Соль пептидной вакцины, способ ее получения и фармацевтический препарат, содержащий эту соль

Изобретение относится к области фармацевтической технологии и относится к ацетату KIFGSLAFL в форме твердого аморфного вещества, способу его получения и фармацевтическому препарату пептидной вакцины, содержащему указанный ацетат. Ацетат KIFGSLAFL обладает хорошей чистотой, стабильностью и растворимостью в воде. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 13 пр.

 

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области фармацевтической технологии, а также к соли пептидной вакцины и способу ее получения, в частности, к ацетату пептида KIFGSLAFL, способу его получения и к фармацевтическому препарату, содержащему такой ацетат.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак молочной железы (ВСа) является наиболее распространенной формой рака, диагностируемой у женщин, и вторым ведущим фактором смертности от рака у женщин (RiesLAG et al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda, MD). В течение последних 20 лет значительный прогресс в лечении рака молочной железы существенно улучшил выживаемость без признаков заболевания (DFS - disease-free survival). Например, для блокировки специфического клеточного процесса с целью замедления прогрессирования заболевания или предотвращения рецидива заболевания была применена терапия с использованием антител, которые реагируют с опухолеассоциированным антигеном. Несмотря на то что лечение рака молочной железы в последние годы прогрессировало, достаточное количество пациентов, в конечном счете, умерли от рецидивов заболевания. Таким образом, терапия с целью профилактики, замедления или подавления рецидива заболевания является необходимой.

Вакцина является достойной внимания моделью для такой терапии и профилактики из-за удобства введения и высокой эффективности, наблюдаемой при лечении инфекционных заболеваний. В теории, принцип создания вакцины довольно прост. Однако на практике, в разработке эффективной противораковой вакцины для лечения солидных опухолей процент успеха невелик.

KIFGSLAFL (нонапептид с аминокислотной последовательностью Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu, также известный как HER2/neu 369-377), пептидная последовательность протоонкогена HER2/neu, стимулирует цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), предназначена для вакцины, направленной на предотвращение и/или лечение рака и, в общем и целом, используется в клинических исследованиях в настоящее время (Zaks Т et al., Immunization with a peptide epitope (369-377) from HER-2/neu leads to peptide specific cytotoxic T lymphocytes that fail to recognize HER-2/neu+tumors, Cancer Research, 1998, 58(21): 4902-8; Knutson KL et al., Immunization of cancer patients with HER-2/neu, HLA-A2 peptide, p 369-377, fesults in short-lived peptide-specific immunity, Clin Cancer Res 2002, 8(5): 1014-1018).

Однако образцы KIFGSLAFL, использованные в клинических испытаниях раскрытых технологий, находятся в растворе ДМСО, обладают низкой стабильностью при комнатной температуре и нуждаются в хранении при низкой температуре -20°С и оттаивании перед использованием. До сих пор не известно ни одного соединения или смеси этого полипептида, которые были бы стабильны при комнатной температуре.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одной из целей настоящего изобретения является получение ацетата KIFGSLAFL для существенного улучшения чистоты, растворимости в воде и стабильности исходных материалов.

При этом, указанный KIFGSLAFL представляет собой нонапептид со следующей аминокислотной последовательностью:

известный также как HER2/neu 369-377, и молекулярной формулой указанного ацетата KIFGSLAFL является C₅₀H₇₈N₁₀O₁₁⋅С₂Н₄О₂.

Вышеуказанный ацетат KIFGSLAFL, предпочтительно приготовленный и полученный способом по настоящему изобретению, имеет очень высокую лекарственную чистоту. Чистота составляет ≥95%, предпочтительно, ≥98% и, более предпочтительно, ≥99%. Обеспечение эффективности и безопасности лекарственного средства является очень важным для коммерческого развития.

Так как в ходе синтеза KIFGSLAFL образуется большое количество примесей, существует очевидная техническая сложность в получении соли KIFGSLAFL высокой чистоты, и трудно выделить одну соль с высокой степенью чистоты.

