Способ одновременной диагностики неклассических форм врожденной дисфункции коры надпочечников с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для одновременной диагностика неклассических форм врожденной дисфункции коры надпочечников (НФ ВДКН) с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы. Для этого используют методы: высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС). При выполнении ВЭЖХ определяют показатели в крови кортизола (F), кортизона (Е), 21-дезоксикортизола (21-deoxy-F), 11-дегидрокортикостерона (А), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC) и 11-дезоксикортизола (S). При выполнении ГХ-МС определяют показатели экскреции с мочой тетрагидрокортизона (THE), тетрагидрокортизола (THF), allo-THF, тетрагидрокортикостерона (ТНВ), allo-THB, тетрагидро-11-дегидрокортикостерона (ТНА), тетрагидро-11-дезоксикортизола (THS), гексагидро-11-дезоксикортизола (HHS), тетрагидро-11-дезоксикортикостерона (THDOC), андростерона (An), этиохоланолона (Et), 17β-гидроксиандростендиола (17βdA₂), дегидроэпиандростерона (DHEA), 11-гидроксиандростерона (11An), 11-гидроксиэтиохоланолона (11Et), 17-гидроксипрегнанолона (17Р), прегнантриола (Р3), 11охо-Р3, 3α,17,20-прегнентриола (dP3-3α), dP3-3β, 16-оксо-андростендиола (16oxo-dA2), 21-дезокситетрагидрокортизола (21deoxy-THF), 16-гидроксипрегненолона (16dP), 21-гидроксипрегненолона (21dP), 11-гидроксипрегнентриола (11dP3), 11-оксо-прегнентриола (11охо dP3). При увеличении 21-deoxy-F >3,0 нг/мл и снижении соотношения F/E<4,0 в крови, повышении экскреции с мочой 17Р>200 мкг/24 ч, DHEA>500 мкг/24 ч, 17βdA2>200 мкг/24 ч, Р3>1000 мкг/24 ч, 11охо-Р3>90 мкг/24 ч, 21deoxy-THF>100 мкг/24 ч, 16oxo-dA2>40 мкг/24 ч, снижении соотношений (THF+alloTHF+THE)/P3<2,5, (THF+alloTHF+THE)/11oxo-P3<21, (THF+alloTHF+THE)/17P<12,0 и THB/THA<1,0, увеличении соотношений allo-THB/THB>2,0, An/Et>1,5 и 11An/11Et>2,0, определении 5-ene прегненов (16dP, 21dP, 11dP3, 11-oxo-dP3 или dP3-3β), не обнаруженных у здоровых лиц, диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы. При увеличении уровней S>10,0 нг/мл и/или DOC >4,0 нг/мл и снижении соотношений F/S<3,5, F/E<4,0 и В/А<1,0 в крови, увеличении экскреции с мочой THS >200 мкг/24 ч и/или THDOC >70 мкг/24 ч, HHS>180 мкг/24 ч и DHEA>500 мкг/24 ч, уменьшении соотношения (THF+alloTHF+THE)/THS<22 диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 11β-гидроксилазы. Изобретение позволяет проводить одновременную диагностику НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы без проведения стимуляционной пробы с синтетическим аналогом кортикотропина, а также повысить точность, специфичность и чувствительность диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы. 8 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии и клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики неклассических форм врожденной дисфункции коры надпочечников (НФ ВДКН) с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы при вирильных синдромах, аденомах коры надпочечников и у больных с артериальной гипертензией неясного генеза без проведения стимуляционной пробы с синтетическим аналогом кортикотропина (СПК), «синактен-депо».

