Антиген-связывающий белок и его применение в качестве продукта для адресной доставки при лечении рака

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу скрининга in vitro антитела или его связывающего фрагмента, способного доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в клетку млекопитающего, экспрессирующую на своей поверхности белок Axl. Для осуществления указанного способа сначала отбирают антитело, которое способно специфически связываться с белком Axl и лишено какой-либо значительной активности в отношении пролиферации опухолевых клеток. Затем проводят ковалентное связывание указанной молекулы с выбранным антителом с образованием комплекса. После чего указанный комплекс контактирует с клеткой млекопитающего, экспрессирующей на своей поверхности белок Axl. Далее определяют, был ли указанный комплекс внутриклеточно доставлен или интернализован в указанную клетку, и отбирают необходимое антитело. Настоящее изобретение также раскрывает способ получения in vitro цитотоксического или цитостатического комплекса и позволяет отбирать антитела к Axl, которые могут быть использованы для получения иммуноконъюгатов, более безопасных, но сохраняющих свою эффективность. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 табл., 13 пр.

 

Настоящее изобретение относится к новому антиген-связывающему белку, в частности моноклональному антителу, способному специфически связываться с белком Axl, а также к аминокислотным и нуклеотидным последовательностям, кодирующим указанный белок. В одном аспекте, изобретение относится к новому антиген-связывающему белку или антиген-связывающим фрагментам, способным специфически связываться с Axl и, вызывая интернализацию Axl, интернализоваться в клетку. Изобретение также относится к применению в качестве продукта для адресной доставки указанного антиген-связывающего белка, конъюгированного с другими противораковыми соединениями, такими как токсины, радиоактивные элементы или лекарственные средства, и его применению для лечения некоторых видов рака.

«Axl» (также называемый как «Ufo», «Ark» или «Tyro7») был клонирован из пациентов с хронической миелоидной лейкемией как онкоген, запускающий трансформацию при сверхэкспрессии мышиными NIH3T3. Он принадлежит к семейству рецепторных тирозинкиназ (RTK), называемому семейство ТАМ (Tyro3, Axl, Mer), которое включает Tyro3 (Rse, Sky, Dtk, Etk, Brt, Tif), Axl и Mer (Eyk, Nyk, Tyro-12) [Lemke G. Nat. Rev. Immunol. (2008). 8, 327-336].

Белок Axl человека состоит из 894 аминокислот, последовательность которых представлена в перечне последовательностей как SEQ ID NO. 29. Аминокислоты 1-25 соответствуют сигнальному пептиду, белок Axl человека без указанного сигнального пептида представлен в перечне последовательностей как SEQ ID NO. 30.

Gas6, первоначально выделенный как ген блокировки роста, является общим лигандом для членов семейства ТАМ [Varnum B.C. et al. Nature (1995). 373, 623-626]. Gas6 демонстрирует самое высокое сродство к Axl, меньшее сродство к Tyro3 и, наконец, еще меньшее сродство к Mer [Nagata K. et al. J. Biol. Chem. (1996). 271, 30022-30027]. Gas6 состоит из домена, обогащенного γ-карбоксиглутаматом (Gla), который опосредует связывание с фосфолипидными мембранами, четырех доменов, подобных эпидермальному фактору роста, и двух доменов, подобных ламинину G (LG) [Manfioletti G., Brancolini.C, Avanzi.G. & Schneider, С. Mol. Cell Biol. (1993). 13, 4976-4985]. Как и у многих других RTK, связывание лиганда приводит к димеризации рецепторов и аутофосфорилированию остатков тирозина (остатки тирозина 779, 821 и 866 для рецептора Axl), которые служат участками стыковки для различных внутриклеточных сигнальных молекул [Linger R.M. Adv. Cancer Res. (2008). 100, 35-83]. Кроме того, рецептор Axl может быть активирован независимо от лиганда. Эта активация может произойти при сверхэкспрессии рецептора Axl.

Сигналы от Gas6/Axl, как было показано, регулируют различные клеточные процессы, включая клеточную пролиферацию, адгезию, миграцию и выживание, у целого ряда клеток in vitro [Hafizi S. & Dahlback.B. FEBS J. (2006).273, 5231-5244]. Кроме того, рецепторы ТАМ участвуют в контроле врожденного иммунитета; они замедляют воспалительные реакции на патогены в дендритных клетках (DC) и макрофагах. Они также запускают фагоцитоз апоптотических клеток этими иммунными клетками, и они необходимы для созревания и поражающей активности естественных клеток-киллеров (NK) [Lemke G. Nat. Rev. Immunol. (2008). 8, 327-336].

Слабо экспрессирующиеся в нормальных клетках, они, в основном, обнаруживаются в фибробластах, миелоидных клетках-предшественниках, макрофагах, нервной ткани, сердечной и скелетных мышцах, где они, главным образом, поддерживают выживание клеток. Система Gas6/Axl играет важную роль в биологии сосудов, регулируя гомеостаз гладкомышечных клеток сосудов [Korshunov V.A., Mohan, A.M., Georger, M.A. & Berk, B.C. Circ. Res. (2006). 98, 1446-1452; Korshunov V.A., Daul, M., Massett, MP. & Berk, B.C. Hypertension (2007). 50, 1057-1062].

В опухолевых клетках Axl играет важную роль в регулировании клеточной инвазии и миграции. Сверхэкспрессия Axl связана не только с плохим прогнозом, но и с повышенной инвазивностью различных злокачественных опухолей человека, как сообщалось для рака молочной железы, рака толстой кишки, рака пищевода, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, глиомы, рака легких, меланомы, остеосаркомы, рака яичников, рака простаты, рабдомиосаркомы, рака почки, рака щитовидной железы и рака эндометрия [Linger R.M. Adv. Cancer Res. (2008). 100, 35-83 и Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011). 10, 1763-1773, для обзоров]. При раке молочной железы Axl, по-видимому, является сильным эффектором эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ); программа ЕМТ активно способствует миграции и распространению раковых клеток в организме [Thiery J.P. Curr. Opin. Cell Biol. (2003). 15, 740-746].

