Метабиотический препарат-иммуномодулятор, содержащий клеточные стенки симбионтных коринебактерий, для укрепления врожденного иммунитета и способ его получения

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены метабиотический препарат-иммуномодулятор и способ его получения. Метабиотический препарат-иммуномодулятор содержит клеточные стенки коринебактерий штамма Corynebacterium diphtheriae, депонированного в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича под номером 2. Способ предусматривает культивирование коринебактерий штамма Corynebacterium diphtheriae №2, дезинтеграцию выращенной биомассы и ее очищение путем дифференциального центрифугирования. Осадок клеточных стенок промывают, ресуспендируют в растворе стабилизатора. Изобретения обеспечивают получение метабиотического препарата-иммуномодулятора для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов - метабиотиков из симбионтных бактерий, которое может быть использовано в медицине и ветеринарии для стимуляции и коррекции иммунного статуса при первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях, связанных с инфекционными, аллергическими, онкологическими, соматическими заболеваниями, путем оптимизации иммунного гомеостаза и микробиоты макроорганизма.

Симбионтные микроорганизмы являются неотъемлемой частью многочисленных микробиоценозов человека и животных, которые вместе с макроорганизмом составляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия. Бондаренко В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях. Consilium medicum, 2005, т. 7, №6, с. 437-443.

Коринебактерии входят в состав микробиоценозов всех открытых полостей: т.е кожи, дыхательных путей, ротоглотки, гениталий и т.д., и их метаболиты оказывают влияние на макроорганизм, поддерживая его иммунный гомеостаз, тем самым влияя на сохранение здоровья.

Профилактическая и терапевтическая активность бактериальных метаболитов-иммуномодуляторов подтверждается их действием на распознающие рецепторы клеток врожденного иммунитета.

Современные исследования и открытия в области иммунологии позволяют оценить активность микробных метаболитов и их роль в стимуляции или коррекции иммунного статуса при первичных или вторичных иммунодефицитных состояниях, сопряженных прежде всего с инфекционными заболеваниями бактериальной и вирусной природы.

Роль врожденного иммунитета, естественной и приобретенной невосприимчивости к инфекциям открывают возможность более целенаправленного управления инфекционным процессом. Так, отпадает прессинг на иммунную систему специфической вакцинацией или массированным использованием антибиотиков, приводящий к появлению еще более устойчивых видов патогенов и дисбиотическим микроэкологическим нарушениям.

Известен иммуномодулятор, подавляющий активность продукции антител класса IgE, выделенный из продукта разложения клеточной стенки Corynebacteriae, полученного путем растворения клеточных стенок Corynebacterium glutamicum с одним из ферментов глюкозидазой и эндопептидазой. Степень распада определяется по растворению гексозамина или глюкозамина в надосадочной жидкости. В частном случае реализации изобретения штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 15354 инокулируют в питательном бульоне и инкубируют со встряхиванием при температуре 30°C в течение 18 ч. Клетки собирают центрифугированием, чтобы получить приблизительно 3 г осадка. Влажные клетки отмывают центрифугированием один раз физиологическим раствором. Затем 500 мл физиологического раствора добавляют к осадку, суспендируют клетки и добавляют при перемешивании 4 мг лизоцима яичного белка. После перемешивания при температуре 37°C в течение 2 ч добавляют 4 мг сератиопептидазы и дополнительно инкубируют при температуре 37°C в течение 2 ч при перемешивании, чтобы получить материал разложения по настоящему изобретению. Полученную смесь нагревают при температуре 80°C в течение 30 мин и подвергают сублимационной сушке с получением 3 г сухого материала. US 5506388 В1, опубл. 14.01.2003.

Способ получения препарата из целых клеток Corynebacterium glutamicum представляет собой процесс приготовления с помощью ферментов лизата целых клеток (лизоцим) и лизата клеточных стенок (сератиопептидаза). Введение такого лизата (сублимационно высушенного) приводит к снижению показателей гуморального иммунитета, т.е. антител изотипа IgE, отражающих наличие аллергического статуса организма.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному является симбионтный штамм Corynebacteriae diphtheriae tox^- №108 - депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», используемый для приготовления иммуномодулятора, создающего неспецифическую резистентность против инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы у сельскохозяйственных животных. Для получения иммуномодулятора штамм выращивают в течение 16 ч на плотной питательной среде на основе рыбного гидролизата с добавлением сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37°C. Затем культуру смывают жидкой питательной средой на основе гидролизата казеина и после 5 ч культивирования вносят в емкости с той же питательной средой большего объема. Проводят выращивание биомассы при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 16 ч. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают физиологическим раствором при центрифугировании в режиме 5000 g в течение 20 мин. Влажный осадок взвешивают, суспендируют в забуференном физиологическом растворе с pH 7,2 до концентрации клеток 5%. Затем целые клетки дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм и охлаждением (льдом или водой) до температуры 30°C. Полученную после ультразвуковой обработки гомогенную суспензию дезинтеграта центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок. Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. Осадок, представляющий собой препарат клеточных стенок, ресуспендируют в физиологическом растворе и снова центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. Отмывание клеточных стенок от примеси цитоплазмы повторяют 3 раза. Отмытые клеточные стенки ресуспендируют в дистиллированной воде, полученный маточный раствор стерилизуют при температуре 100°C, и подвергают лиофильному высушиванию. Полученный сухой препарат - порошок беловатого цвета, после разведения в физиологическом растворе образует суспензию. RU 2477751 С1, опубл. 20.03.2013.