В последние годы отмечено увеличение количества больных с различными заболеваниями коры надпочечников как с опухолями, так и с неопухолевыми формами. По мнению ряда авторов, опухоли нередко выявляются у больных, страдающих ВДКН, а ферментные нарушения могут способствовать их развитию [1]. Большое значение для выбора тактики лечения больных с инциденталомами (случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников) имеет диагностика НФ ВДКН как причина образования данных опухолей. Наиболее частыми причинами вирильного синдрома являются НФ ВДКН, большинство случаев которых обусловлено недостаточностью фермента 21-гидроксилазы [2]. Одной из причин артериальной гипертензии может быть недостаточность 11β-гидроксилазы. Дефект 11β-гидроксилазы встречается в 5-8% случаях больных с ВДКН [3]. XX век открыл большие диагностические возможности в верификации редких и труднодиагностируемых заболеваний надпочечников. Но вместе с этим остается много вопросов в диагностике НФ ВДКН. Для выявления источника гиперпродукции андрогенов используют определение различных стероидов, проводят функциональные пробы на стимуляцию и подавление функции яичников и надпочечников. Однако установить локализацию источника гиперандрогении (ГА) представляет значительные трудности, так как спектр синтезируемых гормонов и ключевых ферментных систем в синтезе андрогенов в яичниках и надпочечниках весьма сходны, а периферический метаболизм гормонов вносит еще большие трудности в интерпретацию источника андрогенных стероидов [4]. Широкое применение в определении гормонов нашли иммуноферментные методы, благодаря их высокой чувствительности. Однако низкая специфичность этих методов, наличие перекрестных реакций приводит к возрастанию числа ложноположительных результатов и, таким образом, гипердиагностике [5]. Кроме этого, содержание 17-ОНП может быть в пределах нормальных значений у женщин с НФ ВДКН, а при синдроме поликистозных яичников в половине случаев выявляется повышенный уровень 17-ОНП [6, 7]. У пациенток с клиническими признаками ГА при базальном уровне 17-ОНП в пределах нормальных значений для выявления источника ГА проводится СПК, которая является «золотым стандартом» для диагностики НФ ВДКН [4]. У некоторых гетерозиготных носителей мутаций в гене 21-гидроксилазы уровни 17-ОНП могут быть такие же, как у пациентов с НФ ВДКН [8].

Пациентам с дефектом 11β-гидроксилазы характерна артериальная гипертензия и им требуется специальная терапия. Для диагностики ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы необходимо измерять уровни 11-дезоксикортикостерона или 11-дезоксикортизола в крови. Ряд диагностических критериев НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы были установлены методом ВЭЖХ в динамике проведения СПК [9, 10]. Кроме этого, данный метод дает возможность определять критерии, общие для дефектов данных ферментов адреналового стероидогенеза, но не позволяет одновременно диагностировать недостаточность 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы [11]. Кроме того, имеются ограничения в проведении СПК, которая требует госпитализации пациента, наличия в клинике препаратов глюкокортикоидов для внутривенного введения, так как синтетические аналоги кортикотропина могут спровоцировать развитие острой надпочечниковой недостаточности. Ряд исследователей придают особое значение исследованию стероидного профиля мочи (СПМ) методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС), дающим возможность идентифицировать большое число стероидов и их метаболитов [12-14]. Авторы считают, что характер СПМ является наиболее значимым для диагностики дефектов адреналового стероидогенеза и врожденные нарушения метаболизма стероидов всегда должны быть подтверждены с помощью данного анализа [15, 16].

По наиболее близкой технической сущности в качестве прототипа нами выбран способ диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, включающий иммуноферментный анализ, при выполнении которого определяют в крови в 9 ч и через 9 ч после внутримышечного введения кортикотропина показатели 17-ОНП (базальные и после СПК). При уровне 17-ОНП в крови больше 30 нмоль/л после СПК диагностируют недостаточность 21-гидроксилазы [4].

Некоторые авторы отмечают, что диагностика НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, основанная только на уровнях 17-ОНП базальных и после СПК, может привести к ложноположительным результатам. Исследователи только в 24% подтвердили наличие недостаточности 21-гидроксилазы при уровне 17-ОНП>30 нмоль/л после СПК генетическими анализами [5]. На основании результатов исследования СПМ у больных с ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы с помощью ГХ-МС ряд авторов отмечают повышение экскреции с мочой только Р3, 11-охо-Р3 и 17Р, но не приводят критерии, статистические данные по метаболитам андрогенов и их предшественников [5]. Диагностика НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы с помощью генетического исследования представляет еще большие трудности в сравнении с диагностикой НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы. Для диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы ряд исследователей проводят СПК по данным ВЭЖХ [11]. Как нами уже было указано выше, имеются некоторые ограничения в проведении СПК. Кроме того, нет данных по комплексному исследованию стероидных профилей методами ВЭЖХ и ГХ-МС для диагностики НФ ВДКН.

Чувствительность способа-прототипа для диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы рассчитана нами по формуле:

,

где ЧС - чувствительность способа;

ИП - истинноположительные результаты;

ЛО - ложноотрицательные результаты.