Также было показано, что Axl регулирует ангиогенез. Действительно, нокдаун Axl в эндотелиальных клетках нарушал формирование трубки и миграцию [Holland S.J. et al. Cancer Res. (2005). 65, 9294-9303], а также повреждал специфичные ангиогенные сигнальные пути [Li Y. et al. Oncogene (2009). 28, 3442-3455].

В нескольких исследованиях ряда клеточных моделей, проведенных в последнее время, описано участие сверхэкспрессии Axl в явлении лекарственной устойчивости. В нижеприведенной таблице 1 приведены сведения об этих исследованиях.

Полные данные об источниках, приведенных выше в таблице 1, следующие:

- Macleod, K. et al. Cancer Res. (2005). 65, 6789-6800

- Mahadevan D. et al. Oncogene (2007). 26, 3909-3919

- Lay J.D. et al. Cancer Res. (2007). 67, 3878-3887

- Hong C.C. etal. Cancer Lett. (2008). 268, 314-324

- Liu L. et al. Cancer Res. (2009). 69, 6871-6878

- Keating A.K. etal. Mol. CancerTher. (2010). 9, 1298-1307

- Ye X. et al. Oncogene (2010). 29, 5254-5264

В таком контексте RTK Axl рассматривается как интересная мишень в онкологии. Несколько групп уже разработали противоопухолевые стратегии, направленные на ось Gas6/Axl, либо использующие изолированные моноклональные антитела, либо направленные на малые молекулы [Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011). 10, 1763-1773].

В первом варианте осуществления изобретение относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, который i) специфически связывается с белком Axl человека и ii) интернализуется после его связывания с указанным белком Axl человека.

В более общем смысле изобретение относится к применению белка Axl для отбора антиген-связывающего белка или его антиген-связывающего фрагмента, способного интернализоваться после его связывания с указанной мишенью Axl. В частности, указанной мишенью является внеклеточный домен Axl.

В этом частном аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга in vitro соединения или его связывающего фрагмента, способного доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в клетку млекопитающего, где молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с указанным соединением, при этом способ включает следующие стадии:

a) отбор соединения, которое способно специфически связываться с белком Axl, или его внеклеточным доменом (ECD), или его эпитопом;

b) необязательно, ковалентное связывание указанной молекулы, представляющей интерес, или контрольной молекулы с соединением, выбранным на стадии а), с образованием комплекса;

c) контактирование соединения, выбранного на стадии а), или комплекса, полученного на стадии b), с клеткой млекопитающего, предпочтительно, жизнеспособной клеткой, экспрессирующей на своей поверхности белок Axl или его функциональный фрагмент;

d) определение, были ли указанное соединение, или указанная молекула, представляющая интерес, или указанный комплекс внутриклеточно доставлены или интернализованы в клетку млекопитающего; и

e) отбор указанного соединения в качестве соединения, способного доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в жизнеспособную клетку млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления указанное соединение, способное доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в жизнеспособную клетку млекопитающего, представляет собой белок (называемый в данном документе также как полипептид или пептид) или подобное белку соединение, содержащее пептидную структуру, в частности, аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5, 10, 15 или более аминокислотных остатков, причем указанный(ые) аминокислотный(ые) остаток(остатки) может(могут) быть гликозилирован(ы).

Когда указанное соединение, способное доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в жизнеспособную клетку млекопитающего, представляет собой белок или подобное белку соединение, указанное соединение также называется в данном документе «антиген-связывающий белок», при этом антиген-связывающий белок или его связывающий фрагмент может:

i) специфически связываться с белком Axl, предпочтительно, белком Axl человека, и

ii) интернализоваться в клетку млекопитающего после его связывания с указанным белком Axl, когда белок Axl экспрессируется на поверхности клетки млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная жизнеспособная клетка млекопитающего представляет собой клетку человека, предпочтительно, клетку, естественным образом экспрессирующую рецептор белка Axl.

В частном воплощении изобретения жизнеспособные клетки млекопитающих на стадии с) являются клетками млекопитающих, которые экспрессируют рекомбинантный(ые) белок(белки) Axl на их поверхности.

В предпочтительном варианте осуществления молекула, представляющая интерес, является цитотоксической молекулой (называемой в данном документе также как цитотоксический или цитостатический агент).

В предпочтительном варианте осуществления молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с соединением, способным связываться с белком Axl с помощью линкера, более предпочтительно, пептидного линкера, более предпочтительно, расщепляемого пептидного линкера, более предпочтительно, линкера, который может расщепляться природными внутриклеточными соединениями, содержащимися в клетке млекопитающего, в частности, в цитозоле указанной клетки млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления соединение, способное связываться с белком Axl, представляет собой антитело или его функциональный связывающий фрагмент, который специфически направлен на белок Axl или его эпитоп, расположенный в домене EDC Axl.

Стадия е) отбора может быть осуществлена любым способом, известным специалисту в данной области, для оценки внутриклеточной доставки или интернализации. Анализы или тесты, способные продемонстрировать или оценить присутствие, отсутствие или активность соединения, способного специфически связывать белок Axl, или комплекса, образованного указанным соединением и молекулой, представляющей интерес, или указанной молекулы, представляющей интерес, которая ковалентно связана с указанным соединением, хорошо известны специалисту в данной области (см. некоторые примеры таких тестов или анализов далее по тексту, однако эти тесты не ограничиваются приведенными здесь примерами).

В частности, эти тесты или анализы могут быть осуществлены методами FACS, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, оценки цитотоксичности/цитостатичности и т.д.

В этом аспекте настоящее изобретение также относится к способу получения in vitro цитотоксического или цитостатического комплекса, способного доставлять цитотоксическое соединение в клетку млекопитающего, предпочтительно, жизнеспособную клетку, при этом способ включает стадию: - ковалентного связывания цитотоксического агента с соединением, которое:

i) способно специфически связываться с белком Axl, предпочтительно, белком Axl человека, и

ii) интернализуется в клетку млекопитающего после его связывания с белком Axl, когда указанный белок Axl экспрессируется на поверхности клетки млекопитающего.

Предпочтительно, указанное соединение представляет собой подобное белку соединение, более предпочтительно, антитело, которое специфически направлено на белок Axl или его эпитоп, расположенный в домене EDC Axl, или функциональный связывающий фрагмент указанного антитела.