Полученный таким способом препарат из симбионтного штамма C.diphtheriae tox^- №108 (Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ» им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) предлагается использовать в качестве иммуномодулятора для создания неспецифической резистентности у сельскохозяйственных животных.

Технической задачей является разработка способа получения метабиотического препарата-иммуномодулятора для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных, использующего клеточные стенки симбионтного штамма Corynebacteriae tox^- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Технический результат от реализации заявленной группы изобретений заключается в получении безопасного и эффективного метабиотического препарата-иммуномодулятора для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных, обеспечивающего поддержание иммунного гомеостаза, что так же способствует и коррекции микроэкологического статуса того или иного биотопа.

Технический результат достигается тем, что симбионтный штамм Corynebacterium diphtheriae tox^- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича выращивают на плотной питательной среде, содержащей рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в соотношении 3:1 в течение 60-70 ч, затем культуру смывают жидкой питательной средой на основе гидролизата казеина и после 5 ч культивирования проводят наращивание биомассы в той же жидкой питательной среде при постоянном перемешивании в течение 16 ч, микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают раствором хлорида натрия при центрифугировании при 5000 g в течение 20 мин, полученный влажный осадок суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия до концентрации клеток 5-6 мас.% и дезинтегрируют в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм, при температуре не выше 30°C, полученный дезинтеграт клеток центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин, осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, полученный осадок ресуспендируют в растворе хлорида натрия и центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, отмывают клеточные стенки от примеси цитоплазмы и питательной среды 3 раза, полученный осадок клеточных стенок ресуспендируют в растворе стабилизатора - глицина в концентрации 15 мг/мл и стерилизуют.

Полученный метабиотический препарат-иммуномодулятор для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных содержит клеточные стенки симбионтного штамма Corynebacteriae tox^- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Приготавливают препарат в форме спрея или высушивают методом лиофилизации. Препарат пригоден для использования в различных лекарственных формах - капсулах, порошках, инъекционных растворах, мазях, аэрозолях, свечах, каплях и др.

Изобретение поясняется примером его осуществления.

Пример 1.

Штамм Corynebacteriae tox^- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича выращивают на плотной питательной среде известного состава - рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в соотношении 3:1 при температуре 37°C в течение 65 ч. Затем культуру смывают жидкой питательной средой, содержащей, г/л: гидролизат казеина - 2,0, пептон - 10,0, глюкоза - 10,0, дрожжевой экстракт - 2,0, натрия хлорид - 6,0, вода - остальное. После 5 ч культивирования при температуре 37°C вносят в рабочие емкости с той же жидкой питательной средой и проводят наращивание биомассы при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 16 ч. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают раствором хлорида натрия при центрифугировании в режиме не менее 5000 g в течение 20 мин. Полученный влажный осадок взвешивают, суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия с pH 7,2 до концентрации клеток 5 мас.%. Затем суспензию целых клеток дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм, при температуре не выше 30°C. Полученный дезинтеграт клеток центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок. Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, отмывают клеточные стенки от примеси цитоплазмы и питательной среды 3 раза, полученный осадок клеточных стенок ресуспендируют в растворе стабилизатора - глицина в концентрации 15 мг/мл и стерилизуют.

Оценка влияния препарата на систему врожденного иммунитета.

При оценке препаратов-модуляторов ориентируются не только на конечный результат невосприимчивости к инфекциям, но и на отдельные наиболее информативные показатели состояния иммунной системы. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, ч. 2, глава 11, доклинические исследования иммуномодуляторов микробного происхождения. М., 2013. С. 284.

Пример 2.

Влияние препарата на устойчивость к Klebsiella, pneumonia.

Важной характеристикой неспецифической активности иммуномодуляторов является их способность стимулировать естественную резистентность организма к различным микробным инфекциям.

