Комбинированная терапия для стабильного и долговременного приживления трансплантата с использованием конкретных протоколов для т/в-клеточной деплеции

Группа изобретений относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использована для лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате. Для этого способ включает (а) трансплантацию субъекту дозы незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками. Причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат меньше чем 5×105 CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и указанная доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×106 CD34+ клеток на кг массы тела субъекта. Незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают путем сепарации указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из: (I) способа, включающего; (i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем указанное антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства; (ii) иммобилизацию указанных незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с указанным антителом, меченным указанным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля; (iii) отмывку указанной матрицы для удаления несвязанных клеток; и (iv) удаление указанного магнитного поля для элюирования связанных клеток из указанной матрицы; (II) на основании продукта, секретируемого указанными Т-клетками; и (III) на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β. Далее субъекту вводят терапевтически эффективное количество циклофосфамида, причем указанное терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела субъекта. Циклофосфамид вводится субъекту после трансплантации, тем самым обеспечивая лечение субъекта. Группа изобретений относится также к вариантам лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, и к способу индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате. Использование данной группы изобретений обеспечивает долгосрочный смешанный химеризм, успешное приживление трансплантата гемопоэтических стволовых клеток путем комбинации без Т-клеточного костного мозга и введения циклофосфамида в высокой дозе после трансплантации. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 табл., 7 ил.

 

Родственные заявки

Предварительная заявка на выдачу патента США №61/578917, поданная 22 декабря 2011 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки, как если бы она была полностью изложена в настоящем документе.

Область техники

Настоящее изобретение согласно его некоторым вариантам осуществления относится к комбинированной терапии для достижения стабильной и долговременной клеточной или тканевой трансплантации.

Уровень техники

Применение не полностью совместимых по гаплотипу гаплоидентичных доноров в качестве альтернативного источника для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) является весьма привлекательным, поскольку фактически у всех пациентов есть доступный гаплоидентичный член семьи, который может служить в качестве донора HSCT. Предыдущие попытки избежать риска развития летальной реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD) и применить гаплоидентичную строго без-Т-клеточную трансплантацию костного мозга (TDBMT) у пациентов с лейкозом выявили тот факт, что отсутствие Т-клеток донора в трансплантате приводит к высокому показателю отторжения трансплантата, опосредованного остаточными устойчивыми к лучевой терапии и химиотерапии Т-клетками хозяина (НТС). Для преодоления этого препятствия внимательно исследовали "мегадозу" TDBM-клеток, которые могут преодолеть этот опосредованный НТС иммунный барьер и могут успешно приживиться даже при использовании комбинаций полностью несовместимых линий мышей [Bachar-Lustig E et al., Nat Med. (1995) 1:1268-1273]. В дальнейшем было показано, что у людей, как и у грызунов, повышение дозы CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток может использоваться для преодоления генетических барьеров, обеспечивая удовлетворительные коэффициенты выживаемости после очищенного гаплоидентичного HSCT [Reisner Y and Martelli MF. Immunol Today. (1995) 16:437-440 и патент США №5806529].

Наряду с тем, что использование очищенной "мегадозы" CD34⁺ HSCT предоставило возможность для гаплоидентичной трансплантации у пациентов с лейкозом, одним главным недостатком, общим для всех без-Т-клеточных трансплантатов, является медленная скорость восстановления иммунной системы реципиента. Это объясняется использованием протоколов обширного иммунного аблативного кондиционирования перед трансплантацией, низкими количествами инфузированных в трансплантате Т-клеток донора и сниженной функцией тимуса взрослых реципиентов. Таким образом, у взрослых реципиентов гаплоидентичного трансплантата CD34⁺ стволовых клеток значительный показатель связанной с трансплантацией смертности (TRM) обусловлен оппортунистическими инфекциями.

Для решения этой задачи разрабатываются некоторые подходы. Они включают в себя новые способы воздействия для улучшения функции тимуса, посттрансплатационного адоптивного переноса противовирусных специфических Т-клеток, переноса частично поликлональных нереактивных в отношении хозяина подвергнутых аллогенной деплеции Т-клеток или переноса полностью поликлональных Т-клеток, трансфектированных с индуцируемыми "суицидальными" генами. Альтернативным и дополнительным подходом для сохранения иммунитета хозяина является применение кондиционирования сниженной интенсивности (RIC). Этот немиелоаблативный подход сохраняет значительное количество иммунных клеток хозяина и, таким образом, может снижать TRM как путем улучшения посттрансплатационного восстановления иммунной системы, так и снижения токсичности, связанной со средствами для кондиционирования. Гаплоидентичная трансплантация в режиме RIC является даже более сложной, вследствие значительного иммунологического барьера, представленного выжившими Т-клетками хозяина. В недавних попытках преодолеть этот барьер, в большинстве случаев, использовали не подвергнутые деплеции Т-клеток трансплантаты, которые обеспечивали высокий показатель приживления трансплантата, но ценой повышенных показателей GVHD. Другой подход в применении гаплоидентичной трансплантации в режиме RIC использует подвергнутые деплеции CD3/CD19 трансплантаты, которые не только содержат CD34⁺ стволовые клетки, но также CD34 - отрицательные предшественники, NK, облегчающие приживление клетки и дендритные клетки, тем не менее, он также достигается ценой повышенных показателей GVHD и TRM.

В 1970-е гг. George Santos показал на грызунах, что короткий курс высоких доз циклофосфамида (CY) вскоре после трансплантации костного мозга (ВМТ) направленно активировал аллореактивные Т-клетки донора или хозяина [Owens АН Jr and GW. S. Transplantation. (1971) 11:378-382]. Показали, что циклофосфамид является нетоксичным в отношении гемопоэтических стволовых клеток вследствие высокой экспрессии в них детоксифицирующего фермента альдегиддегидрогеназы, и Slavin с соавт. дополнительно показали, что введение циклофосфамида в высокой дозе может снижать GVHD и отторжение трансплантата у мышей без неблагоприятных эффектов на приживление трансплантата стволовых клеток [Brodsky RA and RJ. J. Lancet. (2005) 365:1647-1656]. Клинические испытания, проведенные John Hopkins и группами из Fred Hutchinson Cancer Research Center, исследовали немиелоаблативный протокол циклофосфамида, флударабина и TBI в дозе 2 Гр, а также профилактику посттрансплатационной GVHD с помощью циклофосфамида (50 мг/кг в дни +3 и +4), MMF (дни +5 - +35) и такролимуса (дни +5 - +180) [Luznik L et al., Biology of blood and marrow transplantation: journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation. (2008) 14:641]. Согласно данным их исследований этот протокол приводит к высокой частоте рецидивов, что, возможно, обусловлено низкой циторедукцией заболевания с помощью миелоаблативного кондиционирования и отсутствия связанного с GVHD эффекта "трансплантат против лейкоза" (GVL) [Munchel A et al., Pediatric Reports (2011) 3:43-47].

Были предприняты дополнительные подходы для достижения стабильного приживления трансплантата аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, некоторые из них описаны в заявке на выдачу патента США №20110110909, заявке на выдачу патента США №20050118142, заявке на выдачу патента США №20070098693, патент США №5876692, патент США №5514364, патент США №6217867, патент США №5635156, заявке на выдачу патента США №20060140912, заявке на выдачу патента США №20040005300, заявке на выдачу патента США №20070141027, заявке на выдачу патента США №20030017152, заявке на выдачу патента США №20030165475 и заявке на выдачу патента США №20010009663.

Сущность изобретения

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъект нуждающийся в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных (обедненных Т-клетками) незрелых гемопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, включающего: (i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства; (ii) иммобилизацию незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с антителом, меченным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля; (iii) отмывку матрицы для удаления несвязанных клеток; и (iv) удаление магнитного поля для элюирования связанных клеток из матрицы; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, причем способ включает: (а) трансплантацию в подвергнутый кондиционированию субъект дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, включающего: (i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства; (ii) иммобилизацию незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с антителом, меченным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля; (iii) отмывку матрицы для удаления несвязанных клеток; и (iv) удаление магнитного поля для элюирования связанных клеток из матрицы; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, причем способ включает: (а) кондиционирование субъекта согласно протоколу кондиционирования сниженной интенсивности, причем кондиционирование сниженной интенсивности включает в себя тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство; (b) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, включающего: (i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства; (ii) иммобилизацию незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с антителом, меченным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля; (iii) отмывку матрицы для удаления несвязанных клеток; и (iv) удаление магнитного поля для элюирования связанных клеток из матрицы; и впоследствии (с) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, полученных от несингенного донора, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, включающего: (i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства; (ii) иммобилизацию незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с антителом, меченным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля; (iii) отмывку матрицы для удаления несвязанных клеток; и (iv) удаление магнитного поля для элюирования связанных клеток из матрицы; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым индуцируя донор-специфическую толерантность у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем сепарацию Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток осуществляют на основании продукта, секретируемого Т-клетками; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из 4-1ВВ, FoxP3, CD154, CD4, CD8, CD25, GITR CD137, латентного TGF-бета (LAP), GARP (LRRC32) и CD121a/b; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, причем способ включает: (а) трансплантацию подвергнутому кондиционированию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем сепарацию Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток осуществляют на основании продукта, секретируемого Т-клетками; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, причем способ включает: (а) трансплантацию подвергнутому кондиционированию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из 4-1ВВ, РохР3, CD154, CD4, CD8, CD25, GITR CD137, латентного TGF-бета (LAP), GARP (LRRC32) и CD121a/b; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, причем способ включает: (а) кондиционирование субъекта согласно протоколу кондиционирования сниженной интенсивности, причем кондиционирование сниженной интенсивности включает в себя тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство; (b) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем сепарацию Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток осуществляют на основании продукта, секретируемого Т-клетками; и впоследствии (с) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, причем способ включает: (а) кондиционирование субъекта согласно протоколу кондиционирования сниженной интенсивности, причем кондиционирование сниженной интенсивности включает в себя тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство; (b) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из 4-1ВВ, FoxP3, CD154, CD4, CD8, CD25, GITR CD137, латентного TGF-бета (LAP), GARP (LRRC32) и CD121a/b; и впоследствии (с) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, полученных от несингенного донора, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем сепарацию Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток осуществляют на основании продукта, секретируемого Т-клетками; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым индуцируя донор-специфическую толерантность у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток, полученных от несингенного донора, причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают путем сепарации Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из 4-1ВВ, РохР3, CD154, CD4, CD8, CD25, GITR CD137, латентного TGF-бета (LAP), GARP (LRRC32) и CD121a/b; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым индуцируя донор-специфическую толерантность у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает кондиционирование субъекта в режиме кондиционирования сниженной интенсивности перед стадией (а).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает кондиционирование субъекта с помощью in vivo Т-клеточной циторедукции перед стадией (а).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения доза без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток содержит 5-40×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения доза без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток содержит по меньшей мере приблизительно 10×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки выбраны из группы, состоящей из без-Т-клеточных клеток костного мозга, без-Т-клеточных мобилизированных G-CSF клеток - предшественников гемопоэза из периферической крови, без-Т-клеточной пуповинной крови, очищенных CD34+ клеток, полученных путем положительной селекции из костного мозга и/или из мобилизированных G-CSF клеток - предшественников гемопоэза из периферической крови, и ex vivo размноженных CD34⁺ клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки получают путем MACS™.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, когда поверхностный маркер представляет собой Т-клеточный поверхностный маркер, несвязанные клетки содержат без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения Т-клеточный поверхностный маркер выбран из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, когда поверхностный маркер представляет собой поверхностный маркер незрелых гематопоэтических клеток, связанные клетки содержат без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения поверхностный маркер незрелых гематопоэтических клеток выбран из группы, состоящей из CD34, CD33 и CD131.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает сепарацию В-клеток от без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток с применением антитела, которое специфически связывается с В-клеточным поверхностным маркером.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения В-клеточный поверхностный маркер выбран из группы, состоящей из CD19 и CD20.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения матрица представляет собой ферромагнитную матрицу.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения матрица содержит сферы из магнитно-чувствительного или ферромагнитного материала.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения магнитно-чувствительное средство содержит суперпарамагнитную частицу.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения суперпарамагнитная частица конъюгирована с антителом в комбинации со специфической к антииммуноглобулину, авидину и/или антигаптену микрочастицей.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сепарацию Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток осуществляют с использованием сепарации в высокоградиентном магнитном поле (HGMS).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сепарацию Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток осуществляют с использованием разделительной колонки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело выбрано из группы, состоящей из антитела к CD8, антитела к CD4, антитела к CD3, антитела к CD2, антитела к TCRα/β, антитела к CD19 и антитела к CD20, антитела к CD21, антитела к CD34, антитела к CD33 и антитела к CD131.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения без-Т-клеточные незрелые гематопоэтические клетки получают от несингенного донора.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения несингенный донор является аллогенным или ксеногенным по отношению к субъекту.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения аллогенный донор выбран из группы, состоящей из совместимого по HLA сибса, совместимого по HLA неродственного донора, гаплоидентичного по HLA родственного донора и донора, проявляющего одну или несколько различных HLA-детерминант.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения субъект представляет собой субъекта - человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения in vivo Т-клеточную циторедукцию осуществляют с помощью антител.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела включают в себя по меньшей мере одно из антитела к CD8, антитела к CD4, антитела - антитимоцитарного глобулина (ATG), антитела к CD52 и антитела к CD3 (ОКТ3).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кондиционирование сниженной интенсивности включает немиелоаблативное кондиционирование.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения немиелоаблативное кондиционирование включает в себя по меньшей мере одно из тотального облучения тела (TBI), тотального облучения лимфоидной ткани (TLI), химиотерапевтического средства и/или иммунотерапии антителами.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения TBI включает дозу однократного или фракционированного облучения в пределах диапазона, выбранного из группы, состоящей из 1-7,5 Гр и 1-3,5 Гр.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения химиотерапевтическое средство содержит по меньшей мере одно из бусульфана, флударабина, мелфалана и тиотепы.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело включает в себя по меньшей мере одно из антитела к CD52, антитела - антитимоцитарного глобулина (ATG) и антитела к CD3 (ОКТ3).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения концентрация циклофосфамида составляет приблизительно 100-200 или приблизительно 100 мг на кг массы тела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения циклофосфамид вводят в однократной дозе или в двух дозах.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения каждая из двух доз содержит концентрацию, составляющую приблизительно 50 мг на кг массы тела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения каждую из двух доз вводят в дни 3 и 4 после стадии (а).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения субъект характеризуется наличием злокачественного заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения злокачественное заболевание представляет собой гемопоэтическую злокачественную опухоль.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения субъект характеризуется наличием незлокачественного заболевания.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клеточный или тканевой трансплантат содержит незрелые гемопоэтические клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клеточный или тканевой трансплантат выбран из группы, состоящей из печени, поджелудочной железы, селезенки, почки, сердца, легкого, кожи, кишечника и лимфоидной/гемопоэтической ткани или органа.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клеточный или тканевой трансплантат трансплантируют субъекту до, одновременно или после трансплантации дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток субъекту.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клеточный или тканевой трансплантат включает котрансплантацию нескольких органов.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клеточный или тканевой трансплантат и без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки получают от одного донора.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сепарацию осуществляют с использованием антитела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело соединяют с флуоресцентным красителем, гаптеном или магнитной частицей.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сепарацию проводят с использованием проточной цитометрии или магнитной сортировки клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения магнитная сортировка клеток включает в себя MACS™.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сепарация Т-клеток от незрелых гематопоэтических клеток, основанная на продукте, секретируемом Т-клетками, включает в себя сепарацию Т-клеток, меченных с помощью продукта секреции, причем Т-клетки соединили с обеспечивающим захват фрагментом, который специфически связывает продукт, секретируемый Т-клетками и причем Т-клетки культивировали в условиях, при которых продукт секретируется и связывается с обеспечивающим захват фрагментом, тем самым получая Т-клетки, меченные с помощью продукта секреции, причем Т-клетки не лизируют с помощью указанного способа, и причем продукт секреции метят с помощью фрагмента - метки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает сепарацию В-клеток от без-Т-клеточных незрелых гематопоэтических клеток на основании продукта, секретируемого В-клетками, включая в себя сепарацию В-клеток, меченных с помощью продукта секреции, причем В-клетки соединили с обеспечивающим захват фрагментом, который специфически связывает продукт, секретируемый В-клетками и причем В-клетки культивировали в условиях, при которых продукт секретируется и связывается с обеспечивающим захват фрагментом, тем самым получая В-клетки, меченные с помощью продукта секреции, причем В-клетки не лизируют с помощью указанного способа и причем продукт секреции метят с помощью фрагмента - метки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения продукт секреции представляет собой цитокин, антитело или гормон.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения продукт секреции выбран из группы, состоящей из IFN-γ, IL1, IL2, IL4, IL10, IL12, TGF-β, TNF, GM-CSF и SCF.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения обеспечивающий захват фрагмент соединяют с Т-клетками или В-клетками через якорный фрагмент.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения обеспечивающий захват фрагмент представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело является биспецифическим.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело направлено против Т-клеточного или В-клеточного поверхностного маркера.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фрагмент - метка представляет собой антитело, специфическое для продукта секреции.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения фрагмент - метка связана с фторхроматом, является намагничиваемой или содержит магнитные частицы.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело выбрано из группы, состоящей из антитела к CD8, антитела к CD4, антитела к CD3, антитела к CD2, антитела к TCRα/β, антитела к CD 19, антитела к CD20, антитела к CD21, антитела к CD34, антитела к CD33 и антитела к CD131.

Будет понятно, что настоящее раскрытие может использоваться с такими другими допустимыми протоколами, как протоколы, описанные в РСТ публикациях №№ WO 2001/49243, WO 2007/023491 и WO 2010/049935, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Если иное не указано, все используемые в настоящем документе технические и/или научные термины имеют такие же значения, которые обычно подразумеваются под ними в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Несмотря на то, что способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей области техники, могут использоваться на практике или при испытании вариантов осуществления настоящего изобретения, ниже описаны иллюстративные способы и материалы. В случае конфликта настоящее описание изобретения, включая в себя определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными, и не подразумевается, что они являются в обязательном порядке ограничивающими.

Краткое описание чертежей

В настоящем документе описаны некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, исключительно в качестве примера, со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Делая конкретную ссылку на подробные графические материалы, подчеркивают, что показанные детали представлены исключительно для примера и с целью иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В связи с этим, настоящее описание, рассматриваемое совместно с графическими материалами, показывает специалистам в настоящей области техники, как можно осуществить на практике варианты осуществления настоящего изобретения.

На графических материалах:

На фигурах 1А-В представлены графики, иллюстрирующие долгосрочное приживление трансплантата костного мозга (ВМ) несовместимого донора после трансплантации "мегадозы" строго без-Т-клеточного ВМ и введения циклофосфамида после трансплантации. Мышей подвергали кондиционированию с помощью Т-клеточной циторедукции (TCD) с использованием антител к CD4 и CD8, в день -6, и подвергая воздействию 2,0 Гр тотального облучения тела (TBI) в день -1. Циклофосфамид в высокой дозе (CY, 100 мг/кг) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации. Донорский химеризм оценивали через 35 дней (фиг. 1А) и 95 дней (фиг. 1В) после трансплантации.

На фигурах 2А-С представлены точечные диаграммы, иллюстрирующие типичный анализ химеризма с помощью FACS. На фигуре 2С показано, что смешанный химеризм достигался у реципиентов, которым трансплантировали "мегадозу" (25×10⁶) строго без-Т-клеточного ВМ и которым вводили высокую дозу CY. Напротив, мыши - реципиенты, которые получали только протокол кондиционирования (фиг. 2А) или которым инокулировали только 5×10⁶ клеток ВМ и CY, не проявляли донорский химеризм (фиг. 2В).

На фиг. 3 представлен график, иллюстрирующий долгосрочный смешанный химеризм через 180 и 225 дней после трансплантации у мышей - реципиентов, которым трансплантировали "мегадозу" (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ и вводили высокую дозу CY. Следует отметить, что мыши которым инокулировали 5×10⁶ без-Т-клеточный ВМ и CY, не проявляли смешанный химеризм.