В предпочтительном варианте осуществления указанный цитотоксический агент ковалентно связан с антителом к Axl или его функциональным фрагментом с помощью линкера, более предпочтительно, пептидного линкера, более предпочтительно, расщепляемого пептидного линкера, более предпочтительно, линкера, который может расщепляться, например, природными внутриклеточными соединениями, но не ограничиваясь ими.

Подобно другим членам семейства ТАМ, внеклеточный домен (ECD) Axl имеет строение, похожее на строение молекул клеточной адгезии. ECD Axl характеризуется сочетанием двух иммуноглобулин-подобных доменов, за которыми следуют два смежных фибронектин-Ш-подобных домена [O'Bryan J.P. et al. Mol. Cell Biol. (1991). 11, 5016-5031]. Эти два N-концевых иммуноглобулин-подобных домена являются достаточными для связывания лиганда Gas6 [Sasaki Т. et al. EMBO J. (2006).25, 80-87].

ECD белка Axl человека представляет собой фрагмент из 451 аминокислоты, соответствующий аминокислотам 1-451 последовательности SEQ ID NO. 29, которая представлена в перечне последовательностей как SEQ ID NO. 31. Аминокислоты 1-25 соответствуют сигнальному пептиду, ECD белка Axl человека без сигнального пептида соответствует аминокислотам 26-451 последовательности SEQ ID NO. 29, представленным последовательностью SEQ ID NO. 32.

На сегодняшний день установлены различные способы интернализации. Они определяют место появления интернализованных белков или белковых комплексов в клетке. После эндоцитоза большинство мембранных белков или липидов возвращается к клеточной поверхности (рециклизация), но некоторые компоненты мембраны доставляются к поздним эндосомам или Гольджи [Maxfield F.R. & McGraw, Т.Е. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2004). 5, 121-132].

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, который i) специфически связывается с белком Axl человека и ii) интернализуется после его связывания с указанным белком Axl человека, где указанный антиген-связывающий белок содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO. 1-14, или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную последовательностям SEQ ID NO. 1-14.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, который

i) специфически связывается с белком Axl человека, предпочтительно имеющим последовательность SEQ ID NO. 29 или 30 или ее встречающийся в природе вариант, и

ii) интернализуется после его связывания с указанным белком Axl человека, где указанный антиген-связывающий белок содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO. 1-14.

«Связывающий белок» или «антиген-связывающий белок» представляет собой пептидную цепь, имеющую специфическое или общее сродство с другим белком или молекулой (обычно называемой антигеном). Белки входят в контакт и, если связывание возможно, образуют комплекс. Предпочтительно, антиген-связывающий белок согласно изобретению может представлять собой, без ограничения, антитело, фрагмент или производное антитела, белок или пептид.

Под «антиген-связывающим фрагментом» антиген-связывающего белка согласно изобретению следует понимать любой пептид, полипептид или белок, сохраняющий способность специфически связываться с мишенью (также обычно называемой антигеном) антиген-связывающего белка и включающий аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков, или по меньшей мере 250 смежных аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности антиген-связывающего белка.

В предпочтительном варианте осуществления, где антиген-связывающий белок представляет собой антитело, такие «антиген-связывающие фрагменты» выбирают из группы, состоящей из Fv, scFv (sc означает одноцепочечный), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc-фрагментов или диател, или любого фрагмента, время полужизни которого увеличено путем химической модификации, например, путем добавления поли(алкилен)гликоля, такого как поли(этилен)гликоль («ПЭГилирование») (пегилированные фрагменты называют Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG или Fab'-PEG) («PEG» от поли(этилен)гликоль), либо путем включения в липосому, причем указанные фрагменты имеют по меньшей мере один из характерных CDR антитела согласно изобретению. Предпочтительно, указанные «антиген-связывающие фрагменты» будут представлять собой или содержать часть последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, из которого они получены, причем указанная часть последовательности достаточна для того, чтобы сохранить ту же специфичность связывания, как и у антитела, из которого она произошла, и достаточное сродство, предпочтительно, по меньшей мере равное 1/100, в более предпочтительном варианте - по меньшей мере 1/10 сродства антитела, из которого она произошла, по отношению к мишени. Такой функциональный фрагмент будет содержать по меньшей мере 5 аминокислот, предпочтительно 10, 15, 25, 50 и 100 последовательных аминокислот из последовательности антитела, из которого он получен.

Термин «эпитоп» означает область антигена, которая связывается антиген-связывающим белком, в том числе антителами. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, являются разновидностью структурных эпитопов и включают те остатки, которые непосредственно способствуют аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, то есть состоять из аминокислот, не являющихся линейной последовательностью в белке. В некоторых вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые являются химически активными поверхностными группировками молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в некоторых вариантах осуществления могут иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики заряда.

В настоящей заявке эпитоп локализован во внеклеточном домене белка Axl человека.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент специфически связывается с эпитопом, локализованным во внеклеточном домене белка Axl человека, предпочтительно имеющим последовательность SEQ ID NO. 31 или 32 или ее встречающийся в природе вариант.

Под выражениями «специфическое связывание», «специфически связывается» или тому подобными подразумевают, что антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который относительно стабилен в физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать равновесной константой диссоциации по меньшей мере приблизительно 1×10^-6 М или менее. Методы определения того, связываются ли две молекулы специфично, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и тому подобное. Во избежание сомнений, данный термин не означает, что указанный антиген-связывающий фрагмент не мог бы связываться или взаимодействовать на низком уровне с другим антигеном. Тем не менее, в предпочтительном варианте осуществления указанный антиген-связывающий фрагмент связывается только с указанным антигеном.

В этом смысле «ЕС₅₀» относится к 50% эффективной концентрации. Точнее, термин «полумаксимальная эффективная концентрация» (ЕС₅₀) соответствует концентрации лекарственного средства, антитела или токсиканта, которая вызывает ответ посередине между исходной точкой и максимумом после некоторого заданного времени воздействия. Он обычно используется в качестве единицы измерения активности препарата. ЕС₅₀ по градуированной кривой зависимости ответа от дозы, таким образом, представляет концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% от максимального эффекта. ЕС₅₀ по кривой зависимости ответа от дозы, полученной для данных в форме наличия или отсутствия ответа, представляет концентрацию соединения, при которой 50% популяции проявляет ответ после заданной продолжительности воздействия. Измерения концентрации обычно выстраиваются в сигмоидальную кривую, быстро возрастающую при относительно малом изменении концентрации. Она может быть определена математически путем построения наилучшей эмпирической кривой.