Согласно настоящему изобретению в результате множества экспериментов предложен способ получения ацетата KIFGSLAFL, включающий в себя следующие стадии:

(1) Получение сырого KIFGSLAFL

Синтезируют пептидную смолу KIFGSLAFL в соответствии с аминокислотной последовательностью (9→1) твердофазным способом с использованием Fmoc-технологии, отщепляют Fmoc с помощью трифторуксусной кислоты с получением сырого KIFGSLAFL, процесс включает в себя следующие стадии:

(1.1) Используют чувствительную к воздействию кислоты смолу с Fmoc-Leu-OH (такую, как смола Ванга или 2-хлор-тритил-смола) в качестве сырья для реакции с раствором пиперидина, удаляют защитную группу Fmoc и получают Leu-смолу после промывания растворителем.

(1.2) В соответствии с твердофазным способом синтеза пептидов, Leu-смолу приводят в реакцию с Fmoc-защищенными аминокислотами последовательно, с получением нонапептид-KIFGSLAFL-смолы. Проводят транспептидазную реакцию с конденсирующим агентом последовательно в течение периода времени, промывают растворителем, удаляют защитную Fmoc-группу, затем промывают растворителем, осуществляют конденсацию со следующей Fmoc-защищенной аминокислотой.

Fmoc-защищенные аминокислоты соединяют с Leu-смолой в следующем порядке: Fmoc-Phe-ОН, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc Phe-OH, Fmoc-Ile-OH и Fmoc-Lys(Boc)-OH.

Предпочтительными конденсирующими агентами являются HATU, HBTU, ВОР, PyBOP, DIC/HOBt, DIC/HOAt и т.д.

(1.3) Обрабатывают KIFGSLAFL-смолу лизирующим раствором трифторуксусной кислоты с получением раствора KIFGSLAFL в трифторуксусной кислоте, добавляют диэтиловый эфир для осаждения, центрифугируют и отмывают с получением сырого KIFGSLAFL. Лизирующий раствор трифторуксусной кислоты представляет собой реагент улавливания карбкатиона, содержащий трифторуксусную кислоту 50-95% (об./об.), остальное - дихлорметан или далее 1-10% (об./об.) воды, фенола, п-крезола, анизола, тиоанизола, 1,2-дитиогликоля, триизопропилхлоросилана (TIS) и других реагентов улавливания карбкатиона.

(2) Очистка KIFGSLAFL

Растворяют сырой KIFGSLAFL, приготовленный и полученный на стадии (1) в смешанном растворе ацетонитрила и воды, фильтруют, очищают фильтрат путем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с получением чистого раствора KIFGSLAFL в смеси ацетонитрил/вода.

Для очистки путем обращенно-фазовой ВЭЖХ, предпочтительно используют С4, С8 или С18 алкил-привитый силикагель в качестве неподвижной фазы, более предпочтительно, С18-алкил-привитый силикагель; температуру колонки поддерживают, предпочтительно, 20-35°С, более предпочтительно, 25-30°С; в качестве подвижной фазы используют раствор ацетонитрил/вода, содержащий трифторуксусную кислоту, где концентрация трифторуксусной кислоты составляет от 0,02% до 0,5% (об./об.), предпочтительно от 0,05% до 0,2% (об./об.). Предпочтительное содержание ацетонитрила в подвижной фазе в объемных процентах составляет от 10% до 80% для градиентного элюирования от низкой концентрации к высокой концентрации, более предпочтительно, от 20% до 50%.

(3) Преобразование в соль (преобразование в ацетат)

Проводят обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию с чистым KIFGSLAFL, приготовленным и полученным на стадии (2), с помощью уксусной кислоты в растворе ацетонитрил/вода в качестве подвижной фазы, с получением раствора ацетата KIFGSLAFL.

Для преобразования в соль путем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, в качестве неподвижной фазы предпочтительно используют С4 или С8 или С18 алкил-привитый силикагель, более предпочтительно С18 алкил-привитый силикагель; температуру колонки поддерживают 20-35°С, более предпочтительно 25-30°С; в качестве подвижной фазы используют ацетонитрил/водный раствор, содержащий уксусную кислоту, где концентрация уксусной кислоты составляет от 0,02% до 0,5% (об./об.), предпочтительно от 0,05% до 0,2% (об./об.).

