Способ определения гиалуронидазной активности лекарственных средств с использованием лиофилизата лидазы в качестве рабочего стандартного образца

Изобретение относится к биотехнологии и контролю качества и может быть использовано в фармацевтической промышленности и научно-исследовательской деятельности для количественного определения гиалуронидазной активности лекарственных средств. Способ определения гиалуронидазной активности лекарственных средств включает смешивание исследуемого раствора известной концентрации с ацетатным буферным раствором с рН 5,6, инкубирование, добавление раствора гиалуроновой кислоты, инкубирование в течение 15 минут, охлаждение во льду, добавление рассчитанного по титру количества 0,8 М тетрабората калия, помещение на кипящую водяную баню, взаимодействие с реактивом Эрлиха, определение оптической плотности спектрофотометрическим методом при длине волны 586 нм, толщине слоя 10 мм, определение гиалуронидазной активности путем сравнения со стандартным образцом, в качестве рабочего стандартного образца используют лекарственный препарат «Лидаза» с гиалуронидазной активностью не менее 300 МЕ/мл и концентрацией белка не выше 4 мг/мл, определение гиалуронидазной активности проводят в Международных единицах. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и контролю качества лекарственных средств и может быть использовано в фармацевтической промышленности, контрольных лабораториях и научно-исследовательской деятельности для количественного определения гиалуронидазной активности лекарственных средств.

Уровень техники

Количественное определение гиалуронидазы производится в различных единицах измерения - опытные дозы (ОД), условные единицы (УЕ) и международные единицы (ME). Способы определения основываются на фермент-субстратной реакции, количественное измерение продуктов которой производится с применением спектрофотометрии либо вискозиметрии.

Известен способ количественного определения гиалуронидазной активности, в котором единицей измерения служат опытные дозы - ОД (патент SU 1786071 А1, опубл. 07.01.93). Способ включает инкубацию испытуемого образца, содержащего фермент, с гиалуроновой кислотой, введение в полученную смесь сгусткообразователя - 0.75-1.25%-ный раствор риванола в соотношении 1:25 и учет результатов путем измерения оптической плотности экстракта колориметрическим методом при длине волны 402 нм или флюоресценции экстракта при длине волны возбуждения 402 нм и эмиссии 480 нм. Способ был одним из первых количественных методов определения гиалуронидазы в постсоветском пространстве, однако имеет ряд недостатков. Так, в методе присутствует этап образования сгустков, что замедляет процесс и приводит к снижению точности определения. Главным недостатком является то, что гиалуронидазная активность измеряется в опытных дозах - устаревших единицах измерения, не применяемых на сегодняшний день.

В Европейской фармакопее (8-е издание, 2013) описан способ определения гиалуронидазной активности в Международных единицах. Данный способ является обязательным для использования при определении гиалуронидазной активности лекарственных средств на территории стран Европы. В данном методе активность фермента гиалуронидаза определяется вискозиметрически путем сравнения скорости, с которой он гидролизует гиалуронат натрия, со скоростью, полученной с Международным стандартом. Способ допускает использование иного эталонного препарата, нежели Международный стандарт гиалуронидазы, однако не описаны критерии приемлемости подобного эталона. К недостаткам описываемого аналога следует отнести применение дорогостоящего и сложного в эксплуатации микровискозмиметра.

Существует более экономичный и простой, по сравнению с применением микровискозмиметра, метод спектрофотометрического количественного определения активности гиалуронидазы в Международных единицах (ME), в котором сравниваются исследуемые образцы с Международным стандартом гиалуронидазы (BRP). В данном методе продукты реакции гиалуронидазы и гиалуроной кислоты реагируют с раствором цетил-триметил-аммоний-бромида, после чего определяется оптическая плотность референтного и исследуемых образцов при длине волны 400 нм (патент CN 105524977 А, опубликованный 27.04.2016). При относительной простоте и высокой скорости постановки данный способ определения активности ограничен постоянным использованием дорогостоящего международного стандартного образца, что не позволяет проводить поточные промежуточные и выходные контроли большого количества серий лекарственных средств, научно-исследовательский поиск.