Изучение защитной роли препарата при заражении Klebsiella, pneumonia проводили на беспородных мышах. На фиг. 1 показано влияние препарата на устойчивость беспородных мышей к заражению Klebs. pneumonia. По оси ординат представлено количество погибших животных в %, по оси абсцисс - заражающие дозы Klebs. Pneumonia, * - достоверные различия между выживаемостью опытных и контрольных животных. За 1 сутки до заражения мышам подкожно ввели препарат в разных дозах. Как видно, гибель животных, получивших препарат в дозах 200 мкг и 400 мкг, ниже, чем у контрольных животных. Введение препарата в дозе 100 мкг повышает выживаемость мышей только при заражающих дозах 10^-3; 10^-5 микробных клеток.

Пример 3.

Влияние препарата на устойчивость к St. aureus представлено в таблице 1.

* - в скобках отмечено количество выживших животных.

Как видно из данных таблицы, защитное действие препарата проявляется в обеих группах животных, но у мышей F₁(CBA×C57B1/6) оно выражается сильнее. У них выше выживаемость, а локальный очаг воспаления у большинства выживших отсутствует (т.е. все зажило). Наибольший защитный эффект отмечен при вакцинирующей дозе 100 мкг как у беспородных мышей, так и у гибридов.

Пример 4.

Влияние препарата на активность мембранного фермента макрофагов перитонеального экссудата (МПЭ) 5'-нуклеотидазы лабораторных животных.

В реализации биологической активности иммуномодуляторов важнейшую роль играют мембранные структуры. Большое значение для понимания механизма действия модуляторов и оценки их активности имеет изучение экзоферментов цитоплазматической мембраны макрофагов, в частности 5'-нуклеотидазы. 5'-нуклеотидаза (5'-н) - это один из основных ферментов пуринового обмена, который является ключевым звеном, опосредующим влияние различных факторов на жизнедеятельность клеток, в том числе клеток иммунной системы.

Снижение активности 5'-н - маркера цитоплазматической мембраны МПЭ является одним из характерных признаков активации этих клеток.

Препараты, обладающие иммуностимулирующим действием, вызывают снижение активности 5'-н в МПЭ беспородных мышей, а иммуносупрессивным, наоборот - повышение ферментативной активности. Препараты, не обладающие иммуномодулирующим эффектом, не изменяют уровня активности 5'-нуклеотидазы в МПЭ.

Активность 5'-нуклеотидазы в МПЭ мышей гибридов F₁(CBA×C57B1/6) в течение 30 суток после подкожного введения разных доз препарата показана на фиг.2. По оси абсцисс представлено время в сутках, по оси ординат - активность 5'-н у вакцинированных животных по отношению к контрольным, * - достоверные различия между уровнем активности 5'-н у вакцинированных и контрольных мышей.

Видно, что при применении препарата в дозах 100 мкг и 200 мкг наблюдается стабильное снижение активности фермента относительно контрольных значений в течение всего срока исследования. Препарат в дозе 400 мкг вызывает повышение активности фермента к 23 суткам, а к 31 - эта активность падает.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у препарата длительного иммуностимулирующего эффекта. Глубина этого эффекта зависит от вводимой животным дозы и срока наблюдения.

Пример 5.

Влияние препарата на продукцию ИЛ-2 представлено в таблице 2.

Под воздействием иммуномодулятора микробного происхождения возрастает продукция противовоспалительных цитокинов, необходимых для инициации клеточного и гуморального иммунитета.

Определение продукции ИЛ-2 под влиянием препарата-иммуномодулятора в дозах 10 мг/кг при 2-кратном введении мышам линии F₁(CBA×B6) приведены в таблице 2. Видно, что введение препарата стимулирует продукцию ИЛ-2 спленоцитами, активированными конкавалином А, что выражается в усилении пролиферации клеток на 50-70% (индекс стимуляции 1,0). Препарат в дозах 1, 0,1 мг/кг стимулирует ИЛ-2 меньшим процентом клеток, что и отражает индекс стимуляции (2,1±0,25 и 1,2±0,3).

Стимулирующий эффект препарата на продукцию ИЛ-2 по сравнению со стимулирующим эффектом некоторых известных иммуномодуляторов (например, полисахаридами), то последние существенно уступают препарату из коринебактерий.

Выявленное усиление синтеза ИЛ-2 у животных, иммунизированных препаратом, усиливает общую экспрессию иммунокомпетентных клеток, что повышает уровень неспецифической резистентности в ответ на контакт с бактериальными и вирусными антигенами.

Пример 6.