Предпочтительное содержание ацетонитрила в подвижной фазе в объемных процентах составляет от 2% до 80% для градиентного элюирования от низкой концентрации к высокой концентрации, более предпочтительно, сначала осуществляют, по меньшей мере, в размере одного объема колонки, изократическое или градиентное элюирование от 2% до 4%, с последующим изократическим или градиентным элюированием от низкого к высокому градиенту от 20% до 50%.

(4) Удаление растворителя с получением твердого вещества ацетата KIFGSLAFL

Один из способов заключается в концентрации при пониженном давлении и высушивании раствора ацетата KIFGSLAFL, приготовленного и полученного на указанной выше стадии (3) с получением твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.

Другой способ заключается в концентрации (при пониженном давлении) раствора ацетата KIFGSLAFL, приготовленного и полученного на вышеуказанной стадии (3), осаждение ацетата KIFGSLAFL, центрифугирование для получения осадка, вакуумная сушка с получением твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.

Другой целью настоящего изобретения является предложение ацетата KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества, рентгеновская дифрактограмма которого не содержит характерного для кристалла дифракционного пика. Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL очевидно обладает лучшей стабильностью и растворимостью в воде, являясь, таким образом, более удобным для приготовления лекарственных средств, в частности, для применения препарата в инъекционной форме.

Согласно настоящему изобретению в результате множества экспериментов предложен способ получения аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL, включающий в себя следующие стадии:

Доведение значения рН раствора ацетата KIFGSLAFL, приготовленного и полученного на вышеуказанной стадии (3), до значения рН 4 с помощью уксусной кислоты, концентрация при пониженном давлении до выпадения в осадок ацетата KIFGSLAFL, понижение температуры до значения ниже 5°С, центрифугирование для получения осадка, вакуумная сушка при температуре ниже 30°С с получением гомогенного аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.

Рентгеновская дифрактограмма получена с помощью следующего способа детекции. Модель прибора: рентгеновский дифрактометр Empyrean; условия тестирования: Cu Kα1 излучение, напряжение 40 кВ, ток 40 мА, угловой диапазон 2θ 3°-50°, вертикальная щель 1/32°, горизонтальная щель 1/16°, горизонтальная щель 7,5 мм, шаг 0,02°, экспозиция на шаг 40 с.

Указанный аморфный твердый ацетат KIFGSLAFL детектируют в ИК-области спектра методом прессования таблеток с KBr, и его поглощение ИК-излучения имеет пики при 3288 см^-1, 3065 см^-1, 2958 см^-1, 1632 см^-1, 1527 см^-1, 1404 см^-1 и 698 см^-1.

Указанный аморфный твердый ацетат KIFGSLAFL детектируют с помощью масс-спектрометрии ESI (ионизация в электроспрее), с пиком молекулярных ионов 995.9, что, в основном, соответствует вычисленной молекулярной массе для KIFGSLAFL.

Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL растворяют в смешанном растворе ацетонитрила и воды (объемное соотношение = 5:95) и анализируют методом ВЭЖХ в следующих условиях: используют С18-привитый силикагель (250×4,6 мм, 5 мкм) в качестве неподвижной фазы, ацетонитрил - в качестве подвижной фазы А, 0,1 моль/л раствор дигидрофосфата натрия (значение рН доведено до рН 3,0 фосфорной кислотой) - в качестве подвижной фазы В, проводят градиентное элюирование (относительно подвижной фазы А, от 5% до 45% с временем элюирования 20 мин, затем переходят к 45% изократическому элюированию подвижной фазы А), со скоростью пропускания 1 мл/мин. Длины волн детектирования составляют 195 нм (0-8 мин) и 230 нм (8-50 мин). Времена элюирования уксусной кислоты и целевого пептида KIFGSLAFL составляют приблизительно 4,6 мин и 21 мин, соответственно.

