Основанное на иммуноферментном анализе определение кинетики связывания в растворе

Изобретение касается способа определения аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью, включающий следующие стадии: определение доли свободного лекарственного средства или свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и нековалентные комплексы лекарственное средство-мишень в интервале концентраций лекарственного средства при постоянной концентрации мишени, где доля свободного лекарственного средства остается постоянной, посредством определения на основе результата иммуноанализа доли свободного лекарственного средства в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень в образце и, если определенная доля свободного лекарственного средства не сравнима для всех использованных отношений лекарственное средство : мишень, тогда отношение лекарственное средство : мишень в образце уменьшают, и образец подвергают повторному анализу посредством такого же иммуноанализа, или определения на основе результата иммуноанализа доли свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень в образце, и, если определенная доля свободной мишени не сравнима для всех использованных отношений лекарственное средство : мишень, тогда отношение лекарственное средство : мишень в образце увеличивают и образец подвергают повторному анализу посредством такого же иммуноанализа, и проведение расчета на основе доли свободного лекарственного средства или проведение расчета на основе доли свободной мишени, определенных на предыдущей стадии, аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью, где «сравнимый» означает относительное различие (% Разл.) двух определенных значений менее чем 100%, а «несравнимый» означает относительное различие (% Разл.) двух определенных значений больше чем 100%, где % Разл., рассчитанное согласно следующей формулы % Разл. = [(наибольшее значение) - (наименьшее значение)] / (среднее арифметическое значений), где для расчета значения аффинности связывания (KD) применяют следующее уравнение: KD = (доля свободного лекарственного средства) * (концентрация мишени [нМ] / (1 - доля свободного лекарственного средства). Технический результата изобретения заключается в том, что определение аффинности связывающего агента и его лиганда в образцах можно осуществлять с использованием очень ограниченного (малого) числа измерений (образцов), что снижает трудоемкость способа и повышает его точность. 11 з.п. ф-лы, 6 пр., 11 ил.

 

Здесь описано основанное на иммуноферментном анализе определение кинетики связывания в растворе в образцах буфера или сыворотки/плазмы.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фармакологический эффект лекарственного средства, действующего системно, является функцией не только собственной активности лекарственного средства, но также и его поглощения, распределения, метаболизма и выведения в человеческом организме. Данные характеристики объединены под термином «фармакокинетика». Фармакокинетикой обычно называют исследование развития во времени (т.е. кинетики), ассоциированного с динамическими процессами поглощения, распределения, метаболизма и выведения лекарственного средства и/или его метаболитов в живом организме, и она тесно взаимосвязана с областями биофармацевтики, фармакологии и терапевтических средств.

Поскольку организм задерживает транспорт молекул лекарственных средств через мембраны, разбавляет их в разных компартментах, в которых они распределяются, превращает их в метаболиты и, в конечном счете, выводит их, часто сложно предсказывать фармакологический эффект лекарственного средства in vivo. Однако исследователи обычно используют фармакокинетические исследования в качестве одного способа предсказания эффективности лекарственного средства в месте действия в организме.

Традиционно исследователи, участвующие в доклинических исследованиях поглощения, распределения, метаболизма и выведения, используют фармакокинетические/математические модели в сочетании с данными по реальной концентрации лекарственного средства в крови (или сыворотке, или плазме) и/или моче, а также данными по концентрации в разных тканях для характеризации свойств и пути лекарственного средства в живых организмах.

Имея под рукой фармакокинетическую информацию, можно увидеть (1) плохо ли поглощалось лекарственное средство с тем, чтобы давать субтерапевтические уровни в системе кровообращения, или (2) подвергалось ли лекарственное средство пресистемному метаболизму до неактивного метаболита. Такая информация также может давать руководство для последующих решений, таких как (1) следует ли улучшать поглощение лекарственного средства путем изменения солевой формы или композиции, (2) следует ли исследовать возможность получения пролекарств или (3) следует ли рассматривать другой путь введения.

Помимо вышеуказанного, фармакокинетические/математические модели также обычно считаются полезными, среди прочего, для следующего: (1) предсказание уровней лекарственного средства в плазме, ткани и моче при использовании любой схемы дозировки; (2) расчет оптимальной схемы дозировки для индивидуального пациента; (3) оценка возможного накопления лекарственных средств и/или метаболитов; (4) коррелирование концентраций лекарственного средства с фармакологической и токсикологической активностью (т.е. фармакодинамика); (5) оценка различий между композициями в коэффициенте или степени доступности (т.е. биоэквивалентность); (6) описание того, как изменения физиологии или заболевание влияют на поглощение, распределение и/или устранение лекарственного средства и (7) объяснение взаимодействий лекарственное средство-лекарственное средство или пища-лекарственное средство.

Фармакокинетические данные по поглощению, распределению, метаболизму и выведению также стали интегральной частью процесса фармакологической характеризации многообещающих новых потенциальных лекарственных средств.

Таким образом, существенной частью процесса разработки лекарственного средства является характеризация фармакокинетики (РК) и токсикокинетики (ТК) лекарственного средства и установление понимания связи между фармакокинетическими и фармакодинамическими (PD) эффектами (PK/PD). Предпосылкой оценки РК/ТК является доступность надежных биоаналитических методов. В отличие от низкомолекулярных лекарственных средств, которые обычно количественно измеряют с использованием методов на основе жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), золотым стандартом биоаналитической методики для терапевтических белков является анализ связывания с лигандом (LBA). Помимо высокой чувствительности и высокой производительности, главным преимуществом LBA является возможность анализировать либо общие концентрации лекарственного средства, либо конкретно только молекул лекарственного средства, компетентных к связыванию с лигандом («свободное лекарственное средство»).

Ясное понимание возможностей и ограничений биоаналитического анализа, используемого для количественного измерения лекарственного средства, является важным для обеспечения правдоподобной интерпретации данных. Предпосылкой для определения концентрации свободного лекарственного средства является применение LBA, который делает возможным анализ молекул лекарственного средства, компетнтных к связыванию с лигандом, в сложном матриксе, например, посредством применения анализов захвата мишени. Однако один лишь выбор подходящего формата анализа не обязательно является достаточным для точного определения концентрации свободного лекарственного средства. Лекарственное средство и мишень взаимодействуют обратимым, нековалентным способом, управляемым законом действующих масс. Кроме того, LBA равным образом основаны на обратимом нековалентном взаимодействии между лекарственным средством/аналитом и реактивами для анализа. Следовательно, результаты анализа легко искажаются любым вмешательством в равновесие между партнерами по связыванию. Такие мешающие воздействия для анализа рассматривались в современной литературе, но еще не обсуждались подробно (см., например, Lee, J.W., et al., AAPS.J. 13 (2011) 99-110, Kuang, В., et al., Bioanal. 2 (2010) 1125-1140).

Стандартной методикой для биоанализа терапевтических белков являются анализы связывания с лигадом (LBA). Главным преимуществом LBA является возможность различать между общей концентрацией лекарственного средства и концентрацией лекарственного средства, компетентного к связыванию мишени. Однако один лишь выбор подходящего формата анализа не обязательно является достаточным для точного определения концентрации свободного лекарственного средства. Лекарственное средство, мишень и реактивы для анализа взаимодействуют обратимым, нековалентным способом, управляемым законом действующих масс. Следовательно, результаты анализа легко искажаются любым вмешательством в равновесие между партнерами по связыванию. Ясное понимание возможностей и ограничений анализа, однако, является существенным для обеспечения правдоподобной интерпретации данных (см., например, Staack, G., et al., Bioanalysis 4 (2012) 381-395).