Ближайшим аналогом предлагаемого технического решения является способ определения гиалуронидазной активности в лекарственных средствах в условных единицах (УЕ), описанный в ФС-42-0081-02. Способ основан на расчете отношения оптических плотностей раствора исследуемого образца и государственного стандартного образца, предварительно вступивших в реакцию с гиалуроновой кислотой или ее солью, и впоследствии окрашенных по реакции Эльсона-Моргана. Ацетатный буферный раствор, применяемый в описываемом аналоге, обеспечивает рН 4,0. Добавление тетрабората калия (натрия) в реакционную смесь приводит к повышению рН до 8,9, что является необходимым условием для образования окрашенных продуктов, которые учитываются спектрофотометрическим методом. Продукт расщепления гиалуроновой кислоты гиалуронидазой, N-ацетил-D-глюкозамин, при нагревании в щелочном растворе образует хромоген, который в кислом растворе дает с реактивом Эрлиха окрашенное в фиолетовый цвет соединение. Измерения проводятся при длине волны 586 нм при толщине слоя 10 мм.

Недостатками данного способа являются определение активности в условных единицах - единицах измерения, которые не соответствуют международным требованиям, применение стандартного образца, не аттестованного в соответствии с международными эталонами, сильная чувствительность к условиям протекания реакции.

Сущность изобретения

Задачей изобретения было создание дешевого и простого в исполнении способа количественного поточного определения гиалуронидазной активности в Международных единицах в готовых лекарственных формах и полупродуктах.

Поставленная задача достигается путем усовершенствования метода спектрофотометрического определения активности гиалуронидазы, описанного в прототипе, за счет изменения рН, применяемого буферного раствора, изменения условий и времени взаимодействия реактива Эрлиха с хромогеном, применения в качестве рабочего стандартного образца (РСО) любой партии лекарственного средства «Лидаза, лиофилизат», откалиброванного по Международному стандарту гиалуронидазы и отвечающего заявленным требованиям по активности и содержанию белка.

Определение гиалуронидазной активности партии лекарственного средства «Лидаза, лиофилизат», предполагаемого к использованию в качестве РСО, в международных единицах производится путем экстраполяции данных по оптической плотности на калибровочную кривую, построенную по Международному стандартному образцу гиалуронидазы (BRP). Для выполнения методики необходимо подготовить калибровочные растворы стандарта и рабочий раствор калибруемого РСО (с концентрацией белка, определенной любым стандартным методом, не выше 4 мг/мл) в ацетатном буферном растворе с рН 5,6.

При спектрофотометрическом определении в пробирки вносятся исследуемый раствор заданной концентрации и ацетатный буферный раствор с рН 5,6 в соотношении 1:2, в холостую пробу - только буферный раствор. В пробирки, инкубируемые при +37±0,1°C, добавляется раствор гиалуроновой кислоты. Спустя 15 минут пробы охлаждают во льду и добавляют, поставив пробирки на кипящую водяную баню, тетраборат калия (натрия) в количестве 0,8 М, рассчитанном по титру. Окрашивание проводится с применением реактива Эрлиха при температуре 39±1°C в течение 15±2 минут. Оптическая плотность определяется при длине волны 586 нм и толщине слоя 10 мм против холостой пробы. Исходя из полученных данных строится калибровочный график, по которому определяется активность РСО.

Изменение рН ацетатного буферного раствора, применяемого при определении количества гиалуронидазы, с 4,0 до 5,6 обусловлено тем, что большинство лекарственных средств с гиалуронидазной активностью получают на основе тестикулярной гиалуронидазы, действие данного фермента ограничено рН 4,0-7,0, а оптимум приходится на рН 5,4-5,6. Протекание реакции хромогена с реактивом Эрлиха при более высокой температуре и с меньшим временем экспозиции снижает чувствительность к условиям протекания, повышая точность метода.