Влияние препарата на образование Т-киллеров in vivo у животных, иммунизированных препаратом, в ответ на введение аллогенных опухолевых клеток.

* - Указаны средние трех независимых опытов; соотношение киллер:мишень - 30: 1.

Видно, что у животных, иммунизированных препаратом, выявлена высокая неспецифическая активность киллеров в отношении аллогенных опухолевых клеток. Более высокая активность выявлена при иммунизации животных дозой 10 мг/кг.

Пример 7.

Влияние препарата на количественное содержание лимфоцитов в крови у 40 взрослых лиц - носителей возбудителя дифтерии.

Проблема носительства возбудителя дифтерии C. diphtheriae tox⁺ и заболевания привитых остается актуальной. Санация антибиотиками и антисептиками не предотвращает длительного и рецидивирующего носительства возбудителя, которое преимущественно наблюдается у привитых лиц с хронической патологией ЛОР-органов, отягощенных аллергическим статусом и вторичным иммунодефицитным состоянием.

В таблице 4 представлены клинические показатели содержания лимфоцитов в крови длительных носителей C.diphtheriae tox⁺ до и после введения препарата.

Примечание:

n - число обследованных,

отличие от нормы значимо при р*<0,05; **<0,01; ***<0,001.

До введения препарата регистрировались индивидуальные отклонения в содержании лимфоцитов по сравнению с их содержанием в крови здоровых лиц. Поэтому все обследованные в зависимости от исходных показателей были разделены на три группы. В первую группу вошли носители с низким исходным содержанием лимфоцитов, во вторую - с высоким, и в третью - с показателями, соответствовавшими норме.

У всех лиц первой группы показатели содержания лимфоцитов достоверно ниже, чем в контрольной группе. После введения препарата содержание лимфоцитов в первой группе увеличилось, приближаясь к показателям нормы.

В группе №2 носителей с высоким содержанием лимфоцитов в крови после введения препарата их показатели содержания лимфоцитов снизились, приближаясь к показателям контрольной группы.

У носителей третьей группы, в крови которых исходное содержание лимфоцитов соответствовало норме, после введения препарата количество лимфоцитов в крови осталось прежним, т.е. оно колебалось в пределах верхней и нижней границы нормы.

Представленные данные свидетельствуют об избирательном воздействии препарата на иммунную систему человека. Так, при низкой исходной концентрации после введения препарата происходит стимуляция их содержания, при высокой - снижение, при концентрации, соответствующей норме, их содержание не меняется. Следовательно, метабиотический препарат-иммуномодулятор из симбионтных коринебактерий обладает иммуномодулирующей активностью, безвредностью и иммунокорегирующими свойствами. Изменение количественного состава лимфоцитов в крови длительных носителей в сторону физиологического оптимума сопровождалось положительным санирующим эффектом.

Итак, представленные характеристики иммуностимулирующих свойств препарата свидетельствуют о его неспецифической активности.

Выраженная способность макроорганизма под воздействием препарата-метабиотика стимулировать резистентность к инфекционным возбудителям повышает активность системы макрофагов, ИЛ-2, активность Т-киллеров, что позволяет говорить о возможности использования метабиотического препарата-иммуномодулятора из симбионтных коринебактерий для повышения неспецифической резистентности (адаптивного иммунитета) макроорганизма.

1. Способ получения метабиотического препарата-иммуномодулятора для укрепления врожденного иммунитета, содержащего клеточные стенки симбионтных коринебактерий, характеризующийся тем, что выращивают биомассу симбионтного штамма Corynebacterium diphtheriae tox^- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича на плотной питательной среде, содержащей рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в соотношении 3:1 в течение 60-70 ч, затем культуру смывают жидкой питательной средой на основе гидролизата казеина и после 5 ч культивирования проводят наращивание биомассы в той же жидкой питательной среде при постоянном перемешивании в течение 16 ч, микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают раствором хлорида натрия при центрифугировании при 5000 g в течение 20 мин, полученный влажный осадок суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия до концентрации клеток 5-6 мас.% и дезинтегрируют в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм, при температуре не выше 30°С, полученный дезинтеграт клеток центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин, осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, полученный осадок ресуспендируют в растворе хлорида натрия и центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, отмывают клеточные стенки от примеси цитоплазмы и питательной среды 3 раза, полученный осадок клеточных стенок ресуспендируют в растворе стабилизатора и стерилизуют.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют глицин в концентрации 15 мг/мл.

3. Метабиотический препарат-иммуномодулятор для укрепления врожденного иммунитета, содержащий клеточные стенки симбионтных коринебактерий, характеризующийся тем, что он получен способом по любому из пп. 1, 2.