Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы в16 у мышей

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано при воспроизведении агрессивного атипичного роста меланомы B₁₆ у мышей. Способ включает модификацию хронической болью злокачественного роста меланомы. Для этого предварительно, за 2 недели до перевивки опухоли, создают модель хронической боли путем перевязки седалищных нервов с двух сторон. В последующем проводят подкожную имплантацию суспензии опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл в разведении 1:10. Оценку результатов эксперимента осуществляют через 1-4 недели после перевивки опухоли. Способ обеспечивает изменение патогенеза меланомы В₁₆ у мышей, что приводит к раннему выходу подкожных опухолей, раннему метастазированию, метастазированию в нетипичные места и к ранней гибели животных. Такая экономичная и доступная модель может быть использована для поиска путей медикаментозного лечения злокачественных опухолей с обширным метастазированием. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для модификации злокачественного процесса мышиной меланомы В₁₆ путем создания более агрессивной модели опухолевого роста и метастазирования меланомы в эксперименте.

Хроническая боль является распространенным состоянием, которое оказывает существенное влияние на работоспособность, функциональную активность и качество повседневной жизни и одновременно поводом для огромных расходов на здравоохранение. Она связана с ограничением трудоспособности, снижением качества жизни, финансовой несостоятельностью, семейными проблемами. Столь высокая распространенность острых и хронических болевых синдромов, их тяжелое гуманитарное, социальное и экономическое бремя заставило значительно активизировать за рубежом фундаментальные и клинические исследования, оптимизировать организацию медицинской помощи (созданы специализированные центры и клиники боли), вынести рассмотрение проблемы на правительственный уровень. В результате в медицине сформировалось новое направление - медицина боли. Наряду с этим в нашей стране наблюдается значительное отставание как в активности научных исследований, так и в медицинской помощи больным с различными болевыми синдромами. Несмотря на значительный прогресс в понимании нейрофизиологии и психологии боли, фундаментальные и клинические аспекты проблемы хронической боли остаются во многом нерешенными (см. Яхно Н.Н., Кукушкин М.Л. Хроническая боль: медико-биологические и социально-экономические аспекты. Вестник РАМН. 2012; 9: 54-58).

Так, установлено, что боль вызывает анурию, влияет на работу сердечно-сосудистой системы, ЖКТ, селезенку, железы внутренней секреции и т.д. Длительная хроническая боль перестраивает деятельность всех отделов спинного и головного мозга, ухудшается зрение, притупляется слух и обоняние. Течение биохимических процессов в организме изменяется, одни ферменты усиливают свою активность, другие ослабляют ее. Даже способность лейкоцитов крови захватывать бактерии (фагоцитоз) резко снижается. А это говорит о том, что при боли страдают иммунные свойства организма, т.е. способность его бороться с инфекцией. Согласно исследованиям С.М. Дионесова боль снижает сопротивляемость организма к развитию злокачественных опухолей [Кассиль Т.Н. Наука о боли. (см. Академия Наук СССР. Серия «Проблемы науки и технического прогресса»). 2-е дополненное издание. М.: Наука. 1975. 400 с.).

Боль является одним из самых распространенных симптомов у онкологических больных, с прогрессированием заболевания - ее частота увеличивается. Тип боли и ее интенсивность зависят от местоположения опухоли и стадии болезни. Боль присутствует у 30-50% больных при проведении противоопухолевой терапии и у 65-90% пациентов с прогрессированием онкопроцесса, 33% пациентов страдают от боли после окончания противоракового лечения (см. Foley KM., Van den Beuken-van Everdingen MH и др., 2007, Leppert W и др., 2016). Причины боли у онкологических больных, как правило - многофакторные: прямые и косвенные эффекты рака, побочное действие противоопухолевой терапии, сопутствующие заболевания, а патофизиологические механизмы сочетанные, включая как ноцицептивный (соматический и/или висцеральный), так и нейропатический (неврологический) компоненты (см. Leppert W. и др., 2016).