Возможна модификация метода определения гиалуронидазной активности партии препарата «Лидаза, лиофилизат», предполагаемого к использованию в качестве РСО, при которой раствор гиалуронидазы BRP выполняется в единственном разведении с активностью - 300±50 МЕ/мл. Определение оптической плотности производится не менее чем в трех повторах, при этом каждому повтору соответствует отдельная пара проб Международного стандарта и калибруемого РСО. Гиалуронидазная активность определяется как отношение оптических плотностей с учетом концентраций растворов и активности стандартного образца по формуле:

где D_e - оптическая плотность исследуемого образца;

D_st - оптическая плотность стандартного образца;

A_st - гиалуронидазная активность стандартного образца (МЕ/мг);

V_e - объем раствора опытного образца (мл);

V_st - объем раствора стандартного образца (мл);

m_e - масса навески растворенного опытного образца (мг);

m_st - масса навески растворенного стандартного образца (мг);

Ае - искомая гиалуронидазная активность исследуемого образца (МЕ/мг).

Для установления однородности партии лекарственного средства «Лидаза, лиофилизат», которую предлагается использовать в качестве РСО, необходимо определить гиалуронидазую активность не менее чем для десяти проб (флаконов) по предложенному способу. При этом допустимая вариабельность по отдельным пробам должна составлять менее 10 МЕ/мг (возможен меньший предел вариабельности).

Таким образом, предлагаются следующие критерии приемлемости партии лекарственного средства «Лидаза, лиофилизат», предполагаемого к использованию в качестве РСО:

1. Гиалуронидазная активность, установленная по Международному стандарту гиалуронидазы, и концентрация белка в лекарственном средстве «Лидаза, лиофилизат», применяемом в качестве РСО, должны быть такими, чтобы обеспечивалась возможность получения рабочего раствора с активностью не менее 300 МЕ/мл, при этом концентрация белка должна быть не выше 4 мг/мл.

2. Партия препарата «Лидаза, лиофилизат» должна быть однородной - при определении гиалуронидазной активности для десяти проб допускается вариабельность менее 10 МЕ/мг (возможно устанавливать меньший предел вариабельности).

При необходимости указания гиалуронидазной активности, как в Международных, так и в иных единицах (например, в условных), возможно рассчитать коэффициент пересчета, вычисляемого как отношение активности, выраженной в ME, к активности, выраженной в известных для образца единицах.

Поточное определение гиалуронидазной активности исследуемых партий лекарственного средства, содержащего гиалуронидазу, проводится по откалиброванному РСО в МЕ/мг с использованием формулы 1 (должно быть не менее трех параллельных повторов испытания). Для этого исследуемый и рабочий стандартный образцы растворяют в ацетатном буферном растворе с рН 3,6 таким образом, чтобы концентрация белка была не более 4 мг/мл. Полученные растворы и ацетатный буферный раствор вносятся в пробирки в соотношении 1:2, в холостую пробу - только буферный раствор. В пробирки, инкубируемые при +37±0,1°C, добавляется раствор гиалуроновой кислоты. Спустя 15 минут пробы охлаждают во льду и добавляют тетраборат калия (натрия) в количестве 0,8 М, рассчитанному по титру, поставив пробирки на кипящую водяную баню. Окрашивание проводится с применением реактива Эрлиха при температуре 39±1°C в течение 15±2 минут. Оптическая плотность определяется при длине волны 586 нм и толщине слоя 10 мм против холостой пробы. Исходя из полученных данных, строится калибровочный график, по которому определяется активность РСО. При этом оптическая плотность образцов должна попадать в интервал 0,2-0,8.

Краткое описание иллюстративных материалов

Фиг. 1. Калибровочный график, построенный по Международному стандартному образцу гиалуронидазы BRP, - на графике ромбы. На калибровочную линию нанесены оптические плотности, полученные для калибруемого препарата.

Табл. 1. Приготовление разведений стандарта гиалуронидазы.

Табл. 2. Данные по гиалуронидазной активности лекарственного средства «Лидаза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций и местного применения» серии 160716 в МЕ/мг.