Другой целью данного изобретения является создание фармацевтического препарата пептидной вакцины, содержащего вышеуказанный ацетат KIFGSLAFL, который может быть преобразован с фармацевтически приемлемым растворителем в инъекционный лекарственный препарат для пациентов. Фармацевтически приемлемый растворитель включает воду для инъекций, стерильную воду и т.д.

Эффективность и безопасность такого лекарственного препарата является существенно улучшенной, так как ацетат KIFGSLAFL по изобретению, в частности, его аморфный твердый продукт, имеет хорошую чистоту и стабильность и превосходно растворяется в воде.

Указанный фармацевтический препарат содержит один или более лекарственных эксципиентов или не содержит их. Фармацевтический препарат по настоящему изобретению может быть в любой порошковой форме для парентерального введения, например, в форме лиофилизированного порошка, суспензии или инъекционного препарата и т.д.

Указанный фармацевтический препарат может быть предпочтительно использован для лечения рака молочной железы и рецидива рака молочной железы.

Если не указано иное, ацетат KIFGSLAFL имеет молекулярную формулу C₅₀H₇₈N₁₀O₁₁⋅C₂H₄O₂.

Сокращения различных реагентов в данном изобретении, определены следующим образом:

По сравнению с известными технологиями, изобретение имеет следующие характерные преимущества и положительные эффекты:

1. По сравнению с KIFGSLAFL и сульфатом KIFGSLAFL, предложенный в настоящем изобретении ацетат KIFGSLAFL существенно улучшает чистоту, стабильность и растворимость в воде лекарственных препаратов и, в достаточной мере, обеспечивает лекарственную безопасность и эффективность.

2. Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL, предложенный в настоящем изобретении, имеет превосходную стабильность и растворимость в воде, ускоряет повторное растворение лекарственного средства при использовании в качестве инъекций и имеет лучшую стабильность растворенного ацетата KIFGSLAFL, чем растворитель для инъекций (такой как диметилсульфоксид, ДМСО). Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL, предложенный в настоящем изобретении, в соответствии со свойствами растворимости и стабильности, представляет собой более выгодную форму для приготовления фармацевтического препарата, может в достаточной степени обеспечить удобное использование фармацевтического препарата и будет безопасным и эффективным в применении.

3. В настоящем изобретении предложен способ получения высокочистого ацетата KIFGSLAFL и преодолены технические трудности в существующих технологиях получения соли и повышения чистоты. Способ может быть осуществлен в мягких условиях, условия способа могут быть легко воспроизведены и стоимость производства может быть значительно снижена.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показан спектр дифракции рентгеновских лучей аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.

На фиг. 2 показан ИК-спектр аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.

На фиг. 3 показаны спектры масс-спектрометрии ESI аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.

ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие ниже варианты реализации изобретения и прилагаемые чертежи иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают его.

Вариант реализации 1, получение сырого KIFGSLAFL

1. Взвешивали 40 г Fmoc-Leu-смолы Ванга (со степенью замещения: 0,8 ммоль/г), добавляли 300 мл DMF для набухания смолы на 30 мин. Удаляли DMF путем вакуумной фильтрации, и добавляли 300 мл 20%-ного раствора пиперидин/DMF для протекания реакции в течение 30 мин. Проводили фильтрацию с отсосом и промывали смолу с 6×150 мл DMF.

2. Добавляли 24,8 г Fmoc-Phe-OH, 8,6 г HOBt и 150 мл DMF, хорошо перемешивали, добавляли 9,5 мл DIC и перемешивали в водяной бане при температуре 28-30°С в течение 4-5 часов, определяли обесцвечивание смолы методом Kaiser, проводили фильтрование с отсасыванием и промывали смолу с 2×200 мл DMF, добавляли 300 мл 20% раствора пиперидина/DMF для протекания реакции в течение 30 мин, проводили фильтрование и промывали смолу с 6×200 мл DMF.