Эксперимент позволяет дать ответы на многие вопросы, в том числе и в отношении хронической боли при онкологической патологии. Так, путем инокуляции клеток саркомы Meth А в непосредственной близости от седалищного нерва у BALB / с мышей был создан болевой синдром нейропатического генеза: опухоль растет и постепенно сдавливает нерв, тем самым вызывая его повреждение. В данном эксперименте были выявлены термическоая гипералгезия и механическая аллодиния в ипсилатеральной задней лапке на начальном этапе. Дальнейший рост опухоли вызвал понижение механической чувствительности, в то время как тепловая гипералгезия и признаки спонтанной боли по-прежнему сохранялись (см. Shimoyama М., Tanaka К., Hasue F., Shimoyama N. A mouse model of neuropathic cancer pain. Pain. 2002 Sep; 99(1-2): 167-74). У мышей с опухолями костей конечностей было выявлено несколько вариантов изменения периферической чувствительности ноцицепторов. У нормальной мыши нейромедиаторы высвобождались в спинном мозге только в ответ на сильное болевое раздражение. У мыши с костным раком в ответ на обычную безболезненную пальпацию зоны, пораженной опухолью, происходило высвобождение вещества Р в центростремительных волокнах, с последующей активизацией рецепторов нейрокининовой системы особой субпопуляции нейронов спинного мозга, что сопровождалось повышением болевых ощущений (Hunt & Mantyh, 2001; Mantyh et al, 1995a, 1995b).

Аналогичным образом, обычно безболезненная пальпация у мышей с опухолевым поражением конечностей вызывало также появление c-fos протеина в нейронах спинного мозга. У нормальных животных, не имеющих рака, только сильные болевые стимуляторы способны были вызывать появление c-fos протеина в спинном мозге. Таким образом, ноцицепторы под воздействием особых опухолевых алгогенов вовлекаются в процесс генерирования и поддержания костной раковой боли.

Однако ответа на вопрос: участвует ли хроническая боль, в свою очередь, в прогрессировании экспериментальных опухолей и если - да, то каким образом, мы не нашли. Идеальной опухолевой моделью для решения этой задачи является меланома В₁₆, спонтанно возникшая у основания уха мыши линии C57BL/6. Опухоль перевивается в 100% случаев, достаточно быстро растет и при стандартной подкожной перевивке (на 12-16 сутки роста, 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса или среде 199 (1:10)) метастазирует преимущественно гематогенно в легкие (60-90%), реже - в печень и селезенку (см. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - 296 с.; Dingemane К.Р. et al. В-16 Melanoma Metastasis in Mouse Liver and Lung I Urn. Metast. - 1985. - №5. - P. 50-60).

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа модификации злокачественного роста меланомы В₁₆ хронической болью у мышей.

Технический результат достигается тем, что предварительно, за 2 недели до перевивки опухоли, создают модель хронической боли путем перевязки седалищных нервов с двух сторон, с последующей подкожной имплантацией суспензии опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл и в разведении 1:10 и оценкой результатов эксперимента через 1-4 недели после перевивки опухоли.

Изобретение «Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы B₁₆ у мышей» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о модификации роста меланомы В₁₆ у мышей.

Новизна изобретения заключается в предваряющем подкожную перевивку меланомы B₁₆ воссоздании модели хронической боли у мышей, что способствует более ранней гибели животных и развитию патогенеза меланомы B₁₆ по иному «сценарию», чем при стандартном способе перевивки.

Изобретение «Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В₁₆ у мышей» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели злокачественного процесса (меланомы В₁₆) у мышей, протекающего на фоне хронического болевого синдрома, с целью изучения особенностей патогенеза этого процесса и дальнейшей разработки методов его экспериментальной коррекции.

Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В₁₆ у мышей выполняется следующим образом.

Все манипуляции с животными производятся в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицируют общепринятым способом. Каждому животному вводят ксилазолетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вводят ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем - Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела.