На фигурах 4А-В проиллюстрирована трансплантация кожных трансплантатов от линии донорского типа или независимой линии химерным мышам. На фиг. 4А представлен трансплантат, иллюстрирующий приживление (обозначенный "+") или отторжение (обозначенный "-") кожных трансплантатов от линии донорского типа (Balb/c) или независимой линии (C57BL/6) у реципиентов регулярной дозы (5×10⁶) или "мегадозы" (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ, которым вводили высокую дозу CY в дни +3 и +4 после трансплантации. На фиг. 4В представлена фотография кожного трансплантата от линии донорского типа (Balb/c) (белая шерсть) или независимой линии (C57BL/6) (черная шерсть) у реципиентов "мегадозы" (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ, которым вводили высокую дозу CY в дни +3 и +4 после трансплантации.

На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий эффект различных доз облучения на донорский химеризм у мышей - реципиентов "мегадозы" (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ и получивших высокую дозу CY после трансплантации.

На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий эффект повышенных доз циклофосфамида (CY) на донорский химеризм у реципиентов "мегадозы" (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ и 2 Гр TBI.

На фиг. 7 представлен график, иллюстрирующий приживление трансплантата ВМ несовместимого донора, достигнутое путем комбинации "мегадозы" CD8⁺ без-Т-клеточного ВМ и посттрансплантационного введения CY. Следует отметить, что удаление отсаточных CD8⁺ Т-клеток из препарата ВМ не оказывало никакого неблагоприятного воздействия на уровень химеризма, достигнутый при комбинации "мегадозы" клеток без-Т-клеточного ВМ с посттрансплантационным введением CY.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение согласно его некоторым вариантам осуществления относится к комбинированной терапии для достижения стабильной и долговременной клеточной или тканевой трансплантации.

Принципы и действие настоящего изобретения могут стать более понятными со ссылкой на графические материалы и сопутствующие описания.

Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения следует понять, что настоящее изобретение не обязательно ограничено в указанном применении деталями, изложенными в последующем описании или проиллюстрированными с помощью примеров. Настоящее изобретение включает другие варианты осуществления, или оно может осуществляться на практике или может быть выполнено различными путями. Кроме того, следует понимать, что фразеология и терминология в настоящем документе представлена с целью описания и не должна рассматриваться как ограничивающая.

Применение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) было ограничено отсутствием доступных HLA-совместимых доноров в семье или в международных регистрах неродственных доноров - добровольцев. Напротив, фактически все пациенты, нуждающиеся в трансплантации, имеют несовместимого в отношении полного гаплотипа родственного донора.

Основные препятствия при трансплантации костного мозга от не полностью совместимых по гаплотипу родственных доноров представляли собой реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD) и отторжение трансплантата. Применение очень больших количеств гемопоэтических стволовых клеток с минимальной примесью остаточных Т-клеток и агрессивным иммуносупрессорным и миелоаблативным режимом привело в высоким показателям приживления трансплантата с незначительной GVHD тяжелой степени. Тем не менее, восстановление иммунной системы было замедленным и не полным после применения указанного подхода, и значительный показатель связанной с трансплантацией смертности (TRM) обусловлен оппортунистическими инфекциями.

При применении настоящего изобретения на практике авторы настоящего изобретения обнаружили, что успешное приживление трансплантата несовместимого костного мозга может быть достигнуто путем трансплантации строго без-Т-клеточной "мегадозы" костного мозга и последующего введения субъекту высокой дозы циклофосфамида вскоре после трансплантации. Авторы настоящего изобретения показали, что при таком режиме требуется лишь кратковременный режим иммуномиелоаблативного кондиционирования. Авторы настоящего изобретения также показали, что такая процедура трансплантации приводит к долговременному и стабильному химеризму, и что достигалась иммунологическая толерантность.

Как показано ниже в настоящем документе и в разделе "Примеры", который приведен ниже, посредством трудоемких экспериментов авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация трансплантации "мегадозы" без-Т-клеточного костного мозга (TDBMT) и посттрансплантационного введения высокой дозы циклофосфамида (CY) обеспечивает долгосрочное приживление трансплантата костного мозга несовместимого донора (смотрите фигуры 1А-В и 2А-С). Долгосрочный смешанный химеризм наблюдался в течение пролонгированных периодов времени после трансплантации (через 180 и 225 дней после трансплантации у мышей, смотрите фигуру 3). Важно, что комбинация "мегадозы" TDBMT и высокой дозы CY после трансплантации обеспечивала приживление трансплантата гемопоэтических стволовых клеток в режиме кондиционирования сниженной интенсивности (смотрите фигуру 5) и приводила к индукции толерантности, на что указывает приживление кожных трансплантатов донора (смотрите фигуру 4 В).

Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Используемый в настоящем документе термин "лечение" включает в себя устранение, существенное ингибирование, замедление или обратное прогрессирование состояния, существенное улучшение клинических или эстетических симптомов состояния или существенное предотвращение появления клинических или эстетических симптомов состояния.

Используемый в настоящем документе термин "субъект" или "субъект, нуждающийся в этом" относится к млекопитающему, предпочтительно человеку, мужской или женской особи любого возраста, которая нуждается в клеточной или тканевой трансплантации. Как правило, субъект нуждается в клеточной или тканевой трансплантации (также в настоящем документе называемый реципиент) вследствие нарушения или патологического или нежелательного заболевания, состояния или синдрома или физической, морфологической или физиологической аномалии, которая подвергается лечению посредством клеточной или тканевой трансплантации.

Согласно одному варианту осуществления субъект нуждается в регенерации ткани (твердой или мягкой ткани), например, вследствие старения, травмы, раны или любого патологического состояния, которое приводит к потере функциональности органа.

Согласно одному варианту осуществления субъект характеризуется наличием злокачественного заболевания.

Согласно одному варианту осуществления злокачественное заболевание представляет собой гемопоэтическую злокачественную опухоль.

Иллюстративные гемопоэтические злокачественные опухоли включают в себя без ограничения следующее: острый лимфобластный лейкоз (ALL), Т-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (T-ALL), острый миелоцитарный лейкоз (AML), острый нелимфобластный лейкоз (ANLL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелоцитарный лейкоз (CML), Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома, экстранодальная NK/T-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома кожи, энтеропатическая Т-клеточная лимфома, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, анапластическая крупноклеточная Т/0-клеточная лимфома, подкожная панникулитоподобная Т-клеточная лимфома, неспецифическая Т-клеточная лимфома, диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (DLBCL), В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (В-CLL)/хронический лимфоидный лейкоз (CLL), хронический лимфоцитарный лейкоз/мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, экстранодальные В-клеточные лимфомы маргинальной зоны - лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, фолликулярная лимфома, лимфома из клеток мантийной зоны, нодальная В-клеточная лимфома маргинальной зоны, лимфома Беркитта, волосатоклеточный лейкоз, первичная лимфома центральной нервной системы, В-клеточная лимфома маргинальной зоны селезенки, лимфоплазмоцитарная лимфома, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома, лейкоз/лимфома из предшественников Т-клеток, MALT-лимфома, грибовидный микоз и множественная миелома.

Согласно одному варианту осуществления гемопоэтическая злокачественная опухоль включает в себя лейкоз или лимфому.

Согласно одному варианту осуществления субъект характеризуется наличием незлокачественного заболевания.

Согласно одному варианту осуществления незлокачественное заболевание представляет собой генетическое заболевание или нарушение, аутоиммунное заболевание или метаболическое нарушение.

Иллюстративные незлокачественные заболевания включают в себя без ограничения следующее: синдромы тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID), серповидноклеточная болезнь (серповидноклеточная анемия), наследственный агранулоцитоз, тромбоцитопения, апластическая анемия (например, тяжелая апластическая анемия), миелодиспластический синдром, моносомия 7, врожденный остеосклероз, болезнь Гоше, болезнь Гурлера, метахроматическая лейкодистрофия, адренальная лейкодистрофия, талассемия, врожденная или наследственная гемопоэтическая аномалия, недостаточность аденозиндезаминазы (ADA), волчанка, аутоиммунный гепатит, глютеновая энтеропатия, сахарный диабет I типа, диффузный токсический зоб, синдром Гийена-Барре, тяжелая миастения, ревматоидный артрит, склеродермия и псориаз.

Согласно одному варианту осуществления субъект настоящего изобретения может страдать от любого из следующего: сердечно-сосудистое заболевание, ревматоидное заболевание, заболевание железы секреции, заболевание желудочно-кишечного тракта, кожное заболевание, заболевание печени, нейрологическое заболевание, заболевание мышц, заболевание почек, заболевание соединительной ткани, системное заболевание и/или связанное с репродукцией заболевание, подлежащее лечению путем клеточной или тканевой трансплантации.

Используемая в настоящем документе фраза "клеточный или тканевой трансплантат" относится к клетке (например, отдельной клетке или группе клеток) или ткани организма (например, твердым тканям или мягким тканям, которые можно трансплантировать полностью или частично). Иллюстративные ткани, которые можно трансплантировать согласно настоящему раскрытию, включают в себя без ограничения ткани печени, поджелудочной железы, селезенки, почки, сердца, легкого, кожи, кишечника и лимфоидные/гемопоэтические ткани (например, лимфатический узел, пейеровы бляшки, тимус или костный мозг). Иллюстративные клетки, которые можно трансплантировать согласно настоящему раскрытию, включают в себя без ограничения незрелые гемопоэтические клетки, включая в себя стволовые клетки. Настоящее изобретение также включает трансплантацию целых органов, таких как, например, почка, сердце, легкое, печень, поджелудочная железа или селезенка.

Согласно одному варианту осуществления клеточный или тканевой трансплантат содержит незрелые гемопоэтические клетки.

Согласно одному варианту осуществления способ осуществляют с использованием клетки или ткани, которая является несингенной по отношению к субъекту.

В зависимости от применения способ можно осуществить с использованием клеточного или тканевого трансплантата, который является аллогенным или ксеногенным по отношению к субъекту.

Используемый в настоящем документе термин "аллогенный" относится к клетке или ткани, которая получена от донора, относящегося к тому же виду, что и субъект, но которая является по существу неклональной по отношению к субъекту. Как правило, аутбредные млекопитающие - незиготные близнецы одного вида являются аллогенными друг другу. Следует понимать, что аллогенный донор может являться HLA-идентичным или HLA-неидентичным (т.е. проявляющим одну или несколько различных HLA-детерминант) по отношению к субъекту.

Согласно одному варианту осуществления аллогенный донор представляет собой совместимого в отношении HLA сибса, совместимого в отношении HLA неродственного донора, гаплоидентичного по HLA родственного донора или донора, проявляющего одну или несколько различных HLA-детерминант.

Используемый в настоящем документе термин "ксеногенный" относится к клетке или ткани, которая по существу экспрессирует антигены другого вида относительно вида значительной части лимфоцитов субъекта. Как правило, аутбредные млекопитающие различных видов являются ксеногенными относительно друг друга.

Настоящее изобретение включает, что ксеногенные клетки или ткани происходят из разнообразных видов, таких как без ограничения крупный рогатый скот (например, корова), непарнокопытные (например, лошадь), свиньи (например, поросенок), козьи (например, коза, овца), кошачьи (например, Felis domestica), псовые (например, Cams domestica), грызуны (например, мышь, крыса, кролик, морская свинка, песчанка, хомяк) или приматы (например, шимпанзе, макак-резус, макак, мартышка).

Клетки или ткани ксеногенного происхождения (например, свиного происхождения) предпочтительно получают из источника, который, как известно, не содержит такие зоонозы, как свиные эндогенные ретровирусы. Аналогично, происходящие от человека клетки или ткани предпочтительно получают из по существу непатогенных источников.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения как субъект, так и донор являются людьми.

В зависимости от применения и доступных источников клеточный или тканевой трансплантат согласно настоящему изобретению можно получить от пренатального организма, постнатального организма, взрослого или трупного донора. Более того, в зависимости от требуемого применения клеточный или тканевой трансплантат может быть нативным или генетически модифицированным. Определение типа клеточного или тканевого трансплантата, подлежащего использованию, будет находиться в компетенции специалиста в настоящей области техники. Кроме того, любой известный в настоящей области техники способ может использоваться для получения клеточного или тканевого трансплантата (например, для трансплантации).

Как указано, дозу без-Т-клеточных гемопоэтических клеток или ткани, содержащей незрелые гемопоэтические клетки (включая в себя, например, CD34⁺), трансплантируют субъекту.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки являются несингенными (например, аллогенными или ксеногенными) по отношению к субъекту.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки и клеточный или тканевой трансплантат являются сингенными (например, получены от одного донора).

Используемая в настоящем документе фраза "незрелые гемопоэтические клетки" относится к препарату гемопоэтической ткани или клеток, содержащему гемопоэтические клетки - предшественники. Такой тканевой/клеточный препарат включает в себя или получен из биологического образца, например, костного мозга, мобилизированной периферической крови (например, мобилизация CD34-клеток для увеличения их концентрации), пуповинной крови (например, пупочного канатика), фетальной печени, желточного мешка и/или плаценты. Кроме того, очищенные CD34+ клетки или другие гемопоэтические стволовые клетки, такие как CD131+ клетки, могут использоваться в соответствии с настоящим раскрытием, либо с ex vivo размножением, либо без него.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки.

Используемая в настоящем документе фраза "без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки" относится к популяции гемопоэтических клеток, которые подвергли деплеции по Т-лимфоцитам. Без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки могут включать в себя, например, CD34+, CD33+ и/или CD56+ клетки. Без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки можно подвергать деплеции по CD3+ клеткам, CD2+ клеткам, CD8+ клеткам, CD4+ клеткам, α/β Т-клеткам и/или γ/δ Т-клеткам.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат без-Т-клеточные мобилизированные G-CSF клетки крови, обогащенные CD34⁺ незрелыми гемопоэтическими клетками.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки подвергают деплеции по CD3+ Т-клеткам.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 50×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 40×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 30×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 20×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 15×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 10×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 9×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 8×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 7×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 6×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 4×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 3×10⁵ CD3⁺ Т-клеток, 2×10⁵ CD3⁺ Т-клеток или 1×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ Т-клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 20×10⁵ CD3⁺ Т-клетки, но больше чем 10 CD3⁺ Т-клеток.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат по меньшей мере 1×10³-1×10⁵ CD3⁺ Т-клеток.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки подвергают деплеции по CD8+ клеткам.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 1×10⁴-4×10⁵ CD8⁺ клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 50×10⁵ CD8⁺ клеток, 25×10⁵ CD8⁺ клеток, 15×10⁵ CD8⁺ клеток, 10×10⁵ CD8⁺ клеток, 9×10⁵ CD8⁺ клеток, 8×10⁵ CD8⁺ клеток, 7×10⁵ CD8⁺ клеток, 6×10⁵ CD8⁺ клеток, 5×10⁵ CD8⁺ клеток, 4×10⁵ CD8⁺ клеток, 3×10^s CD8⁺ клеток, 2×10⁵ CD8⁺ клеток, 1×10⁵ CD8⁺ клеток, 9×10⁴ CD8⁺ клеток, 8×10⁴ CD8⁺клеток, 7×10⁴ CD8⁺ клеток, 6×10⁴ CD8⁺ клеток, 5×10⁴ CD8⁺ клеток, 4×10⁴ CD8⁺ клеток, 3×10⁴ CD8⁺ клеток, 2×10⁴ CD8⁺ клеток или 1×10⁴ CD8⁺ клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 4×10⁵ CD8⁺ клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 4×10⁵ CD8⁺ клетки, но больше чем 10 CD8⁺ клеток.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 1×10 CD8⁺ TCRα/β^- клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 0,5×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 1×10⁵ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 0,5×10⁵ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 1×10⁴ CD8⁺TCRα/β^- клеток, 0,5×10⁴ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 1×10³ CD8⁺ TCRα/β^- клеток или 0,5×10³ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, но больше чем 10 CD8⁺ TCRα/β^- клеток.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки подвергают деплеции по В-клеткам.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки подвергают деплеции по В-клеткам (CD19+ и/или CD20+ В-клеткам).

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 50×10⁵ В-клеток, 40×10⁵ В-клеток, 30×10⁵ В-клеток, 20×10⁵ В-клеток, 10×10⁵ В-клеток, 9×10⁵ В-клеток, 8×10⁵ В-клеток, 7×10⁵ В-клеток, 6×10⁵ В-клеток, 5×10⁵ В-клеток, 4×10⁵ В-клеток, 3×10⁵ В-клеток, 2×10⁵ В-клеток или 1×10⁵ В-клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 4×10⁵ В-клеток на кг массы тела субъекта. Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 50×10⁵ В-клеток, но больше чем 10 В-клеток.

Деплецию Т-клеток, например, CD3+, CD2+, TCRα/β+, CD4+ и/или CD8+ клеток, или В-клеток, например, CD19+ и/или CD20+ клеток, можно провести с использованием любого известного в настоящей области техники способа, например, путем эрадикации (например, цитолиза) с помощью специфических антител или путем основанного на аффинности очищения, например, с применением магнитно-активированной клеточной сортировки (MACS™), доступной от Miltenyi Biotec (описанной подробнее в настоящем документе ниже), сортера FACS и/или мечения на основе ELISA с захватом.

Такие способы описаны в настоящем документе и в THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1-4, (D.N. Weir, editor) и FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor. Springer Verlag, 1992). Например, клетки можно отсортировать, например, путем проточной цитометрии или FACS. Таким образом, может использоваться сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) и она может характеризоваться варьирующими углами каналов цветового сигнала, каналами обнаружения светорассеяния под малыми и тупыми углами и каналами сопротивления. Любые известные в настоящей области техники лиганд-зависимые техники сепарации могут использоваться совместно с техниками как положительного, так и отрицательного сепарации, которые основаны на физических свойствах клеток, а не на аффинности антител, включая в себя без ограничения элютриацию и центрифугирование в градиенте плотности.

Другие способы сортировки клеток включают в себя, например, пэннинг и сепарацию с использованием техник на основе аффинности, включая в себя те техники, в которых используются такие твердые подложки, как планшеты, гранулы и колонки. Таким образом, биологические образцы можно разделить путем "пэннинга" с антителом, прикрепленным к твердой матрице, например, к планшету.

Альтернативно, клетки можно отсортировать/разделить с помощью техник магнитного сепарации, и некоторые из этих способов используют магнитные микрочастицы. Различные магнитные микрочастицы доступны из ряда источников, включая в себя, например, включая в себя, например, Dynal (Норвегия), Advanced Magnetics (Кэмбридж, Массачусетс, США), Immuncon (Филадельфия, США), Immunotec (Марсель, Франция), Invitrogen, Stem cell Technologies (США), Cellpro (США) и Miltenyi Biotec GmbH (Германия). Альтернативно, антитела могут быть биотинилированы или конъюгированы с дигоксигенином и использованы в сочетании с авидином или покрытыми антителами к дигоксигенину аффинными колонками.

Согласно одному варианту осуществления различные способы деплеции/сепарации могут комбинировать, например, магнитную сортировку клеток могут комбинировать с FACS для увеличения качества сепарации или для обеспечения сортировки по множественным параметрам.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки получают путем Т-клеточной циторедукции (TCD).

Т-клеточную циторедукцию можно осуществить с использованием антител, включающих в себя, например, антитела к CD8, антитела к CD4, антитела к CD3 антитела к CD2, антитела к TCRα/β и/или антитела к TCRγ/δ.

Согласно одному варианту осуществления деплецию В-клеток осуществляют путем В-клеточной циторедукции.

В-клеточную циторедукцию можно осуществить с использованием антител, включающих в себя например, антитела к CD19 или к CD20. Альтернативно, циторедукцию in vivo В-клеток можно осуществить путем инфузии антител к CD20.

Альтернативно, положительную селекцию CD34+ или CD131+ стволовых клеток можно провести с использованием, например, техник магнитного сепарации клеток (например, MACS™), сортера FACS и/или мечение на основе ELISA с захватом, как описано подробнее выше.