В WO 2008/005674 описаны способы проведения анализа взаимодействий, приводящих к связыванию. Способы получения и применения комплекса кумасси бриллиантовый синий/белок описаны в US 6057160. Azimzahdeh, А. и Van Regenmortel, M.H.V. приводят измерение аффинности вирусных моноклональных антител посредством титрования ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) свободного антитела в равновесных смесях (J. Immunol. Meth. 141 (1991) 199-208). Lee, J.W., et al. (AAPS J. 13 (2011) 99-110) приводят биоаналитические подходы для количественного измерения «общих» и «свободных» терапевтических антител и их мишеней. Математическое моделирование разработки биоаналитического анализа приведено Staack, R.F., et al. (Bioanalysis 4 (2012) 381-395). В WO 2011/094445 описаны полипептидные агенты, полученные посредством генной инженерии, для направленной нейтрализации широкого спектра вирусов гриппа.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует потребность в определении свободного лекарственного средства/связывающего агента в образце, содержащем смесь свободного лекарственного средства/связывающего агента, комплексов мишень-лекарственное средство/лиганд-лекарственное средство и свободной мишени/лиганда.

Обнаружили, что определение аффинности и кинетики связывания (KD, константы скорости ассоциации и диссоциации) связывающего агента и его лиганда в образцах буфера или сыворотки/плазмы может осуществляться с использованием очень ограниченного/малого числа измерений/образцов, т.е. одного или двух (и обеспечивая подходящую калибровку). Данный способ основан на открытии того, что определение свободного связывающего агента или свободного лиганда возможно, если определение осуществляется в пределах линейного интервала/постоянного плато кривой (при низкой концентрации связывающего агента/высокой концентрации лиганда нет изменений доли свободного связывающего агента, или, подобным образом, при высокой концентрации связывающего агента/низкой концентрации лиганда нет изменений доли свободного лиганда).

Обнаружили, что определение единичного (одного) значения (т.е., например, одного значения для количества свободного связывающего агента) является достаточным для определения аффинности. При определении дополнительного второго значения, что является опцией, данный способ также включает внутренний контроль качества определенного результата. Таким образом, при использовании описанного здесь способа, не требуется получать и анализировать сложный график точек данных. Даже не является необходимым получение кривой наилучшего соответствия для определенных точек данных.

Определение кинетики связывания возможно с определением одного значения, если известна аффинность.

Обнаружили, что измерение следует проводить с использованием образцов с избытком одного партнера (избытком связывающего агента по сравнению с лигандом (высокое отношение связывающий агент:лиганд) или с избытком лиганда по сравнению со связывающим агентом (высокое отношение лиганд:связывающий агент)).

В одном воплощении избыток одного партнера составляет по меньшей мере 10 раз. В одном воплощении избыток одного партнера составляет по меньшей мере 40 раз. В одном воплощении избыток одного партнера составляет по меньшей мере 100 раз.

Обнаружили, что описанный здесь способ можно использовать с образцом, содержащим сыворотку или плазму.

В описанном здесь способе концентрация лиганда или связывающего агента поддерживается на постоянном уровне, тогда как концентрация соответствующего другого партнера (т.е. связывающего агента или лиганда) изменяется.

В одном воплощении описанного здесь способа концентрация связывающего агента поддерживается на постоянном уровне, тогда как концентрация лиганда изменяется.

Обнаружили, что при низком отношении связывающий агент:лиганд (т.е. меньше 1) можно наблюдать плато свободного связывающего агента, которое является специфичным по отношению к концентрации лиганда и KD, таким образом, при низких отношениях связывающий агент:лиганд получается постоянное значение для доли свободного связывающего агента. Подобным образом, при высоком отношении связывающий агент:лиганд (т.е. больше 1) можно наблюдать плато свободного лиганда, которое является специфичным по отношению к концентрации связывающего агента и KD, таким образом, при высоких отношениях связывающий агент:лиганд получается постоянное значение для доли свободного лиганда.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного (т.е. не образующего комплекс) связывающего агента, который специфично связывается с лигандом, в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд, на плато свободного связывающего агента и

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значение KD) связывающего агента с его лигандом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного (т.е. не образующего комплекс) лиганда, который специфично связывается со связывающим агентом, в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд, на плато свободного лиганда и

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) лиганда, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значение KD) лиганда с его связывающим агентом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли комплексов связывающий агент-лиганд в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд, на плато свободного связывающего агента или на плато свободного лиганда,

- проведение расчета доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента или лиганда на основе определенных комплексов связывающий агент-лиганд и

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента или лиганда, рассчитанной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значение KD) лиганда с его связывающим агентом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного (т.е. не образующего комплекс) связывающего агента, который специфично связывается с лигандом, в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд по меньшей мере для двух разных отношений связывающий агент:лиганд в образце и, если определенная доля свободного (не образующего комплекс) связывающего агента не сравнима для всех использованных отношений связывающий агент:лиганд, тогда отношение связывающий агент:лиганд в образце уменьшают (т.е. количество связывающего агента уменьшают при постоянном количестве лиганда), и образец подвергают повторному анализу,

или

определение доли свободного (т.е. не образующего комплекс) лиганда в образце, содержащем связывающий агент, который специфично связывается с лигандом, лиганд и нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд по меньшей мере для двух разных отношений связывающий агент:лиганд в образце и, если определенная доля свободного (не образующего комплекс) лиганда не сравнима для всех использованных отношений связывающий агент:лиганд, тогда отношение связывающий агент:лиганд в образце увеличивают (т.е. количество лиганда уменьшают при постоянном количестве связывающего агента), и образец подвергают повторному анализу и

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента или проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) лиганда, определенных на предыдущей стадии, аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом.

В одном воплощении данным способом не является анализ по Скэтчарду.

В одном воплощении данный способ не требует линеаризации точек данных.

В одном воплощении данный способ не требует расчета значений ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) или IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация).

В одном воплощении используют два или три разных отношения связывающий агент:лиганд.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для первого отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом отношение связывающий агент:лиганд равно или меньше, чем отношение связывающий агент:лиганд, для которого определенная доля свободного (не образующего комплекс) связывающего агента сравнима по меньшей мере для двух разных отношений связывающий агент:лиганд,

- определение доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для по меньшей мере второго отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом второе отношение связывающий агентлиганд отличается от первого отношения связывающий агент:лиганд путем увеличения или уменьшения количества лиганда в образце и путем сохранения количества связывающего агента в образце,

при этом доля свободного (не образующего комплекс) связывающего агента сравнима для отношения связывающий агент:лиганд с повышенным или пониженным количеством лиганда в образце для повышенного или пониженного количества связывающего агента в образце,

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного (не образующего комплекс) лиганда в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для первого отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом отношение связывающий агент:лиганд является равным или большим, чем отношение связывающий агент:лиганд, для которого определенная доля свободного (не образующего комплекс) лиганда сравнима для по меньшей мере двух разных отношений связывающий агент:лиганд,

- определение доли свободного (не образующего комплекс) лиганда в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для по меньшей мере второго отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом второе отношение связывающий агент:лиганд является отличным от первого отношения связывающий агент:лиганд путем увеличения или уменьшения количества связывающего агента в образце и путем поддержания количества лиганда в образце,