Точность способа-прототипа для диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, составляющая 83,0 %, рассчитана нами по формуле:

,

где ТС - точность способа;

ИП - истинноположительные результаты;

ИО - истинноотрицательные результаты;

ЛП - ложноположительные результаты.

ЛО - ложноотрицательные результаты.

Специфичность способа прототипа, составляющая 86,8%, рассчитана по формуле:

,

где СП - специфичность прототипа

ИО - истинноотрицательные результаты;

ЛП - ложноположительные результаты.

Таким образом, по собственным данным, для диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы чувствительность способа-прототипа составила 75,0%, точность - 83,0%, специфичность - 86,8%.

Способ диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, выбранный нами в качестве прототипа, обладает недостаточно высокой чувствительностью, точностью и специфичностью, и, кроме того, не позволяет проводить одновременно, то есть за один анализ, и диагностику НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы.

Представляется актуальным поиск дополнительных маркеров недостаточности 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы, которые дадут возможность проводить диагностику дефектов данных ферментов за один анализ без проведения СПК, что облегчит выбор тактики лечения данных больных.

Техническим результатом изобретения является одновременная диагностика НФ ВДКН и с недостаточностью 21-гидроксилазы, и с недостаточностью 11β-гидроксилазы, то есть за один анализ, без проведения СПК, повышение точности, специфичности и чувствительности диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, а также расширение контингента больных для диагностики НФ ВДКН за счет тех, у которых имеются ограничения в проведении СПК.

Технический результат изобретения достигается тем, что способ одновременной диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы с использованием методов хроматографии, включающий выполнение высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также газовой хроматографим с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС), при выполнении ВЭЖХ определяют показатели в крови кортизола (F), кортизона (Е), 21-дезоксикортизола (21-deoxy-F),11-дегидрокортикостерона (А), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC) и 11-дезоксикортизола (S), a при выполнении ГХ-МС определяют показатели экскреции с мочой тетрагидрокортизона (THE), тетрагидрокортизола (THF), allo-THF, тетрагидрокортикостерона (ТНВ), allo-THB, тетрагидро-11-дегидрокортикостерона (ТНА), тетрагидро-11-дезоксикортизола (THS), гексагидро-11-дезоксикортизола (HHS), тетрагидро-11-дезоксикортикостерона (THDOC), андростерона (An), этиохоланолона (Et), 17β-гидроксиандростендиола (17βdA₂), дегидроэпиандростерона (DHEA), 11-гидроксиандростерона (11An), 11-гидроксиэтиохоланолона (11Et), 17-гидроксипрегнанолона (17Р), прегнантриола (Р3), 11охо-Р3, 3α,17,20-прегнентриола (dP3-3α), dP3-3β, 16-оксо-андростендиола (16oxo-dA2), 21-дезокситетрагидрокортизола (21deoxy-THF), 16-гидроксипрегненолона (16dP), 21-гидроксипрегненолона (21dP), 11-гидроксипрегнентриола (11dP3), 11-оксо-прегнентриола (11охо dP3); при увеличении 21-deoxy-F >3,0 нг/мл и снижении соотношения F/E<4,0 в крови, повышении экскреции с мочой 17Р>200 мкг/24 ч, DHEA>500 мкг/24 ч, 17βdA2>200 мкг/24 ч, Р3>1000 мкг/24 ч, 11охо-Р3>90 мкг/24 ч, 21deoxy-THF>100 мкг/24 ч, 16oxo-dA2>40 мкг/24 ч, снижении соотношений (THF+alloTHF+THE)/P3<2,5, (THF+alloTHF+THE)/11oxo-P3<21, (THF+alloTHF+THE)/17P<12,0 и THB/THA<1,0, увеличении соотношений allo-THB/THB>2,0, An/Et>1,5 и 11 An/11 Et>2,0, определении 5-ene прегненов (16dP, 21dP, 11dP3, 11-oxo-dP3 или dP3-3β), не обнаруженных у здоровых лиц, диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы; при увеличении уровней S>10,0 нг/мл и/или DOC >4,0 нг/мл и снижении соотношений F/S<3,5, F/E<4,0 и В/А<1,0 в крови, увеличении экскреции с мочой THS >200 мкг/24 ч и/или THDOC >70 мкг/24 ч, HHS >180 мкг/24 ч и DHEA>500 мкг/24 ч, уменьшении соотношения (THF+alloTHF+THE) / THS <22 диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 11β-гидроксилазы.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы основан на сочетании методов ВЭЖХ и ГХ-МС.