Ниже представлены неограничивающие примеры деплеции популяций представляющих интерес клеток (например, Т и/или В-клеток) из незрелых гематопоэтических клеток согласно настоящему изобретению перед их трансплантацией:

I. Сепарация активированных регуляторных Т-хелперных клеток согласно раскрытию РСТ публикации № WO 2007/110249 и патенту США №8129126, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки:

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ сепарации активированных регуляторных CD4+CD25+ Т-хелперных (Th) клеток из клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) с использованием рецептора 4-1ВВ.

Регуляторные клетки могут идентифицировать и/или сепарировать посредством экспрессии одного и/или нескольких маркеров. Для этой цели можно использовать любой маркер, известный специалисту в настоящей области техники для идентификации и/или сепарации. Иллюстративные маркеры представляют собой 4-1ВВ, CD25, CTLA-4 (антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов), GITR (индуцированный глюкокортикоидом рецептор TNF), FoxP3, IL-10, CD69, CD40L, ICOS, ОХ40 и TGF-бета, которые используют отдельно и/или в комбинации. Также для этой цели возможно использование всех маркеров, известных специалисту в настоящей области техники для удаления или деплеции нерегуляторных клеток в комбинации. Тем не менее, согласно конкретному варианту осуществления, рецептор 4-1ВВ (CD137) используют в качестве маркера живых, активированных регуляторных клеток.

II. Сепарация регуляторных Т-клеток или нерегуляторных Т-клеток согласно раскрытию заявки на выдачу патента США №20110097313, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки:

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ сепарации регуляторных Т-клеток (Treg) или нерегуляторных Т-клеток (обычных Т-клеток) из клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) с применением молекулы CD154 [лиганда CD40 (CD40L)].

Поскольку активированные Treg-клетки (CD4+CD25+ Treg) не экспрессируют CD154, настоящее изобретение включает сепарацию между активированными (например, активированными антигеном) обычными Т-клетками (CD154+ клеток) и Treg (CD154-клетками) с использованием средства, способного распознавать CD154 (например, антитела к CD154).

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение включает способ сепарации активированных Treg-клеток из клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) с использованием средства, способного распознавать CD154. Настоящее изобретение дополнительно включает применение дополнительных маркеров, которые являются специфическими для регуляторных Т-клеток, таких как, например, CD25, GITR, CTLA4, или маркеров, которые являются специфическими для активированных регуляторных Т-клеток, таких как, например, CD137, "латентный TGF-бета (LAP)", GARP (LRRC32), CD121a/b для положительной селекции Treg.

Согласно другому варианту осуществления предусмотрен способ получения активированных обычных Т-хелперных (Th) клеток из клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) с использованием маркера CD154. В частности, использование маркера CD154 активированные обычные Th-клетки (экспрессирующие CD154 клетки) можно удалить из клеточного препарата (содержащего регуляторные Т-клетки), в частности, если дополнительные способы селекции с использованием маркеров для активированных/неактивированных регуляторных клеток (CD137 и CD25, соответственно) используют одновременно или последовательно, что обеспечивает возможность применения настоящего изобретения для идентификации и выделения антиген-специфических регуляторных Th-клеток.

Таким образом, после получения клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) от донора и/или субъекта, регуляторные Т-клетки можно обогатить с использованием, например, CD25. Эти клетки можно впоследствии стимулировать с помощью конкретного антигена. Для этой цели можно использовать антитела, пептиды, белки, химические вещества (или их смеси) или патогены или клетки. После конкретного времени активации регуляторные Th-клетки идентифицируют и/или сепарируют, например, посредством применения маркера CD137. Таким образом, антиген-специфические регуляторные Th-клетки предпочтительно идентифицируют и/или сепарируют.

III. Сепарация антиген-специфических Т-клеток согласно раскрытию патента США №7659084, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки:

Согласно одному варианту осуществления предусмотрено применение CD154 [лиганда CD40 (CD40L)] для выделения антиген-специфических Т-клеток, причем клеточный препарат (например, незрелые гематопоэтические клетки) приводят в контакт с ингибитором системы CD40/CD154.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения Т-клетки представляют собой Т-хелперные (Th) CD4+ или CD8+ Th-лимфоциты.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения обнаруживают и/или получают воспалительные, противовоспалительные, регуляторные и/или супрессорные Т-клетки.

Настоящее изобретение также относится к способу выделения антиген-специфических Т-клеток в клеточном препарате (например, незрелых гематопоэтических клетках) после активации с помощью антигена, причем в указанном способе клеточный препарат (например, незрелые гематопоэтические клетки) приводят в контакт с ингибитором системы CD40/CD154, осуществляют внутри- и/или внеклеточное определение CD154 и выделяют содержащие CD154 клетки.

Следует понимать, что такое "приведение в контакт" клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) с ингибитором системы CD40/CD154 обеспечивает внутри- и/или внеклеточное определение CD154 и, таким образом, выделение или сепарацию содержащих CD154 клеток, в частности, клеток, представляющих специфические к полному антигену CD4+ Th-лимфоциты.

В частности, добавление ингибитора системы CD40/CD154 нарушает или ингибирует взаимодействие и передачу сигналов между CD40 и CD154. Согласно настоящему изобретению ингибиторы системы CD40/CD154 могут представлять собой любые молекулы или даже факторы физического воздействия, способные блокировать или ингибировать взаимодействие между CD40 и CD154.

Соответственно, ингибирующее средство может представлять собой антитело, например, антитело, направленное против CD40, или направленное против CD154, молекулу, ион цезия или лития, характеризующиеся эффектом на взаимодействие между CD40 и CD154. Средство также может представлять собой вещество, ингибирующее секрецию или эндоцитоз в клетке, такое как брефелдин A (Bref-A) и/или монсенсин. Брефелдин А представляет собой метаболит гриба Penicillium brefeldianum и, будучи карбоксилированным ионофором, блокирует транспорт свежесинтезированных белков из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и нарушает обмен между эндосомами и лизосомами, при этом циркуляция между клеточной мембраной и эндосомами преимущественно остается ненарушенной.

Эти вещества гарантируют, что CD40, CD154, взаимодействие между двумя из них или система CD40/CD154 модифицированы таким образом, чтобы CD154 либо больше не регулируется отрицательно и/или не разрушается на клеточной поверхности, или, при условии, что он все еще находится внутри клетки, больше не транспортируется на клеточную поверхность. Это прерывание транспорта внутри клетки предотвращает разрушение CD154. Следовательно, CD154 стабилизируется внутри или вне клетки как внешний рецептор, тем самым обеспечивая обнаружение и последующее выделение с использованием способов обнаружения, хорошо известных специалистам в настоящей области техники (которые подробно объясняются в настоящем документе).

IV. Сепарация клеток согласно раскрытию РСТ публикации №WO 94/09117 и патента США №7166423, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки:

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ сепарации клеток (например, В-клеток или Т-клеток) из клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) на основании одного или нескольких продуктов, секретируемых из этих клеток (например, цитокинов, включая в себя без ограничения IFNγ, IL1, IL2, IL4, IL10, IL12, TGF-бета, TNF, GM-CSF и SCF, антител, гормонов, ферментов и белков). Способ включает захват продуктов, секретируемых клетками (например, В-клетками или Т-клетками), на поверхности клетки (например, В-клеток или Т-клеток). Захваченный продукт позволяет отсортировать клетку (например, В-клетки или Т-клетки) в соответствии с присутствием, отсутствием или количеством присутствующего продукта. Захватывающие средства содержат обеспечивающий захват фрагмент, который закреплен на клеточной поверхности средством, подходящим для клетки, подлежащей сортировке.

Обеспечивающий захват фрагмент можно соединить с якорными средствами ("якорным фрагментом") необязательно посредством линкера, и он также может включать в себя линкер, который увеличивает количество доступных обеспечивающих захват фрагментов и, таким образом, потенциального для захвата продукта, такого как разветвленные полимеры, включая в себя, например, модифицированные молекулы декстрана, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливиниловый спирт и поливинилпирролидон.

Подходящие якорные фрагменты для прикрепления к клеточной поверхности включают в себя такие липофильные молекулы, как жирные кислоты. Примеры подходящих молекул клеточной поверхности включают в себя без ограничения любую ассоциированную с клеточной поверхностью молекулу. Подходящие молекулы включают в себя без ограничения такие маркеры клеточной поверхности, как CD45 (маркер всех лейкоцитов), CD3 (Т-клетки (активирующий)), CD4, CD8, CD 19, CD20, CD14, CD16, CD15, молекулы МНС класса I и класса II, CD34, CD38, CD33, CD56 Т-клеточный рецептор, Fc-рецептор, бета-2-микроглобулин или иммуноглобулин и другие CD - маркеры или молекулы клеточной адгезии. Альтернативно, также могут использоваться антитела или другие средства, которые специфически связываются с молекулами клеточной поверхности, такие как антигены МНС или гликопротеины.

Конкретные партнеры по связыванию включают в себя обеспечивающие захват фрагменты и фрагменты - метки. Обеспечивающие захват фрагменты представляют собой фрагменты, которые прикрепляются как клетке, или напрямую, или опосредованно, так и к продукту. Фрагменты - метки представляют собой фрагменты, которые прикрепляются к продукту, и могут быть прямо или опосредованно помечены. Конкретные партнеры по связыванию включают в себя любой фрагмент, для которого существует относительно высокая аффинность и специфичность между продуктом и его партнером по связыванию, и у которого диссоциация комплекса продукт: партнер является относительно медленной, чтобы обнаружить комплекс продукт: партнер в ходе осуществления техники мечения или клеточной сепарации.

Конкретные фрагменты - метки могут включать в себя без ограничения связанные с фторхроматом антитела к продукту, которые могут включать в себя конъюгированные с магнитными микрочастицами, конъюгированные с коллоидными микрочастицами, конъюгированные с FITC, фикоэритрином, PerCP, AMCA, флуоресцентными частицами или липосомами антитела.

Конкретные партнеры по связыванию могут включать в себя без ограничения субстраты или аналоги субстратов, с которыми будет связываться продукт. Эти субстраты включают в себя без ограничения пептиды, полисахариды, стероиды, биотин, дигитоксин, дигитонин и другие молекулы, способные связывать секретируемый продукт, и согласно конкретному варианту осуществления будут включать в себя антитела. Когда обеспечивающий захват фрагмент представляет собой антитело, оно может иметь название "захватывающее антитело" или "улавливающее антитело". Предусмотрено, что используемый в настоящем документе термин "антитело" включает в себя поликлональное и моноклональное антитело.

Предусмотрено, что используемый в настоящем документе термин "антитело" включает в себя поликлональные и моноклональные антитела, химерные антитела, гаптены и фрагменты антител, биспецифические антитела и молекулы, которые являются эквивалентами антител в том смысле, что они специфически связываются с эпитопом на антигене продукта. Биспецифические антитела, также известные как бифункциональные антитела, содержат по меньшей мере один сайт распознавания антигена для первого антигена и по меньшей мере один сайт распознавания антигена для второго антигена. Такие антитела можно получить с помощью способов рекомбинантной ДНК и химически с помощью способов, известных в настоящей области техники. Химически созданные биспецифические антитела включают в себя без ограничения антитела, которые были уменьшены и перестроены так, чтобы сохранить свои бивалентные характеристики, и антитела, которые были химически соединены так, чтобы они содержали по меньшей мере два сайта распознавания антигена для каждого антигена. Биспецифические антитела включают в себя все антитела или конъюгаты антител или полимерные формы антител, которые способны распознавать два различных антигена. Антитела могут быть иммобилизированы на полимере или частице.

Согласно одному варианту осуществления обеспечивающий захват фрагмент может быть прикреплен к клеточной мембране различными способами. Подходящие способы включают в себя без ограничения прямое химическое соединение с аминогруппами белковых компонентов; соединение с тиолами (образованными после восстановления дисульфидных мостиков) белковых компонентов; опосредованное соединение посредством антител (включая в себя пары антител); заякоривание в липидном бислое посредством гидрофобного якорного фрагмента; и связывание с отрицательно заряженной клеточной поверхностью с помощью поликатионов.

Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения обеспечивающий захват фрагмент вводят с использованием двух или больше стадий, например, путем мечения клеток по меньшей мере с помощью одного якорного фрагмента, который обеспечивает соединение обеспечивающего захват фрагмента с якорным фрагментом либо напрямую, например, с помощью комплекса биотин/авидин, либо опосредованно через подходящий линкер или линкеры.

Способы прямого химического соединения антител с клеточной поверхностью известны в настоящей области техники и включают в себя, например, соединение с использованием активированных глутаральдегидом или малеимидом антител. Способы химического соединения с использованием многоэтапных процедур включают в себя, например, биотинилирование, соединение TNP или дигоксигенина с использованием, например, сложных эфиров сукцинимида этих соединений. Биотинилирование можно осуществить, например, путем применения D-биотинил-N-гидроксисукцинимида. Группы сукцинимида эффективно реагируют с аминогруппами при значениях рН выше 7 и предпочтительно от приблизительно рН 8,0 до приблизительно рН 8,5. Биотинилирование также можно осуществить, например, путем обработки клеток дитиотреитолом (DTT) с последующим добавлением биотинмалеимида.

Соединение с клетками также можно осуществить с использованием антител к антигенам клеточной поверхности ("маркерам"). Антитела, как правило, направленные к поверхностным антигенам, могут потребоваться в диапазоне, составляющем приблизительно 0,1-1 мкг антител на 10⁷ клеток, тем не менее, эта потребность будет широко варьировать в соответствии с аффинностью антитела к продукту, и ее будет необходимо определять эмпирически. Такое определение находится в пределах компетенции специалиста в настоящей области техники. Таким образом, соответствующее количество антитела необходимо определить эмпирически, и это находится в пределах компетенции специалиста в настоящей области техники. Это обеспечивает возможность соединения с конкретными клетками на основании экспрессии маркера, специфического для типа клеток. Например, можно специфически пометить такие классы клеток, как Т-клетки или их подклассы. В качестве обеспечивающего захват фрагмента можно использовать биспецифическое антитело, которое содержит сайт распознавания антигена для клетки или якорного фрагмента, расположенного на ней, и продукта.

Обеспечивающий захват фрагмент, в частности захватывающие антитела, должны быть выбраны на основании количества секретируемого продукта. Например, для клеток, которые секретируют только несколько молекул, высокоаффинное антитело должно быть выбрано так, чтобы захватывать большинство секретируемых молекул. Альтернативно, в случае, когда клетка секретирует множество молекул за время инкубации, антитело с пониженной аффинностью может быть предпочтительным для предотвращения слишком раннего насыщения захватывающей матрицы. Определение подходящих аффинностей для уровня секретируемых белков проводят эмпирически, и это находится в пределах компетенции специалиста в настоящей области техники.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения обеспечивающий захват фрагмент соединяют с клеткой гидрофобными якорными фрагментами для прикрепления к клеточной мембране. Подходящие гидрофобные якорные фрагменты, которые будут взаимодействовать с липидным бислоем мембраны, известны в настоящей области техники и включают в себя без ограничения жирные кислоты и неионные детергенты (включая в себя, например, Tween-80). Недостатком прикрепления обеспечивающего захват фрагмента к клетке посредством вставки якорного фрагмента является то, что скорость интеграции якорного фрагмента в клетку является медленной. Таким образом, зачастую необходимы высокие концентрации якорного фрагмента. Указанная ситуация часто является экономически неоправданной, когда обеспечивающий захват фрагмент представляет собой относительно ограниченное в количестве или дорогостоящее вещество, например, антитело. Низкий выход гидрофобных якорных фрагментов, которые внедряются в мембрану, является уместным только в случае, когда указанные молекулы доступны в относительно ограниченных количествах. Эту проблему можно преодолеть путем использования системы с образованием мостика, которая включает в себя якорный фрагмент и обеспечивающий захват фрагмент, причем один из фрагментов характеризуется повышенной доступностью, и причем две части системы с образованием мостика характеризуются высокой степенью специфичности и аффинности друг к другу. Например, согласно одному варианту осуществления авидин или стрептавидин прикрепляют к клеточной поверхности посредством гидрофобного якорного фрагмента, при этом обеспечивающий захват фрагмент представляет собой биотинилированное антитело к продукту.

Согласно другому варианту осуществления клеточную поверхность метят с помощью дигоксигенина, после чего биспецифическими антителами со специфичностью как к дигоксигенину, так и продукту. Этот подход могут использовать с другими парами молекул, способных образовывать связь, включая в себя, например, гаптен с антителами к гаптену или NTA с полигистидиновыми остатками. Конкретный вариант осуществления обеспечивает "амплификацию" системы путем увеличения количества обеспечивающих захват фрагментов на каждый якорный фрагмент.

Согласно одному иллюстративному варианту осуществления разветвленный декстран связывают с пальмитиновой кислотой, таким образом, обеспечивая множество доступных сайтов связывания. Декстран, в свою очередь, соединяют с биотином и обрабатывают конъюгированным с авидином антителом, специфическим для продукта. Разумеется, в вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что линкеры могут использоваться между якорным фрагментом и обеспечивающим захват фрагментом, когда якорный фрагмент соединяют любым способом с клеточной поверхностью. Таким образом, например, авидиновый (или стрептавидиновый) биотиновый линкер может связывать якорный фрагмент антитела с обеспечивающим захват фрагментом. Системы биспецифических антител также могут действовать в качестве линкеров.

Для селекции Т-клеток со способностью секретировать представляющий интерес продукт, клетки, модифицированные, как описано выше, чтобы они содержали обеспечивающий захват фрагмент, инкубируют в условиях, обеспечивающих продукцию и секрецию продукта в достаточном количестве для обеспечения связывания с клетками, которые содержат захваченный продукт, и их обнаружения. Эти условия известны специалистам в настоящей области техники и включают в себя, среди прочего, соответствующую температуру, рН и концентрации солей, факторов роста и субстратов в инкубационной среде, а также соответствующие концентрации газа в газообразной фазе. Если необходимо различить клетки с высокой и низкой продуктивностью, время инкубации является таким, чтобы секреция продукта клетками оставалась линейной. Соответствующие условия можно определить эмпирически, и такое определение находится в компетенции специалиста в настоящей области техники.

Кроме того, секрецию клетками можно модифицировать, т.е. положительно регулировать, индуцировать или снижать с использованием биологического модификатора. Подходящие биологические модификаторы включают в себя без ограничения молекулы и другие клетки. Подходящие молекулы включают в себя без ограничения лекарственные средства, цитокины, низкомолекулярные молекулы, гормоны, комбинации интерлейкинов и другие стимулирующие средства, например, биспецифические антитела и другие средства, которые модифицируют клеточные функции или экспрессию белков. Другие клетки включают в себя без ограничения прямые межклеточные взаимодействия, например, между опухолевой и Т-клеткой и опосредованные межклеточные взаимодействия, такие как взаимодействия, индуцируемые близким расположением к другим клеткам, которые секретируют биологический модификатор. Подходящие клетки включают в себя без ограничения клетки крови, периферические клетки костного мозга (РВМС) и различные клеточные линии. Биологические модификаторы можно добавлять в любое время, но предпочтительно их добавляют в инкубационную среду.

Альтернативно, клетки можно предварительно обработать указанными средствами или клетками перед стадией инкубации. Условия инкубации также являются такими, чтобы продукт, секретируемый клетками - продуцентами, по существу не захватывался другой клеткой, таким образом, возможно определение различий между клетками, не являющимися продуцентами, и производящими продукт клетками или высокоэффективными продуцентами и низкоэффективными продуцентами. Как правило, время инкубации составляет от 5 минут до десяти часов и чаще составляет от 1 до 5 часов. Инкубационная среда может необязательно включать в себя вещество, которое снижает диффузию секретируемого продукта из клетки - продуцента. Вещества, которые ингибируют диффузию продукта в жидких средах и которые являются нетоксичными для клеток, известны в настоящей области техники и включают в себя, например, разнообразные вещества, которые являются частично или полностью гелеобразными, включая в себя, например, альгинат, агарозу с низкой температурой плавления и желатин.