при этом доля свободного (не образующего комплекс) лиганда сравнима для отношения связывающий агент:лиганд с повышенным или пониженным количеством связывающего агента в образце для повышенного или пониженного количества лиганда в образце,

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) лиганда, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для первого отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом отношение связывающий агент:лиганд является равным или большим, чем отношение связывающий агент:лиганд, для которого определенная доля свободного (не образующего комплекс) лиганда сравнима для по меньшей мере двух разных отношений связывающий агент:лиганд,

- определение доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для по меньшей мере второго отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом второе отношение связывающий агент:лиганд является отличным от первого отношения связывающий агент:лиганд посредством увеличения или уменьшения количества связывающего агента в образце и посредством поддержания количества лиганда в образце,

при этом доля свободного (не образующего комплекс) связывающего агента сравнима для отношения связывающий агент:лиганд с повышенным или пониженным количеством связывающего агента в образце для повышенного или пониженного количества лиганда в образце,

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли комплекса связывающий агент-лиганд в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для первого отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом отношение связывающий агент:лиганд является равным или большим, чем отношение связывающий агент:лиганд, для которого определенная доля комплекса связывающий агент-лиганд сравнима для по меньшей мере двух разных отношений связывающий агент:лиганд,

- определение доли комплекса связывающий агент-лиганд в образце, содержащем связывающий агент, лиганд и комплексы связывающий агент-лиганд, для по меньшей мере второго отношения связывающий агент:лиганд в образце,

при этом второе отношение связывающий агент:лиганд является отличным от первого отношения связывающий агент:лиганд посредством увеличения или уменьшения количества связывающего агента в образце и посредством поддержания количества лиганда в образце,

при этом доля комплекса связывающий агент-лиганд сравнима для отношения связывающий агент:лиганд с повышенным или пониженным количеством связывающего агента в образце для повышенного или пониженного количества лиганда в образце,

- проведение расчета на основе доли комплекса связывающий агент-лиганд, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного связывающего агента в по меньшей мере двух образцах с разными отношениями связывающий агент:лиганд,

при этом в по меньшей мере двух образцах количество связывающего агента поддерживается постоянным (таким же), и количество лиганда в каждом образце отличается, при условии, что образец содержит избыток лиганда по сравнению со связывающим агентом,

или

- определение доли свободного лиганда в по меньшей мере двух образцах с разными отношениями связывающий агент:лиганд,

при этом в по меньшей мере двух образцах количество лиганда поддерживается постоянным (таким же), и количество связывающего агента в каждом образце отличается, при условии, что образец содержит избыток связывающего агента по сравнению с лигандом,

- проведение расчета на основе доли свободного (не образующего комплекс) связывающего агента или проведение расчета на основе доли свободного (не образующей комплекс) лиганда, определенных на предыдущей стадии, аффинности связывания (значения KD) связывающего агента с его лигандом для каждого образца,

при этом аффинность связывания была определена, если по меньшей мере три значения KD являются сравнимыми,

при этом, если по меньшей мере два значения KD не являются сравнимыми, данный способ повторяют с использованием образцов, в которых либо

1) количество лиганда снижено при постоянном количестве связывающего агента, либо

2) количество связывающего агента снижено при постоянном количестве лиганда,

по сравнению с образцами, использованными в предыдущем определении.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, связывающий агент/лиганд выбран из группы, включающей антиген/антитело, клетку/метку, лекарственное средство/мишень, рецептор/лиганд рецептора, фермент/субстрат фермента и комплексант/ион металла.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, связывающий агент выбран из группы, включающей низкомолекулярное лекарственное средство, биологически активный полипептид и антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, антитело выбрано из группы, включающей полноразмерное антитело, фрагмент антитела и конъюгат антитела.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, антитело выбрано из группы, включающей моноспецифичное антитело, биспецифичное антитело, триспецифичное антитело, тетраспецифичное антитело и гексаспецифичное антитело.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, антитело выбрано из двухвалентного антитела, трехвалентного антитела, четырехвалентного антитела и шестивалентного антитела.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, образец содержит сыворотку или плазму.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, определение осуществляется посредством иммуноанализа. В одном воплощении повторное проведение анализа осуществляется таким же иммуноанализом. В одном воплощении иммуноанализ представляет собой гетерогенный анализ.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, лекарственное средство/связывающий агент представляет собой антитело, и мишень/лиганд представляет собой антиген, который специфично связывается антителом.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, связывающий агент или лиганд иммобилизован на твердой фазе.

В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, для расчета значения KD используют следующее уравнение:

KD = (доля свободного лекарственного средства/связывающего агента) * (концентрация мишени/лиганда [нМ]) / (1 - доля свободного лекарственного средства/связывающего агента).

Одним аспектом, как здесь описано, является применение одной точки данных (определенной с использованием подходящей калибровки), определенной на плато свободного связывающего агента, для определения аффинности в растворе (KD).

Одним аспектом, как здесь описано, является применение способа, как здесь описано, для определения KD для определения кинетики связывания/констант скорости (kon и koff) путем определения концентраций свободного связывающего агента или лиганда в фазе ассоциации или диссоциации связывающего агента и лиганда, индуцированной разведением образца.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение способа, как здесь описано, для определения кинетики связывания/констант скорости в растворе (kon и koff).

Одним аспектом, как здесь описано, является применение способа, как здесь описано, для определения значений kon в растворе. В данном случае значение KD известно.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение способа, как здесь описано, для определения значений koff в растворе.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Зависимость доли свободного лекарственного средства/связывающего агента от изменяющихся концентраций лекарственного средства/связывающего агента и мишени/лиганда, предполагая обычно встречающиеся аффинности (KD - фиксированная (0,1 нМ (1×10-10 М)), мишень/лиганд - изменяющаяся, лекарственное средство/связывающий агент - изменяющаяся).

Фиг. 2. Схематическое описание методики анализа ELISA (1).

Фиг. 3. Схематическое описание методики анализа ELISA (2).

Фиг. 4. Калибровочная кривая анализа.

Фиг. 5. Типичная концентрационная кривая свободного лекарственного средства/связывающего агента, демонстрирующая зависимость доли свободного лекарственного средства/связывающего агента от изменяющейся общей концентрации лекарственного средства/связывающего агента.

Фиг. 6. Зависимость доли свободного лекарственного средства/связывающего агента от времени и после разведения буфера после достижения равновесия.

Фиг. 7. Взаимная зависимость между концентрацией лекарственного средства/связывающего агента, концентрацией мишени/лиганда и аффинностью/KD.

Фиг. 8. Доля свободного лекарственного средства/связывающего агента в зависимости от концентрации лекарственного средства/связывающего агента при постоянной концентрации мишени/лиганда, определенная для антитела против VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) в качестве лекарственного средства/связывающего агента и VEGF в качестве мишени/лиганда.

Фиг. 9. KD является постоянной, независимо от концентрации лекарственного средства/связывающего агента в пределах плато свободного лекарственного средства/связывающего агента.

Фиг. 10. KD является постоянной, независимо от концентрации мишени/лиганда в пределах плато свободного лекарственного средства/связывающего агента.