3. В отношении стадии 2, присоединяли следующую аминокислоту по порядку. Последовательность и дозировка аминокислот были следующими: Fmoc-Ala-OH, 19,9 г, Fmoc-Leu-OH, 22,6 г, Fmoc-Ser(tBu)-OH 24,5 г, Fmoc-Gly-OH, 19,0 г, Fmoc-Phe-OH 24,8 г, Fmoc-Ile-OH 22,6 г и Fmoc-Lys(Boc)-OH 30,0 г.

4. Промывали смолу последовательно дихлорметаном и метиловым спиртом, сушили под вакуумом с получением пептид-KIFGSLAFL-смолы.

5. Взвешивали 10 г пептидной смолы, добавляли 100 мл лизирующего раствора (TFA/TIS/H₂O=95/2,5/2,5, об./об./об.), и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, фильтровали смолу и промывали смолу соответствующим количеством лизирующего раствора, комбинировали промывочную жидкость с фильтратом, добавляли 1 л диэтилового эфира при перемешивании для получения осадка, центрифугировали и несколько раз промывали диэтиловым эфиром, сушили под вакуумом с получением сырого KIFGSLAFL.

Вариант реализации 2, очистка KIFGSLAFL

Растворяли 5 г сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1, в 100 мл воды, содержащей 10% ацетонитрила в объемном соотношении, и фильтровали, фильтрат очищали на колонке С18 с высотой наполнения 250 мм и диаметром 15 мм, проводили градиентное элюирование (В: 20-50%, время элюирования: 60 мин) с водой, содержащей 0,1% трифторуксусную кислоту в качестве подвижной фазы А, и ацетонитрилом, содержащим 0,1% трифторуксусную кислоту в качестве подвижной фазы В, со скоростью пропускания 600 мл/мин, с длиной волны детектирования 230 нм, собирали компоненты основного пика, определяли степень очистки собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 98%, для получения чистого раствора KIFGSLAFL, определяли степень очистки собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, и получали чистоту 98,6% и выход 45%.

Условия определения содержания трифторуксусной кислоты и целевого пептида с помощью аналитической ВЭЖХ были следующими: ВЭЖХ: Chuangxin Tongheng LC300, неподвижная фаза: С18-привитый силикагель (250×4,6 мм, 5 мкм), подвижная фаза А: ацетонитрил и подвижная фаза В: 0,1 моль/л раствор дигидрофосфата натрия (значение рН доводили до 3,0 фосфорной кислотой). Проводили градиентное элюирование (пропускали подвижную фазу А с градиентом от 5% до 45%, со временем элюирования 20 мин, а затем переходили к 45% изократическому элюированию подвижной фазы А) со скоростью пропускания 1 мл/мин и длинами волн детектирования 195 нм (0-8 мин) и 230 нм (8-50 мин). Времена элюирования для трифторуксусной кислоты и целевого пептида были приблизительно 4,9 мин и 21 мин, соответственно.

Условия для определения чистоты целевых пептидов с помощью аналитической ВЭЖХ были следующими: ВЭЖХ: Chuangxin Tongheng LC300, неподвижная фаза: С18-привитый силикагель (250×4,6 мм, 5 мкм), подвижная фаза: смешанный раствор 0,1 моль/л дигидрофосфата натрия (значение рН доведено до рН 3,0 фосфорной кислотой) и ацетонитрила (при объемном соотношении 7:3), со скоростью пропускания 1 мл/мин и длиной волны детектирования 230 нм. Время элюирования для целевого пептида составляло приблизительно 10 мин.

Вариант реализации 3, получение свободного пептида KIFGSLAFL

Охлаждали раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте реализации 2 до 0-5°С, и по каплям при перемешивании добавляли 5% раствор NaOH до достижения значения рН 10, концентрировали при пониженном давлении до выпадения в осадок массы гелеобразных преципитатов, центрифугировали, промывали небольшим количеством ледяной воды, осаждали и сушили под вакуумом с получением белого твердого вещества с чистотой 98,1%.