Путем варьирования вязкости или проницаемости среды можно модулировать локальный захват клеткой - продуцентом секретируемых продуктов определенных размеров. Для оптимизации реакции можно отрегулировать исключение по размеру на основании молекулярной массы в отношении среды. Оптимальный состав среды можно определить эмпирически, и на него влияет концентрация клеток, уровень секреции и молекулярная масса продукта и аффинность захватывающих антител для продукта. Такое определение находится в компетенции специалиста в настоящей области техники.

Предпочтительно, гели солюбилизируют после инкубации для обеспечения выделения клеток или групп клеток из сред с помощью техники сортировки клеток. Таким образом, например, гели могут быть связаны дисульфидными связями, которые можно диссоциировать с помощью таких восстановителей сульфгидрильных групп, как /3-меркаптоэтанол или DTT, или гели могут содержать ионные перекрестные сшивки, включая в себя, например, ионы кальция, которые солюбилизируют путем добавления такого хелатирующего средства, как EDTA.

Согласно конкретному варианту осуществления в ходе фазы секреции клетки инкубируют в гелеобразной среде, и предпочтительно ограничение по размеру для проникновения в гель предотвращает по существу проникновение продукта в гель.

Альтернативным или дополнительным к использованию вязкой или гелеобразной среды для предотвращения неспецифической перекрестной контаминации клеток является обеспечение системы захвата для захвата продуктов, не захваченных системой захвата клеточной поверхности на секретирующей клетке. Например, эту технику можно использовать в случае, когда многие типы клеток производят продукт, или если нельзя создать достаточный диффузионный барьер между клетками. Это можно осуществить путем добавления к среде, окружающей клетки, микрочастиц (например, латексных микрочастиц), конъюгированных с продуктом антитела из супернатанта. Альтернативно, можно использовать гели с иммобилизированными антителами или другими фрагментами, способными удалить несвязанный продукт из среды. Эти улавливающие фрагменты способны удерживать эти нежелательные продукты или предотвращать их связывание с не секретирующими клетками путем связывания с не задержанными продуктами. Указанная "система захвата отходов" может состоять из иммобилизированной в геле матрицы, или ее можно прикрепить к магнитным частицам или частицам другого типа. Положение и характеристики захвата системы захвата отходов необходимо регулировать так, чтобы достаточное количество молекул продукта специфически связалось с секретирующими клетками, таким образом, минимизируя фоновое значение не производящих продукт клеток.

В конце фазы секреции гелевую матрицу (если таковая присутствует) солюбилизируют. Клетки, содержащие захваченный продукт, затем метят фрагментом - меткой. Мечение можно осуществить любым известным специалистам в настоящей области техники способом. Например, антитела к продукту можно использовать для прямого или опосредованного мечения содержащих продукт клеток. Используемые метки представляют собой метки, являющиеся подходящими для применения в системах, в которых клетки подлежат анализу или сортировке на основании прикрепления фрагмента - метки к продукту.

Согласно другим вариантам осуществления можно обнаружить обеспечивающие захват фрагменты, которые не содержат захваченный продукт. Это обеспечивает, например, выделение клеток, которые секретируют высокие количества продукта с использованием способа отрицательной сепарации, т.е. обнаружения клеток, не насыщенных в высокой степени продуктом. Клетки можно пометить другими распознающими веществами, включая в себя без ограничения маркеры клеточной поверхности, маркеры типа клеток, такие клеточные параметры, как содержание ДНК, клеточный статус или количество обеспечивающих захват фрагментов.

Подсчет фактических обеспечивающих захват фрагментов может быть важным для восполнения варьирующих количеств этих молекул вследствие, например, различных потенциалов клеток к конъюгации. Он может быть особенно важным для выделения редких клеток для исключения клеток со сниженной или повышенной способностью к связыванию системы захвата продукта, включая в себя якорные и обеспечивающие захват фрагменты.

Анализ клеточных популяций и сортировку клеток на основании присутствия метки можно осуществить с помощью ряда техник, известных в настоящей области техники и описанных подробно в настоящем документе.

V. Сепарация антиген-специфических Т-клеток согласно раскрытию патента США №6576428, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки:

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ клеточной сепарации антиген-специфических Т-клеток из клеточного препарата (например, незрелых гематопоэтических клеток) на основании одного или нескольких продуктов, секретируемых этими Т-клетками (например, цитокинов или факторов роста, включая в себя без ограничения IL-3, GM-CSF, IL-2, IFN-гамма, TNF-альфа, IL-4, IL-5, IL-10 и/или IL-13) в ответ на антигенную стимуляцию. Т-клетки снабжают обеспечивающим захват фрагментом (например, антителом) для продукта, который затем можно использовать непосредственно в качестве метки в некоторых случаях, или связанный продукт можно дополнительно пометить посредством фрагментов - меток (т.е. обнаруживаемым фрагментом), которые специфически связываются с продуктом и которые метят с помощью таких традиционный материалов - меток, как флуорофоры, радиоактивные изотопы, хромофоры или магнитные частицы. Меченые клетки затем сепарируют с использованием стандартных техник сортировки клеток на основании этих меток. Такие техники включают в себя проточную цитометрию, сепарацию в градиенте магнитного поля, центрифугирование и подобное (как описано подробно в настоящем документе).

Согласно одному варианту осуществления антигенную стимуляцию осуществляют путем воздействия на клеточный препарат (например, незрелые гематопоэтические клетки) по меньшей мере одного антигена в условиях, эффективных для индукции антиген-специфической стимуляции по меньшей мере одной Т-клетки. Мечение с продуктом достигается путем модификации поверхности клеток так, чтобы она содержала по меньшей мере один обеспечивающий захват фрагмент, культивирования клеток в условиях, при которых продукт секретируется, высвобождается и специфически связывается ("захватывается" или "улавливается") обеспечивающим захват фрагментом; и мечения захваченного продукта фрагментом - меткой, где меченые клетки не лизируют в качестве части процедуры мечения или в качестве части процедуры сепарации.

Согласно другому варианту осуществления клеточный препарат (например, незрелые гематопоэтические клетки) можно дополнительно подвергать действию одного или нескольких протоколов сепарации на основании экспрессии маркеров клеточной поверхности. Например, клетки можно подвергать положительной селекции на основании экспрессии одного или нескольких полипептидов клеточной поверхности, включая в себя без ограничения такие маркеры клеточной поверхности - "кластеры дифференциации (CD)", как CD2, CD3, CD4, CD8, TCR, CD45, CD45RO, CD45RA, CD11b, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD40L; другие маркеры, ассоциированные с активацией лимфоцитов, такие как продукт гена 3 активации лимфоцитов (LAG3), сигнальная молекула активации лимфоцитов (SLAM), T1/ST2; такие хемокиновые рецепторы, как CCR3, CCR4, CXCR3, CCR5; такие "хоминг" - рецепторы, как CD62L, CD44, CLA, CD 146, альфа.4.бета.7, альфа.Е.бета.7; такие маркеры активации, как CD25, CD69 и OX40; и липогликаны, представленные CD1. Альтернативно, клеточный препарат (например, незрелые гематопоэтические клетки) можно дополнительно подвергать отрицательной селекции для деплеции не-Т-клеток и/или конкретных подклассов Т-клеток. Отрицательную селекцию можно проводить на основании экспрессии клеточной поверхности разнообразных молекул, включая в себя без ограничения такие В-клеточные маркеры, как CD19 и CD20; маркер моноцитов CD14; маркер NK-клеток CD56.

Как указано, Т-клеточную или В-клеточную циторедукцию можно осуществить in vitro или in vivo (например, у донора перед забором от него незрелых гематопоэтических клеток).

Далее представлен ряд неорганичивающих примеров проведения Т/В-клеточной циторедукции согласно настоящему изобретению.

I. MACS™ согласно раскрытию РСТ публикации № WO 2009/066180. которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному варианту осуществления in vitro циторедукцию Т или В-клеток (TCD и/или BCD) осуществляют с помощью магнитно-активированной клеточной сортировки (MACS™). Таким образом, MACS™ обеспечивает средство для сепарации конкретной живой клетки из популяции живых клеток.

Сепарацию клеток, как правило, проводят путем добавления к популяции клеток антитела, которое специфически связывается с внеклеточным эпитопом поверхностного маркера (в случае Т/В-клеточного маркера, например, кластером дифференциации, т.е. CD, полипептидом). Предпочтительным является то, что антитело метят с помощью обнаруживаемого средства, подходящего для сортировки клеток (сепарации клеток), такого как флуоресцентный краситель (например, FITC) или магнитно-чувствительное средство (например, микрочастица).

Таким образом, антитело можно соединить с магнитно-чувствительным средством, после чего антитело можно использовать для сепарации клетки, связанной с ним в условиях, достаточных для специфического связывания антител с эпитопом (антигеном).

Согласно одному варианту осуществления и согласно раскрытию WO/2009/066180, способ дополнительно включает следующие стадии: иммобилизация клетки, экспрессирующей поверхностный маркер, который специфически связался с антителом, меченным магнитно-чувствительным средством в ферромагнитной матрице (описанной подробно в настоящем документе ниже) посредством магнитного поля; отмывка матрицы для удаления несвязанных клеток; и удаление магнитного поля для элюирования клетки из матрицы. Таким образом, обеспечивается клеточный образец, обогащенный или состоящий из клеток, экспрессирующих поверхностный маркер.

Элюирование ферромагнитной матрицы можно проводить с использованием гравитационного потока, центрифугирования, вакуумной фильтрации или с помощью положительного давления, например, с использованием плунжера.

Используемый в настоящем документе термин "магнитная сортировка клеток" относится к процедурам сепарации клеток (клеточной сортировки), включая в себя без ограничения магнитную сепарацию с использованием антител, связанных с коллоидными магнитными частицами, аффинную хроматографию и цитотоксические средства, связанные с моноклональным антителом или используемые в сочетании с любой техникой антителозависимой сепарации, известной в настоящей области техники.

Согласно иллюстративному варианту осуществления моноклональные антитела используют в сочетании с коллоидными суперпарамагнитными микрочастицами с органическим покрытием, например, полисахаридами (Miltenyi et al. (1990) Cytometry 11:231-238). Можно использовать эти частицы с размером 10-200 нм, предпочтительно от 40 до 100 нм, и их можно либо непосредственно конъюгировать с антителами, либо использовать в комбинации со специфическими к антииммуноглобулину, авидину или антигаптену микрочастицами. Покрытые полисахаридом суперпарамагнитные частицы коммерчески доступны от Miltenyi Biotec GmbH, Германия.

Способы получения суперпарамагнитных частиц, описанные в патенте США №4770183, можно комбинировать с настоящим раскрытием.

В отношении терминологии, которая соответствует общему употреблению в настоящей области техники:

Используемый в настоящем документе термин "ферромагнитный" относится к материалам, которые сильно чувствительны к магнитным полям и способны сохранять магнитные свойства при удалении поля. Ферромагнтезим возникает только в тех случаях, когда неспаренные электроны в материале содержатся в кристаллической решетке, таким образом, обеспечивая возможность соединения с неспаренными электронами.

Используемый в настоящем документе термин "суперпарамагнитный" относится к материалам, которые являются в высокой степени магнитно-чувствительными, т.е. они становятся сильно магнитными при помещении их в магнитное поле, но быстро теряют свою намагниченность. Суперпарамагнетизм происходит в ферромагнитных материалах, когда диаметр кристаллической решетки снижается меньше чем до критического значения.

Следует понимать, что степень намагниченности, которая достигается частицей, представляет собой функцию ее магнитной чувствительности и приложенного магнитного поля. Намагниченность представляет собой функцию результирующего магнитного момента и объема частицы. Чем выше магнитный момент и чем меньше объем, тем выше намагниченность.

II. MACS™ согласно раскрытию патента США №5411863, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному варианту осуществления и раскрытию патента США №5411863 сепарацию клеток [циторедукцию in vitro Т- или В-клеток (TCD и/или BCD)] можно провести с помощью сепарации в высокоградиентном магнитном поле (HGMS), а именно с помощью процедуры для селективного удержания магнитных материалов или немагнитных мишеней, меченных магнитными частицами, в камере или колонке, расположенной в магнитном поле. Таким образом, например, жидкость, содержащую магнитные частицы, пропускают через сосуд или колонку, которую располагают в градиенте магнитного поля. В требуемых способах проведения сепарации клеток сосуд заполняют матрицей, которая способна создавать высокие градиенты магнитного поля вблизи его поверхностью. Наряду с тем, что сила магнитного поля, приложенного к частицам, определяет их намагниченность, их удержание представляет собой функцию силы градиента магнитного поля. Намагниченные частицы удерживаются высокими градиентами магнитного поля. Типичные матрицы являются волокнистыми или представляют собой твердые частицы металлов, такие как стальная шерсть, провода или волокна или твердые частицы или сетки.

Настоящее изобретение дополнительно включает способ нанесения покрытия на такие матрицы, которое продуктивно и эффективно защищает биологические материалы, подвергаемые прохождению через матрицу, от повреждения, которое будет вызвано воздействием на эти материалы металлической поверхности. Покрытие на матрице эффективно предотвращает коррозию металлических поверхностей и предотвращает прохождение любых ионов, которые могут формироваться на поверхности, в окружающую жидкость. Кроме того, предусмотренное настоящим изобретением непроницаемое покрытие усиливает физическую стабильность матрицы.

Дополнительные публикации, описывающие разнообразные систем HGMS, известны в настоящей области техники и включают в себя, например, патент США №4452773, патент США №4230685, заявку согласно РСТ № WO 85/04330, патент США №4770183 и РСТ/ЕР 89/01602; системы также описаны в заявке на выдачу патента США №07/291177 и в заявке на выдачу патента США №07/291176, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

III. Устройство для магнитной сепарации (MACS™) согласно раскрытию патентов США №№5786161 и 5711871, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному варианту осуществления устройство для магнитной сепарации можно использовать в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно одному варианту осуществления устройство для магнитной сепарации для процедур магнитной сепарации содержит матрицы, которые обеспечивают однородные поры или каналы, которые снижают захват воздуха или нецелевых веществ и снижают потерю целевых веществ вследствие механического разрыва. Целевые клетки (например. В- или Т-клетки) из различных биологических образцов метят в сочетании с подходящим специфическим связывающим средством (например, специфическим к Т/В-клеткам антителом, описанным выше) и выделяют с использованием устройств и способов настоящего изобретения.

Система сепарации способна специфически отбирать и сепарировать определенную популяцию клеток (целевые клетки) из такой смешанной клеточной популяции, как периферическая кровь, костный мозг, кровь из пупочного канатика или плаценты, фетальная кровь или продукт лейкафереза.

Согласно одному варианту осуществления устройство для сепарации в высокоградиентном магнитном поле (HGMS) используют в соответствии с настоящим изобретением.

Обычные матрицы для сепарации в высокоградиентном магнитном поле, как правило, получают из таких материалов, как провода, покрытое металлом волокно или стальная шерсть. В улучшенном устройстве для магнитной сепарации согласно настоящему изобретению интенсифицирующая градиент матрица высокоградиентного магнитного сепаратора образована их небольших сфер магнитно-чувствительного или ферромагнитного материала. Такие материалы включают в себя без ограничения железо, сталь, кобальт, никель и другие ферромагнитные редкоземельные металлы или их сплавы. Например, материал матрицы может включать в себя ферромагнитные металлические сферы, такие как железные сферы (например, MARABU Balls, Kugelfabrik Schulte & Co., Wermelskirchen, Германия).

Известны многочисленные различные способы получения сфер. Как правило, сферы характеризуются средним диаметром в диапазоне от приблизительно 0,2 до 1,5 мм для сепарации больших клеток или клеточных комплексов, и диаметром приблизительно 0,05-0,2 мм для субклеточного материала. В частности, сферы характеризуются средним диаметром в диапазоне от приблизительно 0,2 до 0,5 мм и более конкретно выбирают сферы, характеризующиеся средним диаметром в диапазоне от приблизительно 0,2 до 0,3 мм. Необходимо, чтобы размер сфер был относительно гомогенным, как правило, варьирующим не больше чем приблизительно на 15% от среднего размера, чаще не больше чем приблизительно на 10% и предпочтительно не больше чем приблизительно на 5%.

Сферы состоят из ферромагнитного материала (например, железа, стали и т.д.), который может быть покрыт непроницаемым покрытием для предотвращения контакта клеток с металлом. Под непроницаемым покрытием понимают полимерное покрытие, которое состоит из по существу меньше чем 30% воды по массе, которое не позволяет проходить ионам и которое образуется на сфере в результате пассивного нанесения, образования перекрестных сшивок или полимеризации относительно гидрофобного полимера или сополимера. Подходящие полимеры включают в себя полистиролы, полиакриламиды, полиэфируретаны, полисульфоны, такие фторсодержащие или хлорсодержащие полимеры, как поливинилхлорид, полиэтилены и полипропилены, поликарбонаты и сложные полиэфиры и т.д.

Матрица сфер должна характеризоваться адекватной площадью поверхности для создания достаточных градиентов магнитного поля в устройстве для сепарации для обеспечения эффективного удержания магнитно-меченных клеток. Объем, необходимый для данной сепарации, можно определить эмпирически, и он будет варьировать в зависимости от размера клеток, плотности антигенов на клеточной поверхности, аффинности антител и т.д. Объемная скорость потока будет определяться размером колонки, но, как правило, для регуляции потока не будет необходимости в канюле или клапане.

Меченые клетки удерживаются в устройстве магнитной сепарации в присутствии магнитного поля, составляющего, как правило, по меньшей мере приблизительно 100 мТл, чаще по меньшей мере приблизительно 500 мТл, как правило, больше чем приблизительно 2 Тл, чаще не больше чем приблизительно 1 Тл. Источник магнитного поля может быть постоянным или электромагнитным. После начального связывания устройство можно отмыть любым подходящим физиологическим буфером для удаления несвязанных клеток.

Связанные клетки высвобождают из устройства для магнитной сепарации путем удаления магнитного поля и элюирования в подходящем буфере. Клетки можно собирать в любой соответствующей среде, предпочтительно среде, поддерживающей жизнеспособность клеток. Различные среды являются коммерчески доступными и могут использоваться в соответствии с природой клеток, включая в себя dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, PBS-EDTA, PBS, среду Искова и т.д., которые можно дополнить фетальной телячьей сывороткой, BSA, HSA и т.д. Клетки затем можно использовать сообразно ситуации и согласно раскрытию в настоящем документе.

В своей самой простой форме система сепарации клеток настоящего изобретения содержит два основных компонента: магнитный сепаратор и реагент для сепарации клеток. Более сложное устройство для сепарации включает в себя каналы для жидкости, контейнеры для сбора и хранения и разделительную колонку. Схему циркуляции жидкости можно сконструировать с встроенными клапанами, или действие клапанов можно применить к потокам жидкости внешним образом.

Дополнительные устройства для магнитной сепарации, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, описаны в международной патентной публикации № WO/90/07380, международной патентной заявке № PCT/US 96/00953 и европейском патенте № ЕР 438520, патентах США №№5779892, 6417011, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

IV. MACS™ согласно раскрытию патента США №6900029, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения популяцию клеток можно подвергать селекции с использованием частиц и гравитационного осаждения, раскрытого в патенте США №6900029. Таким образом, Т/В-клеточную циторедукцию можно проводить путем удаления нежелательной популяции или субпопуляции клеток (например, клеток, экспрессирующих CD20, CD19, CD2, CD4, CD8) путем их сепарации из биологического образца (например, жидкого образца), такого как цельная кровь или костный мозг, быстро и с большим выходом с использованием множества плотных, относительно тяжелых частиц, содержащих один или несколько реагентов, таких как моноклональные или поликлональные антитела, связанных с ними, смешанными с биологическим образцом (например, жидким образцом). Антитела, связанные с частицами, могут быть направлены на Т- или В-клетки, которые подлежат удалению из биологического образца. Существует возможность дифференциально осадить частицы с клетками, связанными с ними, с помощью гравитационной силы, и затем оставшийся образец (содержащий без-Т/В-клеточный образец, например, незрелые гематопоэтические клетки) удаляют для последующего использования. Это увеличивает количество оставшихся представляющих интерес клеток (например, незрелых гематопоэтических клеток) в образце, которые не подверглись нацеленному воздействию частиц. Соответственно предусмотрен высоких выход представляющих интерес клеток даже после множественных стадий удаления. Связанные с частицами антитела также могут быть направлены на представляющие интерес клетки (например, незрелые гематопоэтические клетки, экспрессирующие, например, CD34). Нацеленные клетки (например, CD34+ незрелые гематопоэтические клетки) можно затем удалить из частиц для дальнейшего использования.