В предпочтительном варианте осуществления ЕС₅₀, определенная в настоящем изобретении, характеризует эффективность связывания антитела с ECD Axl, экспонированным на опухолевых клетках человека. Параметр ЕС₅₀ определяется с помощью анализа FACS. Параметр ЕС₅₀ отражает концентрацию антитела, при которой достигается 50% от максимального связывания Axl человека, экспрессированного на опухолевых клетках человека. Каждое значение ЕС₅₀ было рассчитано как средняя точка кривой зависимости ответа от дозы с использованием программы вычерчивания четырехпараметрической регрессионной кривой (Prism Software). Этот параметр был выбран в качестве репрезентативного для физиологических/патологических состояний.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент связывается со своим эпитопом с ЕС₅₀ по меньшей мере 10^-9 М, предпочтительно, между 10^-9 и 10^-12 М.

Еще один вариант осуществления изобретения представляет собой процесс или способ отбора антиген-связывающего белка или его антиген-связывающего фрагмента, способного внутриклеточно интернализоваться в клетку млекопитающего, предпочтительно, в клетку человека, предпочтительно, в жизнеспособную клетку, включающий стадии:

- i) отбор антиген-связывающего белка, который специфически связывается с Axl, предпочтительно, с его доменом EDC или с его эпитопом; и

- ii) отбор антиген-связывающего белка из предшествующей стадии i), который интернализуется в клетку млекопитающего после его связывания с белком Axl, экспрессируемым на поверхности клетки млекопитающего.

В частном воплощении указанная клетка млекопитающего естественным образом экспрессирует рецептор белка Axl на своей поверхности или является клеткой млекопитающего, предпочтительно, клеткой человека, которая экспрессирует рекомбинантный белок Axl на своей поверхности.

Такой способ или процесс может включать стадии i) отбора антиген-связывающего белка, который специфически связывается с Axl с ЕС₅₀ по меньшей мере 10^-9 М и ii) отбор антиген-связывающего белка из предшествующей стадии, который интернализуется после связывания с Axl. Стадия отбора ii) может быть осуществлена любым способом, известным специалисту в данной области для оценки интернализации. В частности, можно провести тесты с помощью FACS, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, оценки цитотоксичности и т.д.

Еще одной характеристикой антиген-связывающего белка согласно изобретению является то, что он не имеет какой-либо значительной активности в отношении пролиферации опухолевых клеток. В частности, как показано в нижеприведенных примерах, антиген-связывающий белок согласно изобретению не имеет какой-либо существенной активности in vitro на модели пролиферации SN12C.

В онкологии существует несколько механизмов, посредством которых моноклональные антитела (mAbs) могут проявлять терапевтический эффект, но зачастую их активность недостаточна для получения долговременного положительного эффекта. Поэтому были использованы несколько стратегий для усиления их активности, в частности, комбинирование их с лекарственными средствами, такими как химиотерапевтические агенты. В качестве эффективной альтернативы таким комбинационным подходам, новым возможным терапевтическим средством для лечения рака могут стать иммунотоксины [Beck А. et al. Discov. Med. (2010). 10, 329-339; Alley S.C. et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009). 330, 932-938]. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) представляют собой один из подходов, при которых возможность использовать специфичность mAbs и адресную доставку цитотоксического агента к опухоли может значительно повысить активность как mAbs, так и лекарственного средства. В идеале mAb будет специфически связываться с антигеном со значительной экспрессией на опухолевых клетках, но с ограниченной экспрессией на нормальных клетках.

Настоящее изобретение направлено на белок, специфически связывающий Axl, и, более конкретно, на специфичное антитело к Axl, которое обладает высокой способностью к интернализации после связывания с Axl. Такой антиген-связывающий белок представляет интерес как один из компонентов конъюгата антитело-лекарственное средство, чтобы обеспечивать адресную доставку присоединенного цитотоксического агента в раковые клетки-мишени. Сразу после интернализации цитотоксический агент вызывает гибель раковых клеток.

Важными моментами для успешной иммуноконъюгационной терапии считают специфичность к антигену-мишени и интернализацию раковыми клетками комплексов антиген-связывающих белков. Очевидно, неинтернализующиеся антигены являются менее эффективными для доставки цитотоксических агентов, чем интернализующиеся антигены. Процессы интернализации различаются среди антигенов и зависят от нескольких параметров, которые могут зависеть от связывающих белков. RTK клеточной поверхности представляют собой интересное семейство антигенов для исследования такого подхода.

В биомолекуле цитотоксический агент привносит цитотоксическую активность, а используемый антиген-связывающий белок вносит свою специфичность против раковых клеток, а также является переносчиком для проникновения внутрь клеток, чтобы правильно направить цитотоксический агент.

Таким образом, чтобы улучшить молекулу иммуноконъюгата, белок, связывающий носитель, должен проявлять высокую способность к интернализации в раковые клетки-мишени. Эффективность, с которой связывающие белки опосредовали интернализацию, существенно различается в зависимости от эпитопа-мишени. Отбор активно интернализующихся белков, связывающих Axl, требует разнообразных экспериментальных данных, показывающих не только снижение экспрессии Axl, но и последующее появление связывающих Axl белков в этих клетках.

В предпочтительном варианте осуществления интернализация антиген-связывающего белка согласно изобретению может быть оценена, предпочтительно, посредством иммунофлуоресценции (как показано в последующих примерах в настоящей заявке) или любого способа или процесса, известного специалисту в данной области техники, специфичного для данного механизма интернализации.

В другом предпочтительном варианте осуществления, так как после связывания связывающего белка согласно изобретению с ECD указанного Axl комплекс антиген-связывающего белка с Axl в соответствии с изобретением интернализуется, происходит уменьшение количества Axl на поверхности клеток. Это уменьшение может быть количественно измерено любым способом, известным специалисту в данной области (вестерн-блоттинг, FACS, иммунофлюоресценция и т.д.).