Фиг. 11. Схематическое описание определения кинетики связывания на основе иммуноанализа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаружили, что определение аффинности и кинетики связывания (KD, константы скорости ассоциации и диссоциации) связывающего агента с его лигандом в образцах буфера или сыворотки/плазмы можно осуществлять с использованием малого числа образцов на основе определения свободного связывающего агента или свободного лиганда, при этом определение следует проводить в пределах линейного интервала/постоянного плато кривой, т.е. при низкой концентрации связывающего агента/лиганда, когда не происходит изменений доли свободного связывающего агента, или, подобным образом, при высокой концентрации связывающего агента/лиганда, когда не происходит изменений доли свободного лиганда.

Обнаружили, что при низком отношении связывающий агент:лиганд можно наблюдать плато свободного связывающего агента, которое является специфичным для концентрации лиганда и KD, таким образом, при низких отношениях связывающий агент:лиганд получается постоянное значение доли свободного связывающего агента. Подобным образом, при высоком отношении связывающий агент:лиганд можно наблюдать плато свободного лиганда, которое является специфичным для концентрации связывающего агента и KD, таким образом, при высоких отношениях связывающий агент:лиганд получается постоянное значение доли свободного лиганда.

Термин «плато свободного связывающего агента» обозначает интервал концентрации связывающего агента при постоянной концентрации лиганда в образцах, содержащих разные концентрации связывающего агента, постоянные концентрации лиганда и соответствующие нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд, где доля свободного связывающего агента остается постоянной (см., например, Фиг. 5).

Термин «плато свободного лиганда» обозначает интервал концентрации лиганда при постоянной концентрации связывающего агента в образцах, содержащих разные концентрации лиганда, постоянные концентрации связывающего агента и соответствующие нековалентные комплексы связывающий агент-лиганд, где доля свободного лиганда остается постоянной.

Термин «сравнимый» обозначает то, что относительное различие (% Разл.) двух определенных значений меньше, чем 100%. В одном воплощении различие меньше, чем 50%. В одном воплощении различие меньше, чем 30%. Различие (% Разл.) рассчитывается с использованием следующей формулы:

% Разл. = [(наибольшее значение)-(наименьшее значение)]/(среднее арифметическое значений).

Например, при первом определении было определено 10% свободного связывающего агента, и при втором определении было определено 13% свободного связывающего агента. Согласно приведенной выше формуле это приводит к различию 26% (13-10)/((13+10)/2)=26%).

Термин «несравнимый» обозначает то, что относительное различие (% Разл.) двух определенных значений больше, чем 100%. В одном воплощении различие больше, чем 50%. В одном воплощении различие больше, чем 30%. Различие (% Разл.) рассчитывается с использованием следующей формулы:

% Разл. = [(наибольшее значение)-(наименьшее значение)]/(среднее арифметическое значений).

Далее настоящее изобретение проиллюстрировано примерами с использованием лекарственного средства в качестве примера связывающего агента и мишени - в качестве примера лиганда. Лекарственное средство специфично взаимодействует с мишенью.

Как показано на Фиг. 7, существует взаимная зависимость между концентрацией лекарственного средства, концентрацией мишени и аффинностью (KD).

При низком отношении лекарственное средство:мишень можно наблюдать плато свободного лекарственного средства, которое является специфичным в отношении концентрации мишени и KD. Экспериментально определенная доля свободного лекарственного средства, зависящая от концентрации лекарственного средства при постоянной концентрации мишени, показана на Фиг. 8. Можно видеть, что при низких отношениях лекарственное средство:мишень получается постоянное значение для доли свободного лекарственного средства.

Подобным образом, при высоких отношениях лекарственное средство:мишень можно наблюдать аналогичное плато. Данное плато также можно использовать для определения значения KD. Следовательно, все аспекты и воплощение, которые направлены на низкое отношение лекарственное средство:мишень (избыток мишени) также можно осуществлять при высоком отношении лекарственное средство:мишень (избыток лекарственного средства).

Подобным образом, данный способ можно изменять путем определения концентрации свободной мишени при использовании избытка лекарственного средства. Следовательно, все аспекты и воплощения, которые направлены на лекарственное средство, также можно осуществлять при направлении на мишень.

Обнаружили, что доля свободного лекарственного средства и, соответственно, значение KD, являются постоянными, независимо от концентрации лекарственного средства в пределах плато свободного лекарственного средства (см. Фиг. 9).

Обнаружили, что значение KD является постоянным, независимо от концентрации мишени в пределах плато свободного лекарственного средства (см. Фиг. 10).

Для определения аффинности лекарственное средство-мишень и кинетики связывания (KD) константа скорости для ассоциации и диссоциации) в образцах буфера или сыворотки/плазмы получали образцы с различной ожидаемой концентрацией свободного лекарственного средства/аналита (для оценки KD должно достигаться равновесие). Доля свободного лекарственного средства/аналита должна находиться в линейном интервале/постоянном плато кривой (низкая концентрация лекарственного средства/аналита, нет изменений доли свободного лекарственного средства). Для первой оценки доли свободного лекарственного средства/аналита на Фиг. 1 приведены соответствующие концентрации. Анализировали реальные доли свободного лекарственного средства/аналита. Рассчитывали аффинность (KD) и константы скорости (kon, koff) с использованием определенной доли свободного лекарственного средства.

Таким образом, в способе, как здесь описано, можно использовать любой способ, который подходит для определения доли свободного лекарственного средства.

В качестве альтернативы, долю свободного лекарственного средства можно определять опосредованно с использованием установки для анализа для определения образованного комплекса.

Например, для определения концентрации свободного лекарственного средства/аналита в образцах буфера или сыворотки/плазмы можно использовать два серийных многослойных твердофазных иммуноферментных анализа (ELISA).

На Фиг. 2 и 3 показаны разные стадии методики анализа на основе ELISA.

Более подробно, на планшет для микротитрования (МТР), покрытый стрептавидином (SA), последовательно добавляют биотинилированный захватывающий белок (мишень-Bi), лекарственное средство/аналит, mAb(моноклональное антитело) <лекарственное средство/аналит> - Dig (дигоксигенин) и антитело против дигоксигенина-POD (перксидаза) с инкубацией каждого реактива в течение 1 часа на шейкере для МТР. Для ускорения анализа, в качестве альтернативы, можно использовать mAb <лекарственное средство/аналит> - POD вместо комбинации mAb <лекарственное средство/аналит> - Dig и антитело против дигоксигенина-POD.

Для точной картины концентрации свободного лекарственного средства/аналита в растворе лекарственное средство/аналит инкубируют в течение примерно 5 мин (компромисс между получением сигнала и минимальным мешающим влиянием равновесия).

После каждой стадии МТР промывают три раза, и остаточные жидкости удаляют. Наконец, образовавшиеся иммобилизованные иммунные комплексы визуализируют добавлением раствора ТМВ (тетраметилбензидин), субстрата POD, который превращается в окрашенный продукт реакции. Развитие окрашивания следует отслеживать фотометрически (поглощение при 680 нм - контрольная длина волны 450 нм) и останавливать добавлением 1 М H2SO4 при достижении калибровочным стандартом с наибольшей концентрацией OD (оптическая плотность) 0,65. Наконец, фотометрически определяют интенсивность окрашивания (поглощение при 450 нм - контрольная длина волны 690 нм), и она пропорциональна концентрации аналита в образце сыворотки/плазмы/буфера. Количественное измерение лекарственного средства/аналита проводят путем обратного пересчета значений поглощения с использованием соответствующей стандартной кривой с использованием нелинейной 4-параметрической функции аппроксимации кривой Вимера-Родбарда.