Согласно одному варианту осуществления материал твердых частиц может представлять собой никель. Никелевую частицу можно нагревать для стерилизации частицы, если это необходимо. Если образец был промыт и подлежит трансплантации человеку, магнитное поле и процедуру отмывки можно использовать (как описано подробно выше) для удаления дополнительных нежелательных клеток (например, эритроцитов) и для того, чтобы дополнительно убедиться, что все плотные частицы были удалены из биологического образца.

Согласно одному варианту осуществления без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки (например, содержащие CD34+ клетки) содержат без-Т-клеточные клетки костного мозга, без-Т-клеточные мобилизированные клетки - предшественники гемопоэза из периферической крови (например, мобилизированные с помощью G-CSF), без-Т-клеточную пуповинную кровь/фетальную печень/желточный мешок и/или очищенные CD34⁺ клетки (полученные из всех упомянутых выше источников, например, из костного мозга и/или из мобилизированных G-CSF клеток - предшественников гемопоэза из периферической крови), и их подвергают положительной селекции (например, с помощью магнитных микрочастиц с использованием антитела к CD34, например, как описано выше с использованием MACS™). Кроме того, очищенные CD34⁺ клетки, размноженные ex vivo для увеличения количества клеток, также предусмотрены согласно настоящим способам.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения субъекту вводят дозу без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, содержащую по меньшей мере приблизительно 4×10⁶, 4,5×10⁶, 5×10⁶, 5,5×10⁶, 6×10⁶, 6,5×10⁶, 7×10⁶, 7,5×10⁶, 8×10⁶, 8,5×10⁶, 9×10⁶, 9,5×10⁶, 10×10⁶, 12,5×10⁶, 15×10⁶, 20×10⁶, 25×10⁶, 30×10⁶, 35×10⁶, 40×10⁶, 45×10⁶, 50×10⁶, 60×10⁶, 70×10⁶, 80×10⁶, 90×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят дозу без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, содержащую по меньшей мере приблизительно 10×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят дозу без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, содержащую по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела.

Согласно одному варианту осуществления субъекту вводят дозу без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, содержащую диапазон, составляющий приблизительно 4-30×10⁶, 4-40×10⁶, 4-50×10⁶, 4-60×10⁶, 4-70×10⁶, 4-80×10⁶, 4-90×10⁶, 4-100×10⁶, 5-10×10⁶, 5-20×10⁶, 5-30×10⁶, 5-40×10⁶, 5-50×10⁶, 5-60×10⁶, 5-70×10⁶, 5-80×10⁶, 5-90×10⁶, 5-100×10⁶, 10-20×10⁶, 10-30×10⁶, 10-40×10⁶, 10-50×10⁶, 10-60×10⁶, 10-70×10⁶, 10-80×10⁶, 10-90×10⁶, 10-100×10⁶, 20-30×10⁶, 20-40×10⁶, 20-50×10⁶, 20-60×10⁶, 20-70×10⁶, 20-80×10⁶, 20-90×10⁶, 20-100×10⁶, 30-40×10⁶, 30-50×10⁶, 30-60×10⁶, 30-70×10⁶, 30-80×10⁶, 30-90×10⁶, 30-100×10⁶, 40-50×10⁶, 40-60×10⁶, 40-70×10⁶, 40-80×10⁶, 40-90×10⁶, 40-100×10⁶, 50-60×10⁶, 50-70×10⁶, 50-80×10⁶, 50-90×10⁶, 50-100×10⁶, 60-70×10⁶, 60-80×10⁶, 60-90×10⁶, 60-100×10⁶, 70-80×10⁶, 70-90×10⁶, 70-100×10⁶, 80-90×10⁶, 80-100×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят дозу без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, содержащую диапазон, составляющий приблизительно 5-40×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела.

Без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки согласно настоящему изобретению могут трансплантировать реципиенту с использованием любого способа, известного в настоящей области техники для клеточной трансплантации, такого как без ограничения клеточная инфузия (например, внутривенная), интраперитонеальным путем или внутрикостным путем.

Как указано, субъекту согласно настоящему изобретению могут дополнительно трансплантировать клеточный или тканевой трансплантат (например, печень, поджелудочную железу, селезенку, почку, сердце, легкое, кожу, кишечник и/или лимфоидные/гемопоэтические ткани).

Трансплантацию клетки или ткани субъекту можно осуществить различными путями, в зависимости от различных параметров, таких как, например, тип клетки или ткани; тип, стадия или тяжесть заболевания реципиента (например, функциональная недостаточность органа); физические или физиологические параметры, специфические для субъекта; и/или требуемый терапевтический результат.

Трансплантацию клеточного или тканевого трансплантата согласно настоящему изобретению можно осуществить путем трансплантации клеточного или тканевого трансплантата в любое одно из различных анатомических положений в зависимости от применения. Клеточный или тканевой трансплантат можно трансплантировать в гомотопическое анатомические положение (нормальное анатомические положение для трансплантата), или в эктопическое анатомические положение (аномальное анатомические положение для трансплантата). В зависимости от применения клеточный или тканевой трансплантат можно преимущественно имплантировать под почечную капсулу или в почку, тестикулярную жировую клетчатку, подкожный жировой слой, сальник, портальную вену, печень, селезенку, полость сердца, сердце, грудную полость, легкое, кожу, поджелудочную железу и/или внутрибрюшинное пространство.

Например, ткань печени согласно настоящему раскрытию можно трансплантировать в печень, портальную вену, почечную капсулу, подкожный жировой слой, сальник, селезенку и внутрибрюшинное пространство. Трансплантацию печени в различные анатомические положения, такие как перечисленные выше, как правило, проводят в настоящей области техники для лечения заболеваний, подлежащих лечению посредством трансплантации печени (например, печеночной недостаточности). Аналогично, трансплантацию ткани поджелудочной железы согласно настоящему изобретению можно преимущественно осуществить путем трансплантации ткани в портальную вену, печень, поджелудочную железу, тестикулярную жировую клетчатку, подкожный жировой слой, сальник, петлю кишечника (субсерозную оболочку U-образной петли тонкого кишечника) и/или внутрибрюшинное пространство. Трансплантация ткани поджелудочной железы может использоваться для лечения заболеваний, подлежащих лечению посредством трансплантации поджелудочной железы (например, диабета). Аналогично, трансплантацию таких тканей, как ткань почки, сердца, легкого или кожи можно провести в любое описанное выше анатомическое положение с целью лечения реципиентов, страдающих, например, от почечной недостаточности, сердечной недостаточности, легочной недостаточности или кожного повреждения (например, ожогов).

Необязательно при трансплантации клеточного или тканевого трансплантата по настоящему изобретению субъекту с поврежденным органом, может быть предпочтительным вначале по меньшей мере частично удалить поврежденный орган у субъекта для того, чтобы обеспечить оптимальное развитие трансплантата и его структурную/функциональную интеграцию с анатомией/физиологией субъекта.

Способ по настоящему изобретению также включает котрансплантацию нескольких органов (например, сердца и легкого, печени и селезенки, поджелудочной железы и костного мозга, например, гемопоэтических стволовых клеток, почки и костного мозга, например, гемопоэтических стволовых клеток и т.д.) в случае, если такая процедура может оказать благоприятное воздействие на субъекта.

Согласно одному варианту осуществления котрансплантация включает трансплантацию незрелых гемопоэтических клеток и твердой ткани/цельного органа или нескольких цельных органов/твердых тканей.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки и цельный орган получают от одного донора.

Согласно одному варианту осуществления клеточный или тканевой трансплантат (например, цельный орган) трансплантируют субъекту до, одновременно или после трансплантации без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток (например, содержащих CD34+ клетки) субъекту.

После трансплантации клеточного или тканевого трансплантата субъекту целесообразно согласно стандартной медицинской практике проводить мониторинг функциональности в отношении роста и иммуносовместимости органа согласно любой одной из различных стандартных техник, известных в настоящей области техники. Например, функциональность трансплантата ткани поджелудочной железы можно подвергнуть мониторингу после трансплантации с помощью стандартных исследований функций поджелудочной железы (например, анализ содержания инсулина в сыворотке). Аналогично, трансплантат ткани печень можно подвергнуть мониторингу после трансплантации с помощью стандартных исследований функций печени (например, анализ содержания альбумина, общего белка, АЛТ, ACT и билирубина в сыворотке и анализ времени коагуляции крови). Структурное развитие клеточного или тканевого трансплантата можно подвергнуть мониторингу посредством компьютерной томографии или ультразвукового исследования.

Независимо от типа трансплантата для снижения по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или предпочтительно во избежание отторжения трансплантата и/или реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD), настоящее изобретение после трансплантации включает введение циклофосфамида.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение дополнительно включает введение циклофосфамида перед трансплантацией (например, в дни 4, 3 или 2 перед трансплантацией, т.е. Т-4, -3 или -2) в дополнение к введению после трансплантации, как описано в настоящем документе.

Следует отметить, что дату трансплантации (клеточного или тканевого трансплантата) принимают за Т=0.

Используемый в настоящем документе термин "циклофосфамид" относится к алкилирующему средству хлорметину, которое специфически присоединяет алкильную группу (CnH2n+1) к ДНК (также известному как цитофосфан). Согласно конкретному варианту осуществления циклофосфамид относится к молекулярной формуле C₇H₁₅C₁₂N₂O₂P⋅H₂O и химическому названию 2-[бис(2-хлорэтил)амино]тетрагидро-2Н-1,3,2-оксазафосфорин-2-оксидмоногидрат. Циклофосфамид коммерчески доступен, например, от Zydus (German Remedies), Roxane Laboratories Inc-Boehringer Ingelheim, Bristol-Myers Squibb Co - Mead Johnson and Co, и Pfizer - Pharmacia & Upjohn, под торговыми названиями Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox и Revimmune.

Терапевтически эффективное количество циклофосфамида, как правило, вводят субъекту после трансплантации клеточного или тканевого трансплантата.

Не ограничиваясь теорией, терапевтически эффективное количество представляет собой количество циклофосфамида, эффективное для цитолиза активированных аллореактивных Т-клеток донора или хозяина, не являясь токсическим для субъекта.

Например, в случае клеточного или тканевого трансплантата терапевтическое эффективное количество циклофосфамида составляет приблизительно 1-25 мг, 1-50 мг, 1-75 мг, 1-100 мг, 1-250 мг, 1-500 мг, 1-750 мг, 1-1000 мг, 5-50 мг, 5-75 мг, 5-100 мг, 5-250 мг, 5-500 мг, 5-750 мг, 5-1000 мг, 10-50 мг, 10-75 мг, 10-100 мг, 10-250 мг, 10-500 мг, 10-750 мг, 10-1000 мг, 25-50 мг, 25-75 мг, 25-100 мг, 25-125 мг, 25-200 мг, 25-300 мг, 25-400 мг, 25-500 мг, 25-750 мг, 25-1000 мг, 50-75 мг, 50-100 мг, 50-125 мг, 50-150 мг, 50-175 мг, 50-200 мг, 50-250 мг, 50-500 мг, 50-1000 мг, 75-100 мг, 75-125 мг, 75-150 мг, 75-250 мг, 75-500 мг, 75-1000 мг, 100-125 мг, 100-150 мг, 100-200 мг, 100-300 мг, 100-400 мг, 100-500 мг, 100-1000 мг, 125-150 мг, 125-250 мг, 125-500 мг, 125-1000 мг, 150-200 мг, 150-300 мг, 150-500 мг, 150-1000 мг, 200-300 мг, 200-400 мг, 200-500 мг, 200-750 мг, 200-1000 мг, 250-500 мг, 250-750 мг, 250-1000 мг на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления терапевтическое эффективное количество циклофосфамида составляет приблизительно 25-200 мг на кг массы тела субъекта.

Как показано в представленном ниже разделе "Примеры", авторы настоящего изобретения показали, что введение двух доз циклофосфамида после трансплантации (в дни 3 и 4 после трансплантации) обеспечивает долгосрочное приживление трансплантата и толерантность "мегадозы" без-Т-клеточного костного мозга от несовместимого донора.

Согласно одному варианту осуществления циклофосфамид вводят в однократной дозе.

Согласно одному варианту осуществления циклофосфамид вводят в множественных дозах, например, в 2, 3, 4, 5 дозах или больше.

Согласно конкретному варианту осуществления циклофосфамид вводят в двух дозах.

Согласно одному варианту осуществления циклофосфамид вводят ежедневно, например один раз в день или два раза в день.

Доза каждого введения циклофосфамида может содержать приблизительно 5 мг, 7,5 мг, 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 60 мг, 70 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг, 220 мг, 230 мг, 240 мг, 250 мг, 260 мг, 270 мг, 280 мг, 290 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг или 500 мг на кг массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления доза циклофосфамида составляет 50 мг на кг массы тела субъекта.

Как указано, циклофосфамид вводят после трансплантации. Таким образом, например, циклофосфамид могут вводить субъекту через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней или больше после трансплантации (т.е., Т+1, +2, +3, +4, +5, +6, +7, +8, +9, +10). Согласно конкретному варианту осуществления циклофосфамид вводят субъекту в двух дозах через 3 и 4 дня после трансплантации.

Согласно одному варианту осуществления циклофосфамид вводят перед трансплантация и после трансплантации. Таким образом, например, циклофосфамид могут вводить субъекту за 3 дня перед трансплантацией (Т-3) и затем после трансплантации (например, в дни Т+3, +4 и т.д.).

Количество введений и терапевтически эффективное количество циклофосфамида можно отрегулировать в соответствии с потребностью, принимая во внимание тип трансплантации и ответ субъекта на режим. Определение количества ведений и терапевтически эффективного количества будет находиться в пределах компетенции специалистов в настоящей области техники, особенно в свете представленного в настоящем документе подробного раскрытия.

Для облегчения приживления трансплантата клеточного или тканевого трансплантата способ может дополнительно преимущественно включать кондиционирование субъекта с помощью дополнительного иммуносупрессивного лекарственного средства и/или иммуносупрессивного облучения до, одновременно или после трансплантации клеточного или тканевого трансплантата.

Следует понимать, что в ситуации, в которой клеточный или тканевой трансплантат (например, цельный орган) трансплантируют перед без-Т-клеточными незрелыми гемопоэтическими клетками, рекомендуется использовать иммунносупрессивные средства общего действия (например, описанный более подробно ниже циклоспорин А), чтобы избежать отторжения органа. Как только без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки трансплантируют, и достигается химеризм, введение иммунносупрессивных средств общего действия могут снижать и впоследствии прекращать. Напротив, в ситуациях, в которых клеточный или тканевой трансплантат (например, цельный орган) трансплантируют после без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, после индукции химеризма, применение иммунносупрессивных средств общего действия может не понадобиться.

Подробное руководство относительно выбора и введения подходящих иммуносупрессивных режимов для трансплантации представлено в литературе в настоящей области техники (например, ссылаются на: Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. and Strom ТВ., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623).

Таким образом, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения субъект подвергают кондиционированию в режиме кондиционирования сниженной интенсивности перед трансплантацией клеточного или тканевого трансплантата.

Согласно одному варианту осуществления кондиционирование сниженной интенсивности осуществляют в течение до 2 недель (например, 1-10 или 1-7 дней) перед трансплантацией клеточного или тканевого трансплантата.

Таким образом, например, на субъекта могут воздействовать с помощью миелоаблативного или немиелоаблативного кондиционирования. Такое кондиционирование может включать, например, и как описано подробно в приведенном ниже разделе "Примеры", in vivo Т-клеточную циторедукцию, например, с помощью антитела к CD4, антитела к CD8, антител к CD3 (ОКТ3), антител к CD52 (например, САМРАТН) и/или антитела - антитимоцитарного глобулина (ATG) (например, за 6 дней перед трансплантацией в терапевтической эффективной дозе, составляющей приблизительно 300 мкг для каждого антитела).

Кондиционирование может дополнительно или альтернативно включать тотальное облучение тела (TBI), тотальное облучение лимфоидной ткани (TLI, т.е. воздействие на все лимфатические узлы, тимус и селезенку), химиотерапевтическое средство и/или иммунотерапию антителами.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления TBI включает дозу однократного или фракционированного облучения в пределах диапазона, составляющего 0,5-1 Гр, 0,5-1,5 Гр, 0,5-2,5 Гр, 0,5-5 Гр, 0,5-7,5 Гр, 0,5-10 Гр, 0,5-15 Гр, 1-1,5 Гр, 1-2 Гр, 1-2,5 Гр, 1-3 Гр, 1-3,5 Гр, 1-4 Гр, 1-4,5 Гр, 1-1,5 Гр, 1-7,5 Гр, 1-10 Гр, 2-3 Гр, 2-4 Гр, 2-5 Гр, 2-6 Гр, 2-7 Гр, 2-8 Гр, 2-9 Гр, 2-10 Гр, 3-4 Гр, 3-5 Гр, 3-6 Гр, 3-7 Гр, 3-8 Гр, 3-9 Гр, 3-10 Гр, 4-5 Гр, 4-6 Гр, 4-7 Гр, 4-8 Гр, 4-9 Гр, 4-10 Гр, 5-6 Гр, 5-7 Гр, 5-8 Гр, 5-9 Гр, 5-10 Гр, 6-7 Гр, 6-8 Гр, 6-9 Гр, 6-10 Гр, 7-8 Гр, 7-9 Гр, 7-10 Гр, 8-9 Гр, 8-10 Гр, 10-12 Гр или 10-15 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления TBI включает дозу однократного или фракционированного облучения в пределах диапазона, составляющего 1-3,5 Гр.

Согласно одному варианту осуществления лечение TBI вводят субъекту за 1-10 дней (например, за 1-3 дня) перед трансплантацией. Согласно одному варианту осуществления субъект подвергают кондиционированию один раз с помощью TBI за 1 или 2 дня перед трансплантацией.

Согласно конкретному варианту осуществления TLI включает в себя облучение доза в пределах диапазона, составляющего 0,5-1 Гр, 0,5-1,5 Гр, 0,5-2,5 Гр, 0,5-5 Гр, 0,5-7,5 Гр, 0,5-10 Гр, 0,5-15 Гр, 1-1,5 Гр, 1-2 Гр, 1-2,5 Гр, 1-3 Гр, 1-3,5 Гр, 1-4 Гр, 1-4,5 Гр, 1-1,5 Гр, 1-7,5 Гр, 1-10 Гр, 2-3 Гр, 2-4 Гр, 2-5 Гр, 2-6 Гр, 2-7 Гр, 2-8 Гр, 2-9 Гр, 2-10 Гр, 3-4 Гр, 3-5 Гр, 3-6 Гр, 3-7 Гр, 3-8 Гр, 3-9 Гр, 3-10 Гр, 4-5 Гр, 4-6 Гр, 4-7 Гр, 4-8 Гр, 4-9 Гр, 4-10 Гр, 5-6 Гр, 5-7 Гр, 5-8 Гр, 5-9 Гр, 5-10 Гр, 6-7 Гр, 6-8 Гр, 6-9 Гр, 6-10 Гр, 7-8 Гр, 7-9 Гр, 7-10 Гр, 8-9 Гр, 8-10 Гр, 10-12 Гр, 10-15 Гр, 10-20 Гр, 10-30 Гр, 10-40 Гр, 10-50 Гр, 0,5-20 Гр, 0,5-30 Гр, 0,5-40 Гр или 0,5-50 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления TLI включает в себя дозу однократного или фракционированного облучения в пределах диапазона, составляющего 1-3,5 Гр.

Согласно одному варианту осуществления лечение TLI вводят субъекту за 1-10 дней (например, за 1-3 дня) перед трансплантацией. Согласно одному варианту осуществления субъект подвергают кондиционированию один раз с помощью TLI за 2-7 дней перед трансплантацией.