В одном варианте осуществления изобретения это снижение, отражающее интернализацию, предпочтительно, может быть измерено с помощью FACS и выражено как отличие или разность между средней интенсивностью флуоресценции (MFI), измеренной на необработанных клетках, и MFI, измеренной на клетках, обработанных антиген-связывающим белком согласно изобретению.

В качестве неограничивающего примера настоящего изобретения эта разность определяется на основе MFI, полученных для необработанных клеток и клеток, обработанных антиген-связывающим белком согласно настоящему изобретению, как описано в примере 9, с использованием i) клеток опухоли почки человека SN12C после 24-часового периода инкубации с антиген-связывающим белком согласно изобретению и ii) вторичного антитела, меченого Alexa 488. Этот параметр определяют путем вычислений по следующей формуле:

Эта разность между MFI отражает снижение количества Axl, так как MFI пропорциональны количеству Axl, экспрессированного на поверхности клетки.

В более предпочтительном и выгодном аспекте антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент согласно изобретению состоит из моноклонального антитела, предпочтительно, выделенного Mab, вызывающего Δ(MFI_24ч необработанных клеток - MFI_24ч обработанных клеток), равную по меньшей мере 200, предпочтительно, по меньшей мере 300.

Антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с изобретением вызывает снижение MFI, равное по меньшей мере 200.

Более подробно, вышеупомянутая разность может быть измерена в соответствии со следующим способом, который должен рассматриваться в качестве иллюстративного и неограничивающего примера:

a) обработка и инкубация представляющих интерес опухолевых клеток с антиген-связывающим белком согласно изобретению;

b) обработка клеток, обработанных на стадии а), и, параллельно, необработанных клеток антиген-связывающим белком согласно изобретению,

c) измерение MFI (отражающей количество Axl, присутствующего на поверхности) для обработанных и необработанных клеток с использованием вторичного меченого антитела, способного связываться с антиген-связывающим белком, и

d) расчет разности, получаемой вычитанием из значения MFI, полученного для обработанных клеток, значения MFI, полученного для необработанных клеток.

Термины «антитело», «антитела» или «иммуноглобулин» используются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают монокпональные антитела, предпочтительно, выделенные Mab (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, если они проявляют желаемую биологическую активность).

В частности, такие молекулы состоят из гликопротеина, содержащего по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (или домен) тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую здесь как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую здесь как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен, CL. Участки VH и VL могут быть разделены на участки гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, располагаемых от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента.

Антитела в контексте настоящего изобретения также означают некоторые фрагменты антител. Указанные фрагменты антител проявляют желаемую специфичность связывания и аффинность независимо от источника или типа иммуноглобулина (например, IgG, IgE, IgM, IgA и т.д.), то есть они способны специфически связываться с белком Axl с аффинностью, сравнимой с полноразмерными антителами согласно изобретению.

В общем, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно использовать методы, которые описаны, в частности, в руководстве «Антитела» (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988), или методы получения из гибридом, описанные в Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Термин «моноклональное антитело» или «Mab», используемый в данном документе, относится к молекуле антитела, которая направлена на конкретный антиген и которая может быть получена с помощью единственного клона В-клеток или гибридомы. Моноклональные антитела также могут быть рекомбинантными, т.е. производимыми с помощью белковой инженерии. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные на различные детерминанты или эпитопы, каждое моноклональное антитело направлено на один эпитоп антигена. Изобретение относится к антителам, выделенным или полученным путем очистки из природных источников или полученным с помощью генетической рекомбинации или химического синтеза.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения представляет собой антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент, содержащий или состоящий из антитела, при этом указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 1, 2 и 3 или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную SEQ ID NO. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 4, 5 и 6 или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную SEQ ID NO. 4, 5 и 6.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент состоит из антитела, при этом указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 4, 5 и 6.

В предпочтительном аспекте под участками CDR, или CDR(s), понимают гипервариабельные участки тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено IMGT. Во избежание каких-либо противоречий CDRs будут определяться в настоящем описании в соответствии с системой нумерации IMGT.

Уникальная нумерация IMGT была введена, чтобы сравнивать вариабельные домены независимо от рецептора антигена, типа цепи или вида [Lefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Сотр. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют ту же самую позицию, например, цистеин 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2nd-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1-IMGT: позиции от 1 до 26, FR2-IMGT: от 39 до 55, FR3-IMGT: от 66 до 104, и FR4-IMGT: от 118 до 128) и участков, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: от 27 до 38, CDR2-IMGT: от 56 до 65, и CDR3-IMGT: от 105 до 117. Так как разрывы представляют собой незанятые позиции, длины CDR-IMGT (показаны в скобках и разделяются точками, например, [8.8.13]) становятся определяющей информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в виде графических 2D структур, называемых «Жемчужные колье IMGT» (IMGT Colliers de Perles) [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210(2004)].

Необходимо понимать, что для исключения противоречия в настоящем описании определяющие комплементарность участки или CDRs означают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как они определены в соответствии с системой нумерации IMGT.

Тем не менее, CDRs также могут быть определены в соответствии с системой нумерации Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, и более поздние издания). Существуют три CDR тяжелых цепей и три CDR легких цепей. В данном документе термины «CDR» и «CDRs» (CDR в единственном числе или множественном числе соответственно) используются для обозначения, в зависимости от конкретного случая, одного или нескольких, или даже всех участков, содержащих большую часть аминокислотных остатков, ответственных за сродство связывания антитела по отношению к антигену или эпитопу, которые оно распознает.

В соответствии с системой нумерации Kabat, настоящее изобретение относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, состоящему из антитела, при этом указанное антитело содержит три CDR легкой цепи, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, содержащие последовательности SEQ ID NO. 9, 10 и 11 или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную SEQ ID NO. 9, 10 и 11; и три CDR тяжелой цепи, определенные в соответствии с системой нумерации Kabat, содержащие последовательности SEQ ID NO. 12, 13 и 14 или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную SEQ ID NO. 12, 13 и 14.

