Штамм schizosaccharomyces pombe - продуцент молочной кислоты

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, являющийся продуцент молочной кислоты. Штамм получен путем последовательного трехкратного введения гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы дрожжей S. pombe, в которой инактивирован ген алкогольдегидрогеназы, путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора. Штамм депонирован в ВКПМ под номером Y-4224. Использование штамма позволяет получить молочную кислоту в количестве 100 г/л культуральной жидкости. 2 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe - продуцента молочной кислоты.

Молочная кислота (МК) широко используется в пищевой промышленности для консервирования и ароматизации и в производстве биодеградируемой пластмассы - полилактата. Другая сфера использования молочной кислоты - получение биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Предполагается, что нетоксичные эфиры молочной кислоты потенциально могут заменить более 80% растворителей, используемых в мире в настоящее время. В связи с этим актуальной становится задача разработки эффективных способов производства молочной кислоты.

Традиционно для получения МК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов молочнокислых бактерий. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов молочной кислоты является их чувствительность к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты, что приводит к замедлению роста культуры, снижению скорости синтеза молочной кислоты и, как следствие, преждевременному завершению процесса ферментации.

В связи с этим особый интерес для создания продуцентов молочной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям рН и высоким концентрациям молочной кислоты.

Перспективным объектом для производства молочной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности [Бабьева И.П, Чернов И.Ю Биология дрожжей, Товарищество научных изданий КМК, М. 2004] и, в отличие от бактерий, не требуют для своего роста сложных по составу сред.

В норме дрожжи не продуцируют значимых количеств молочной кислоты, однако экспрессия гена лактатдегидрогеназы (ldh) в дрожжевых клетках позволяет получить штаммы, продуцирующие молочную кислоту в количествах, сравнимых с производственным уровнем [Biotechnol Genet Eng Rev. - 2010. - V. 27. - №1. - P. 229-256.]. При этом в качестве реципиента используют такие дрожжи, как Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Pichia sp., Schizosaccharomyces sp. и Hansenula sp., а в качестве источника гена лактатдегидрогеназы - молочнокислые бактерии (Lactobacillus), грибы (Rhizopus oryzae) и ткани млекопитающих (ген ldh из клеток мышечной ткани быка, человека)

Так дрожжи Pichia stipitis, несущие ген лактатдегидрогеназы из Lactobacillus helveticus, способны продуцировать молочную кислоту в количестве 41 г/л [Appl Environ Microbiol. - 2007. - V. 73. - P. 117-123].

Продукция штамма Saccharomyces cerevisiae JnvSc1, содержащего ген лактатдегидрогеназы из гриба Rhizopus oryzae (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2003; 30; 22-27), составляет 35-40 г/л молочной кислоты, а его отличительной способностью является неизменная скорость образования молочной кислоты в интервале рН 3,5-6,0.

Известен [Enzyme Microbial Technology. - 2003. - V. 33. - №1. - P. 38-46] штамм Saccharomyces cerevisiae, несущий ген лактатдегидрогеназы из бактерий Lactobacillus plantarum, который продуцирует 58 г/л молочной кислоты при рН 3,6.

Основным недостатком дрожжей Saccharomyces cerevisiae является то, что процесс синтеза молочной кислоты ингибируется ее высокими концентрациями, что отрицательно влияет на эффективность процесса получения молочной кислоты.

В соответствии с [Патент RU 2268304, С12Р 7/56, 2004] высокой устойчивостью к низким значениям рН среды и высоким концентрациям молочной кислоты обладают дрожжи Schizosaccharomyces pombe. Данные дрожжи хорошо генетически изучены, не требуют для своего роста сложных органических сред, удобны для промышленной ферментации и являются перспективным объектом для создания продуцентов молочной кислоты.

Так дрожжи Schizosaccharomyces pombe, содержащие ген лактатдегидрогеназы из грибов Rhizopus oryzae [Патент RU 2268304, С12Р 7/56, 2004], продуцируют 58 г/л молочной кислоты. Однако данный штамм не подходит для промышленного применения, т.к. культивирование осуществляется в две стадии и требует тщательной отмывки клеток, что неосуществимо в промышленных масштабах. Кроме того, время культивирования для достижения указанного количества молочной кислоты очень велико и составляет 8 суток.

