Способ подготовки шахтных вод для выделения днк



Способ подготовки шахтных вод для выделения днк
Способ подготовки шахтных вод для выделения днк
C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2648158:

Федеральное государственное учреждение Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (RU)

Изобретение относится к микробиологии. Способ подготовки шахтных вод для выделения ДНК предусматривает фильтрацию проб кислой шахтной воды через нитрозоцеллюлозный фильтр, трехкратную промывку осадка оксалатом аммония и осаждение отмытых клеток центрифугированием в течение 20 мин. Изобретение позволяет подготовить образцы биомассы для последующего выделения с помощью стандартных наборов реагентов образцов ДНК необходимого качества для проведения молекулярно-биологического анализа. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой способ подготовки воды и осадков кислых шахтных дренажей для выделения ДНК для последующего молекулярно-биологического анализа. Высокую эффективность выделения ДНК предлагается достичь путем сбора клеток микроорганизмов с помощью фильтрации и промывки оксалатом аммония. Данный способ может быть использован для получения образцов ДНК с целью проведения молекулярно-биологического анализа микробных сообществ кислых сточных вод и осадков для выявления штаммов, перспективных для использования в различных биотехнологических процессах.

Кислые шахтные дренажные воды содержат высокие концентрации тяжелых металлов, характеризуются низкими значениями рН и относительно невысокой численностью микроорганизмов. Все это в совокупности затрудняет выделение ДНК в достаточном количестве для проведения молекулярно-биологических исследований, так как делает невозможным получение препаратов ДНК надлежащего качества. При этом молекулярно-биологические анализы микробных сообществ кислых дренажей являются необходимым этапом исследований, направленных на выделение перспективных для использования в биотехнологиях излечения металлов из сульфидного сырья и очистки кислых сточных вод от сульфатов и тяжелых металлов штаммов микроорганизмов.

Известен способ подготовки проб осадков кислых дренажей угольных шахт для последующего выделения ДНК для молекулярно-биологических исследований (CN 101648985). Для подготовки проб предлагается добавление к пробе осадка раствора ПАВ (Tween 40 или 80) в фосфатном буфере, обработку ультразвуком, чтобы перевести клетки в супернатант, и последующее его фильтрование для сбора клеток из жидкой фазы. Осажденную на мембранном фильтре предлагается использовать для выделения ДНК. Недостатком способа является необходимость использования специального оборудования для обработки ультразвуком.

В статье (Zeng et al., 2008) предложен способ подготовки проб биомассы ацидофильных микроорганизмов для последующего выделения ДНК, т.к. применение стандартных коммерческих наборов для выделения ДНК из проб кислых сточных вод не давало удовлетворительных результатов: клетки ацидофильных микроорганизмов, осажденных центрифугированием, промывали три раза PBS с высоким содержанием хлорида натрия (PBS; 300 mM NaCl, 2.7 mM KСl, 10 mM Na2HPO4, 1.7 mM NaH2PO4), затем ресуспендировали в буфере для лизиса клеток (EDTA: рН 8.0, 0.5М, 50 ml; NaCl: 5М, 5 ml; SDS: 20%, 25 ml; Cetyltrimethylammoniumbromide (СТАВ): 1 %) и инкубировали в кипящей воде 6 мин и по 30 мин при 60°С и 72°С, затем выделяли ДНК фенол-хлороформным методом. Недостатком способа является необходимость длительной инкубации биомассы при высоких температурах.

В статье (Zammit et al., 2011) был предложен способ для выделения ДНК ацидофильных микроорганизмов, выращенных на средах с двухвалентным железом и нерастворимыми субстратами (элементарной серой и пиритом). Клетки с поверхности пирита удаляли с помощью обработки 1% Tween 20, затем пирит осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 3 с. Аналогично удаляли из среды элементарную серу и осадки гидроксида железа, затем клетки собирали из супернатанта центрифугированием при 20000 g. Клетки разрушали комбинацией ферментативного лизиса и механического разрушения, ДНК извлекали с помощью раствора полиэтиленгликоля (30 % PEG 8000/1.6 М NaCl) в течение 16 часов. Недостатками способа являются сложная процедура разрушения клеток, требующая комбинации различных методов, и большая продолжительность.

Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является способ выделения ДНК ацидофильных микроорганизмов из пульпы реактора биовыщелачивания с рН 1.8-2.0 (CN 1990864), который для достижения высокой эффективности выделения ДНК предполагает проведение следующих операций:

(1) осаждения клеток центрифугированием;

(2) двукратная промывка 0.02 М серной кислотой;

(3) ресуспендирование в нейтральном STE буфере (сахароза 10%, Tris ⋅ НСl 50 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8.0), чтобы избежать разрушения ДНК при лизисе клеток;

(4) лизис клеток путем добавления к суспензии лизоцима, SDS и протеиназы К, экстракцию ДНК с помощью хлороформа.

Недостатком способа является промывка 0.02 М серной кислотой, что может не позволить полностью удалить осадки соединений железа из биомассы, так как они стабильны в разбавленных сернокислых растворах и могут ингибировать реагенты, предназначенные для лизиса клеток и выделения нуклеиновых кислот.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа подготовки воды и осадков кислых шахтных дренажей для молекулярно-биологического анализа с целью повышения качества и количества выделенной ДНК, что должно обеспечить высокую достоверность и точность результатов последующего молекулярно-биологического анализа.

Техническим результатом при осуществлении заявленного способа является получение достаточного количества и качества образцов ДНК из кислых шахтных дренажей для молекулярно-биологического анализа.

Поставленная задача решается тем, что способ подготовки воды и осадков кислых шахтных дренажей для молекулярно-биологического анализа включает следующую последовательность манипуляций:

(1) фильтрование проб кислой шахтной воды через нитроцеллюлозный фильтр для сбора клеток;

(2) промывку оксалатом аммония (рН 5.0), который способствует переводу железа из твердой фазы в жидкую, что благоприятствует отделению клеток от микрочастиц породы с клетками с фильтра, оксалат аммония благодаря способности образовывать растворимые комплексы эффективно растворяет осадки соединений железа при относительно небольшой концентрации;

(3) осаждение при помощи центрифугирования.

Полученный осадок используется для выделения ДНК с помощью стандартных реагентов и последующего молекулярно-биологического анализа.

Предложенный способ можно применять для выделения ДНК из кислых шахтных дренажных вод, а также других жидких отходов горно-рудной промышленности с последующим молекулярно-биологическим анализом.

Пример осуществления изобретения приведен ниже.

Пример 1.

Для анализа были взяты пробы кислой шахтной воды из отходов добычи золота месторождений «Центральный» (проба КУ1, рН 2,85) и «Комсомольский» (проба КУ3, рН 2,29) Кемеровской области, содержащие высокие концентрации металлов (Таблица 1).

Предварительно проводили фильтрование проб кислой шахтной воды с помощью системы Sartorius (Германия) через нитроцеллюлозный фильтр для сбора клеток. Далее фильтр промывали оксалатом аммония (рН 5.0) 3 раза по 30 минут при температуре 30°С и осаждали отмытые клетки с помощью центрифугирования (20 минут, 4000 об/мин, 4°С). Полученный осадок с клетками использовали для выделения ДНК.

Кроме того, были использованы другие стандартные методы подготовки осадков для выделения ДНК (Таблица 2).

Далее из проб, подготовленных описанными в Таблице 2 способами, проводили выделение ДНК с помощью двух разных методов. В качестве первого метода использовали набор реактивов MOBIO PowerSoil DNA Kit (MOBIOLaboratories, Inc, Carlsbad, CA) в строгом соответствии с инструкцией производителя (https://mobio.com/media/wysiwyg/pdfs/protocols/12888.pdf). Второй метод выделения ДНК заключался в использовании реагента СТАВ (ЦТАБ-цетилтриметиламмонийбромид) и фенол/хлороформа. Для этого ресуспендировали клетки на фильтре в ТЕ-буфере (10 мМ Tris; 1 мМ EDTA, рН 8,0) и лизировали с помощью лизоцима, SDS и протеиназы К. Далее ДНК очищали с помощью 5М NaCl и CTAB/NaCl, промывки в смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт и осаждали с этанолом. Концентрацию ДНК в полученных препаратах измеряли спектрофотометрически.