ВЭЖХ: определяют в крови кортизол (F), кортизон (Е), 21-дезоксикортизол (21-deoxy-F), 11-дегидрокортикостерон (А), кортико-стерон (В), 11-дезоксикортикостерон (DOC) и 11-дезоксикортизол (S).

ГХ-МС: определяют экскрецию с мочой тетрагидрокортизона (THE), тетрагидрокортизола (THF), allo-THF, тетрагидрокортикостеро-на (ТНВ), allo-THB, тетрагидро-11-дегидрокортикостерона (ТНА), тетрагидро-11-дезоксикортизолa (THS), гексагидро-11-дезоксикортизола (HHS), тетрагидро-11-дезоксикортикостерона (THDOC), андростерона (An), этиохоланолона (Et), 17β-гидроксиандростендиола (17βdA₂), дегидроэпиандростерона (DHEA), 11-гидроксиандростерона (11An), 11-гидроксиэтиохоланолона (11Et), 17-гидроксипрегнанолона (17Р), прегнантриола (Р3), 11-охо-Р3, 3α,17,20-прегнентриола (dP3-3α), dP3-3β, 16-оксо-андростендиола (16oxo-dA2), 21-дезокситетрагидрокортизола (21deoxy-THF), 16-гидроксипрегненолона (16dP), 21-гидроксипрегненолона (21dP), 11-гидроксипрегнентриола (11dP3), 11-оксо-прегнентриола (11охо dP3).

Используемая аппаратура: жидкостный хроматограф с УФ-детектированием AGILENT-1260 - для определения кортикостероидов в крови методом ВЭЖХ, газовый хроматограф с масс-спектрометрическим детектированием Shimadzu GCMS-QP2010 ULTRA - для определения стероидного профиля мочи методом ГХ-МС.

В крови определяют кортикостероиды (F, Е, 21-deoxy-F, А, В, DOC, S) методом ВЭЖХ и исследуют СПМ методом ГХ-МС. На основании данных, полученных при количественном определении кортикостероидов методом ВЭЖХ и данных, полученных при исследовании СПМ методом ГХ-МС, у больных с вирильным синдромом, а также у пациентов с образованиями коры надпочечников:

- при увеличении 21-deoxy-F >3 нг/мл и снижении соотношения F/E <4,0 в крови, при повышении экскреции с мочой 17Р>200 мкг/24 ч, DHEA>500 мкг/24 ч, 17βdA2>200 мкг/24 ч, Р3>1000 мкг/24 ч, 11охо-Р3>90 мкг/24 ч, 21deoxy-THF>100 мкг/24 ч, 16oxo-dA2>40 мкг/24 ч, снижении соотношений (THF+alloTHF+THE)/P3<2,5, (THF+alloTHF+THE)/11oxo-P3<21, (THF+alloTHF+THE)/17P<12 и ТНВ/ТНА<1,0, увеличении соотношений allo-THB/THB>2,0, An/Et>1,5 и 11An/11Et>2,0, определении 5-еnе прегненов (16dP, 21dP, 11dP3, 11-oxo-dP3 или dP3-3(3), не обнаруженных у здоровых лиц, диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы;

- при увеличении уровней S>10 нг/мл и/или DOC >4,0 нг/мл и уменьшении соотношений F/S<3,5, F/E<4,0 и В/А<1,0 в крови, увеличении экскреции с мочой 17βdA2>200 мкг/24 ч, THS >200 мкг/24 ч и/или THDOC >70 мкг/24, HHS >180 мкг/24 ч и DHEA>500, уменьшении соотношения (THF+alloTHF+THE) / THS <22 диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 11β-гидроксилазы.

Изобретение основано на сочетании различных лабораторных технологий, базирующихся на установленной нами взаимосвязи между особенностями стероидогенеза и метаболизмом глюкокортикоидов, минералокортикоидов, андрогенов и прогестинов. Методом ГХ-МС разработаны диагностические критерии неклассических форм ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы.