В работе [Patent US 20120214214, C12N 1/19, 2012] показано, что Schizosaccharomyces pombe АТСС №2476, несущий ген лактатдегидрогеназы млекопитающих (Homo sapiens), продуцирует молочную кислоту в количестве 88 г/л. Однако для успешного культивирования ферментационная среда должна содержать экзотическую добавку - протеолипиды (белково-липидные соединения, экстрагируемые органическими растворителями из ткани мозга).

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 - продуцента молочной кислоты.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 получен путем последовательного трехкратного введения гена ldh лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum [GenBank: ACJ15334.1] в состав хромосомы дрожжей S. pombe, в которой инактивирован ген adh1 алкогольдегидрогеназы путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора.

В результате получают трансформанты дрожжей S. pombe, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрировано несколько копий гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum. Отбирают трансформант, способный продуцировать молочную кислоту в количестве 69 г/л, а этанол - 13 г/л за 48 ч культивирования.

Трансформант депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km- - продуцент молочной кислоты, регистрационный номер ВКПМ Y-4224.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки

Для описания культурально-морфологических признаков использовали среды "Malt extract", "Malt agar" и картофельно-кукурузный агар [Amsterdam, Elsevier Sci. Publ. B.V., 1984, р. 421].

После трех дней культивирования на среде "Malt extract" культура образует клетки округлые, элипсоидальные и цилиндрические (3,0-5,0)×(5,0-15,0-24,0) мкм. Осадок формируется.

На среде "Malt agar" на 5 сутки образует некрупные колонии белого или слегка кремоватого оттенка. Поверхность колоний гладкая, край ровный. Вегетативное размножение - деление клетки пополам.

Физиолого-биохимические признаки

Культура способна сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу. Не способна к брожению галактозы, лактозы и мелибиозы. Ассимилирует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу, раффинозу. Не ассимилирует галактозу, целлобиозу, трегалозу, лактозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, эритрит, рибитол, маннит, крахмал, янтарную, лимонную кислоты, инозит культура не ассимилирует нитраты, не способна расти на среде без витаминов.

Оптимальные условия для размножения штамма

Температура 30°С, рН 6, полная дрожжевая среда YPD [Захаров А. и др. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. - Л., Наука, 1984, стр. 144].

Штамм хранится в лиофилизированном виде или в парах жидкого азота.

Полученный штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 сохраняет способность к образованию молочной кислоты после 18 последовательных пересевов на полноценной среде.

Заявляемый штамм при выращивании в пробирках способен продуцировать молочную кислоту в количестве 69 г/л культуральной жидкости, продукция побочного продукта этанола составляет 13 г/л за 48 ч культивирования.

Пример 1. Получение штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224

1.1. Инактивация гена adh1 алкогольдегидрогеназы в дрожжах S. pombe путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора

Инактивацию гена adh1 алкогольдегидрогеназы в дрожжах S. pombe путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора осуществляют путем трансформации плазмиды padh1-nmt1-Cre в штамм S. pombe ВКПМ Y-3106. Плазмиду padh1-nmt1-Cre получают методом клонирования [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] в полилинкер коммерческого вектора pUC19 следующих генетических элементов:

- дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора;

- ген Cre-рекомбиназы фага Р1 под контролем nmt1 промотора;

- область для интеграции - фрагменты нуклеотидной последовательности гена алкогольдегидрогеназы adh1 дрожжей S. Pombe;

- селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину;

- бактериальный pUC origin.

Дрожжи S. pombe трансформируют плазмидной ДНК padh1-nmt1-Cre, линеаризованной эндонуклеазами рестрикции Sac1, Kpn1, методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YES (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 130 мкг/мл.

Отбирают трансформант с отключенным геном adh1 по стандартной методике [http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/disruptions.html].

Выщепление маркерного гена kanMX по loxP-сайтам из хромосомы трансформанта S. pombe осуществляют за счет индукции синтеза Cre-рекомбиназы методом [Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (3), 545-550, 2004].