Как видно из представленных данных, ДНК удалось выделить только при использовании способа, предлагаемого в качестве изобретения.

Предлагаемый способ подготовки проб позволил выделить с помощью реагента СТАВ и фенол/хлороформа 1,5 мкг и 2,3 мкг ДНК из пробы КУ-1 и КУ-3 соответственно. Другие способы подготовки осадков не позволили выделить ДНК ни одним из использованных методов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Patent CN 101648985, С07Н 21/04, 2010.

2. Patent CN 1990864, C12N 15/10, C22B 3/18, 2007.

3. Zammit С.М., Mutch L.A., Watling H.R., Watkin E.L.J. The recovery of nucleic acid from biomining and acid mine drainage microorganisms. Hydrometallurgy. 2011. Volume 108, Issues 1-2, P. 87-92.

4. Zeng L., Huang J., Zhang Y., Qiu G., Tong J., Chen D., Zhou J., Luo X. An effective method of DNA extraction for bioleaching bacteria from acid mine drainage. Applied Microbiology and Biotechnology. 2008. V. 79. P. 881.

Способ подготовки биомассы микроорганизмов из осадков шахтных вод для выделения ДНК, включающий фильтрование проб кислой шахтной воды через нитроцеллюлозный фильтр для сбора осадков, содержащих клетки микроорганизмов, трехкратную промывку собранного осадка раствором оксалата аммония, рН 5,0, и осаждение отмытых клеток с помощью центрифугирования при 4000 об/мин и 4°С в течение 20 минут.



 

Похожие патенты:

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ получения ДНК-праймеров и зондов для определения присутствия и определения относительного количества фетальной ДНК в образце плазмы крови беременной женщины.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения гетерогенного набора одноцепочечных фрагментов ДНК для мультиплексного генетического анализа.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к способу определения и секвенирования неизвестных последовательностей ДНК, которые фланкируют известные последовательности в выделенной ДНК.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ получения ДНК-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-й хромосомы у плода по крови беременной женщины, характеризующийся тем, что выбирают сайт дифференциального метилирования фетальной ДНК 21-й хромосомы и ДНК 21-й хромосомы взрослого человека, чувствительный к эндонуклеазам, синтезируют прямой и обратный праймер, соответствующие ампликону длиной от 60 до 300 п.н., а также зонд, соответствующий этому ампликону, проводят ПЦР в реальном времени смеси образцов после их обработки эндонуклеазой рестрикции, отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность реакции ПЦР в реальном времени выше 90% и линейность при изменении относительной концентрации образцов выше 90%.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ автоматизированного выделения с одновременной очисткой нуклеиновых кислот из двух и более биологических образцов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности растения кукурузы, содержащего трансгенную конструкцию, содержащую ген арилоксиалканоатдиоксигеназы, где указанный способ включает: получение образца геномной ДНК от указанного растения кукурузы; получение приведенного в контакт образца посредством контактирования указанного образца ДНК с первым праймером и вторым праймером и флуоресцентным зондом, определение зиготности указанного растения кукурузы, а также к набору для его осуществления.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения зиготности растения сои, включающего арилоксиалканоатдиоксигеназу (AAD-12) с SEQ ID NO: 1, где указанное растение содержит трансгенную конструкцию, включающую ген AAD-12, состоящий из остатков 2731-9121 SEQ ID NO: 1, и указанная трансгенная конструкция фланкирована 5′-фланкирующей геномной ДНК сои и 3′-фланкирующей геномной ДНК сои, где указанная 5′-фланкирующая геномная ДНК содержит остатки 1-2730 SEQ ID NO: 1, указанная 3′-фланкирующая геномная ДНК содержит остатки 9122-10212 SEQ ID NO: 1, а также к комплекту для его выполнения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ подготовки культур сульфидогенных бактерий для выделения ДНК.

Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 включает разрушение клеток дрожжей в буфере с pH 7,4, содержащем 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА и 0,5 М NaCl, обработку додецилсульфатом натрия в концентрации от 0,5 до 1,0% 20-25 мин при 20°C и хлороформом в концентрации до 25% 20-25 мин при 20°C.

Группа изобретений относится к области биохимии. Заявлены варианты способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний, включающего забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию методом множественной обратной транскрипции полимеразой цепной реакции с последующим анализом амплифицированных продуктов.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм суспензионной культуры клеток растения диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea Wall) под обозначением ИФР-ДМ-05-pro №89, депонированный в Российскую коллекцию высших растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им.

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к диагностике, а именно: к ДНК-анализу, и может быть использовано для выявления мутаций резистентности к макролидным антибиотикам у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumonia, а именно в позициях 2058/2059 и 2611 23S рРНК.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа объектов, включающая способ определения бактерии вида Dickeya solani методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) и набор праймеров для определения бактерии вида Dickeya solani методом петлевой изотермической амплификации (LAMP).

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ дифференциации штаммов Yersinia pestis на основной и неосновные подвиды методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к бис-Met-гистонам, и может быть использовано в медицине. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим гистоном H1.
Изобретения относятся к экологии. Биологически активный препарат, ускоряющий минерализацию останков, включает смесь спор непатогенных бактерий, принадлежащих к виду Bacillus, причем дополнительно включает компонент, сдерживающий влагу - глинистый нетоксичный минерал, способный разбухать при гидратации в 14-16 раз, питательные вещества, витамины, микроэлементы и источник тепловой активации для поддержания жизнедеятельности непатогенных бактерий в виде пероксида калия K2O2 и/или пероксида натрия Na2O2.
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Осуществляют обеспечение питания корневой системы растения посредством воспроизведения в субстрате, предназначенном для выращивания растений, ассоциативного симбиоза композиции микробиологических инокулянтов и живой биомассы зеленых микроводорослей, либо сине-зеленых микроводорослей, либо комбинации зеленых и сине-зеленых микроводорослей, обеспечивающего воспроизведение в субстрате процесса кислородно-углеродного цикла аналогично происходящему в условиях естественного почвенного биоценоза.
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Осуществляют активацию субстратов посредством воспроизведения в субстрате, предназначенном для выращивания растений, ассоциативного симбиоза композиции микробиологических инокулянтов и живой биомассы зеленых микроводорослей, либо сине-зеленых микроводорослей, либо комбинации зеленых и сине-зеленых микроводорослей, обеспечивающего воспроизведение в субстрате процесса кислородно-углеродного цикла аналогично происходящему в условиях естественного почвенного биоценоза.

Изобретения относятся в целом к микробным инокулянтам. Микробный инокулянт для использования в увеличении роста растений, продуктивности растений и/или качества почвы содержит штаммы двух или более видов бактерий, выбранных из Lactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi и Lactobacillus zeae.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Bacillus megaterium V3, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 04324 в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур. Изобретение позволяет ускорить рост и увеличить продуктивность зерновых, овощных и древесных культур. 9 табл.

Изобретение относится к микробиологии. Способ подготовки шахтных вод для выделения ДНК предусматривает фильтрацию проб кислой шахтной воды через нитрозоцеллюлозный фильтр, трехкратную промывку осадка оксалатом аммония и осаждение отмытых клеток центрифугированием в течение 20 мин. Изобретение позволяет подготовить образцы биомассы для последующего выделения с помощью стандартных наборов реагентов образцов ДНК необходимого качества для проведения молекулярно-биологического анализа. 2 табл., 1 пр.

Наверх