После обратного пересчета концентрации свободного лекарственного средства в инкубированных образцах можно построить кривую, аналогичную кривой, показанной на Фиг. 5. Следует получить по меньшей мере два сравнимых значения для свободного лекарственного средства на плато (прямой контроль качества анализа, например, олигомеризации мишени).

Для расчета значения KD используют следующее уравнение:

KD = (доля свободного лекарственного средства) * (концентрация мишени [нМ]) / (1 - доля свободного лекарственного средства)

Типичный расчет (см. также Пример 3):

концентрация мишени - 1 нМ - постоянная

концентрация лекарственного средства 17 нг/мл приводит к доле свободного лекарственного средства 9,2%

концентрация лекарственного средства 8,5 нг/мл приводит к доле свободного лекарственного средства 7,6%

таким образом, KD равна 0,1 нМ и 0,08 нМ.

При использовании описанного здесь способа требуется маленькое количество лекарственного средства, и можно анализировать/характеризовать высокоаффинные лекарственные средства.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение способа, как здесь описано, для определения значения KD двухвалентных лекарственных средств, таких как антитела.

В одном воплощении определение значения KD осуществляется посредством диссоциации комплексов лекарственное средство-мишень, индуцированной разведением, начиная с образца в состоянии равновесия.

Характерной проблемой всех подходов для определения значения KD двухвалентных лекарственных средств в растворе является наличие равновесия между полностью свободным лекарственным средством (не занята ни одна валентность), частично свободным лекарственным средством (занята одна валентность) и связанным лекарственным средством (заняты обе валентности), так как подход в растворе основан на определении свободного лекарственного средства.

Обычно образец, используемый для определения значения KD двухвалентного лекарственного средства, содержит известное количество лекарственного средства и мишени. Вывод данных анализа свободного лекарственного средства осуществляется посредством калибровочной кривой свободного лекарственного средства, описывающей связь с количеством свободного лекарственного средства, присутствующего в образце. Для двухвалентных лекарственных средств свободное лекарственное средство представляет собой смесь полностью свободного лекарственного средства и частично свободного лекарственного средства, при этом ее отдельные фракции распределены согласно статистическому распределению. Реальную концентрацию свободного лекарственного средства можно определять с использованием статистического распределения полностью свободного лекарственного средства и частично свободного лекарственного средства, что приводит к определению общего количества лекарственных средств, компетентных к связыванию.

Данный способ может включать следующие стадии:

1) иммобилизация мишени, например, покрытие захватывающим белком (мишень-Bi) твердой фазы, покрытой стрептавидином (например, планшета для микротитрования)

2) инкубация с образцами, QC (контроль качества) и калибраторами

3) детекция захваченного лекарственного средства меченым антителом против лекарственного средства, например, mAb <лекарственное средство/аналит> - Dig

4) детекция первичного антитела меченым вторичным антителом, например, антителом против дигоксигенина-POD.

Кроме того, стадию 3 и стадию 4 можно заменять инкубацией с mAb <лекарственное средство/аналит> - POD.

5) считывание показаний

6) анализ данных

Рассчитываются средние значения для каждого стандарта и каждого разведения образца.

Стандартную калибровочную кривую получают нелинейной 4-параметрической аппроксимацией с использованием функции Вимера-Родбарда (например, с использованием XLfit):

А и В отвечают за отклонение сигнала (приблизительное начало и конец калибровочной кривой). С и D отвечают за форму кривой.

Воспроизводимые и надежные расчеты разведений опытных образцов достигаются в пределах интервала концентраций от 0,033 нг/мл (нижняя граница количественного измерения) до 8,0 нг/мл (концентрации в анализе). Образцы разводят так, чтобы они попадали в данный интервал.

Типичная калибровочная кривая (расчет с взвешиванием по концентрации мишени) и соответствующие данные анализа показаны на Фиг. 4.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение способа, как здесь описано, для определения кинетики связывания связывающих агентов.

Данный способ включает три стадии:

1) получение образца,

2) количественное измерение свободного лекарственного средства или свободной мишени и

3) расчет кинетики связывания.

В принципе, возможно два подхода:

а) подход, включающий ассоциацию и равновесие, и

б) подход, включающий равновесие и диссоциацию, посредством диссоциации комплексов лекарственное средство-мишень в образце, индуцированной разведением, начиная с равновесных условий.

Для данной KD только одна kon и koff может приводить к долям свободного лекарственного средства в два данных момента времени (см. Фиг. 6).

Для определения константы скорости взаимодействия возможны два способа. Для расчета константы скорости в обоих способах используется значение KD как константа, которую следует определить. Одним возможным подходом является смешивание обоих партнеров связывания и измерение на протяжении фазы ассоциации, например, доли свободного лекарственного средства («подход, включающий ассоциацию-равновесие»). Другой возможностью для определения константы скорости является пертурбация уравновешенной смеси путем разведения и измерение, например, доли свободного лекарственного средства на протяжении фазы диссоциации до достижения равновесия («подход, включающий равновесие-диссоциацию»). Для каждого подхода необходимой является только одна точка данных образца, не находящегося в состоянии равновесия. Расчет константы скорости осуществляется путем решения дифференциальных уравнений системы (например, реакции 2-го порядка). Существует только одна возможная пара kon (константа скорости ассоциации) и koff (константа скорости диссоциации), которая представляет систему с известным значением KD. Применение обоих подходов можно использовать для взаимного подтверждения определенных кинетических параметров.

Для расчета констант скорости можно сделать аппроксимацию оценочной доли свободного лекарственного средства в по меньшей мере один момент времени, когда отсутствует равновесие (см. Фиг. 6) к рассчитанному решению следующего дифференциального уравнения. Аффинность (KD) является обязательным значением для того, чтобы иметь привязку для расчета. Аппроксимация оптимизируется путем изменения kon или koff.

Дифференциальное уравнение:

d/dt(лекарственное средство)=-kon*лекарственное средство*мишень + koff*комплекс

d/dt(мишень)=-kon*лекарственное средство*мишень + koff*комплекс

d/dt(комплекс)=kon*лекарственное средство*мишень - koff*комплекс

Для определения кинетики связывания можно использовать иммуноанализ, как здесь описано, для определения свободного лекарственного средства.

На Фиг. 11 показаны разные этапы процедуры анализа.

Данный анализ включает следующие этапы:

1) получение образца

с низкой концентрацией лекарственного средства и высокой концентрацией мишени или

с высокой концентрацией лекарственного средства и низкой концентрацией мишени

2) инкубация и образование комплекса

3) количественное измерение свободного лекарственного средства или количественное измерение свободной мишени

см. пример 2

4) расчет доли свободного лекарственного средства или концентрации свободной мишени

например,

Доля свободного

5) расчет значения KD

Таким образом, описанные здесь способы имеют характерные особенности, такие как:

- для определения аффинности связывания (значения KD)

i) один партнер присутствует в (большом) избытке (либо лекарственное средство, либо мишень),

ii) анализ/определение двух или трех образцов является достаточным для определения значения KD и

iii) самое заметное - встроенный контроль качества для проверки того, находятся ли значения для образцов в пределах области плато,

- для определения кинетики связывания (значение kon и koff)

i) определение кинетики связывания с использованием иммуноанализа (отсутствует требование анализа в реальном времени),

ii) анализ/определение двух образцов является достаточным для определения значений kon и koff и

iii) самое заметное - применение подхода, включающего разведение, для определения кинетики связывания (путем разведения образца, в котором было достигнуто равновесие),

- для определения двухвалентных лекарственных средств

i) самое заметное - применение статистического подхода для определения полностью свободного и частично свободного лекарственного средства в образце.