ВЭЖХ дает возможность определять уровни предшественников кортизола (S, 21-deoxy-F) и альдостерона (А, В и DOC) в крови, соотношения продукт-субстрат, ГХ-МС - андрогены, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, их предшественники и метаболиты за один анализ (более 60 стероидов), а также стероиды, не обнаруженные у здоровых лиц, и соотношения продукт-субстрат, что дает возможность установить критерии нескольких дефектов ферментов адреналового стероидогенеза, а также повысить точность, чувствительность и специфичность диагностики НФ ВДКН.

Исследование СПМ методами хроматографии особое значение имеет для диагностики редких ферментативных дефектов адреналового стероидогенеза, таких как недостаточность 11β-гидроксилазы, для которой нет биохимических маркеров при использовании классических тестов.

Для определения критериев диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы обследованы 65 женщин с различными формами гиперандрогении в возрасте 27,9±0,9 лет, 115 пациентов с образованиями коры надпочечников и артериальной гипертензией в возрасте 51,5±1,9 лет и 25 здоровых людей в возрасте 29,5±1,2 лет, которые составили контрольную группу. В результате комплексного обследования больных с гиперандрогенией у 18,5% (12 чел.) диагностирована НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы (Табл. 1-3). Уровень 17-ОНП после СПК был больше 30 нмоль/л (Табл. 1). Определение уровня 17-ОНП в крови в динамике проведения пробы с кортикотропином использовалось нами для сопоставления с результатами ВЭЖХ и ГХ-МС с целью доказательства возможности применения разработанных нами критериев методами хроматографии без СПК

Снижение соотношения F/E, увеличение уровня 21-desoxy-F в крови были дополнительными признаками недостаточности 21-гидроксилазы, полученными методом ВЭЖХ (Табл. 2). Основные критерии НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы установлены методом ГХ-МС при сопоставлении результатов исследования СПМ с классическими тестами и генетическими исследованиями. Установлены диагностические значения для соотношений (THE+THF+allo-THF)/P3 < 2,5, (THE+THF+allo-THF)/11-oxo-P3 < 21) и (THE+THF+allo-THF)/17P<12 (Табл. 3). Получены важные маркеры недостаточности 21-гидроксилазы, увеличивающие чувствительность, точность и специфичность диагностики: 21-deoxy-THF, 16-oxo-dA2 и 5-еnе прегнены, не детектируемые у здоровых лиц (Табл. 3, 4). В результате комплексного анализа (методы ИФА, ВЭЖХ и ГХ-МС) у 7 пациентов СПК дала ложноположительный результат.

Методами ВЭЖХ и ГХ-МС у 7,0% больных (8 чел.) с образованиями коры надпочечников и артериальной гипертензией диагностирована НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы (Табл. 2, 3). Увеличение уровней S и DOC, снижение соотношений F/S, F/E и В/А в крови, полученные методом ВЭЖХ, указывали на недостаточность 11β-гидроксилазы (Табл. 2). Основные критерии НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы были получены при исследовании СПМ методом ГХ-МС: увеличение экскреции с мочой DHEA, 17(3dA2, Et, THDOC, THS и HHS и снижение соотношения (THE+THF+allo-THF)/THS в сравнении с группой здоровых лиц (Табл. 3).

Сравнительные данные по чувствительности, точности и специфичности заявляемого способа диагностики неклассических форм ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы (21-ОНД) и способа прототипа представлены в Табл. 5.

Чувствительность диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы по заявляемому способу составила 100%, по способу, выбранному в качестве прототипа, - 75,0%, т.е. чувствительность увеличилась на 25,0%.

Точность диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы по заявляемому способу составила 100%, по способу, выбранному в качестве прототипа, - 83,0%, т.е. точность увеличилась на 17,0%.

Специфичность диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы по заявляемому способу составила 100%, по способу, выбранному в качестве прототипа, - 86,8%, т.е. специфичность увеличилась на 13,2%.

Отличительные существенные признаки являются новыми и позволяют проводить одновременную диагностику НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и с недостаточностью 11β-гидроксилазы, то есть за один анализ, без проведения СПК, повысить точность, специфичность и чувствительность диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, а также расширить контингент больных для диагностики НФ ВДКН за счет тех, у которых имеются ограничения в проведении СПК.

Приводим клинические примеры.

Пример 1. Больная Б., 27 лет, ИМТ=19,5 кг/м².

