Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о



Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
Штамм о n 2212/приморский/2014 вируса ящура aphtae epizooticae типа о для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа о
C12N2770/32021 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

Владельцы патента RU 2650768:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура. Представлен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированный в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ О №2212/Приморский/2014 (производственный). Штамм репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IBRS-2 и ВНК-21 в течение 18-24 часов инкубирования урожая вируса в указанных культурах клеток достигает значений 5,0-7,5 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл.,6 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Ящур - это острое, контагиозное, вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на (%): 30-40 [1].

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Он имеет 7 антигенных типов, большое количество подтипов и множество штаммов [2].

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков [2, 3].

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа О, использовавшиеся в качестве производственных на территории России в течение последних 50 лет. К ним относятся следующие штаммы: О1 №1618 Чечено-Ингушский, выделенный в 1966 году; О1 №194, выделенный в 1957 году в Волгоградской области. Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны, в настоящее время поддерживаются в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Известен штамм типа О №1736/Абхазия/2000, выделенный от КРС в Гальском районе Абхазии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм типа О №1964/Монголия/2004, выделенный от КРС в феврале 2004 г. в Восточно-гобийском аймаке Монголии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [4].

Известен штамм типа О №1734 «Приморский-2000», выделенный 13.04.2000 г. от свиней в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района Приморского края [5, 6].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм типа О №1734 «Приморский-2000» принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Японии, Корее, Монголии, а также Армении и Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 г. также была вызвана паназиатским вирусом. Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О Вьетнам/99 и О Тайвань/99. Установлено, что изолят О №1734 «Приморский-2000» отличается от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов O1 №194 и O1 №1618, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики.

Производственный штамм №1734 «Приморский-2000» используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.

В 2010 г. в Японии, Южной Корее, Гонконге и континентальном Китае вспышки ящура типа О были вызваны вирусом топотипа Юго-Восточная Азия, относящимся к генетической линии Муа-98 [7]. На территории РФ вспышки ящура типа О штаммов О №2102/Забайкальский/2010 и О №2108/Забайкальский/2010, принадлежащих к генетической линии Муа-98 были отмечены в июле и августе 2010 г. в Забайкальском и Шилкинском районах Забайкальского края, в 2011 г. - в Ононском районе Забайкальского края [8, 9, 10].

В феврале 2014 года ящур типа О был отмечен в Северной Корее. В июле 2014 г. в Южной Корее также были выявлены вспышки ящура типа О. Эпизоотия распространялась среди свиней. По данным Всемирной справочной лаборатории, это был новый занос вируса O/SEA/Mya-98, отличающегося от вируса из предыдущих вспышек 2010-2011 гг. Вспышка ящура на территории РФ была отмечена среди свинопоголовья в мае 2014 г. в ООО «Мерси Трейд», деревня Прохоры Спасского района Приморского края [11].

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм №2102/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят в антигенных отличиях от изолятов вируса ящура типа О, выделенных в различные временные промежутки, а приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа О для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма О №2212/Приморский/2014 (авторское наименование) вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2212/Приморский/2014, выделен в мае 2014 года от больной свиньи в ООО «Мерси Трейд» с. Прохоры Спасского района Приморского края (экспертиза №2212). Производственный штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О депонирован 29 мая 2015 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм ВЯ О №2212/Приморский/2014 (производственный).

По сравнению со штаммом-прототипом штамм О №2212/Приморский/2014 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма вируса ящура О №2212/Приморский/2014 для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура О №2212/Приморский/2014 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP 1.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О.

Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного штамма типа О №2212/Приморский/2014 вируса ящура индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:20.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №2212/Приморский/2014 принадлежит к топотипу Юго-Восточная Азия (SEA) генетической линии Муа-98 вируса ящура серологического типа О.