В контексте настоящего изобретения «процент идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает процентное отношение идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя сравниваемыми последовательностями, полученное после оптимального выравнивания, причем это процентное отношение является чисто статистическим и различия между двумя последовательностями распределены по их длине случайным образом. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот обычно выполняется путем сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, причем сравнение можно проводить по сегментам или с помощью «окна выравнивания». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, в дополнение к сравнению вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], посредством алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], посредством метода поиска сходства Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или посредством компьютерных программ, использующих эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA от Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или программного обеспечения для сравнения BLAST NR или BLAST Р).

Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей, в которых сравниваемые нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут иметь добавления или делеции по сравнению с контрольной последовательностью для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывают путем определения количества положений, в которых нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны между двумя последовательностями, предпочтительно, между двумя полными последовательностями, деления количества идентичных положений на общее число положений в окне выравнивания и умножения результата на 100 для получения процента идентичности между двумя последовательностями.

Например, может быть использована программа BLAST, «Последовательности BLAST 2» (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250), доступная на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами, принимающими значения по умолчанию (в частности, для параметров «штраф за внесение пропуска»: 5, и «штраф за продление пропуска»: 2; с выбранной матрицей, например, «BLOSUM 62», предлагаемой программой); процент идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями вычисляется непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичной аминокислотной последовательности сравнения, предпочтительные примеры включают последовательности, которые содержат последовательность сравнения, некоторые модификации, в частности, делецию, вставку или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более расположенных последовательно или непоследовательно аминокислот предпочтительны замены, при которых замещенные аминокислоты заменены на «эквивалентные» аминокислоты. Выражение «эквивалентные аминокислоты» в настоящем документе означает любые аминокислоты, которые могут заменить одну из структурных аминокислот, не меняя при этом биологической активности соответствующих антител и тех конкретных примеров, что приведены ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которые они замещают, или по результатам сравнительных испытаний биологической активности разных антиген-связывающих белков, которые могут быть получены.

В качестве неограничивающего примера в нижеприведенной таблице 2 представлены возможные замены, которые могут быть осуществлены без значительного изменения биологической активности соответствующего модифицированного антиген-связывающего белка; обратные замены, естественно, возможны при тех же условиях.

Вариант осуществления изобретения относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, содержащему три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 1, 2 и 3 или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную SEQ ID NO. 1, 2 и 3; и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичной SEQ ID NO. 8.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент содержит три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 1, 2 и 3, и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 8.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 8.

Под «любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 8» следует понимать последовательность, имеющую три CDR тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO. 4, 5 и 6 и, кроме того, по меньшей мере на 80% идентичную полной последовательности SEQ ID NO. 8 за пределами последовательностей, соответствующих этим CDRs, т.е. SEQ ID NO. 4, 5 и 6.

Еще один вариант осуществления изобретения относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичной SEQ ID NO. 7; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 4, 5 и 6 или любую последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную последовательностям SEQ ID NO. 4, 5 и 6.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности SEQ ID NO.7, и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 4, 5 и 6.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 7.

Под «любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 7» также понимают последовательность, имеющую три CDR легкой цепи с SEQ ID NO. 1, 2 и 3 и, кроме того, по меньшей мере на 80% идентичную полной последовательности SEQ ID NO. 7 за пределами последовательностей, соответствующих этим CDRs, т.е. SEQ ID NO. 1, 2 и 3.

Другой вариант осуществления изобретения относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичной SEQ ID NO. 7, и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной SEQ ID NO. 8.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент включает вариабельный домен легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 7 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 7, и вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO. 8 или любой последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID NO. 8.

Для большей ясности ниже в таблице 3 приведены разные аминокислотные последовательности, соответствующие антиген-связывающему белку согласно изобретению (Mu. = мышиный).

Специфический аспект настоящего изобретения относится к мышиному антителу или к полученным из него соединениям или антиген-связывающим фрагментам, отличающимся тем, что указанное антитело содержит также константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела организма, гетерологичного мыши по видовой принадлежности, в частности, человека.

Другой специфический аспект настоящего изобретения относится к химерному антителу или к полученным из него соединениям или антиген-связывающим фрагментам, отличающимся тем, что антитело также содержит константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела организма, гетерологичного мыши по видовой принадлежности, в частности, человека.

Еще один специфический аспект настоящего изобретения относится к гуманизированному антителу или к полученным из него соединениям или антиген-связывающим фрагментам, отличающимся тем, что константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела человека, представляют собой, соответственно, лямбда или каппа области и гамма-1, гамма-2 или гамма-4 области.

Другим аспектом изобретения является антиген-связывающий белок, состоящий из моноклонального антитела 1613F12, полученного из гибридомы I-4505, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Франция, 28 июля 2011 г., или его антиген-связывающего фрагмента.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать антиген-связывающий белок согласно изобретению, в частности, гибридоме мышиного происхождения, поданной во французскую коллекцию культур микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция) 28 июля 2011 г. под номером I-4505. Указанная гибридома была получена путем слияния спленоцитов/лимфоцитов иммунизированных мышей линии BaIb/C и клеток миеломы клеточной линии Sp 2/O-Ag 14.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать антитело, содержащее три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 1, 2 и 3; и три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID NO. 4, 5 и 6, причем указанная гибридома депонирована в CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция, 28 июля 2011 г. под номером I-4505. Указанная гибридома была получена путем слияния спленоцитов/лимфоцитов иммунизированных мышей линии BaIb/C и клеток миеломы клеточной линии Sp 2/O-Ag 14.

Объектом настоящего изобретения является мышиная гибридома I-4505, депонированная в CNCM, Институт Пастера, Франция, 28 июля 2011 г.

Антиген-связывающий белок согласно настоящему изобретению также включает химерные или гуманизированные антитела.

Химерное антитело является антителом, которое содержит природные вариабельные области (легкой цепи и тяжелой цепи), полученные из антитела одного вида, в сочетании с константными областями легкой цепи и тяжелой цепи антитела вида, гетерологичного по отношению к указанному виду.