Следующие примеры и графические материалы приведены для того, чтобы помочь пониманию настоящего изобретения, истинный объем которого изложен в приложенной формуле изобретения. Понятно, что в изложенных методиках можно делать модификации без отступления от сущности изобретения.

Сокращения

BLQ Ниже границы количественного измерения
ВРА 1 Альбумин коровьей плазмы 1
СоА Сертификат анализа
Конц. Концентрация
CV Коэффициент вариации
Dig Дигоксигенин
ELISA Твердофазный иммуноферментный анализ
H2SO4 Серная кислота
IgG Иммуноглобулин G
mAb Моноклональное антитело
МТР Планшет для микротитрования
OD Оптическая плотность
PBS Фосфатно-солевой буферный раствор
POD Полимеризованная пероксидаза хрена
ОС Контроль качества
об./мин Обороты в минуту
RT Комнатная температура (от +15°С до +25°С)
SA Стрептавидин
SD Стандартное отклонение
ТМВ 3,3',5,5'-Тетраметилбензидин

ПРИМЕРЫ

Материалы

Оборудование

- ELISA - планшет-ридер для 96-луночных МТР (λ отслеживания: 680/450 нм, λ измерения: 450/690 нм)

- Планшет для микротитрования (МТР) - установка для промывки

- Планшет для микротитрования (МТР) - шейкер

- Стандартные и многоствольные пипетки

- Пробирки для проведения реакций

- Обычное лабораторное оборудование

Расходные материалы

- Планшеты для микротитрования, покрытые стрептавидином

- Готовый к применению раствор субстрата - ТМВ

- 10×PBS

Развести 1:10 в деионизированной воде до 1×PBS.

- Альбумин, альбумин коровьей плазмы 1 (ВРА 1)

- Tween 20

Образцы

- Объединить сыворотку/плазму минимум 10 здоровых, не подвергавшихся лечению человеческих индивидов (центрифугировать образцы сыворотки во избежание переноса пипеткой в лунки МТР сворачивающейся или мутной сыворотки).

Буферы

- Буфер для анализа: 0,5% ВРА1 в 1 × PBS

например, растворить 5 г ВРА 1 в 1000 мл 1 × PBS

- Буфер для промывки: 1 × PBS / 0,05% Tween 20

например, развести 10 мл Tween 20 в 2000 мл 1 × PBS

- Разведение объединенной сыворотки/плазмы:

10% пустой объединенной человеческой сыворотки развести в буфере для анализа

например, смешать 1 мл объединенной сыворотки с 9 мл буфера для анализа

Реактивы

- Антитело против дигоксигенина-POD(поли), фрагменты Fab (<Dig>-POD)

Второй реактив для детекции

Лиофилизированную аликвоту 50 U растворить в 1 мл деионизированной воды до 50 U/мл.

Пример 1

Общий принцип анализа для определения значения KD

Для определения концентрации свободного лекарственного средства/аналита в образцах буфера или сыворотки/плазмы были проведены два серийных многослойных твердофазных иммуноферментных анализа (ELISA).

На Фиг. 2 и 3 показаны разные стадии методики анализа.

На планшет для микротитрования (МТР), покрытый стрептавидином (SA), последовательно добавляют биотинилированный захватывающий белок (мишень-Bi), лекарственное средство/аналит, mAb <лекарственное средство/аналит> - Dig и антитело против дигоксигенина-POD с инкубацией каждого реактива в течение 1 часа на шейкере для МТР. Для ускорения анализа, в качестве альтернативы, можно использовать mAb <лекарственное средство/аналит> - POD вместо комбинации mAb <лекарственное средство/аналит> - Dig и антитело против дигоксигенина-POD.

Для точной картины концентрации свободного лекарственного средства/аналита в растворе лекарственное средство/аналит инкубируют в течение примерно 5 мин (компромисс между получением сигнала и минимальным мешающим влиянием равновесия).

После каждой стадии МТР промывают три раза, и остаточные жидкости удаляют. Наконец, образовавшиеся иммобилизованные иммунные комплексы визуализируют добавлением раствора ТМВ, субстрата POD, который превращается в окрашенный продукт реакции. Развитие окрашивания следует отслеживать фотометрически (поглощение при 680 нм - контрольная длина волны 450 нм) и останавливать добавлением 1 М H2SO4 при достижении калибровочным стандартом в максимальной концентрации OD 0,65. Наконец, фотометрически определяют интенсивность окрашивания (поглощение при 450 нм - контрольная длина волны 690 нм), и она пропорциональна концентрации аналита в образце сыворотки/плазмы/буфера. Количественное измерение лекарственного средства/аналита проводят путем обратного пересчета значений поглощения с использованием соответствующей стандартной кривой с использованием нелинейной 4-параметрической функции аппроксимации кривой Вимера-Родбарда.

Пример 2

Анализ образца

Образцы, образцы для контроля качества (QC) и стандарты позитивного контроля анализируют в буфере для анализа.

Все стадии методики анализа проводят при температуре от +15°С до +25°С (RT).

Приведенные объемы рассчитаны для получения одного МТР. При проведении анализа более чем на одном МТР, умножьте указанные ниже объемы на число МТР. Минимальный объем для переноса пипеткой составляет 2 мкл.

Для обеспечения точных измерений все опытные образцы, разведения образца позитивного контроля (стандартная кривая) и образцы контроля качества следует анализировать в двойной повторности.

Получение калибровочных стандартов и опытных образцов:

Приготовить серийные титрования стандарта лекарственного средства/мишени (mAb <мишень>) в виде стандартной кривой, включающей 7 разных концентраций калибровочного стандарта и одно пустое значение (серийное разведение 1:2,5 в 100% объединенном буфере/сыворотке/плазме).

Приготовить несколько опытных образцов (инкубация лекарственного средства/аналита с мишенью), как указано на Фиг. 1. Обязательным является то, чтобы в образцах для определения аффинности достигалось равновесие при наименьших возможных концентрациях лекарственного средства/аналита. Для оценки констант скорости обязательно проводить измерения с использованием точной шкалы времени и не в состоянии равновесия.

Анализ включает следующие этапы:

1) Покрытие захватывающим белком (мишень-Bi) планшетов для микротитрования, покрытых стрептавидином; 1 ч инкубация с последующей 3-кратной промывкой.

12 мл рабочего раствора захватывающего реактива мишень-Bi с конечной концентрацией, например, 500 нг/мл получали в буфере для анализа.

100 мкл рабочего раствора переносят пипеткой в каждую лунку МТР. МТР покрывают адгезивной покровной фольгой и инкубируют в течение 1 часа на шейкере для МТР (450 об./мин). МТР промывают три раза 300 мл буфера для промывки на лунку, и удаляют остаточный буфер для промывки. Затем добавляют стандарты и образцы.

2) Загрузка образцов, QC и калибровочных стандартов на планшет; инкубация в течение примерно 5 мин (такая короткая, как только возможно) с последующей 3-кратной промывкой.