Диагноз основной: Аденома коры надпочечников (1 см), вирильный синдром (акне, гиперандрогения), НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы.

Диагноз НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы поставлен на основании уровня 17-ОНП 73,8 нмоль/л (больше 30 нмоль/л) после СПК (Табл. 6). Определение уровня 17-ОНП в крови в динамике проведения пробы с кортикотропином было необходимо с целью доказательства возможности применения разработанных нами критериев методами хроматографии без СПК. По данным ВЭЖХ и ГХ-МС были установлены все критерии, подтверждающие НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы (Табл. 7, 8).

НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы была исключена по данным ГХ-МС. Диагноз был подтвержден данными генетического анализа, по которому были выявлены мутации гена CYP21A2 (30kbdel/V28IL).

Пример 2. Больная К., 28 лет, ИМТ=27 кг/м².

Диагноз основной: Синдром гиперандрогении (повышенный рост волос на лице и линии живота, нарушение менструального цикла). СПК была отрицательной, т.к. 17-ОНП был увеличен до 24,6 нмоль/л (меньше 30 нмоль/л) (Табл. 6). НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы была исключена по данным ГХ-МС. По данным ВЭЖХ установлено увеличение 21-deoxy-F до 3,2 нг/мл (Табл. 7). Убедительные данные за НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы получены при исследовании СПМ методом ГХ-МС (Табл. 8).

Пример 3. Больная Ф., 25 лет, ИМТ=27 кг/м².

Диагноз: Синдром гиперандрогении (повышенный рост волос на лице и линии живота, нарушение менструального цикла) СПК положительная, т.к. 17-ОНП был увеличен до 51,9 нмоль/л (больше 30 нмоль/л) (Табл. 6). По данным ВЭЖХ и ГХ-МС не установлены признаки НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы (Табл.7 и 8). НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы была исключена по данным ГХ-МС. По данным генетического анализа не были выявлены мутации гена CYP21. На основании комплексного исследования СПК была признана ложноположительной в отношении диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы.

Пример 4. Больной П., 23 года, ИМТ=26 кг/м².

Диагноз: Гиперплазия левого надпочечника, ВДКН, недостаточность 11β-гидроксилазы, артериальная гипертензия 3 ст., риск ССО-4. По данным классических тестов был исключен дефект 21-гидроксилазы (Табл. 6). По данным ВЭЖХ установлено увеличение уровней S и DOC в крови, снижение соотношений F/S, F/E и В/А. Полученные данные указывали на НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы (Табл. 7). Увеличение экскреции с мочой THS и HHS и снижение соотношения (THE+THF+allo-THF)/THS до 7,7 (меньше 22), полученные по данным ГХ-МС, в сочетании с данными ВЭЖХ свидетельствовали о НФ ВДКН с недостаточностью 11β- гидроксилазы (Табл. 7, 8).

Пример 5. Больной М., 45 лет, ИМТ=30, ИМТ=26 кг/м².

Диагноз: Гиперплазия правого надпочечника, ВДКН, недостаточность 11β-гидроксилазы и 21-гидроксилазы, артериальная гипертензия 3 ст. НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы диагностирована на основании увеличения экскреции с мочой 11-охо-Р3=461 мкг/24 ч, 17Р=300 мкг/24 ч, Р3=2394 мкг/24 ч, 21-deoxy-THF=525 мкг/24 ч, снижения соотношений (THE+THF+allo-THF)/P3=2,3, (THE+THF+allo-THF)/11-oxo-P3=20 и (THE+THF+allo-THF)/17P=11,5 по данным ГХ-МС. НФ ВДКН с недостаточностью 11β-гидроксилазы диагностирована на основании увеличения S=10 нг/мл, снижения соотношений F/S=2,5, F/E=3,4 и В/А=0,9 в крови по данным ВЭЖХ, увеличения THS=723 мкг/24 ч и HHS=300 мкг/24 ч, снижения соотношения (THE+THF+allo-THF)/THS до 14,8 (меньше 22) по данным ГХ-МС.

Приведенные клинические примеры убедительно демонстрируют эффективность одновременной диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и с недостаточностью 11β-гидроксилазы с помощью использования высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием, причем показана возможность проведения диагностики дефектов данных ферментов за один анализ без проведения СПК.