Возможность осуществления изобретения подтверждают следующие примеры.

Пример 1. Проводилось определение гиалуронидазной активности для препарата «Лидаза - стандартный образец» серии №10115 производства ООО «Самсон-Мед», предполагаемого в качестве РСО по калибровочной кривой. Калибровка проводилась по Международному стандарту гиалуронидазы (Ph.Eur. Reference Standard Hyaluronidase BRP batch 2, кат № H1115000, активность 341 МЕ/мг).

Были приготовлены калибровочные растворы BRP, полученные путем параллельных разведений, представленных в таблице 2, из начального с концентрацией 2 мг/мл, и растворы калибруемого РСО с концентрациями 2,5, 2,0 и 1,7 мг/мл. Исследование проводилось в четырех повторах.

По результатам определения оптических плотностей были построены калибровочные графики. Гиалуронидазная активность калибруемого РСО на указном графике составила 290, 350 и 430 МЕ/мл для концентраций 1,7, 2,0 и 2,5 мг/мл соответственно.

Гиалуронидазная активность откалиброванного РСО составила 171,5±5,2 МЕ/мг. Вариабельность данных была менее 10 МЕ/мг. Концентрация белка, установленная по биуретовому методу, составила 850 мг в 1 г препарата.

Соответственно рабочий раствор для данного РСО при концентрации 2 мг/мл имеет активность 343 МЕ/мл и концентрацию белка - 1,7 мг/мл.

Пример 2. Было произведено определение гиалуронидазной активности путем расчета по формуле 1 трех параллельных повторов проб Международного стандарта и лекарственного средства «Лидаза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций и местного применения» серии 160716 производства ООО «Самсон-Мед», которое планировалось использовать в качестве РСО.

Определение проводилось по Международному стандарту гиалуронидазы, указанному в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 2. По биуретовому методу было установлено, что в 1 г лекарственного средства содержится 610 мг белка.

Следовательно, данная партия лекарственного средства удовлетворяет критериям приемлемости РСО; рабочий раствор имеет концентрацию 5 мг/мл, при этом активность - 302,6 МЕ/мл, содержание белка - 3,05 мг/мл.

1. Способ определения гиалуронидазной активности лекарственных средств, включающий смешивание исследуемого раствора известной концентрации с ацетатным буферным раствором в соотношении 1:2, инкубирование при температуре 37±0,1°С, добавление раствора гиалуроновой кислоты, инкубирование в течение 15 минут при температуре 37±0,1°С, охлаждение во льду, добавление рассчитанного по титру количества 0,8 М тетрабората калия, помещение на кипящую водяную баню, взаимодействие с реактивом Эрлиха, определение оптической плотности спектрофотометрическим методом при длине волны 586 нм, толщине слоя 10 мм против холостой пробы, определение гиалуронидазной активности путем сравнения со стандартным образцом, отличающийся тем, что рН ацетатного буферного раствора составляет 5,6, взаимодействие с реактивом Эрлиха осуществляют при температуре 39±1°С в течение 15±2 минут, в качестве рабочего стандартного образца используют лекарственный препарат «Лидаза» с гиалуронидазной активностью не менее 300 МЕ/мл и концентрацией белка не выше 4 мг/мл, рабочий стандартный образец предварительно калибруют по Международному стандарту гиалуронидазы, определение гиалуронидазной активности проводят в Международных единицах.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение гиалуронидазной активности проводят путем построения калибровочного графика.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что расчет гиалуронидазной активности проводят по формуле:

, где

D_e - оптическая плотность исследуемого раствора;

D_st - оптическая плотность стандартного образца;

A_st - гиалуронидазная активность стандартного образца (МЕ/мг);

V_e - объем исследуемого раствора (мл);

V_st - объем раствора стандартного образца (мл);

m_е - масса навески для приготовления исследуемого раствора (мг);

m_st - масса навески растворенного стандартного образца (мг);

A_e - гиалуронидазная активность исследуемого раствора (МЕ/мг).