Антитела или их химерные фрагменты могут быть получены с помощью методик рекомбинантной генетики. Например, химерное антитело может быть получено путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область нечеловекообразного моноклонального антитела согласно изобретению, в частности, антитела мыши, а также последовательность, кодирующую константную область антитела человека. Химерное антитело в соответствии с изобретением, кодируемое одним таким рекомбинантным геном, может представлять собой, например, химеру мышь-человек, причем специфичность этого антитела определяется вариабельной областью, полученной из ДНК мыши, а его изотип определяется константной областью, полученной из ДНК человека. Способы получения химерных антител см. Verhoeyn etal. (BioEssays, 8:74, 1988).

В другом аспекте изобретение раскрывает связывающий белок, который состоит из химерного антитела.

В особенно предпочтительном варианте осуществления химерное антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно изобретению содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 7, и содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 8.

В еще одном аспекте изобретение раскрывает связывающий белок, который состоит из гуманизированного антитела.

«Гуманизированное антитело» означает антитело, которое содержит участки CDR, полученные из антитела нечеловеческого происхождения, причем другие части молекулы антитела являются производными от одного (или нескольких) антител человека. Кроме того, чтобы сохранить аффинность связывания, могут быть изменены некоторые из остатков каркасного участка (называемого FR) (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Гуманизированные антитела согласно изобретению или их фрагменты могут быть получены известными специалисту в данной области способами (такими, например, как способы, которые описаны в документах Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain etal., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; и Bebbington et al., ВюЯесппоюду, 10:169-175, 1992). Такие гуманизированные антитела являются предпочтительными для их использования в способах, включающих диагностику in vitro или профилактическое и/или терапевтическое лечение in vivo. Другие методы гуманизации, также известные специалисту в данной области, такие, например, как методика «CDR-прививки», описаны PDL в патентах ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0566647 или US 5530101, US 6180370, US 5585089 и US 5693761. Также можно упомянуть патенты США 5639641 или 6054297, 5886152 и 5877293.

Кроме того, изобретение также относится к гуманизированным антителам, происходящим из мышиных антител, описанных выше.

В предпочтительном варианте осуществления константные области легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из антитела человека, представляют собой, соответственно, лямбда или каппа и гамма-1, гамма-2-или гамма-4 области.

Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, отличающейся тем, что она выбрана из следующих нуклеиновых кислот (включая любые варианты, вызванные вырожденностью генетического кода):

a) нуклеиновая кислота, кодирующая антиген-связывающий белок или его антиген-связывающий фрагмент согласно изобретению;

b) нуклеиновая кислота, включающая:

- нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ IDNO. 15-28, или

- нуклеотидную последовательность, содержащую шесть нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO. 15-20, или

- нуклеотидную последовательность, содержащую две нуклеотидные последовательности SEQ ID NO. 21, 22;

c) нуклеиновая кислота, комплементарная нуклеиновой кислоте, определенной в а) или Ь); и

d) нуклеиновая кислота, которая предпочтительно имеет по меньшей мере 18 нуклеотидов, способная к гибридизации в очень жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, определенной в частях а) или b), либо с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичной после оптимального выравнивания нуклеотидной последовательности, определенной в частях а) или b).

В таблице 4 ниже приведены различные нуклеотидные последовательности, относящиеся к связывающему белку согласно изобретению (Mu. = мышиный).

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность», «нуклеотидная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, означают точную последовательность нуклеотидов, модифицированных или немодифицированных, которая определяет фрагмент или область нуклеиновой кислоты, содержит неприродные или природные нуклеотиды и представляет собой либо двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК, либо продукты транскрипции указанных ДНК.

Последовательности настоящего изобретения были выделены и/или очищены, то есть они были отобраны прямо или косвенно, например, путем копирования, причем их окружение было по меньшей мере частично изменено. Также здесь следует упомянуть выделенные нуклеиновые кислоты, полученные с помощью рекомбинантной генетики, например, посредством клеток-хозяев, или полученные путем химического синтеза.

«Нуклеиновые последовательности, процент идентичности предпочтительной последовательности которых составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% после оптимального выравнивания» означают нуклеиновые последовательности, демонстрирующие относительно нуклеиновой последовательности сравнения определенные модификации, такие как, в частности, делецию, усечение, удлинение, химерное слияние и/или замену, в частности, точечную замену. Предпочтительно, чтобы это были последовательности, которые кодируют те же аминокислотные последовательности, что и последовательность сравнения, причем это относится к вырожденности генетического кода, или комплементарные последовательности, которые могут гибридизоваться специфически с последовательностями сравнения, предпочтительно в очень жестких условиях, в частности в таких условиях, которые определены ниже.

Гибридизация в очень жестких условиях означает, что условия, относящиеся к температуре и ионной силе, выбраны таким образом, что они позволяют поддерживать гибридизацию между двумя комплементарными фрагментами ДНК. Только в качестве иллюстрации, очень жесткие условия стадии гибридизации с целью определения полинуклеотидных фрагментов, описанных выше, предпочтительно являются следующими.

ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизацию осуществляют в два этапа: (1) предгибридизация при 42°С в течение трех часов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,5), содержащем 5Х SSC (1Х SSC соответствует раствору 0,15 М NaCl+0,015 М цитрата натрия), 50% формамида, 7% додецилсульфата натрия (SDS), 10Х раствора Денхардта, 5% сульфата декстрана и 1% ДНК спермы лосося; (2) первичная гибридизация в течение 20 часов при температуре, зависящей от длины зонда (то есть 42°С для зонда >100 нуклеотидов в длину) с последующими двумя 20-минутными промывками при температуре 20°С в 2Х SSC+2% SDS, одной 20-минутной промывкой при 20°С в 0,1Х SSC+0,1% SDS. Последнюю промывку выполняют в 0,1 X SSC+0,1% SDS в течение 30 минут при 60°С для зонда >100 нуклеотидов в длину. Очень жесткие условия гибридизации, описанные выше для полинуклеотида определенного размера, могут быть адаптированы специалистом в данной области для более длинных или более коротких олигонуклеотидов по методикам, описанным в Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).

Кроме того, изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, раскрытую в изобретении.

Особенно изобретение нацелено на векторы клонирования и/или экспрессии, которые содержат такую нуклеотидную последовательность.