Вариант реализации 4, получение раствора ацетата KIFGSLAFL

Раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте 2, после соответствующей концентрации очищали с помощью С18-колонки, с высотой наполнения 250 мм и диаметром 150 мм. Элюировали водным раствором, содержащим в объемном соотношении 0,1% уксусной кислоты и 3% ацетонитрила в течение 15 мин, при скорости пропускания 800 мл/мин. Затем проводили градиентное элюирование (В: 20% - 40%, время элюирования: 50 мин) с водой, содержащей 0,1% уксусной кислоты в качестве подвижной фазы А, и ацетонитрилом, содержащим 0,1% уксусной кислоты, в качестве подвижной фазы В, с длиной волны детектирования 230 нм, собирали компоненты основного пика раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 99,6% и выходом 90%.

Вариант реализации 5, получение аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL

Доводили значение рН раствора ацетата KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 4 до рН 4 с помощью уксусной кислоты, концентрировали при пониженном давлении до выпадения в осадок массы гелеобразных преципитатов, охлаждали до температуры 0-5°С, центрифугировали для получения осадка, сушили под вакуумом при 30°С с получением твердого вещества белого цвета.

Согласно определению аналитической ВЭЖХ в варианте реализации 2, время элюирования уксусной кислоты было приблизительно 4,6 мин. Как показали измерения, массовый процент уксусной кислоты в образце был 5,7%. Чистота KIFGSLAFL была 99,5%.

Условия детекции рентгенодифракционным методом были следующими: модель прибора: рентгеновский дифрактометр Empyrean; условия тестирования: Cu Kα1 излучение, напряжение: 40 кВ, ток: 40 мА, угловой диапазон 2θ: 3°-50°, вертикальная щель: 1/32°, горизонтальная щель: 1/16°, горизонтальная щель: 7,5 мм, шаг: 0,02°, экспозиция на шаг: 40 с. Рентгеновский дифракционный спектр показан на фиг. 1.

ИК-спектр поглощения, полученный методом прессования таблеток с KBr показан на фиг. 2.

Результат масс-спектрометрической детекции ESI (электроспрейной ионизацией) показан на фиг. 3, где 995,9 m/z пик был М+Н⁺, что в основном соответствовало рассчитанной молекулярной массе KIFGSLAFL.

Вариант реализации 6, получение KIFGSLAFL⋅H₂SO₄

Охлаждали раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте 2 до 0-5°С, и добавляли по каплям при перемешивании раствор NaOH в соотношении по массе 5% до достижения значения рН 10, концентрировали при пониженном давлении до осаждения массы гелеобразных преципитатов, центрифугировали и промывали небольшим количеством ледяной воды, растворяли твердое вещество в растворе ацетонитрила с объемным отношением 50%, добавляли H₂SO₄ в количестве 0,5 моль H₂SO₄ на моль Е75, хорошо перемешивали (рН 6), и осуществляли вращательное испарение и концентрацию при пониженном давлении в водяной бане при температуре 30°С в течение 2~3 ч, лиофилизировали с получением твердого продукта.

Вариант реализации 7, определение стабильности KIFGSLAFL и ацетата KIFGSLAFL

Изучали стабильность следующих образцов в стерильных условиях при 25°С и относительной влажности 50%:

Образец 1 представлял собой аморфный твердый продукт по варианту реализации 5. Образец 2 представлял собой раствор по варианту реализации 4, который был разбавлен ДМСО до приблизительно 1 мг/мл и профильтрован через мембранный фильтр с пористостью 0,2 мкм. Образец 3 представлял собой твердый продукт по варианту реализации 3. Образец 4 представлял собой твердый продукт по варианту реализации 3, который растворяли в ДМСО, разбавляли до приблизительно 1 мг/мл и фильтровали через мембранный фильтр с пористостью 0,2 мкм. Образец 5 представлял собой твердый продукт по варианту реализации 6. Чистоту каждого образца определяли с помощью ВЭЖХ, и получили следующие результаты:

Экспериментальные результаты, приведенные выше, показывают, что: стабильность твердого вещества KIFGSLAFL (образец 3) и раствора ДМСО (образец 4) в имеющихся технологиях явно уступали аморфному твердому веществу ацетата KIFGSLAFL (образец 1) и раствору ацетата KIFGSLAFL в ДМСО (пример 4); и стабильность аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL (образец 1) была, очевидно, выше, чем стабильность раствора ДМСО (образец 2) и KIFGSLAFL⋅H₂SO₄ (образец 5).