100 мкл стандартов и 100 мкл разведений опытных образцов переносят пипеткой в двойной повторности в предназначенные для них лунки МТР. МТР покрывают адгезивной покровной фольгой и инкубируют в течение 1 часа на шейкере для МТР (450 об./мин). МТР промывают три раза 300 мкл буфера для промывки на лунку, и удаляют остаточный буфер для промывки. Затем добавляют первое детектирующее антитело.

3) Детекция mAb <лекарственное средство/аналит> - Dig; 1 ч инкубация с последующей 3-кратной промывкой

Для каждого МТР готовят 12 мл рабочего раствора первого детектирующего реактива, содержащего mAb <лекарственное средство/аналит> - Dig в конечной концентрации, например, 500 нг/мл в буфере для анализа.

100 мкл рабочего раствора переносят пипеткой в каждую лунку МТР. МТР покрывают адгезивной покровной фольгой и инкубируют в течение 1 часа на шейкере для МТР (450 об./мин). МТР промывают три раза 300 мкл буфера для промывки на лунку, и удаляют остаточный буфер для промывки. Затем добавляют второе детектирующее антитело.

4) Детекция антителом против дигоксигенина-POD; 1 ч инкубация с последующей 3-кратной промывкой

Для каждого МТР готовят 12 мл рабочего раствора второго детектирующего реактива, содержащего <Dig> - POD в конечной концентрации 2,5 mU/мл в буфере для анализа.

100 мкл этого раствора переносят пипеткой в каждую лунку МТР. МТР покрывают адгезивной покровной фольгой и инкубируют в течение 1 часа на шейкере для МТР (450 об./мин). МТР промывают три раза 300 мкл буфера для промывки на лунку, и удаляют остаточный буфер для промывки. Затем добавляют реактив, представляющий собой субстрат.

Стадию 3 и стадию 4 можно заменять инкубацией с mAb <лекарственное средство/аналит> - POD.

5) Считывание показаний осуществляется с использованием раствора ТМВ, и реакция останавливается раствором H2SO4. Поглощение отслеживали до достижения OD680/450 0,65. Измерение поглощения осуществляли до достижения OD450/690 1,8-2,2.

100 мкл готового к применению раствора ТМВ переносили пипеткой в каждую лунку МТР. МТР можно инкубировать с раствором субстрата со встряхиванием при 450 об./мин. Поглощение отслеживают несколько раз до достижения раствором стандарта с максимальной концентрацией (конц. равна 8,0 нг/мл) OD680/450 0,65. Реакцию останавливают 50 мкл 1 М раствора H2SO4, и поглощение измеряют несколько раз до достижения раствором стандарта с максимальной концентрацией (конц. равна 8,0 нг/мл) OD450/690 1,8-2,2.

Длина волны отслеживания: 680 нм (контрольная длина волны: 450 нм).

Длина волны измерения: 450 нм (контрольная длина волны: 690 нм).

6) Анализ данных

Рассчитывают средние значения для каждого стандарта и каждого разведения образца.

Стандартную калибровочную кривую получают нелинейной 4-параметрической аппроксимацией с использованием функции Вимера-Родбарда (например, с использованием XLfit):

А и В отвечают за отклонение сигнала (приблизительное начало и конец калибровочной кривой). С и D отвечают за форму кривой.

Воспроизводимые и надежные расчеты разведений опытных образцов достигаются в пределах интервала концентрации от 0,033 нг/мл (нижняя граница количественного измерения) до 8,0 нг/мл (концентрации в анализе). Образцы разводят так, чтобы они попадали в данный интервал.

Типичная калибровочная кривая (расчет с взвешиванием по концентрации мишени) и соответствующие данные анализа показаны на Фиг. 4 и в следующей таблице.

Пример 3

Определение значения KD в растворе на основе иммуноанализа - пример одновалентного связывания с использованием биспецифичного антитела против EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) / IGFR (рецептор инсулиноподобного фактора роста) в качестве лекарственного средства и EGFR в качестве мишени

Иммуноанализ и определение свободного лекарственного средства, а также расчет значения KD проводили, как описано выше.

Определение KD (с использованием времени инкубации 15 часов для обеспечения равновесия) проводили с использованием разных концентраций лекарственного средства и мишени в разные сутки. Результаты показаны в следующей таблице.

Можно видеть, что определение значения KD является воспроизводимым и независимым от концентрации лекарственного средства и от концентрации мишени.

Пример 4

Определение значения KD в растворе на основе иммуноанализа -пример одновалентного связывания с использованием биспецифичного антитела против EGFR/IGFR в качестве лекарственного средства и IGFR в качестве мишени

Иммуноанализ и определение свободного лекарственного средства, а также расчет значения KD проводили, как описано выше.

Определение KD (с использованием времени инкубации 15 часов для обеспечения равновесия) проводили с использованием разных концентраций лекарственного средства и мишени в разные сутки. Результаты показаны в следующей таблице.

Пример 5

Определение кинетики связывания на основе иммуноанализа - подход, включающий ассоциацию и равновесие, с использованием биспецифичного антитела против EGFR/IGFR в качестве лекарственного средства и EGFR в качестве мишени

Биспецифичное антитело использовали в концентрации 17 нг/мл. EGFR (мишень) использовали в концентрации 1 нМ. Определенное значение KD составляет 0,09 нМ.

Определенная доля свободного лекарственного средства после времени инкубации 30 мин (фаза ассоциации) составляла 0,31 (первый момент времени на Фиг. 6). Определенная доля свободного лекарственного средства после времени инкубации 180 мин (равновесие) составляла 0,09.

На основе данных экспериментальных результатов было рассчитано, что параметр кинетики связывания koff составляет 0,000073 (1/с), и было рассчитано, что параметр кинетики связывания kon составляет 7300000 (1/с*нМ).

Пример 6

Определение кинетики связывания на основе иммуноанализа - подход, включающий равновесие и диссоциацию, с использованием биспецифичного антитела против EGFR/IGFR в качестве лекарственного средства и IGFR в качестве мишени

Биспецифичное антитело использовали в концентрации 680 нг/мл. IGFR (мишень) использовали в концентрации 200 нМ. Определенное значение KD составляет 9,4*10-9 М.

Определенная доля свободного лекарственного средства в состоянии равновесия составляла 0,07. Определенная доля свободного лекарственного средства через 15 мин после разведения буфера (фаза диссоциации) составляла 0,67.

На основе данных экспериментальных результатов было рассчитано, что параметр кинетики связывания koff составляет 0,0014854 (1/с), и было рассчитано, что параметр кинетики связывания kon составляет 158020 (1/с*нМ).