Согласно одному варианту осуществления кондиционирование включает в себя химиотерапевтическое средство. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают в себя без ограничения бусульфан, милеран, бусульфекс, флударабин, мелфалан и тиотепа и циклофосфамид. Химиотерапевтическое(ие) средство(а) могут вводить субъекту в однократной дозе или в нескольких дозах, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше дозах (например, ежедневных дозах) перед трансплантацией. Согласно одному варианту осуществления субъекту вводят химиотерапевтическое средство (например, флударабин, например, в дозе, составляющей приблизительно 30 мг/м²/день) в течение 5 последовательных дней перед трансплантацией (например, в дни с -7 по -3).

Согласно одному варианту осуществления кондиционирование включает в себя иммунотерапию антителами. Иллюстративные антитела включают в себя без ограничения антитело к CD52 (например, алтемтузумаб, продаваемый под торговыми названиями, например, Campath, MabCampath, Campath-1H и Lemtrada) и средство - антитимоцитарный глобулин (ATG) [например, Thymoglobulin (ATG кролика, rATG, доступный от Genzyme) и Atgam (ATG лошади, eATG, доступный от Pfizer)]. Дополнительная иммунотерапия антителами может включать в себя средства к CD3 (ОКТ3), к CD4 или к CD8. Согласно одному варианту осуществления антитело вводят субъекту в однократной дозе или в нескольких дозах, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше дозах (например, ежедневных дозах) перед трансплантацией (например, за 6 дней перед трансплантацией).

Согласно одному варианту осуществления субъект не получает длительное лечение (например, в течение пролонгированного периода времени, например, в течение больше чем 10 дней) путем профилактики GVHD после трансплантации.

Согласно одному варианту осуществления в случае рецидива после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток субъект может дополнительно получить лечение с помощью инфузий донорских лимфоцитов (DLI). Например, субъекту могут вводить ступенчатые дозы Т-клеток, как описано ранее Dazzi с соавт. [Dazzi, Szydio et al., Blood, (2000) 96: 2712-6], полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному варианту осуществления субъект может получать лечение путем инфузий приблизительно 0,5-5×10⁴ CD3⁺ лимфоцитов на кг массы тела реципиента (например, 1×10 CD3⁺ лимфоцитов, например, не подвергшихся манипуляции CD3⁺ лимфоцитов на кг массы тела пациента) для лечения рецидива после без-Т-клеточной гаплоидентичной трансплантации.

Согласно одному варианту осуществления пациент с ранним молекулярным и/или гематологическим рецидивом будет дополнительно получать лечение с помощью первой дозы, составляющей приблизительно 1×10⁴ CD3⁺ клеток на кг массы тела пациента. При отсутствии GVHD вторую инфузию, составляющую приблизительно 1×10⁵ CD3⁺ клеток на кг массы тела пациента, будут, как правило, вводить приблизительно через 45 дней, после чего через 2 месяца будут вводить третью дозу, составляющую приблизительно 1×10 CD3⁺ клеток на кг массы тела пациента. Следует понимать, что доноры, как правило, подвергаются лейкаферезу для сбора лимфоцитов перед мобилизацией гемопоэтических клеток (например, для трансплантации). Замороженные препараты при необходимости оттаивают и проводят быструю инфузию в течение периода, составляющего 5-10 минут. Пациенты, проявляющие острую GVHD или которые не могут продемонстрировать приживление гематологического трансплантата, как правило, не будут получать DLI.

Согласно одному варианту осуществления пациент с рецидивирующей В-клеточной неходжкинской лимфомой будет, как правило, получать лечение с помощью ритуксимаба (например, 375 мг/м² каждую неделю в течение приблизительно 4 недель) с DLI, проводимой одновременно со второй дозой ритуксимаба.

Согласно одному варианту осуществления пациент с рецидивирующей множественной миеломой будет дополнительно получать лечение с помощью бортезомиба (например, 1,3 мг/м² в дни 1, 4, 8 и 11) перед началом DLI.

Согласно одному варианту осуществления совместно с настоящими способами не будут применяться никакие иммуносупрессивные средства после DLI.

Согласно аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, причем способ включает: (а) трансплантацию подвергнутому кондиционированию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, причем способ включает: (а) кондиционирование субъекта согласно протоколу кондиционирования сниженной интенсивности, причем кондиционирование сниженной интенсивности включает в себя тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство; (b) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10 CD34+ клеток на кг массы тела субъекта; и впоследствии (с) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Согласно аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, причем способ включает: (а) трансплантацию субъекту дозы без-Т-клеточных незрелых гемопоэтических клеток, полученных от несингенного донора, причем без-Т-клеточные незрелые гемопоэтические клетки содержат меньше чем 5×10 CD3⁺ клеток на кг массы тела субъекта, и причем доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта; и впоследствии (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

Используемый в настоящем документе термин "донор-специфическая толерантность" относится к состоянию, при котором существует сниженная реактивность клеток реципиента (например, Т-клеток реципиента), когда они приходят в контакт с клетками донора (например, гемопоэтическими клетками донора) по сравнению с реактивностью клеток реципиента при отсутствии такого способа лечения.

Индукция толерантности обеспечивает возможность трансплантации клеточного или тканевого трансплантата (описанной подробнее выше в настоящем документе) со сниженным риском отторжения трансплантата или GVHD.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения пациенты с ранним молекулярным и/или гематологическим рецидивом могут получать инфузии донорских лимфоцитов (DLI).

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения DLI может содержать 1×10³-1×10⁶ CD3⁺ Т-клеток/кг массы тела реципиента.

Согласно одному варианту осуществления пациенты с ранним молекулярным и/или гематологическим рецидивом могут получать однократную дозу или несколько доз (две, три, четыре, пять или больше доз) DLI.

Таким образом, например, пациенты с ранним молекулярным и/или гематологическим рецидивом могут получать первую дозу, составляющую 1×10⁴ CD3⁺ Т-клеток/кг массы тела реципиента. При отсутствии реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD) вторую инфузию 1×10⁵ CD3⁺ Т-клеток/кг массы тела реципиента могут вводить, например, через 45 дней с последующей, например, через 2 месяца, третьей дозой, составляющей 1×10⁶ CD3⁺ Т-клеток/кг массы тела реципиента.

Согласно одному варианту осуществления пациенты с ранним молекулярным и/или гематологическим рецидивом могут получать тотальное облучение тела (TBI), тотальное облучение лимфоидной ткани (TLI), химиотерапевтическое средство и/или иммунотерапию антителами.

Таким образом, например, пациенты с рецидивирующей В-клеточной неходжкинской лимфомой могут получать ритуксимаб (например, в дозе 375 мг/м² каждую неделю) в течение приблизительно 4 недель с DLI, проводимой одновременно со второй дозой ритуксимаба.

Таким образом, например, пациенты с рецидивирующей множественной миеломой могут получать лечение с помощью бортезомиба (например, в дозе, составляющей 1,3 мг/м² в дни 1, 4, 8 и 11) перед началом DLI.

Используемый в настоящем документе термин "приблизительно" относится к ±10%.

Термины "содержит", "содержащий", "включает в себя", "включающий в себя", "характеризующийся" и их родственные слова означают "включающий в себя без ограничения".

Термин "состоящий из" означает "включая в себя и ограничиваясь этим".

Термин "состоящий по существу из" означает, что композиция, способ или структура может включать в себя дополнительные ингредиенты, стадии и/или части, но только если дополнительные ингредиенты, стадии и/или части не изменяют существенно основные и новые характеристики заявленной композиции, способа или структуры.

Используемые в настоящем документе формы единственного числа включают в себя ссылки на формы множественного числа, если в контексте ясно не указано иное. Например, термин "соединение" или "по меньшей мере одно соединение" может включать в себя множество соединений, включая в себя их смеси.

В настоящей заявке различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона представлено для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретное раскрытие всех возможных поддиапазонов, а также отдельных численных значений в пределах этого диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6 должно рассматриваться как конкретное раскрытие таких поддиапазонов, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельных численных значение в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применяется независимо от ширины диапазона.

Во всех случаях в настоящем документе, когда указан численных диапазон, это означает, что он включают в себя любое указанное число (дробное или целое) в пределах указанного диапазона. Фразы "в диапазоне/диапазоны между" первым указанным числом и вторым указанным числом и "в диапазон/диапазоны от" первого указанного числа "до" второго указанного числа используются в настоящем документе взаимозаменяемо и означают включение первого и второго указанных чисел и всех дробных и целых чисел между ними.

Используемый в настоящем документе термин "способ" относится к способам, средствам, техникам и процедурам для осуществления поставленной задачи, включая в себя без ограничения те способы, средства, техники и процедуры, которые либо являются известными, либо легко разрабатываются на основе известных способов, средств, техник и процедур специалистами в химической, фармакологической, биологической, биохимической и медицинских областях.

Следует понимать, что определенные признаки настоящего изобретения, который для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предусмотрены в комбинации в одном варианте осуществления. Напротив, различные признаки настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предусмотрены отдельно или в любой подходящей подкомбинации или подходящим образом в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться в качестве основных признаков этих вариантов осуществления, за исключением случаев, когда вариант осуществления является нефункциональным без указанных элементов.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, представленные в настоящем документе выше и заявленные в формуле изобретения ниже, находят экспериментальное подтверждение в последующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Последующие примеры вместе с представленными выше описаниями иллюстрируют настоящее изобретение неограничивающим образом.

Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура и используемые в настоящем изобретении лабораторные процедуры включают в себя молекулярные, биохимические, микробиологические техники и техники рекомбинантной ДНК. Такие техники всесторонне описаны в литературе. Смотрите, например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Bin-en et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методики, представленные в патентах США №№4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммуноанализы всесторонне описаны в патентной и научной литературе, смотрите, например, патенты США №№3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) и "Methods in Enzymology" Vol.1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе. Другие общие ссылки представлены по ходу настоящего документа. Считается, что описанные в них процедуры хорошо известны в настоящей области техники и представлены для удобства читателя. Вся содержащаяся в них информация включена в настоящий документ посредством ссылки.

ПРИМЕР 1

Стабильное приживление трансплантата HLA-несовместимого костного мозга после трансплантации "мегадозы" костного мозга и посттрансплантационного введения циклофосфамида

Материалы и экспериментальные процедуры

Животные

Используемые в настоящих исследованиях мыши представляли собой самок мышей возрастом 6-12 недель. Линии Balb/c-Nude (H-2d) и С3Н/Hen (H-2k) покупали в Harlan Israel (Rehovot, Израиль). Всех мышей содержали в небольших клетках (по 5 животных в каждой клетке) и кормили стерильной пищей и подкисленной водой. Эти исследования были одобрены Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных Института имени Вейцмана.

Протокол трансплантации

Клетки ВМ в низкой (5×10⁶) и высокой дозе (25×10⁶) от мышей Balb/c-Nude (которые представляют собой источник ВМ, подвергнутого деплеции Т-клеток) трансплантировали аллогенным реципиентам (C3H/HEn) в день 0 после in vivo T-клеточной циторедукции (TCD) с помощью антител к CD4 (клон GK1.5) и к CD8 (клон 53.6.72) (по 300 мкг каждое; Bio X Cell, NH, США), вводимых в день -6, и воздействия 2,0 Гр тотального облучения тела (TBI) в день -1. Высокую дозу циклофосфамида (CY, 100 мг/кг, Baxter Oncology, Германия) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации и донорский химеризм оценивали через 35 и 95 дней после трансплантации с использованием конъюгированных с флуоресцеином антител к Н-2 хозяина и донора (например, меченное F1TC антитело к H-2D, специфическое к клеткам донорского типа, и меченное РЕ антитело к H-2K, специфическое к клеткам характерного для хозяина типа).

Протокол трансплантации кожи

Кожные трансплантаты линии донорского типа (Balb/c) и независимой линии (C57BL/6) трансплантировали смешанным химерным реципиентам, как описано выше [т.е. тем мышам, которым предварительно трансплантировали мегадозу (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ и ввели высокую дозу CY] и мышам - реципиентам, которым инокулировали регулярную дозу (5×10⁶) клеток без-Т-клеточного ВМ и вводили высокую дозу CY.

Результаты

Для исследования потенциального синергизма между "мегадозой" без-Т-клеточного трансплантата костного мозга (ВМТ) и высокой дозы циклофосфамида (CY) после трансплантации, после кондиционирования сниженной интенсивности (RIC) мышей - реципиентом, проводили следующие эксперименты.

Мыши - реципиенты (C3H/Hen) получали лечение с помощью протокола кондиционирования перед трансплантацией без-Т-клеточного трансплантата костного мозга. В частности, на мышей воздействовали in vivo путем Т-клеточной циторедукции (TCD) с использованием антител к CD4 и CD8, вводимых в день -6, и путем воздействия с помощью 2,0 Гр тотального облучения тела (TBI) в день -1. Далее низкую (5×10⁶) или высокую дозу (25×10⁶) клеток ВМ Balb/c-Nude (обеспечивающих источник ВМ, подвергнутого деплеции Т-клеток, поскольку мыши Nude характеризуются минимальным содержанием зрелых Т-клеток) трансплантировали аллогенным реципиентам (C3H/Hen) в день 0. Высокую дозу циклофосфамида (CY, 100 мг/кг) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации. Оценку приживление трансплантата клеток костного мозга проводили с помощью оценки донорского химеризма в 35 и 95 дни после трансплантации.

Как показано на фигурах 1А-В и фигурах 2А-В, анализ химеризма в день 35 и день 95 выявил, что ни одна из контрольных мышей (подвергнутых кондиционированию с помощью TCD, 2 Гр TBI и необязательно CY, но которая не получила ВМ) не проявляла донорский химеризм. Аналогично, ни одна из мышей - реципиентов ВМ, которым трансплантировали регулярную дозу, составляющую 5×10⁶ без-Т-клеточного ВМ, в присутствии или при отсутствии лечения циклофосфамидом, не проявляла донорский химеризм. Тем не менее, когда дозу без-Т-клеточного ВМ увеличивали до 25×10⁶ клеток, долгосрочный смешанный химеризм достигался у 4 из 7 мышей, которые также получали лечение циклофосфамидом в дни +3 и +4 после трансплантации (смотрите фигуры 1А-В и фигуру 2С).

Последующее наблюдение за этими мышами - реципиентами в дни 180 и 225 после трансплантации выявило, что индуцированный химеризм был стабильным и долгосрочным (фигура 3). Как показано на фигуре 3, количество химерных реципиентов с клетками донорского типа и уровень донорского химеризма оставались неизменными через 225 дней после трансплантации, указывая на то, что была достигнута толерантность.

Индукцию толерантности измеряли путем трансплантации кожных трансплантатов от линии донорского типа (Balb/c) и независимой линии (C57BL/6) смешанным химерным реципиентам, которым трансплантировали мегадозу (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ и которым вводили высокую дозу CY (как описано выше), по сравнению с реципиентами, которым инокулировали регулярную дозу (5×10⁶) клеток без-Т-клеточного ВМ (как описано выше).

Как показано на фигурах 4А-В, три из 4 химерных мышей, которым трансплантировали 25×10⁶ без-Т-клеточного ВМ, приживляли трансплантат от линии донорского типа и отторгали кожные трансплантаты от независимой линии. Напротив, мыши - реципиенты, которым инокулировали 5×10⁶ клеток без-Т-клеточного ВМ и CY, отторгали кожные трансплантаты как от линии донорского типа, так и от независимой линии (фигура 4А).

Эти результаты показывают, что комбинация мегадозы без-Т-клеточного ВМ и лечения циклофосфамидом в высокой дозе обеспечивает успешное приживление трансплантата гемопоэтических стволовых клеток, в режиме кондиционирования сниженной интенсивности наряду с индукцией толерантности.

Опираясь на эти результаты, инициировали ряд калибровочных экспериментов для определения оптимального облучения и дозы циклофосфамида для улучшения индукции химеризма с помощью указанного подхода.

ПРИМЕР 2

Эффект различных доз тотального облучения тела (TBI) на химеризм

Материалы и экспериментальные процедуры

Животные

Как описаны в примере 1, в настоящем документе выше.

Протокол трансплантации

Высокую дозу (25×10⁶) клеток ВМ Balb/c-Nude (обеспечивающих источник ВМ, подвергнутого деплеции Т-клеток) трансплантировали аллогенным реципиентам (C3H/Hen) в день 0 после in vivo Т-клеточной циторедукции (TCD) с помощью антител к CD4 (клон GK1.5) и к CD8 (клон 53.6.72) (по 300 мкг каждое; Bio X Cell, NH, США), вводимых в день -6, и воздействия различных доз облучения в диапазоне от 1 до 3,5 Гр TBI в день -1. Высокую дозу циклофосфамида (CY, 100 мг/кг, Baxter Oncology, Германия) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации и донорский химеризм оценивали через 30 дней после трансплантации с использованием конъюгированных с флуоресцеином антител к Н-2 хозяина и донора (например, меченное F1TC антитело к H-2D^d, специфической к клеткам донорского типа, и меченное РЕ антитело к Н-2K^k, специфическое к клеткам характерного для хозяина типа).

Результаты

В указанном эксперименте определили минимальную дозу облучения. "Мегадозу" (25×10⁶) без-Т-клеточного ВМ Balb/c-Nude трансплантировали 5 группам аллогенных реципиентов (C3H/Hen) в день 0 после Т-клеточной циторедукции (с антителами к CD4 и CD8) в день -6, и различными дозами облучения (в диапазоне от 1 до 3,5 Гр TBI) в день -1. Высокую дозу циклофосфамида (CY) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации и донорский химеризм оценивали через 30 дней после трансплантации.

Как видно на фигуре 5, все мыши - реципиенты, которых облучали с помощью 2,5, 3 или 3,5 Гр TBI (6/6), были химерными, проявляющими донорский химеризм в диапазоне 58-83%. Аналогично, 87% (13/15) мышей, на которых воздействовали с помощью 2 Гр TBI, проявляли донорский химеризм в диапазоне 56-85%.

Дальнейшее снижение дозы облучения до 1,0 Гр вызывало небольшое снижение процентного отношения химерных мышей, которое составляло 83% (5/6), тем не менее диапазон донорского химеризма был существенно снижен до 14,5-58%.

ПРИМЕР 3

Эффект различных доз циклофосфамида (CY) на химеризм

Материалы и экспериментальные процедуры

Животные

Как описаны в примере 1, в настоящем документе выше.

Протокол трансплантации

Высокую дозу (25×10⁶) клеток ВМ Balb/c-Nude (обеспечивающих источник ВМ, подвергнутого деплеции Т-клеток) трансплантировали аллогенным реципиентам (C3H/Hen) в день 0 после in vivo Т-клеточной циторедукции (TCD) с помощью антител к CD4 (клон GK1.5) и к CD8 (клон 53.6.72) (каждое по 300 мкг; Bio X Cell, NH, США), вводимых в день -6, и воздействия 2,0 Гр тотального облучения тела (TBI) в день -1. Различные дозы циклофосфамида (CY, 100 мг/кг, 125 мг/кг или 150 мг/кг, Baxter Oncology, Германия) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации и донорский химеризм оценивали через 30 дней после трансплантации с использованием конъюгированных с флуоресцеином антител к Н-2 хозяина и донора (например, меченное F1TC антитело к H-2D^d, специфической к клеткам донорского типа, и меченное РЕ антитело к Н-2K^k, специфическое к клеткам характерного для хозяина типа).

Результаты

В настоящем эксперименте определили оптимальную дозу CY после трансплантации. "Мегадозу" (25×10⁶) клеток ВМ Balb/c-Nude трансплантировали 3 группам аллогенных реципиентов (C3H/Hen) в день 0 после Т-клеточной циторедукции (TCD) с помощью антител к CD4 и CD8 в день -6, и 2 Гр TBI в день -1. Различные дозы циклофосфамида (CY), 100 мг/кг, 125 мг/кг или 150 мг/кг, вводили в дни +3 и +4 после трансплантации и донорский химеризм оценивали через 30 дней после трансплантации.