Таким образом, заявляемый способ позволяет одновременно, то есть за один анализ, диагностировать неклассические формы врожденной дисфункции коры надпочечников с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы без проведения стимуляционной пробы с синтетическим аналогом кортикотропина (СПК), а также повысить точность, специфичность и чувствительность диагностики НФ ВДКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и расширить контингент больных, за счет тех, у которых имеются ограничения в проведении СПК.

Примечание: ** - р<0,01 - уровень статистической значимости различий по сравнению с группой здоровых лиц.

Примечания: * - р<0,05; ** - р <0,01 - уровень статистической значимости различий в сравнении с группой здоровых лиц.

Примечания: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 - уровень статистической значимости различий по сравнению с группой здоровых лиц.

Список литературы

1. Reincke М. Impairment of 11 beta-hydroxylase but not 21-hydroxylase in adrenal "incidentalomas". / Reincke M., Peter M., Sippell W.G., Allolio B. // European Journal of Endocrinology. - 1997. - Vol. 136. - №2. - P. 196-200.

2. Falhammar H. Nonclassic congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: clinical presentation, diagnosis, treatment, and outcome / Falhammar H., Nordenstrom A. // Endocrine. - 2015. - Vol. 50. - №1. - P. 32-50.

3. White P.C. Disorders of steroid 11 beta-hydroxylase isozymes. / White P.C., Curnow K.M., Pascoe L. // Endocrine reviews. - 1994. - Vol. 15. - №4. - P. 421-38.

4. Мельниченко Г.А., Трошина E.A., Молашенко H.B., Сазонова А.И., Ужегова Ж.А. Клинические рекомендации Российской ассоциации эндокринологов по диагностике и лечебно-профилактическим мероприятиям при врожденной дисфункции коры надпочечников у пациентов во взрослом возрасте / Мельниченко Г.А., Трошина Е.А., Молашенко Н.В., Сазонова А.И., Ужегова Ж.А. // Consilium Medicum. - 2016. - Т. 18. - №4. - С. 8-19.

5. Ambroziak U. The diagnosis of nonclassic congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency, based on serum basal or post-ACTH stimulation 17-hydroxyprogesterone, can lead to false-positive diagnosis / Ambroziak U., A., A., E.M., A., P., Macech M. // Clinical Endocrinology. - 2016. - Vol. 84. - №1. - P. 23-29.

6. Киракосян К.Э., Краснопольская К.В., Назаренко Т.А. Распространенность неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников среди женщин армянской национальности, обращающихся по поводу бесплодия / Киракосян К.Э., Краснопольская К.В., Назаренко Т.А. // Российский вестник акушера-гинеколога - 2012. - Т. 12. - №5. - С. 17-20.

7. Witchel S.F. Nonclassic congenital adrenal hyperplasia. / Witchel S.F., Azziz R. // International Journal of Pediatric Endocrinology. - 2010. - Vol. 2010. - P. 1-10.

8. Falhammar H. Biochemical and genetic diagnosis of 21-hydroxylase deficiency / Falhammar H., Wedell A., A. // Endocrine. - 2015. - Vol.50. - №2. - P. 306-314.

9. Великанова Л.И. Диагностическое значение высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов при заболеваниях гипофизарно-надпочечниковой системы / Великанова Л.И., Сильницкий П.А., Ворохобина Н.В., Шафигуллина З.Р., Бессонова Е.А. // Проблемы эндокринологии. - 2005. - Т. 51. - №6. - С. 9-12.

10. Великанова Л.И. Особенности диагностики гормональной недостаточности у больных с опухолями коры надпочечников // Вестник хирургии. - 2005. - №3. - С. 50-53.

11. Серебрякова И.П. Особенности адреналового стероидогенеза у больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы / Серебрякова И.П., Великанова Л.И., Ворохобина Н.В., Сильницкий П.А., Е.Г. Стрельникова // Проблемы эндокринологии. - 2005. - №4. - С. 22-27.

12. Tiu S.C. Use of urinary steroid profiling for diagnosing and monitoring adrenocortical tumours. / Tiu S.C, Chan A.O.K., Taylor N.F., Lee C.Y., Loung P.Y., Choi C.H., Shek C.C. // Hong Kong medical journal = Xianggang yi xue za zhi. - 2009. - Vol. 15. - № 6. - P. 463-70.