Вариант реализации 8, определение растворимости

Добавляли твердые продукты вариантов реализации 3, 5 и 6 в определенное количество воды для инъекций с температурой 25°С в небольшие пробирки, соответственно, помещали в шейкеры с постоянной температурой, наблюдали условия растворения. Условия растворения были следующими:

Экспериментальные результаты, приведенные выше, показывают, что: растворимость аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL (образец варианта реализации 5) в воде значительно превосходит растворимость твердого вещества KIFGSLAFL из имеющихся технологий и растворимость KIFGSLAFL⋅H₂SO₄, что делает ацетат KIFGSLAFL более удобным для приготовления лекарственного средства.

Вариант реализации 9, получение продукта пептидной вакцины

Получали ацетат KIFGSLAFL способом по варианту реализации 5 в стерильных условиях, точно взвешивали (1 мг/доза по KIFGSLAFL), упаковывали и запечатывали в стеклянные бутылки, с получением продукта пептидной вакцины.

Вариант реализации 10

Соответствующим образом концентрировали раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте реализации 2, очищали на колонке С18 с высотой наполнения 250 мм и диаметром 150 мм. Проводили градиентное элюирование (В: 20% - 40%, время элюирования: 50 мин) с водой, содержащей 0,1% уксусную кислоту в объемном соотношении в качестве подвижной фазы А и ацетонитрилом в качестве подвижной фазы В, со скоростью пропускания 800 мл/мин, длиной волны детектирования 230 нм, собирали компоненты основного пика и получали раствор KIFGSLAFL, концентрировали при пониженном давлении и лиофилизировали с получением твердого вещества белого цвета. В соответствии с ВЭЖХ детекцией в варианте реализации 2, массовый процент уксусной кислоты был 4,8%, а массовый процент трифторуксусной кислоты был 1,9%.

Вариант реализации 11

Проводили хроматографическую очистку сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1 методом по варианту реализации 2, чтобы собрать компоненты основного пика.

Определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 92% с получением раствора KIFGSLAFL, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ с получением чистоты 95,1%, проводили преобразование в соль методом хроматографии по варианту реализации 4 и собирали компоненты основного пика с получением раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 95,3%, концентрировали полученный раствор ацетата KIFGSLAFL при пониженном давлении досуха, сушили в вакууме при температуре ниже 40°C с получением твердого вещества белого цвета. Общий выход был 60%. Чистота KIFGSLAFL, как было определено методом ВЭЖХ по варианту реализации 2, соответствовала 94,1%.

Вариант реализации 12

Проводили хроматографическую очистку сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1 методом по варианту реализации 2, собирали компоненты основного пика. Определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 92% с получением раствора KIFGSLAFL, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ с получением чистоты 95,1%. Проводили преобразование в соль с помощью хроматографии по варианту реализации 4 и собирали компоненты основного пика с получением раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 95,3% и общим выходом 60%, процессировали методом по варианту реализации 5 с получением твердого продукта белого цвета, представляющего собой аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL с чистотой 95,3%.

Вариант реализации 13

Проводили хроматографическую очистку сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1, способом по варианту реализации 2 со сбором компонентов основного пика, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 96% с получением раствора KIFGSLAFL, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ с получением чистоты 97,5%, проводили преобразование в соль хроматографическим способом по варианту реализации 4 и собирали компоненты основного пика с получением раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 98,1% и общим выходом 45%, процессировали способом по варианту реализации 5 с получением твердого вещества белого цвета, представляющего собой аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL с чистотой 98,0%.