Как показано на фигуре 6, увеличение дозы CY до 125 мг/кг или 150 мг/кг не обеспечивало существенного усиления химеризма. Таким образом, мыши реципиенты, которым вводили 100 мг/кг, 125 мг/кг или 150 мг/кг CY, проявляли средние значения донорского химеризма, составляющие 57,5±25,8, 66,5±20,6 или 67,4±27,4, соответственно. Не обнаружена статистическая значимость при сравнении реципиентов, получивших лечение с помощью 100 мг/кг, с реципиентами, получившими лечение с помощью 125 мг/кг или 150 мг/кг (Р=0,5 и р=0,469 соответственно).

ПРИМЕР 4

Не относящиеся к CD8⁺ Т-клетки не являются важными для достижения химеризма путем комбинации "мегадозы" без-Т-клеточного ВМ с введением СУ после трансплантации

Материалы и экспериментальные процедуры

Животные

Как описаны в примере 1, в настоящем документе выше.

Протокол трансплантации

Высокую дозу (25×10⁶) подвергнутых деплеции CD8 и не подвергнутых деплеции клеток ВМ Balb/c-Nude трансплантировали 2 когортам аллогенных реципиентов (C3H/Hen) в день 0 после in vivo Т-клеточной циторедукции (TCD) с помощью антител к CD4 (клон GK1.5) и к CD8 (клон 53.6.72) (каждое по 300 мкг; Bio X Cell, NH, США), вводимых в день -6, и воздействия 2,0 Гр тотального облучения тела (TBI) в день -1. Высокую дозу циклофосфамида (CY, 100 мг/кг, Baxter Oncology, Германия) вводили в дни +3 и +4 после трансплантации и донорский химеризм оценивали через 30 дней после трансплантации с использованием конъюгированных с флуоресцеином антител к Н-2 хозяина и донора (например, меченное F1TC антитело к H-2D^d, специфической к клеткам донорского типа, и меченное РЕ антитело к Н-2K^k, специфическое к клеткам характерного для хозяина типа).

Источником ВМ в настоящих экспериментах являлись мыши Balb/c-Nude. Более того, мыши, которым проводили трансплантацию в указанных экспериментах, были бестимусными, и по существу они не содержали Т-клетки. Тем не менее, для опровержения возможности того, что эффект был обусловлен остаточными не относящимися к CD8 Т-клетками, препарат ВМ от мышей Balb/c-Nude подвергали отрицательной сортировке в отношении С08-клеток с использованием системы сортировки клеток (например, магнитных микрочастиц к CD8 или сортера FACS).

Результаты

Поскольку ранее Ildstad с соавт. предполагали, что клетки ВМ подкласса CD8⁺ TCR^- являются критически важными для достижения донорского химеризма [Fugier-Vivier IJ et al., J Exp Med (2005) 201:373-383; Grimes HL et al., Exp Hematol. (2004) 32:946-954; Huang Y et al., Blood (2011) 117:2494-2505; Kaufman CL et al., Blood (1994) 84:2436-2446; Leventhal J et al., BMC Med (2012) 10:48; Leventhal J et al., Sci Transi Med. (2012) 4:124ra128], авторы настоящего изобретения подвергли деплеции остаточные CD8⁺ клетки из препарата "мегадозы" ВМ Balb/c-Nude и измерили индукцию химеризма по сравнению с контрольными не подвергнутыми деплеции CD8⁺ клеток ВМ Nude.

Как показано на фигуре 7, деплеция CD8⁺ Т-клеток из препарата ВМ не оказывала какого-либо неблагоприятного воздействия на уровень достигнутого химеризма при комбинации "мегадозы" клеток без-Т-клеточного ВМ с посттрансплантационным введением CY.

ПРИМЕР 5

Клинический протокол

Схема исследования

Исследование представляет собой проспективное, наблюдательное многоцентровое исследование 1/11 фазы. Десять пациентов с гематологическими нарушениями будут вовлечены в настоящее исследование в течение периода, составляющего один год.

Первичным конечным показателем исследования является приживление трансплантата, и 10 подлежащих оцениванию пациентов (т.е. пациентов, выживших в период после 28 дня) будут включены в исследование. Приемлемый показатель первичной недостаточности трансплантата или отторжения составляет приблизительно 10%.

Длительность исследования

Первичный анализ будут проводить с использованием данных последующего наблюдения в течение 6 и 12 месяцев. Пациентов будут подвергать последующему наблюдению до достижения 48 месяцев после трансплантации.

Определения

Стабильное длительное приживление трансплантата определяют по показателям содержания нейтрофилов, составляющего больше чем 1000/мкл в течение трех последовательных дней, и содержания тромбоцитов, составляющего больше чем 20000/мкл в течение трех последовательных дней без трансфузии.

Отторжение трансплантата определяют как быстрое падение содержания нейтрофилов, составляющее меньше чем 100/мкл после документально зарегистрированного приживления нейтрофилов, с увеличением лимфоцитов или без него.

Недостаточность трансплантата определяют как невозможность достижения содержания больше чем 1000/мкл нейтрофилов в течение трех последовательных дней и больше чем 20000/мкл тромбоцитов в течение трех последовательных дней без трансфузии в день +28.

Вторичный конечный показатель исследования представляет собой частоту возникновения острой GVHD II-I V степени. Приемлемая частота возниконовения острой GVHD II-IV степени составляет приблизительно 10%.

Для острой GVHD критерии определения степени представлены в таблицах 1А-В ниже.

Таблица 1А
Клиническая оценка стадии острой GVHD
Стадия	Кожа	Печень	Кишечник
+	Сыпь больше чем 25%	Билирубин =2-3 мг/дл	Диарея 500-1000 мл
++	Сыпь 25-50%	Билирубин =3-6 мг/дл	Диарея 1000-15 00 мл
+++	Генерализованная эритродермия	Билирубин =6-15 мг/дл	Диарея больше чем 1500 мл
++++	Шелушение и пузыри	Билирубин больше чем 15 мг/дл	Боль или кишечная непроходимость

Таблица 1В
Клиническая оценка степени острой GVHD
Стадия	Кожа	Печень	Кишечник	Функциональное нарушение
0 нет	0	0	0	0
I легкая	+ до ++	0	0	0
II умеренная	+ до +++	+	+	+
III тяжелая	++ до +++	++ до +++	++ до +++	++
IV/угрожающая жизни	++ до ++++	++ до ++++	++ до ++++	+++

Статистические аспекты

Временные интервалы для определения показателей приживления трансплантата, выживаемости, выживаемости без заболевания, частоты рецидива и риска связанной с трансплантацией смертности будут рассчитывать, начиная с даты трансплантации стволовых клеток. Вероятностные кривые будут рассчитывать согласно методу Каплана-Майера.

Критерии отбора

Критерии включения - пациент

- Возраст - больше или равен 18 и меньше или равен 70 годам

- Пациенты с CLL с рефрактерностью к флударабину или другой химиотерапии вследствие потери р53 путем делеции 17р и/или мутации ТР53

- Фолликулярная лимфома с любой неблагоприятной цитогенетикой, такой как комплексный кариотип, делеция 17р, делеция 6q23-26, мутации в ТР53, минус 1р

- Лимфома Ходжкина, рецидивирующая после аутологичной трансплантации, не поддающаяся иммунотерапии с помощью антитела к CD30

- Множественная миелома, рецидивирующая после аутологичной трансплантации, с неблагоприятной цитогенетикой либо в частичной, либо в полной ремиссии

- Тяжелая апластическая анемия, рецидивирующая после иммунотерапии

- Отсутствие полностью HLA-совместимого или HLA-несовместимого по одному локусу родственного донора

- Отсутствие совместимого неродственного донора или отсутствие права на поиск донора в регистре доноров (IBMDR)

- Присутствие гаплоидентичного родственного донора и резерв аутологичных стволовых клеток пациента

- Стабильные клинические состояния и ожидаемая продолжительность жизни, составляющая больше 12 недель

- Индекс Карнофски - больше 70%

- Письменное информированное согласие

Оценка предыдущего лечения

- полная клиническая история и исследование и определение индекса общего состояния и площади поверхности тела

- клинический анализ крови

- группа крови, подгруппы эритроцитов, типа анти-А и/или анти-В агглютининов

- клиренс креатинина, содержание мочевой кислоты, ферритина, лактатдегидрогеназы, бета-2-микроглобулина, протеинограмма, ACT, АЛТ, анализ мочи, содержание глюкозы в крови, содержание азота в крови, содержание иммуноглобулинов, реакции Кумбса

- проба на наличие беременности

- определение антител к ВИЧ, поверхностного антигена вируса гепатита В, ДНК вируса гепатита В, антител в вирусу гепатита С, РНК вируса гепатита С, антител к цитомегаловирусу, антител к токсоплазме, антител к вирусу простого герпеса

- ЭКГ и измерение фракции выброса с помощью ультразвукового или сцинтиграфического исследования

- рентгенография органов грудной клетки.

- компьютерная томография легких, мозга, гайморовой полости

- рентгенограмма зубов и ее изучение

- биопсия и аспират костного мозга для морфологического и цитогенетического анализа, поиска молекулярного маркера (если таковой известен) и анализа FACS (в соответствии с основным заболеванием)

- нейрологическое обследование и спинномозговая пункция у находящегося в группе риска пациента

- радиологическое сканирование (КТ, ЯМР) локализации известного заболевания

- полное серологическое и молекулярное HLA-типирование, исследование культур ML и цитотоксичности с выбранными донорами

- цитотоксические антитела к HLA

- абдоминальная эхография

Критерии исключения - Пациент

- Заболевание с локализацией в центральной нервной системе в анамнезе

- Положительный статус в отношении ВИЧ, вируса гепатита С, РНК вируса гепатита С, поверхностного антигена вируса гепатита В, ДНК вируса гепатита В

- Активная и документально зафиксированная пневмония любого вида, грибковая инфекция тканей, вирусные положительные культуры в секреции из органов дыхания или крови

- билирубин больше чем в 2 раза превышает норму

- клиренс креатинина в крови меньше чем 50 мл/мин

- DLCO меньше чем 50% от прогнозируемого значения

- фракция выброса меньше 45% (или миокардиальный инсульт за последний год)

- беременность или лактация

- психиатрические нарушения

Критерии отбора - Донор

- Отсутствие гемопоэтического или связанного с функцией костного мозга заболевания, которое препятствует забору достаточных количеств нормальных клеток - предшественников

- Отсутствие любого медицинского состояния, которое будет представлять существенный риск здоровью при осуществлении забора стволовых клеток периферической крови

- Отрицательные анализы на ВИЧ, HTLV-1

- Любой здоровый член семьи будет рассматриваться в качестве донора гемопоэтических стволовых клеток. Выбор донора будет основан на типировании HLA-А, В, С, DR-локусов, которое необходимо провести на реципиенте, родных братьях и сестрах, родителях и возможно других членах семьи, таких как тети, дяди и двоюродные братья и сестры. Перспективный родственный донор должен быть по меньшей мере генотипически HLA-A, В, С, DR-гаплоидентичным пациенту, но может отличаться по 2-3 HLA-аллелям на не являющимся общим гаплотипе

- Донора будут выбирать предпочтительно на основании аллореактивности NK донора-против-реципиента

Оценка донора

- Полная история болезни, физический осмотр и физическое обследование вен сотрудниками осуществляющей аферез службы для определения пригодности для афереза через периферические вены

- Анализы крови: абсолютное содержание лейкоцитов, содержание тромбоцитов, гемоглобин, протромбиновое время, частичное тромбоплатиновое время, общий белок, альбумин, электролиты, глюкоза, АСТ/АЛТ, щелочная фосфатаза, билирубин, лактатдегидрогеназа, мочевая кислота, креатинин

- Серологический анализ на цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус простого герпеса, вирус Варицелла-Зостер, гепатит В+С, ВИЧ, токсоплазму

- Полное типирование эритроцитов

- Серологический анализ на сифилис, вирус Эпштейна-Барра, вирус простого герпеса, вирус Варицелла-Зостер, гепатит В+С, HTLV-1, ВИЧ, токсоплазмоз

- Исследование в отношении передаваемых с трансфузией заболеваний должно проводиться за 30-7 дней перед забором стволовых клеток

- Рентгенография органов грудной клетки

- ЭКГ

- Анализ локусов с варьирующим числом тандемных повторов (VNTR) с помощью ПЦР

- Донорам будут отдавать предпочтение на основании более молодого возраста, лучшего состояния здоровья и если они являются ЦМВ-отрицательными для ЦМВ-отрицательных реципиентов

Критерии исключения - Донор

- Положительный анализ на ВИЧ или HTLV-1 или доказательства активной/персистирующей инфекции вирусного гепатита будут исключать донора из участия в настоящем исследовании.

- Присутствие любого медицинского состояния которое будет представлять существенный риск здоровью при осуществлении забора стволовых клеток периферической крови (т.е. инсулинзависимый диабет, сердечно-сосудистые нарушения, хронические воспалительные заболевания).

Процедуры лечения

Мобилизация HSC донора и обработка трансплантата.

Необходимо, чтобы пациенты имели родственного донора (в возрасте от 18 до 60 лет), готового и способного стать донором стимулированных филграстимом/ленограстимом гемопоэтических клеток периферической крови. Доноров будут подвергать отбору согласно общим правилам станции переливания крови. Рекомендуется проводить исследование ЭКГ с нагрузкой у доноров возрастом старше 50 лет. Нормальные доноры будут получать филграстим или ленограстим 5 мкг/кг подкожно каждые 12 часов; на 5 день будут начинать лейкаферез. Дозировку филграстима/ленограстима будут регулировать для поддержания содержания лейкоцитов ниже 60×10⁹/л. На 4-ый день лечения филграстимом/ленограстимом, если количество циркулирующих CD34+ клеток составляет больше чем 40/мкл, донор будет начинать лейкаферез. Ежедневный лейкаферез будет продолжаться в течение запланированных 3 дней, максимум 4 дней, для забора необходимой дозы клеток, составляющей больше чем 10×10⁶ CD34+ клеток/кг. Если цель достигнута раньше, забор могут продолжать в течение в целом 3 дней для получения наибольшей возможной дозы. Если донор не переносит процедуру в любой из составляющих ее частей, могут использовать альтернативного донора, если таковой доступен. Если из одного места невозможно собрать больше чем 10×10⁶ CD34+ клеток/кг от соответствующего донора, пациенты не имеют права продолжать участие в исследовании. РВРС будут подвергать деплеции донорских Т- и В-клеток путем селекции CD3+ и/или CD19+ клеток с использованием системы сортировки клеток (например, анти-CD3/19 магнитных микрочастиц или сортера FACS). Необходимый объем CD34-положительных клеток будет составлять по меньшей мере 10×10⁶/кг массы тела реципиента.

Аферез будут проводить через латеральные подкожные вены руки.

Таблица 2
Режим кондиционирования
день -7	Флударабин 30 мг/м2
день -6	Флударабин 30 мг/м2
день -5	Флударабин 30 мг/м2
день -4	Флударабин 30 мг/м2
день -3	Флударабин 30 мг/м2
день -2	TBI 2 Гр однократная фракция
день-1	Покой
день 0	Трансплантация
день +1	Покой
день +2	Покой
день +3	CY 50 мг/кг
день +4	CY 50 мг/кг

Как описано в таблице 2 выше, флударабин будут вводить внутривенно ежедневно в течение 5 последовательных дней, -7, -6, -5, -4 и -3, в дозе, составляющей 30 мг/м². Каждую дозу будут инфузировать в течение 30 минут. TBI 200 сГр будут осуществлять в день -1 в однократной фракции.

В день 0, CD3^-/CD19^- подвергнутые иммуноселекции HSC будут оттаивать, отмывать и инфузировать через центральный доступ.

CY будут вводить внутривенно в течение одного часа в дни+3 и+4 после трансплантации в дозе 50 мг/кг/день.

Специальные предписания ведения пациентов

а. двупросветный центральный венозный катетер будут помещать до осуществления режима кондиционирования;

b. для профилактики образования уратов будут перорально вводить аллопуринол в дозе 300 мг;

с. противорвотную терапию будут проводить согласно указаниям из единого исследовательского центра;

d. при трансфузии фильтрованных и облученных препаратов крови поддерживать содержание гемоглобина больше чем 8 г/л и содержание тромбоцитов больше чем 15000/мкл при отсутствии лихорадки или признаков кровотечения.

Мониторинг пациентов в течение лечения

а. ежедневный общий анализ крови и лейкоцитарная формула

b. креатинин в сыворотке, Na+, K+, Са++, билирубин ежедневно в ходе химиотерапии и гипергидратации

с. анализы функции печени, альбумин, анализы коагуляции с определением антитромбина III, цитомегаловирусной антигенемии и ПЦР дважды в неделю

d. надзор за культурами согласно центральным указаниям

Оценка токсичности

Токсичность будут оценивать согласно критериям ВОЗ, как показано в таблице 3 ниже.

Таблица 3
Критерии токсичности согласно ВОЗ
	Степень 0	Степень 1	Степень 2	Степень 3	Степень 4
Гематологические
Гемоглобин	≥11,0 г/дл ≥6,8 ммоль/л	9,5-10,9 г/дл 5,6-6,7 ммоль/л	8,0-9,4 г/дл 4,9-5,6 ммоль/л	6,5-7,9 г/дл 4,0-4,9 ммоль/л	<6,5 г/дл <4,0 ммоль/л
Лейкоциты (1000/мм)	≥4,0	3,0-3,9	2,0-2,9	1,0-1,9	<1,0
Гранулоциты (1000/мм)	≥2,0	1,5-1,9	1,0-1.4	0,5-0,9	<0,5
Тромбоциты (1000/мм)	≥100	75-99	50-74	25-49	<25
Кровотечение	Нет	Петехиально	Слабая кровопотеря	Обширная кровопотеря	Изнурительная кровопотеря
Желудочно-кишечные
Билирубин	≤1,25×N*	1,26-2,5×N*	2,6-5×N*	5,1-10×N*	>10×N*
Трансаминазы (АСТ/АЛТ)	≤1,25×N*	1,26-2,5×N*	2,6-5×N*	5,1-10×N*	>10×N*
Щелочная фоефатаза	≤1,25×N*	1,26-2,5×N*	2,6-5×N*	5,1-10×N*	>10×N*
Оральные	Без изменения	Болезненность/эритема	Эритема, язвы: может есть твердую пищу	Язвы: нуждается только в жидкой диете	Питание невозможно
Тошнота/рвота	Нет	Тошнота	Временная рвота	Рвота, требующая лечения	Неукротимая рвота
Диарея	Нет	Временная<2 дней	Переносимая, но >2 дней	Непереносимая, требующая лечения	Геморрагическая, обезвоживание
Почечные

Мочевина крови или креатинин	≤1,25×N*	1,26-2,5×N*	2,6-5×N*	5-10×N*	>10×N*
Протеинурия	Без изменения	1+<0,3 г% <3 г/л	2-3+0,3-1,0 г% 3-10 г/л	4+>1,0 г%>10 г/л	Нефротический синдром
Гематурия	Без изменения	Микроскопическая	Обширная	Обширная + тромбы	Обструктивная уропатия
Пульмонарные критерии	Без изменения	Слабые симптомы	Одышка при физической нагрузке	Одышка в покое	Необходим полный постельный режим
Лихорадка с жаропонижающим	Нет	Лихорадка <38°C	Лихорадка 38-40°C	Лихорадка >40°C	Лихорадка с гипотонией
Аллергические	Без изменения	Отек	Бронхоспазм: нет необходимости в парентеральной терапии	Бронхоспазм: требуется парентеральная терапия	Анафилаксия
Кожные	Без изменения	Эритема	Сухое шелушение, везикуляция, зуд	Влажное шелушение, изъязвление	Эксфолиативный дерматит: некроз. требующий хирургического вмешательства
Волосы	Без изменения	Минимальная потеря волос	Умеренная, частичная алопеция	Полная алопеция, но обратимая	Необратимая алопеция
Инфекция (установить локализацию)	Нет	Незначительная инфекция	Умеренная инфекция	Обширная инфекция	Обширная инфекция с гипотонией
Кардиологические
Сердечный ритм	Без изменения	Синусовая тахикардия, >110 в покое	Монофокусная экстрасистолия, предсердная аритмия	Многофокусная экстрасистолия	Желудочковая тахикардия
Функция	Без изменения	Асимптоматический, но аномальный сердечный симптом	Временная симптоматическая дисфункция: нет необходимости в лечении	Симптоматическая дисфункция, реагирующая на лечение	Симптоматическая дисфункция, не реагирующая на лечение

Перикардит	Без изменения	Асимптоматический экссудат	Симптоматический: нет необходимости в пункции	Тампонада: необходима пункция	Тампонада: необходима операция
Нейротоксичность
Состояние сознания	В ясном сознании	Временная терапия	Сонливость<50% часов бодрствования	Сонливость>50% часов бодрствования	Кома
Периферические	Нет	Парестезии и/или сниженные сухожильные рефлексы	Тяжелые парестезии и/или небольшая слабость	Непереносимые парестезии и/или значительная утрата двигательной функции	Паралич
Запор**	Нет	Слабый	Умеренный	Вздутие живота	Вздутие и рвота
Боль	Нет	Слабая	Умеренная	Тяжелая	Некупируемая
N* верхняя граница нормального значения в исследуемой популяции.
** Указанная доза не включает в себя запор в результате приема наркотических средств
+ Рассматривается только связанная с лечением боль, а не связанная с заболеванием боль.