1.2. Последовательное трехкратное введение гена ldh лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы трансформанта S. pombe

Последовательное трехкратное введение гена ldh лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы трансформанта S. pombe осуществляют путем трансформации плазмиды pCMV-pla-Tf1. Плазмиду pCMV-pla-Tf1 получают методом клонирования [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] в полилинкер коммерческого вектора pUC19 следующих генетических элементов:

- дрожжевой селективный маркер kanMX, фланкированный сайтами lox 66 и lox 71, под контролем дрожжевого TEF промотора;

- фрагмент ДНК (ген ldh Lactobacillus plantarum) под контролем CMV промотора;

- область для интеграции - нуклеотидная последовательность ретротранспозона Тf1;

- селективный маркер для клеток E. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину;

- бактериальный pUC origin.

Клетки трансформанта S. pombe трансформируют плазмидной ДНК pCMV-pla-Tf1, линеаризованной эндонуклеазами рестрикции BamH1, Nae1, методом электропорации (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/tfmn.html).

Селекцию трансформантов осуществляют, как описано в п. 1.1.

Продукцию молочной кислоты трансформантами первоначально оценивают в чашечном тесте с добавлением мела по зонам гидролиза. В тесте используют агаризованную среду LA (мас. %: дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) и мела (0,5 мас. %). В качестве контроля используют штамм Schizosaccharomyces pombe Y-3106.

Наиболее продуктивные трансформанты, показавшие наибольшее соотношение диаметра зоны гидролиза к диаметру колонии на чашках с мелом, отбирают и используют для выщепления маркерного гена kanMX по способу [Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (3), 545-550, 2004].

Трансформанты, потерявшие маркерный ген, культивируют в жидкой питательной среде для определения продукции молочной кислоты.

Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас.%) при 30°С в течение 24 ч на качалке с 250 об/мин. Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10 об.

Ферментацию проводят при 30°С на качалке с 150 об/мин в питательной среде состава (мас.%): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное, с добавлением глюкозы (18 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Ферментацию продолжают в течение 48 часов.

Концентрацию молочной кислоты определяют согласно методу ВЭЖХ [Acta Biotechnol. 1990. v. 10 (5) p. 459-468]. Концентрацию этанола определяют согласно методу ГХ [Chromatogr. Sci. 2009. v. 47 (4). p. 272-278].

По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант.

Введение фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность гена ldh Lactobacillus plantarum, в состав хромосомы дрожжей S. pombe проводят последовательно еще дважды способом, описанным выше. Однако для трансформации на каждом этапе используют клетки наиболее продуктивного трансформанта, отобранного в конце каждого этапа.

В результате получают трансформанты, в которых инактивирован ген алкогольдегидрогеназы adh1, а в хромосому интегрировано несколько копий гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum. Отбирают трансформант, способный продуцировать молочную кислоту в количестве 69 г/л, а этанол - 13 г/л за 48 ч культивирования. Трансформант депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Schizosaccharomyces pombe A4Km- - продуцент молочной кислоты, регистрационный номер ВКПМ Y-4224.

Пример 2. Культивирование штамма Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-2424

Посевную культуру выращивают при 30°С в течение 2 суток на чашках Петри на агаризованной среде YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %).

Для получения инокулята пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YPD с добавлением глюкозы (2 мас. %) засевают посевной культурой. Пробирки инкубируют на качалке (250 об/мин) при 30°С в течение 24 ч.

Колбу объемом 750 мл, содержащую 95 мл жидкой среды состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (18 мас. %), засевают 5 мл инокулята.

Культивирование осуществляют на качалке со скоростью 250 об/мин при температуре 30°С в течение 96 часов. Пробы отбирают каждые 12 часов стерильно по 1 мл для определения концентрации биомассы и молочной кислоты в культуральной жидкости, а также контроля стерильности. Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 секретирует молочную кислоту в количестве 100 г/л культуральной жидкости культивирования, продукция побочного продукта этанола составляет 8 г/л.

Штамм Schizosaccharomyces pombe ВКПМ Y-4224 - продуцент молочной кислоты.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине и может быть использовано при промышленном производстве формолвакцины гидроокисьалюминиевой полиштаммной против стрептококковых заболеваний крупного рогатого скота.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к переработке биомассы. Предложен способ получения фермента.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к переработке биомассы. Предложен способ получения корма для животных, включающий целлюлозный или лигноцеллюлозный материал и один или несколько ферментов.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Phyllobacterium ifriqiyense 6 депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 04327.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ контроля пролиферации Naegleria fowleri и применение дезинфицирующего агента.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Питательная среда для выделения бактерий Yersinia enterocolitica содержит пептон, дрожжевой экстракт, маннит, натрия пируват, натрия хлорид, магния сульфат, натрия дезоксихолат, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый, агар-агар, иргасан, дополнительно содержит гидролизат панкреатический мяса с содержанием аминного азота 0,15%, «Монаспор», новобиоцина натриевую соль, аспарагин, глицерин и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены метабиотический препарат-иммуномодулятор и способ его получения.

Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда для культивирования чумного микроба содержит кислотный гидролизат водорастворимой фракции эмбрионально-яичной массы птиц, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, натрий сернистокислый, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков человека, и может быть использовано для получения орексина А человека в клетках Escherichia coli.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения лакказ предусматривает погружное культивирование Rhizoctonia solani F-895 в минеральной питательной среде с добавлением в качестве натурального источника углерода и энергии по крайней мере одного компонента, выбранного из ряда: белокочанная капуста, горох, фасоль, картофель, томатная паста, до получения максимальной активности лакказ в культуральной жидкости с последующим отделением культуральной жидкости от мицелия центрифугированием.

Настоящее изобретение заключается в способе получения молочной кислоты, где способ включает стадию удаления глицерина из содержащего глицерин в качестве примеси водного раствора молочной кислоты с помощью ионообменной смолы, причем на указанную ионообменную смолу адсорбируется глицерин, содержащийся в водном растворе молочной кислоты.

Группа изобретений относится к среде для ферментации синтез-газа и способу ферментации синтез-газа. Среда для ферментации синтез-газа содержит от 546 до 838 частей на миллион ионов NH4+, от 31,8 до 279 частей на миллион ионов фосфора, от 39,3 до 118 частей на миллион ионов калия, от 8,4 до 16,8 частей на миллион ионов железа, от 14,8 до 59,8 частей на миллион ионов магния, и 250 частей на миллион цистеина HCl, при этом среда для ферментации содержит менее чем 0,025 части на миллион ионов бора, менее чем 0,0025 части на миллион ионов марганца, менее чем 0,001 части на миллион ионов молибдена и менее чем 0,01 части на миллион ионов меди.

Группа изобретений относится к рекомбинантному микроорганизму Lactobacillus sp., продуцирующему D-молочную кислоту, способу его получения и способу получения D-молочной кислоты с использованием указанного микроорганизма.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к модифицированному микроорганизму Saccharomyces cerevisiae, имеющему повышенную продуктивность в отношении молочной кислоты.

Настоящее изобретение относится к получению молочной кислоты, являющейся полимеризуемым материалом, из углеводсодержащих материалов посредством ферментации последующей очистки от ферментируемых сред.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения трансформантов дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующих молочную кислоту. Предложен трансформант, несущий ген ldh, кодирующий лактатдегидрогеназу из Lactobacillus acidophilus или фермент, аминокислотная последовательность которого гомологична ей не менее чем на 93%.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения молочной кислоты на ферментационных средах предусматривает приготовление посевной, ферментационной и дополнительной сред с углеводной, белковой и солевой, содержащей соли калия, магния, марганца, аммония, частями, культивирование в посевных колбах и ферментере на основной ферментационной среде штамма-продуцента с внесением дополнительной ферментационной среды в ходе процесса культивирования, при поддержании величины pH, температуры культивирования, перемешивания.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом(ами) посредством непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности. Предложен способ получения химического вещества, продуцируемого микроорганизмом (микроорганизмами) путем непрерывной ферментации сахарного сиропа, полученного из целлюлозосодержащей биомассы.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен вариант мутантной рекомбинантной гепариназы I из Pedobacter heparinus, содержащий следующие аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью исходной гепариназы I: E117Q, Q118P, Е362Р, Y363P.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, являющийся продуцент молочной кислоты. Штамм получен путем последовательного трехкратного введения гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus plantarum в состав хромосомы дрожжей S. pombe, в которой инактивирован ген алкогольдегидрогеназы, путем инсерции гена Cre-рекомбиназы под контролем nmt 1 промотора. Штамм депонирован в ВКПМ под номером Y-4224. Использование штамма позволяет получить молочную кислоту в количестве 100 гл культуральной жидкости. 2 пр.

Наверх