После наступления медикаментозного сна ассистент фиксирует мышь в положении на животе, удаляет шерсть сзади в районе проекции седалищных нервов и смазывает кожу 70% спиртом. Экспериментатор в стерильных условиях выделяет седалищный нерв, накладывает на него лигатуру, ушивает рану послойно и обрабатывает шов 5% спиртовым раствором йода. Через 2 недели после заживления операционной раны подкожно вводят 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в разведении 1:10. Для этого, соблюдая все условия асептики, описанные выше, ассистент фиксирует мышь спиной кверху, предварительно сбрив шерсть и обработав кожу 5% спиртовым раствором йода чуть ниже правой лопатки. Экспериментатор рукой в стерильной перчатке захватывает кожную складку, в центре которой прокалывает кожу и вводит опухолевую взвесь. Затем извлекает иглу, место введения плотно прижимает ватным тампоном, смоченным в 70% спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание вводимой взвеси. Контролем служили животные с перевивкой меланомы B₁₆ в той же дозе и объеме, что и в основной группе, но без воспроизведения модели хронической боли.

Через 15 дней мыши основной группы (14 штук) начали дохнуть. Средняя продолжительность их жизни составила 19,17±1,35 дней, максимальная - 24 дня. В контрольной группе (11 мышей) - первая смерть наступила на 24 сутки, средняя продолжительность их жизни составила 30,25±1,67 дня, максимальная - 36 дней.

Как видно из представленной таблицы подкожные опухоли появлялись у мышей основной группы уже через 1 неделю после перевивки, у группы сравнения - через 2 недели. Средний объем подкожных опухолей у мышей со временем увеличивался. Однако у группы сравнения подкожная опухоль росла более активно. Так ее средний размер со 2 по 3 неделю увеличился в 3,2 раза, а с 3 по 4 - в 1,7 раза, в то время как у мышей основной группы средний размер опухоли с 1 по 2 неделю увеличился в 2,3 раза, а со 2 по 3 неделю - в 1,5 раза. В результате, у мышей основной группы, средний размер опухоли на 2 неделе эксперимента был в 1,9 раза больше, чем у группы сравнения в это же время, а на 3 неделе - достоверно не отличался от нее. Минимальный размер впервые зафиксированных подкожных опухолей у мышей основной группы (на 1 неделе) был в 2 раза больше, чем у группы сравнения (на 2 неделе), в то время как максимальный размер опухоли на 3 неделе эксперимента у мышей из группы сравнения (без боли) был в 2,5 раза больше, чем у мышей с болью. При этом у большинства мышей с болью 3 неделя - предтерминальный период, а у мышей из группы сравнения - нет.

Несмотря на то, что у мышей с болью объем опухоли нарастал менее активно, у значительного количества мышей на разных этапах исследования, начиная уже с 1 недели, отмечался ее 2-х фокусный рост. Кроме того, поверхностный некроз опухоли появлялся на неделю раньше и у большего количества животных, чем в группе сравнения.

У мышей из основной группы меланома В₁₆ вела себя более агрессивно, поскольку метастазировала чаще, иногда в несколько органов и имела нетипичные для себя зоны метастазирования. Метастазы у мышей с болью регистрировались уже через неделю после перевивки, а у мышей без боли - через 4 недели. У мышей с болью опухоль метастазировала кроме типичных мест: в печень, селезенку и легкие, еще и в нетипичные: сердце, матку.

У мышей из основной группы мыши в предтерминальном состоянии регистрировались уже на 1 неделе после перевивки, с развитием процесса их относительное количество увеличивалось. У группы сравнения - с 3 недели.

Технико-экономическая эффективность «Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В₁₆ у мышей» заключается в том, что боль изменяет патогенез меланомы B₁₆ у мышей, приводящей к раннему выходу подкожных опухолей, раннему метастазированию, метастазированию в нетипичные места и приводящей к ранней гибели животных. Разработанный способ может служить моделью для поиска путей медикаментозного лечения злокачественных опухолей с обширным метастазированием. Способ экономичен, доступен.

Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В₁₆ у мышей, включающий предварительное, за 2 недели до перевивки опухоли, создание модели хронической боли путем перевязки седалищных нервов с двух сторон, с последующей подкожной имплантацией суспензии опухолевых клеток мышиной меланомы В₁₆ в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл и в разведении 1:10 и оценкой результатов эксперимента через 1-4 недели после перевивки опухоли.