Применение наркотических средств может быть эффективно в ослаблении боли в зависимости от переносимости пациента.

Поддерживающая терапия

Мониторинг и лечение бактериальных и грибковых инфекций

За пациентами ухаживают в изолированных палатах с ламинарным потоком воздуха или высокоэффективной фильтрацией микрочастиц в воздухе. Липосомальный амфотерицин вводят в дозе 1 мг/кг/день, начиная с дня -5 до приживления трансплантата в качестве противогрибковой профилактики. Бактериальные инфекции подвергают мониторингу с помощью взятия мазков и гемокультур каждую неделю. Внутривенную антибактериальную терапию начинают на основании клинических признаков инфекции (лихорадка неизвестного генеза) или положительных гемокультур. Если у пациента все еще наблюдается жар через 72 часов, эмпирическую противогрибковую терапию начинают с использованием или L-AMB в дозе 3 мг/кг/день, или вариконазола в дозе 8 мг/кг/день внутривенно. Ванкомицин добавляют через следующие 72 часа лихорадки, или в присутствии грам + сепсиса, или положительной гемикультуры.

Профилактика, мониторинг и лечение цитомегаловирусных инфекций

У реципиентов, которые являются сероположительными в отношении антитела к ЦМВ, профилактика ЦМВ состоит из введения ганцикловира (10 мг/кг/день) между десятым и вторым днем перед инфузией стволовых клеток. Ганцикловир повторно вводят в качестве упреждающей терапии с дня +21 до дня +360. ЦМВ-антигенемию/ПЦР определяют каждую неделю в образцах крови. Если развивается ЦМВ-антигенемия/ПЦР, то пациенты будут получать лечение с помощью ганцикловира (10 мг/кг/день) или фоскарнета (180 мг/кг/день).

Перед трансфузией препараты крови облучают (30 Гр).

Посттрансплатационная лабораторная оценка:

1. Ежедневно полные гемограммы, до самоподдержания содержания гранулоцитов и тромбоцитов, затем три раза в неделю до выписки; по меньшей мере каждую неделю после выписки до 100 дня и затем каждые 2 недели до 12 месяцев.

2. Скрининг профиля с анализами функций печени и почек дважды каждую неделю в течение первых 30 дней, затем каждую неделю до выписки; чаще, если есть клинические показания.

3. Аспираты костного мозга для морфологического анализа химеризма с помощью FISH (несовместимые по полу трансплантаты) или цитогенетического исследования будут проводить приблизительно через 1, 3, 6, 12 месяцев, и каждые 4 месяца после этого в течение приблизительно 3 лет. Дополнительный анализ будут проводить в случае клинических показаний. Пациенты с CML также будут подвергаться мониторингу показателя рецидива bcr/abl

4. Иммунологическое восстановление будут подвергать мониторингу с помощью анализов in vitro, включающих в себя фенотипический анализ циркулирующих лимфоцитов, оценку функции натуральных киллеров и активированных лимфокинами клеток-киллеров, реакции трансформации лимфоцитов на Т-клеточные и В-клеточные митогены и содержание иммуноглобулинов.

Последующее наблюдение

До дня +90 клинические анализы крови, анализ антигенемии и ПЦР на ЦМВ, С-реактивный белок, полный анализ функций печени и почек будут проводить дважды в неделю.

Каждые две недели до +90 анализ фенотипа периферической крови (CD3, CD4, CD8, CD 19, CD56, CD57, HLADR), рентгенография органов грудной клетки.

Каждые две недели от +90 до +180:

клинические анализы крови, антигенемия и ПЦР на ЦМВ, С - реактивный белок, полный анализ функций печени и почек.

Каждый месяц:

Содержание иммуноглобулинов, протеинограмма,

после +90 анализ фенотипа периферической крови (CD3, CD4, CD8, CD 19, CD56, CD57, HLADR), рентгенография органов грудной клетки.

после +180 клинические анализы крови, антигенемия и ПЦР на ЦМВ, С-реактивный белок, полный анализ функций печени и почек.

Полное рестадирование заболевания будут проводить через 2, 4, 6, 8, 12, 18 и 24 месяцев после трансплантации, затем ежегодно, оно включает в себя оценку донорского химеризма с помощью анализа ПЦР HLA на клетках периферической крови и костного мозга.

Критерии определения степени общего состояния показаны в таблице 4 ниже.

Таблица 4
Шкала оценки общего состояния по Карнофски
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ	ОЦЕНКА В БАЛЛАХ	ГРУППОВЫЕ БАЛЛЫ
Нормальное. Отсутствие жалоб. Отсутствие признаков заболевания.
Способен совершать нормальную деятельность. Незначительные признаки или симптомы заболевания.	100
90	Восстановившийся (80+)
Нормальная деятельность с определенными усилиями. Некоторые признаки или симптомы заболевания.	80
Заботится о себе. Не способен совершать нормальную деятельность или совершать активную работу.	70	Только самообслуживание (70-90)
Нуждается в периодической помощи, но способен обеспечить большинство потребностей.	60
Нуждается в значительной помощи и частом медицинском уходе.	50	Нуждается в сиделке (40-69)
Недееспособный. Нуждается в специальном уходе и помощи.	40
Недееспособный в тяжелой степени. Показана госпитализация, хотя смертельный исход не угрожает.	30	Нуждается в помещение в специализированное учреждение (1-39)
Очень слабый. Необходима госпитализация.	20
Агональное состояние. Прогрессирующие летальные процессы.	10
0
Смерть.

Запрограммированные инфузии донорских лимфоцитов

Инфузии донорских лимфоцитов (DLI) эффективны в лечении рецидивов после аллогенной HSCT. Тем не менее, успех DLI был в определенной степени ограничен ассоциированной GVHD заболеваемостью и смертностью. Дробные дозы Т-клеток менее вероятно вызовут GVHD, чем одна большая инфузия и, вероятно, являются эффективными в индукции ремиссии [Dazzi, Szydio et al.. Blood, (2000) 96: 2712-6]. Недавнее исследовании подбора дозы показало, что 1×10⁴ не подвергшихся манипуляции CD3⁺ лимфоцитов/кг массы тела реципиента можно безопасно инфузировать пациентам, которые провели без-Т-клеточную гаплоидентичную трансплантацию [Lewalle P. et al. Bone Marrow Transplant (2002) 29 (suppi 2): S26, 0164a].

Пациенты с ранним молекулярным и/или гематологическим рецидивом будут получать первую дозу, составляющую 1×10 CD3⁺ клеток/кг массы тела реципиента; при отсутствии GVHD вторую инфузию 1×10⁵ CD3⁺ клеток/кг будут вводить через 45 дней с последующим введением через 2 месяца третьей дозы, составляющей 1×10⁶ CD3⁺ клеток/кг. Доноры будут подвергаться лейкаферезу для забора лимфоцитов перед мобилизацией гемопоэтических клеток, поскольку было показано, что G-CSF оказывает иммунномодулирующий эффект на некоторые субпопуляции Т-лимфоцитов, снижая их реактивность на аллогенные стимулы. Замороженные препараты будут оттаивать и быстро инфузировать в течение периода, составляющего 5-10 минут. Пациенты с острой GVHD или которые не демонстрируют приживления гематологического трансплантата не будут получать DLI.

Пациенты с рецидивирующей В-клеточной неходжкинской лимфомой будут получать ритуксимаб в дозе 375 мг/м² каждую неделю в течение 4 недель с DLI, проводимой одновременно со второй дозой ритуксимаба. Пациенты с рецидивирующей множественной миеломой будут получать лечение бортезомибом (1,3 мг/м² в дни 1, 4, 8 и 11) перед началом DLI.

После DLI не будут применять никаких иммуносупрессивных средств.

Хотя настоящее изобретение было описано вместе с его конкретными вариантами осуществления, очевидно, что многие альтернативы, модификации и варианты станут очевидными специалистам в настоящей области техники. Соответственно, предусмотрено включение всех таких альтернатив, модификаций и вариантов, которые находятся в пределах сущности и широкого объема прилагаемой формулы изобретения.

Все упомянутые в настоящем описании изобретения публикации, патенты и патентные публикации полностью включены в настоящее описание в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент или патентная публикация была специально и отдельно включена в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, цитирование или определение любой ссылки в настоящей заявке не должно быть истолковано как допущение того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня техники настоящего изобретения. В тех случаях, когда используются названия разделов, они не должны рассматриваться в качестве обязательным образом ограничивающих.

1. Способ лечения субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, включающий:

(а) трансплантацию субъекту дозы незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанная доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают путем сепарации указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из:

(I) способа, включающего

(i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем указанное антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства;

(ii) иммобилизацию указанных незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с указанным антителом, меченным указанным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля;

(iii) отмывку указанной матрицы для удаления несвязанных клеток; и

(iv) удаление указанного магнитного поля для элюирования связанных клеток из указанной матрицы;

(II) на основании продукта, секретируемого указанными Т-клетками; и

(III) на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β;

и впоследствии

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем указанное терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела субъекта, и где указанный циклофосфамид вводится субъекту после трансплантации, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий:

(i) кондиционирование субъекта в режиме кондиционирования сниженной интенсивности перед стадией (а); или

(ii) кондиционирование субъекта путем in vivo Т-клеточной циторедукции перед стадией (а), и необязательно при котором указанную in vivo Т-клеточную циторедукцию осуществляют с помощью антител.

3. Способ по п. 1, при котором доза указанных незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, содержит 5-40×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта.

4. Способ по п. 1, при котором указанные незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками:

(i) содержат меньше чем 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на кг массы тела субъекта; или

(ii) получают с помощью MACS™.

5. Способ по п. 1, при котором:

если указанный поверхностный маркер представляет собой Т-клеточный поверхностный маркер, указанные несвязанные клетки содержат незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками; или

если указанный поверхностный маркер представляет собой поверхностный маркер незрелых гематопоэтических клеток, указанные связанные клетки содержат незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками.

6. Способ по п. 1, дополнительно включающий сепарацию В-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, путем применения антитела, которое специфически связывается с В-клеточным поверхностным маркером.

7. Способ по п. 1, при котором:

(i) указанная матрица представляет собой ферромагнитную матрицу или содержит сферы магнитно-чувствительного или ферромагнитного материала; или

(ii) при котором указанное магнитно-чувствительное средство включает в себя суперпарамагнитную частицу и необязательно при котором указанную суперпарамагнитную частицу конъюгируют с указанным антителом в комбинации со специфической к антииммуноглобулину, авидину и/или антигаптену микрочастицей.

8. Способ по п. 1, при котором указанную сепарацию указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток осуществляют с использованием сепарации в высокоградиентном магнитном поле (HGMS) или с использованием разделительной колонки.

9. Способ по п. 1, при котором указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают от несингенного донора.

10. Способ по п. 1, при котором субъект представляет собой субъекта - человека.

11. Способ по п. 2, при котором указанное кондиционирование сниженной интенсивности включает немиелоаблативное кондиционирование и необязательно при котором указанное немиелоаблативное кондиционирование включает в себя по меньшей мере одно из тотального облучения тела (TBI), тотального облучения лимфоидной ткани (TLI), химиотерапевтического средства и/или иммунотерапии антителами.

12. Способ по п. 11, при котором:

(i) указанное TBI включает дозу однократного или фракционированного облучения в пределах диапазона, выбранного из группы, состоящей из 1-7,5 Гр и 1-3,5 Гр; или

(ii) указанное химиотерапевтическое средство включает в себя по меньшей мере одно из бусульфана, флударабина, мелфалана и тиотепы; или

(iii) указанное антитело включает в себя по меньшей мере одно из антитела к CD52, антитела - антитимоцитарного глобулина (ATG) и антитела к CD3 (OKT3).

13. Способ по п. 1, при котором указанная концентрация указанного циклофосфамида составляет приблизительно 100-200 или приблизительно 100 мг на кг массы тела субъекта.

14. Способ по п. 1, при котором указанный циклофосфамид вводят в однократной дозе или в двух дозах и необязательно при котором:

(i) каждая из указанных двух доз содержит концентрацию, составляющую приблизительно 50 мг на кг массы тела субъекта; или

(ii) каждую из указанных двух доз вводят в дни 3 и 4 после стадии (а).

15. Способ по п. 1, при котором субъект:

(i) характеризуется наличием злокачественного заболевания, и необязательно при котором указанное злокачественное заболевание представляет собой гематопоэтическую злокачественную опухоль; или

(ii) характеризуется наличием незлокачественного заболевания, и необязательно при котором указанное незлокачественное заболевание представляет собой генетическое заболевание или нарушение, гемопоэтическую аномалию, аутоиммунное заболевание или метаболическое нарушение.

16. Способ по п. 1, при котором указанный клеточный или тканевой трансплантат:

(i) выбирают из группы, состоящей из незрелых гемопоэтических клеток, печени, поджелудочной железы, селезенки, почки, сердца, легкого, кожи, кишечника и лимфоидной/гемопоэтической ткани или органа; или

(ii) трансплантируют субъекту перед, одновременно или после указанной трансплантации указанной дозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, указанному субъекту; или

(ii) включает котрансплантацию нескольких органов.

17. Способ по п. 16, при котором указанный клеточный или тканевой трансплантат и указанные незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают от одного донора.

18. Способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, включающий:

(а) трансплантацию подвергнутому кондиционированию субъекту дозы незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанная доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают путем сепарации указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из:

(I) способа, включающего:

(i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем указанное антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства;

(ii) иммобилизацию указанных незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с указанным антителом, меченным указанным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля;

(iii) отмывку указанной матрицы для удаления несвязанных клеток; и

(iv) удаление указанного магнитного поля для элюирования связанных клеток из указанной матрицы;

(II) на основании продукта, секретируемого указанными Т-клетками; и

(III) на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β;

и впоследствии

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем указанное терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела субъекта, и где указанный циклофосфамид вводится субъекту после трансплантации, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

19. Способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гематопоэтических клеток, включающий:

(a) кондиционирование субъекта согласно протоколу кондиционирования сниженной интенсивности, причем указанное кондиционирование сниженной интенсивности включает в себя тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство;

(b) трансплантацию субъекту дозы незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат меньше чем 5×10⁵ CD3+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанная доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают путем сепарации указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из:

(I) способа, включающего:

(i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем указанное антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства;

(ii) иммобилизацию указанных незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с указанным антителом, меченным указанным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля;

(iii) отмывку указанной матрицы для удаления несвязанных клеток; и

(iv) удаление указанного магнитного поля для элюирования связанных клеток из указанной матрицы;

(II) на основании продукта, секретируемого указанными Т-клетками; и

(III) на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β;

и впоследствии

(с) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем указанное терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела субъекта, и где указанный циклофосфамид вводится субъекту после трансплантации, тем самым обеспечивая лечение субъекта.

20. Способ индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в несингенном клеточном или тканевом трансплантате, включающий:

(а) трансплантацию субъекту дозы незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, полученных от несингенного донора, причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат меньше чем 5×10⁵ CD3⁺ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанная доза содержит по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34+ клеток на кг массы тела субъекта, и причем указанные незрелые гематопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают путем сепарации указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из:

(I) способа, включающего:

(i) добавление к незрелым гематопоэтическим клеткам антитела, которое специфически связывается с поверхностным маркером, причем указанное антитело метят с помощью магнитно-чувствительного средства;

(ii) иммобилизацию указанных незрелых гематопоэтических клеток, специфически связанных с указанным антителом, меченным указанным магнитно-чувствительным средством, в матрице посредством магнитного поля;

(iii) отмывку указанной матрицы для удаления несвязанных клеток; и

(iv) удаление указанного магнитного поля для элюирования связанных клеток из указанной матрицы;

(II) на основании продукта, секретируемого указанными Т-клетками; и

(III) на основании экспрессии по меньшей мере одного поверхностного маркера Т-клеток, выбранного из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD8 и TCRα/β;

и впоследствии

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, причем указанное терапевтически эффективное количество составляет 25-200 мг на кг массы тела субъекта, и где указанный циклофосфамид вводится субъекту после трансплантации, тем самым индуцируя донор-специфическую толерантность у субъекта.

21. Способ по п. 1, при котором указанную сепарацию:

(i) проводят с использованием антитела и необязательно при котором указанное антитело соединяют с флуоресцентным красителем, гаптеном или магнитной частицей; или

(ii) проводят с использованием проточной цитометрии или магнитной сортировки клеток.

22. Способ по п. 1, при котором указанная сепарация указанных Т-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток на основании указанного продукта, секретируемого указанными Т-клетками, включает в себя сепарацию Т-клеток, меченных продуктом секреции, причем указанные Т-клетки соединили с обеспечивающим захват фрагментом, который специфически связывает продукт, секретируемый указанными Т-клетками, и причем указанные Т-клетки культивировали в условиях, при которых продукт секретируется и связывается с указанным обеспечивающим захват фрагментом, тем самым получая Т-клетки, меченные указанным продуктом секреции, причем указанные Т-клетки не лизируют с помощью указанного способа и причем указанный продукт секреции метят с помощью фрагмента - метки,

и необязательно при котором указанный продукт секреции представляет собой цитокин, антитело или гормон,

и необязательно при котором указанный фрагмент - метка представляет собой специфическое к продукту секреции антитело или является конъюгированным с фторхроматом, намагничиваемым или содержит магнитные частицы,

и необязательно при котором указанный обеспечивающий захват фрагмент соединяют с указанными Т-клетками или В-клетками через якорный фрагмент, или он представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и необязательно при котором указанное антитело является биспецифическим или направлено против Т-клеточного или В-клеточного поверхностного маркера.

23. Способ по п. 1, дополнительно включающий сепарацию В-клеток от указанных незрелых гематопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, на основании продукта, секретируемого указанными В-клетками, включающую в себя сепарацию В-клеток, меченных продуктом секреции, причем указанные В-клетки соединили с обеспечивающим захват фрагментом, который специфически связывает продукт, секретируемый указанными В-клетками, и причем указанные В-клетки культивировали в условиях, при которых продукт секретируется и связывается с указанным обеспечивающим захват фрагментом, тем самым получая В-клетки, меченные указанным продуктом секреции, причем указанные В-клетки не лизируют с помощью указанного способа и причем указанный продукт секреции метят с помощью фрагмента - метки,

и необязательно при котором указанный продукт секреции представляет собой цитокин, антитело или гормон,

и необязательно при котором указанный фрагмент - метка представляет собой специфическое к продукту секреции антитело или является конъюгированным с фторхроматом, намагничиваемым или содержит магнитные частицы,

и необязательно при котором указанный обеспечивающий захват фрагмент соединяют с указанными Т-клетками или В-клетками через якорный фрагмент, или он представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и необязательно при котором указанное антитело является биспецифическим или направлено против Т-клеточного или В-клеточного поверхностного маркера.

24. Способ по пп. 1, 18, 19 или 20, где указанный субъект не подвергается лечению иммуносупрессивными средствами в течение более 10 дней после трансплантации.