Из-за образования большого количества примесей в ходе синтеза KIFGSLAFL, промышленное получение соли KIFGSLAFL высокой чистоты технологически затруднительно, и было трудно выделить одну соль с высокой степенью чистоты. Как указывалось в варианте реализации 10, синтетический продукт может легко образовывать смешанные соли, такие как соли уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты и т.д., которые трудно отделить и очистить для получения одной чистой соли.

Изобретатель смог получить продукты с чистотой менее 95%, используя традиционные в данной области техники схемы разделения и методы очистки, такие как схема в варианте реализации 11, идущая вразрез с применением продукта в медицине. Однако чистота продукта повышалась до 95% или даже до 98% при использовании предпочтительных схем очистки, разработанных в результате большого количества экспериментов, таких как схемы в вариантах реализации 12 и 13, которые преодолевают трудности получения соли KIFGSLAFL высокой чистоты и делают возможными промышленное производство тестируемого продукта и применение его в медицине.

Вышеперечисленные варианты реализации представляют собой предпочтительные варианты реализации изобретения и не являются ограничениями. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения, без отклонения от сущности и принципов настоящего изобретения, будут эквивалентными вариантами и будут включены в объем правовой охраны данного изобретения.

1. Ацетат KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества, молекулярная формула которого представляет собой C₅₀H₇₈N₁₀O₁₁⋅C₂H₄O₂, при этом чистота ацетата KIFGSLAFL составляет ≥98%, рентгеновская дифрактограмма указанного ацетата KIFGSLAFL не содержит характерного для кристалла дифракционного пика, и поглощение в ИК-области спектра для ацетата KIFGSLAFL имеет пики при 3288 см^-1, 3065 см^-1, 2958 см^-1, 1632 см^-1, 1527 см^-1, 1404 см^-1 и 698 см^-1.

2. Ацетат по п. 1, отличающийся тем, что чистота ацетата KIFGSLAFL составляет ≥99%.

3. Фармацевтический препарат пептидной вакцины для предотвращения и/или лечения рака молочной железы, содержащий ацетат KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества по любому из пп. 1, 2 и один или более фармацевтически приемлемый растворитель, причем препарат приготовлен в виде инъекционного лекарственного препарата для пациентов.

4. Фармацевтический препарат по п. 3, в котором растворитель содержит воду для инъекций или стерильную воду.

5. Способ получения ацетата KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества по п. 1, включающий следующие стадии:

(1) синтез пептидной смолы KIFGSLAFL в соответствии с аминокислотной последовательностью (9→1) твердофазным способом с использованием Fmoc-технологии, отщепление Fmoc с помощью трифторуксусной кислоты с получением неочищенного KIFGSLAFL;

(2) очистка KIFGSLAFL: растворение и фильтрация неочищенного KIFGSLAFL, проведение очистки путем обращенно-фазовой ВЭЖХ со смесью ацетонитрил/вода, содержащей трифторуксусную кислоту, в качестве подвижной фазы, сбор компонентов основного пика;

(3) преобразование в соль: проведение преобразования в соль компонентов основного пика, собранных на стадии (2), с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ со смесью ацетонитрил/вода, содержащей уксусную кислоту, в качестве подвижной фазы, сбор компонентов основного пика;

при этом для очистки на стадии (2) и для преобразования в соль на стадии (3) соответственно используют С4, С8 или С18 алкил-привитый силикагель в качестве неподвижной фазы; температура колонки составляет 20-35°С; в качестве подвижной фазы при очистке на стадии (2) используют 0,02%-0,5% (об./об.) трифторуксусную кислоту и в качестве подвижной фазы при преобразовании в соль на стадии (3) используют 0,02%-0,5% (об./об.) уксусную кислоту; (4) концентрация и сушка при пониженном давлении, доведение значения рН раствора ацетата KIFGSLAFL после преобразования в соль до значения рН 4 с помощью уксусной кислоты, концентрация при пониженном давлении до выпадения в осадок ацетата KIFGSLAFL, понижение температуры до значения ниже 5°С, центрифугирование для получения осадка, вакуумная сушка при температуре ниже 30°С.