NGF) и нейтрализуют способность собачьего NGF связываться с рецептором собачьего NGF р75 или TrkA, и соответствующим антителам.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения антител, подходящих для применения у собаки, которые специфично связываются с собачьим фактором роста нервов (NGF) и нейтрализуют способность собачьего NGF связываться с рецептором собачьего NGF р75 или TrkA, и соответствующим антителам.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам для ингибирования серин-протеаз, и может быть использовано в медицине. Получают слитые белки имеющие, по меньшей мере, один человеческий полипептид альфа-1-антитрипсина (ААТ), функционально связанный с Fc-полипептидом иммуноглобулина, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен полипептид, обладающий цитотоксической активностью, содержащий Fc-область IgG, которая состоит из гетеродимера, содержащего первый полипептид и второй полипептид, в аминокислотных последовательностях которых произведены серии мутаций.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения антител, подходящих для применения у кошки, которые специфично связываются с кошачьим фактором роста нервов (NGF) и нейтрализуют способность кошачьего NGF связываться с рецептором кошачьего NGF р75 или TrkA, и соответствующим антителам.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения антител, подходящих для применения у кошки, которые специфично связываются с кошачьим фактором роста нервов (NGF) и нейтрализуют способность кошачьего NGF связываться с рецептором кошачьего NGF р75 или TrkA, и соответствующим антителам.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с фактором роста сосудистого эндотелия человека - VEGF и ангиопоэтином-2 человека - ANG-2, фармацевтической композиции его содержащей, а также к способу его получения.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и фармацевтике, в частности к фармацевтической композиции для применения в ингибировании роста опухоли, резистентной к анти-VEGF-средствам.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам домена CD95, и может быть использовано для ингибирования сигнального пути CD95. Получен химерный белок, содержащий функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95, непосредственно сшитого с Fc-доменом, где функциональный фрагмент укороченного по N-концу внеклеточного домена CD95 расположен на N-конце Fc-домена или его функционального фрагмента, и где химерный белок лишен дополнительной N-концевой последовательности.

Представленные изобретения касаются варианта исходного антитела против TNF-α или исходного связывающего фрагмента антитела против TNF-α, молекулы нуклеиновой кислоты, клетки-хозяина, фармацевтической композиции и способа лечения.

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, такой как антитело, где способ включает культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно предложен высокостабильный Т-клеточный рецептор, что может быть использовано в медицине. Полученный Т-клеточный рецептор, имеющий мутации в своем гидрофобном коровом домене, используют в составе фармацевтической композиции для лечения опухоли.

Представлены полинуклеотидная библиотека для получения спаренных последовательностей антител, способ получения представляющего интерес полинуклеотида и способ анализа и использования данных секвенирования.

Настоящее изобретение относится к хроматографическим матрицам, включающим лиганды на основе одного или нескольких доменов связывающихся с иммуноглобулином белков, таких как белок A (SpA) Staphylococcus aureus, а также способам их применения.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Получают иммуноцитокин, содержащий: конъюгат интерлейкина 15 и домена sushi IL-15Rα, ковалентно связанный с антителом или его фрагмент, направленным против антигена, имеющего отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, или опухолевого антигена.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлено одноцепочечное антитело для лечения или диагностики, содержащее один полипептид, содержащий следующие домены, расположенные относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу следующим образом: VL1-CL1-CLH линкер1-VH1-CH11-шарнир1-CH21-CH31-HD линкер-VL2-CL2-CLH линкер2-VH2-CH12-шарнир2-CH22-CH32, где каждый из CLH линкера1, CLH линкера2 и HD линкера содержит аминокислотную последовательность, расщепляемую эндопептидазой на N- и C-концах.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам определения комбинации антигенсвязывающих сайтов и получения биспецифического антитела, что может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и фармацевтике, в частности к фармацевтической композиции для применения в ингибировании роста опухоли, резистентной к анти-VEGF-средствам.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело, экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид, трансформированную клетку СНО для экспрессии вышеуказанного антитела, способ получения вышеуказанного антитела, фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую терапевтическое эффективное количество антитела, композицию для диагностики рака, способ диагностирования рака и способ лечения рака, включающий этап введения вышеуказанного антитела. В одном из представлений антитело специфически связывается с конформационным эпитопом DLL4, содержащим аминокислотные остатки с 58-го по 65-й и со 110-го по 115-й аминокислотной последовательности белка DLL4, представленного в SEQ ID NO: 21, и антитело специфически связывается с VEGF. Изобретение расширяет арсенал антител, связывающихся с VEGF и DLL4. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 10 пр.

Наверх