Антигенное родство штамма О №2212/Приморский/2014 с производственными штаммами вируса ящура O1 Manisa, О №1734/Приморский/2000, О PanAsia2, О/Тайвань 3/97, О №2102/Забайкальский/2010 и О №2147/Приморский/2012 изучено в РМН.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для O1 Manisa - 0,45, О №1734/Приморский/2000 - 0,08, О PanAsia2 - 0,08, О №2102/Забайкальский/2010 - 0,18 и О №2147/Приморский/2012 - 0,38, О/Тайвань 3/97 - 0,09. При значении r1>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного [12]. Следовательно штамм вируса ящура О №2212/Приморский/2014 не имеет выраженного антигенного родства с большинством производственных штаммов вируса ящура, используемых в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Биотехнологические характеристики

Штамм О №2212/Приморский/2014 репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки сирийского хомячка (ВНК-21) и почки свиньи (IB-RS-2). В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 5,0 до 7,5 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106 Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм О №2212/Приморский/2014 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,2-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2212/Приморский/2014, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в мае 2014 года от подозреваемой в заболевании ящуром свиньи из деревни Прохоры ООО «Мерси Трейд» Спасского района Приморского края (экспертиза №2212/2014). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 20 мая 2014 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [13].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение вируса и его адаптацию.

Выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 и свиньях с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5%) гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°C во флаконы вносили по 5 см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°C до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» и «Набор для выявления антигена вируса ящура в ИФА», изготовленный ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Адаптация эпизоотического изолята О №2212/Приморский/2014 к различным клеточным линиям наступала на уровне 3 пассажей. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакциях: РСК и ИФА с целью идентификации его типовой принадлежности (таблицы 3 и 4). Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблицах 3 и 4 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2212/Приморский/2014 выявлен антиген вируса ящура типа О в разведении 1:2 в РСК и 1:16 в ИФА.

Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении pH 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см3 внутримышечно. Через 21 и 28 дней после первого введения антигена проводят вторую и третью иммунизации животных, через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [13].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°C в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5-1,0 см3 и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 5.

Данные, приведенные в таблице 6, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических реакций используют штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура Aphtae epizooticae, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом была приготовлена 1 серии диагностического антигена, характеристики которой приведены в таблице 6.

Результаты исследований, приведенные в таблице 6, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4.

Для изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа О вирус штамма О №2212/Приморский/2014 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей, контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6°C до момента использования в вакцине.

Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта марки Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001) в соотношении 3:7-1:1 соответственно.

В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против вируса ящура типа О, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 2 см3 через 30 дней после вакцинации. Вакцину вводят свиньям подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S и 75S компонентов.

Пример 5

Проведены испытания иммуногенной активности противоящурной вакцины инактивированной эмульсионной из штамма О №2212/Приморский/2014, изготовленной так, как описано в примере 4. Иммуногенная активность данной вакцины проверена на свиньях массой 35-40 кг. Трем группам свиней по 5 голов вводили по 2,0 см3 цельной вакцины, в разведении 1:5 и 1:25 соответственно. 2 головы свиней не вакцинировали и использовали в качестве контроля. Через 29 дней после вакцинации всем животным вводили 10000 ИД50 контрольного вируса ящура штамма О №2212/Приморский/2014, полученного как описано в примере 6.

Результаты исследований представлены в таблице 7. Свиньи, привитые цельной вакциной на основе адъюванта марки Montanide ISA-206, на 29 день после вакцинации имели титр вируснейтрализующих антител (ВНА), равный 6,30±0,32 log2, свиньи, привитые вакциной в разведениях 1:5 и 1:25 - 5,40±0,16 log2 и 4,25±0,22 log2 соответственно. После контрольного заражения заболели с генерализацией процесса только 2 контрольных свиньи.

Пример 6

Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура типа О, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на свиньях, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на свиньях, заражая 1-2 животных массой 30-50 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение 2 лет не проводили вакцинацию скота против ящура. Вируссодержащую суспензию вводят под слизистую оболочку языка или в кожу венчика конечностей. Созревшие афты снимают через 24-72 часа после заражения. Титрование инфекционной активности вируса ящура проводят на свиньях и в культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 104,0 ИД50/0,1 см3.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм О №2212/Приморский/2014 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О»:

1. Рёрер X. Ящур. Пер. с нем. Г.А. Сурковой. / Под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.] - М.: Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. [и др.] - М., ВНИИТИБП, 1998, С. 532-548.

4. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 / Т.А. Фомина, В.К. Спирин, А.И. Егорова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 94-104.

5. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 «Приморский-2000» / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-57.

6. Пат. РФ №2204599, C12N 7/00, A61K 39/135, 20.05.2003 г.

7. Southeast Asian Foot-and-Mouth Disease Viruses in Eastern Asia / N.J. Knowles, J.J. He, Y. Shang [et al.] // Emerg Infect Dis. - 2012. - V. 18(3): P. 499-501.

8. Результаты изучения изолятов вируса ящура типа О, вызвавших вспышки в Забайкальском крае в 2010-2011 гг. / С.Р. Кременчугская, Н.Е. Камалова, А.В. Мищенко, Т.К. Майорова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии - 2015 - №1 (25) - С. 34-38

9. Пат. РФ №2563522, C12N 7/00, C12R 1/93, 20.09.2015 Бюл. №26

10. Пат. РФ №2575801 C12N 7/00, C12Q 1/04, A61K 39/135, 20.02.2016 Бюл. №5

11. Лозовой, Д.А. Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире в 2013-2015 гг. и меры борьбы с ним / Д.А. Лозовой, A.M. Рахманов // Ветеринария сегодня. - 2016 - №1 - С. 38-42.

12. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and beers). - 7th Edition, Paris, 2008. - Vol. 1. - P. 203-207

13. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

1. Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа О, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ О №2212/Приморский/2014 (производственный) для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О, характеризующийся тем, что он получен в течение последовательного пассирования в культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения, обладает высокой биологической активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.

2. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) с титром инфекционной активности не менее 6,0 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:2.

3. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в первично трипсинизированной культуре клеток свиной почки (СП) с титром инфекционной активности не менее 5,0 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) в цельном виде.

4. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки свиньи (IB-RS-2) с титром инфекционной активности не менее 6,0±0,25 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:2.

5. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 2 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки сирийского хомячка с титром инфекционной активности не менее 7,5±0,25 lg ТЦД50/см3 и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:4.

6. Штамм по любому из пп. 1-5, характеризующийся тем, что после инактивации он индуцирует в организме морских свинок образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведениях 1:20.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии. Предложен способ определения показаний к проведению противогерпетической терапии при инфекции ВГЧ-6 у детей с острыми респираторными заболеваниями.

Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии. Предложен способ определения показаний к проведению противогерпетической терапии при инфекции ВГЧ-6 у детей с острыми респираторными заболеваниями.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к созданию тест-системы ИФА с использованием вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота при разработке и производстве средств диагностики.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к созданию тест-системы ИФА с использованием вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота при разработке и производстве средств диагностики.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии и иммунологии, и может быть использовано для ведения больных в раннем послеоперационном периоде после трансплантации сердца, других хирургических вмешательствах на сердце, выполняемых в условиях искусственного кровообращения.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способ и система для клеточного анализа.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к способу повышения адгезивной активности культур лактобацилл. Способ повышения адгезивной активности культур лактобацилл, включающий в себя выращивание на плотной питательной среде MRS лактобактерий при температуре 36-38°C в течение 24-48 ч, подготовку суспензии лактобактерий до концентрации 1 OD и суспензии эритроцитов до концентрации 1012 кл./мл в физиологическом растворе хлорида натрия при рН, равном 7,2-7,4, инкубирование смеси суспензий бактерий 2,5 мл и эритроцитов 1 мл в шейкер-инкубаторе в течение 30 мин при 36-38°C, центрифугирование смеси в течение 5 мин при 1000 об./мин, декантирование надосадочной жидкости, ресуспендирование осадка в физиологическом растворе хлорида натрия при рН равном 7,2-7,4, фильтрацию ресуспендированного осадка через мембранный фильтр с диаметром пор 1,2 мкм для освобождения от неприкрепившихся к эритроцитам бактерий, пересев лактобактерий с поверхности фильтра на плотную питательную среду MRS и выращивание культуры при температуре 36-38°C в течение 24-48 часов.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм вируса гриппа свиней A/swine/Siberia/1sw/2016 H1N1-субтипа, выделенный из гомогената легочной ткани домашней свиньи на территории Западной Сибири и депонированный в Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им.