13. Krone N. Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) remains a pre-eminent discovery tool in clinical steroid investigations even in the era of fast liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) / Krone N., Hughes B.A., Lavery G.G., Stewart P.M., Arlt W., Shackleton C.H.L. // The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. - 2010. - Vol. 121. - №3-5. - P. 496-504.

14. McDonald J.G. Steroid Profiling by Gas Chromatography-Mass Spectrometry and High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for Adrenal Diseases / McDonald J.G., Matthew S., Auchus R.J. // Hormones and Cancer. - 2011. - Vol. 2. - №6. - P. 324-332.

15. Christakoudi S. Steroids excreted in urine by neonates with 21-hydroxylase deficiency. 4. Characterization, using GC-MS and GC-MS/MS, of 11oxo-pregnanes and 11oxo-pregnenes / Christakoudi S., Cowan D.A., Taylor N.F. // Steroids. - 2013. - Vol. 78. - №5. - P. 468-475.

16. Великанова Л.И., Ворохобина Н.В., Татаринова М.В. Исследование стероидного профиля мочи методом газовой хромато-масс-спектрометрии у больных с гиперандрогенией / Великанова Л.И., Ворохобина Н.В., Татаринова М.В. // Лечаший врач. - 2015. - №3. - С. 34-37.

Способ одновременной диагностики неклассических форм врожденной дисфункции коры надпочечников (НФ ВДКН) с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11β-гидроксилазы, включающий выполнение высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС), при выполнении ВЭЖХ определяют показатели в крови кортизола (F), кортизона (Е), 21-дезоксикортизола (21-deoxy-F), 11-дегидрокортикостерона (А), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (DOC) и 11-дезоксикортизола (S), а при выполнении ГХ-МС определяют показатели экскреции с мочой тетрагидрокортизона (THE), тетрагидрокортизола (THF), allo-THF, тетрагидрокортикостерона (ТНВ), allo-THB, тетрагидро-11-дегидрокортикостерона (ТНА), тетрагидро-11-дезоксикортизола (THS), гексагидро-11-дезоксикортизола (HHS), тетрагидро-11-дезоксикортикостерона (THDOC), андростерона (An), этиохоланолона (Et), 17β-гидроксиандростендиола (17βdA₂), дегидроэпиандростерона (DHEA), 11-гидроксиандростерона (11An), 11-гидроксиэтиохоланолона (11Et), 17-гидроксипрегнанолона (17Р), прегнантриола (Р3), 11охо-Р3, 3α,17,20-прегнентриола (dP3-3α), dP3-3β, 16-оксо-андростендиола (16oxo-dA2), 21-дезокситетрагидрокортизола (21deoxy-THF), 16-гидроксипрегненолона (16dP), 21-гидроксипрегненолона (21dP), 11-гидроксипрегнентриола (11dP3), 11-оксо-прегнентриола (11охо dP3); при увеличении 21-deoxy-F >3,0 нг/мл и снижении соотношения F/E<4,0 в крови, повышении экскреции с мочой 17Р>200 мкг/24 ч, DHEA>500 мкг/24 ч, 17βdA2>200 мкг/24 ч, Р3>1000 мкг/24 ч, 11охо-Р3>90 мкг/24 ч, 21deoxy-THF>100 мкг/24 ч, 16oxo-dA2>40 мкг/24 ч, снижении соотношений (THF+alloTHF+THE)/P3<2,5, (THF+alloTHF+THE)/11oxo-P3<21, (THF+alloTHF+THE)/17P<12,0 и THB/THA<1,0, увеличении соотношений allo-THB/THB>2,0, An/Et>1,5 и 11An/11Et>2,0, определении 5-ene прегненов (16dP, 21dP, 11dP3, 11-oxo-dP3 или dP3-3β), не обнаруженных у здоровых лиц, диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы; при увеличении уровней S>10,0 нг/мл и/или DOC >4,0 нг/мл и снижении соотношений F/S<3,5, F/E<4,0 и В/А<1,0 в крови, увеличении экскреции с мочой THS >200 мкг/24 ч и/или THDOC >70 мкг/24 ч, HHS>180 мкг/24 ч и DHEA>500 мкг/24 ч, уменьшении соотношения (THF+alloTHF+THE)/THS<22 диагностируют неклассическую форму ВДКН вследствие дефекта 11β-гидроксилазы.