1. Способ определения аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью, включающий следующую стадию:

- определение доли свободного лекарственного средства или свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и нековалентные комплексы лекарственное средство-мишень в интервале концентраций лекарственного средства при постоянной концентрации мишени, где доля свободного лекарственного средства остается постоянной, посредством

определения на основе результата иммуноанализа доли свободного лекарственного средства в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень в образце, и, если определенная доля свободного лекарственного средства не сравнима для всех использованных отношений лекарственное средство : мишень, тогда отношение лекарственное средство : мишень в образце уменьшают и образец подвергают повторному анализу посредством такого же иммуноанализа,

или

определения на основе результата иммуноанализа доли свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень в образце, и, если определенная доля свободной мишени не сравнима для всех использованных отношений лекарственное средство : мишень, тогда отношение лекарственное средство : мишень в образце увеличивают и образец подвергают повторному анализу посредством такого же иммуноанализа, и

- проведение расчета на основе доли свободного лекарственного средства или проведение расчета на основе доли свободной мишени, определенных на предыдущей стадии, аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью,

где «сравнимый» означает относительное различие (% Разл.) двух определенных значений менее чем 100%, а «несравнимый» означает относительное различие (% Разл.) двух определенных значений больше чем 100%, где % Разл., рассчитанное согласно следующей формуле:

% Разл. = [(наибольшее значение) - (наименьшее значение)] / (среднее арифметическое значений),

где для расчета значения аффинности связывания (KD) применяют следующее уравнение:

KD = (доля свободного лекарственного средства) * (концентрация мишени [нМ] / (1 - доля свободного лекарственного средства).

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что используют одно или два, или три разных отношения лекарственное средство : мишень.

3. Способ определения аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью по п. 1, включающий следующие стадии:

- определение на основе результата иммуноанализа доли свободного лекарственного средства в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень для первого отношения лекарственное средство : мишень в образце,

при этом отношение лекарственное средство : мишень равно или меньше, чем отношение лекарственное средство : мишень, для которого определенная доля свободного лекарственного средства сравнима по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень,

- определение на основе результата иммуноанализа доли свободного лекарственного средства в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень для по меньшей мере второго отношения лекарственное средство : мишень в образце,

при этом второе отношение лекарственное средство : мишень отличается от первого отношения лекарственное средство : мишень посредством увеличения или уменьшения количества мишени в образце и посредством сохранения количества лекарственного средства в образце,

при этом определенные доли свободного лекарственного средства сравнимы для отношения лекарственное средство : мишень с повышенным или пониженным количеством мишени в образце для повышенного или пониженного количества лекарственного средства в образце и исходного отношения лекарственное средство : мишень,

- проведение расчета на основе доли свободного лекарственного средства, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью.

4. Способ определения аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью по п. 1, включающий следующие стадии:

- определение на основе результата иммуноанализа доли свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, для первого отношения лекарственное средство : мишень в образце,

при этом отношение лекарственное средство : мишень равно или больше, чем отношение лекарственное средство : мишень, для которого определенная доля свободной мишени сравнима по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень,

- определение на основе результата иммуноанализа доли свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, для по меньшей мере второго отношения лекарственное средство : мишень в образце,

при этом второе отношение лекарственное средство : мишень отличается от первого отношения лекарственное средство : мишень посредством увеличения или уменьшения количества лекарственного средства в образце и посредством сохранения количества мишени в образце,

при этом доля свободной мишени сравнима для отношения лекарственное средство : мишень с повышенным или пониженным количеством лекарственного средства в образце для повышенного или пониженного количества мишени в образце и исходного отношения лекарственное средство : мишень,

- проведение расчета на основе доли свободной мишени, определенной на предыдущей стадии, аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью.

5. Способ определения аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью по п. 1, включающий следующие стадии:

- определение доли свободного лекарственного средства в по меньшей мере трех образцах с разными отношениями лекарственное средство : мишень,

при этом в по меньшей мере трех образцах количество лекарственного средства поддерживается постоянным и количество мишени в каждом образце отличается при условии, что образец содержит избыток мишени по сравнению с лекарственным средством,

или

определение доли свободной мишени в по меньшей мере трех образцах с разными отношениями лекарственное средство : мишень,

при этом в по меньшей мере трех образцах количество мишени поддерживается постоянным и количество лекарственного средства в каждом образце отличается при условии, что образец содержит избыток лекарственного средства по сравнению с мишенью,

- проведение расчета на основе доли свободного лекарственного средства или проведение расчета на основе доли свободной мишени, определенных на предыдущей стадии, аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью для каждого образца,

при этом аффинность связывания была определена, если по меньшей мере три значения KD являются сравнимыми,

при этом, если по меньшей мере три значения KD не являются сравнимыми, данный способ повторяют с использованием образцов, в которых либо

1) количество мишени снижено при постоянном количестве лекарственного средства, либо

2) количество лекарственного средства снижено при постоянном количестве мишени,

по сравнению с образцами, использованными в предыдущем определении.

6. Способ по любому из пп. 1-5, характеризующийся тем, что образец содержит сыворотку или плазму.

7. Способ по любому из пп. 1-5, характеризующийся тем, что лекарственное средство представляет собой антитело и мишень представляет собой антиген, который специфично связывается антителом.

8. Способ по любому из пп. 1-5, характеризующийся тем, что мишень иммобилизована на твердой фазе.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где избыток концентрации лекарственного средства над концентрацией мишени или концентрации мишени над концентрацией лекарственного средства является по меньшей мере 10-кратным.

10. Способ по любому из пп. 1-8, где избыток концентрации лекарственного средства над концентрацией мишени или концентрации мишени над концентрацией лекарственного средства является по меньшей мере 40-кратным.

11. Способ по любому из пп. 1-8, где избыток концентрации лекарственного средства над концентрацией мишени или концентрации мишени над концентрацией лекарственного средства является по меньшей мере 100-кратным.

12. Способ по любому из пп. 1-8, где избыток концентрации лекарственного средства над концентрацией мишени или концентрации мишени над концентрацией лекарственного средства находится в диапазоне от 10 до 100 раз.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, в частности к биохимии, фармакологии, биологии, и может быть использовано для тестирования биологически активных веществ с учетом групповой принадлежности крови.
Изобретение относится к медицине, в частности к травматологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и к внутренним болезням. .

Изобретение касается способа определения аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью, включающий следующие стадии: определение доли свободного лекарственного средства или свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и нековалентные комплексы лекарственное средство-мишень в интервале концентраций лекарственного средства при постоянной концентрации мишени, где доля свободного лекарственного средства остается постоянной, посредством определения на основе результата иммуноанализа доли свободного лекарственного средства в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень в образце и, если определенная доля свободного лекарственного средства не сравнима для всех использованных отношений лекарственное средство : мишень, тогда отношение лекарственное средство : мишень в образце уменьшают, и образец подвергают повторному анализу посредством такого же иммуноанализа, или определения на основе результата иммуноанализа доли свободной мишени в образце, содержащем лекарственное средство, мишень и комплексы лекарственное средство-мишень, по меньшей мере для двух разных отношений лекарственное средство : мишень в образце, и, если определенная доля свободной мишени не сравнима для всех использованных отношений лекарственное средство : мишень, тогда отношение лекарственное средство : мишень в образце увеличивают и образец подвергают повторному анализу посредством такого же иммуноанализа, и проведение расчета на основе доли свободного лекарственного средства или проведение расчета на основе доли свободной мишени, определенных на предыдущей стадии, аффинности связывания лекарственного средства с его мишенью, где «сравнимый» означает относительное различие двух определенных значений менее чем 100, а «несравнимый» означает относительное различие двух определенных значений больше чем 100, где Разл., рассчитанное согласно следующей формулы Разл. [ - ] , где для расчета значения аффинности связывания применяют следующее уравнение: KD *. Технический результата изобретения заключается в том, что определение аффинности связывающего агента и его лиганда в образцах можно осуществлять с использованием очень ограниченного числа измерений, что снижает трудоемкость способа и повышает его точность. 11 з.п. ф-лы, 6 пр., 11 ил.

Наверх