Группа изобретений относится к области медицины. Предложены заготовка для изготовления тест-системы для проведения экспресс-диагностики инфекции Helicobacter pylori по уреазной активности биоптата и способ изготовления вышеуказанной тест-системы.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены рекомбинантные дрожжи штамма Kluyveromyces lactis DSM 25405, Kluyveromyces lactis DSM 25406 или Kluyveromyces lactis DSM 25407, несущие в качестве чужеродного гена ген для VP2-антигена вируса инфекционного бурсита (IBDV), интегрированный в геном дрожжей и обеспечивающий экспрессию VP2-антигена IBDV в качестве чужеродного белка.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым иммуногенам на основе перекрывающихся пептидов (OLP), и может быть использовано в медицине для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции.

Изобретения относятся к выделению экспрессированных бакуловирусами вирусоподобных частиц (VLP)безоболочечных вирусов из клеток насекомых и касаются способа выделения экспрессированных бакуловирусом VLP цирковируса свиней 2-го типа (PCV2) в клетках насекомых и способа получения экспрессированных бакуловирусами VLP PCV2.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и ветеринарии. Предложен штамм “Калмыкия-16” вируса оспы овец семейства Poxviridae рода Capripoxvirus, выделенный от больной овцы во время эпизоотии болезни в Республике Калмыкия и депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под номером 3160.

Изобретение относится к вирусологии и ветеринарии. Предложен штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота «Волгоградский» семейства Poxviridae, род Capripoxvirus, выделенный из патологического материала от больных коров из Волгоградской области и депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3161.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм вируса гриппа A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8, типа А, подтипа Н5, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus, полученный в течение последовательного пассирования в 10-суточных эмбрионах СПФ-кур и депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным номером штамм ВГП A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 (диагностический).

Настоящее изобретение относится к вирусологии и ветеринарии. Предложен штамм вируса инфекционной анемии цыплят «МЕ-77», выделенный из печени клинически больных цыплят-бройлеров из промышленного птицеводческого хозяйства ООО «Торгово-птицеводческая компания «Балтптицепром» (г.

Изобретение относится к областям медицинской вирусологии, биотехнологии и микробиологии и касается онколитического штамма вируса болезни Ньюкасла, способного селективно лизировать новообразования млекопитающих.

Настоящее изобретение относится к вирусологии и медицине. Предложен штамм А/Япония/ГК/6:2/2014 RA-36 (H2N2), Influenzavirus А, подтип H2N2, полученный методом классической генетической реассортации штамма-донора A/HongKong/1/68/162/35(H3N2) и эпидемического вируса A/Japan/305/1957 (H2N2) и депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена композиция антибактериальная для продления срока годности охлажденной рыбы и снижения риска возникновения инфекций, передаваемых пищевым путем.

Настоящее изобретение относится к агробиотехнологии. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления вируса крапчатости винограда (Grapevine fleck virus) с использованием метода полимеразной цепной реакции.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к клеточной линии рака яичника человека 533 OOS. Указанная клеточная линия предназначена для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования активности различных фармацевтических препаратов.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура. Представлен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированный в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм ВЯ О №2212Приморский2014. Штамм репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи, перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога, IBRS-2 и ВНК-21 в течение 18-24 часов инкубирования урожая вируса в указанных культурах клеток достигает значений 5,0-7,5 lg ТЦД50см3. При высокой множественности заражения вызывает ЦПД через 5 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл.,6 пр.

Наверх