Векторы согласно изобретению предпочтительно содержат элементы, которые делают возможной экспрессию и/или секрецию нуклеотидных последовательностей в данной клетке-хозяине. Вектор, таким образом, должен содержать промотор, сигналы инициации и терминации трансляции, а также подходящие участки регуляции транскрипции. Он должен обладать способностью сохранять стабильность в клетке-хозяине и необязательно может иметь специфические сигналы, которые направляют секрецию транслируемого белка. Эти различные элементы выбираются и оптимизируются специалистом в данной области в зависимости от используемой клетки-хозяина. Для этой цели нуклеотидные последовательности могут быть вставлены в самореплицирующиеся векторы внутри выбранного хозяина или могут быть интегративными векторами выбранного хозяина.

Такие векторы получают способами, обычно используемыми специалистами в данной области, и полученные клоны могут быть введены в подходящего хозяина с помощью стандартных методов, таких как липофекция, электропорация, тепловой шок или химические методы.

Векторы представляют собой, например, плазмидные векторы или векторы вирусного происхождения. Они используются для трансформации клеток-хозяев, чтобы клонировать или экспрессировать нуклеотидные последовательности согласно изобретению.

Изобретение также включает выделенные клетки-хозяева, трансформированные или содержащие вектор, раскрытый в настоящем изобретении.

Клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических систем, таких, например, как бактериальные клетки, но также могут использоваться дрожжевые клетки или клетки животных, в особенности клетки млекопитающих (за исключением человека). Также могут быть использованы клетки насекомых или растений.

Изобретение также относится к животным, за исключением человека, которые имеют трансформированные клетки в соответствии с изобретением.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения антиген-связывающего белка согласно изобретению или его антиген-связывающего фрагмента, отличающемуся тем, что указанный способ включает следующие стадии:

a) культивирование в среде с подходящими условиями культивирования для клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением; и

b) выделение антиген-связывающего белка или одного из его антиген-связывающих фрагментов, полученных таким образом, из среды для культивирования или из указанных культивируемых клеток.

Трансформированные клетки в соответствии с изобретением находят применение в способах получения рекомбинантных антиген-связывающих белков согласно изобретению. Способы получения антиген-связывающих белков согласно изобретению в рекомбинантной форме, отличающиеся тем, что в указанных способах используют вектор и/или клетку, трансформированную вектором согласно изобретению, также включены в настоящее изобретение. Предпочтительно, клетку, трансформированную вектором согласно изобретению, культивируют в условиях, в которых возможна экспрессия вышеуказанного антиген-связывающего белка и выделение указанного рекомбинантного белка.

Как уже упоминалось, клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических клеток. В частности, можно идентифицировать нуклеотидные последовательности согласно изобретению, которые облегчают секрецию в таких прокариотических или эукариотических системах. Вектор согласно изобретению, несущий такую последовательность, таким образом может использоваться предпочтительно для получения секретируемых рекомбинантных белков. Действительно, очистка этих рекомбинантных белков, представляющих интерес, будет упрощена вследствие того, что они присутствуют в супернатанте клеточной культуры, а не внутри клеток-хозяев.

Антиген-связывающий белок согласно изобретению также может быть получен путем химического синтеза. Один из таких способов получения также является объектом настоящего изобретения. Специалистам в данной области известны способы химического синтеза, такие как твердофазные методики (см., в частности, Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., pp 71-95) или частично твердофазные методики, путем конденсации фрагментов или путем обычного синтеза в растворе. Полипептиды, полученные путем химического синтеза, которые могут содержать соответствующие аминокислоты неприродного происхождения, также включены в изобретение.

Антиген-связывающий белок или его антиген-связывающие фрагменты, которые могут быть получены способом согласно настоящему изобретению, также включены в настоящее изобретение.

Согласно частному аспекту изобретение относится к антиген-связывающему белку или его антиген-связывающему фрагменту, как описано выше, для применения в качестве продукта для адресной доставки цитотоксического агента к сайту-мишени хозяина, где сайт-мишень хозяина состоит из эпитопа, локализованного во внеклеточном домене белка Axl, предпочтительно, внеклеточном домене белка Axl человека, более предпочтительно, внеклеточном домене белка Axl человека, имеющем последовательность SEQ ID NO. 31 или 32 или ее встречающийся в природе вариант.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный сайт-мишень хозяина является сайтом-мишенью клетки млекопитающего, более предпочтительно, клетки человека, более предпочтительно, клеток, которые естественным образом или путем генетической рекомбинации экспрессируют белок Axl.

Изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антиген-связывающий белок, раскрытый в настоящем описании, конъюгированный с цитотоксическим агентом.

В контексте настоящего изобретения термин «иммуноконъюгат» или «иммуно-конъюгат» относится в основном к соединению, содержащему по меньшей мере продукт для адресной доставки, физически связанный с одним или более терапевтическим(и) агентом(ами), создавая таким образом высоконаправленное соединение.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие терапевтические агенты состоят из цитотоксических агентов.

Под «цитотоксическим агентом» или «цитотоксином» понимают агент, который, будучи введенным субъекту, лечит или предотвращает развитие пролиферации клеток, предпочтительно, распространение рака в организме субъекта, ингибируя или предотвращая клеточное функционирование и/или вызывая гибель клеток.

Было выделено или синтезировано множество цитотоксических агентов, чтобы сделать возможным ингибирование пролиферации клеток или уничтожение или уменьшение количества опухолевых клеток, если не окончательно, то, по крайней мере, значительно. Тем не менее, токсическая активность этих агентов не ограничивается опухолевыми клетками, и неопухолевые клетки также подвергаются воздействию и могут быть уничтожены. В частности, побочные эффекты наблюдаются на быстро обновляющихся клетках, таких как гематопоэтические клетки или клетки эпителия, в частности, слизистых оболочек. В качестве иллюстрации можно привести клетки желудочно-кишечного тракта, которые подвергаются сильному воздействию при использовании таких цитотоксических агентов.

Одной из задач настоящего изобретения является также обеспечение цитотоксического агента, который позволяет ограничить побочные эффекты для нормальных клеток, сохраняя в то же время высокую цитотоксичность для опухолевых клеток.

В частности, цитотоксический агент может предпочтительно состоять, без ограничения, из лекарственного средства (т.е. «конъюгата антитело-лекарственное средство»), токсина (т.е. «иммунотоксина» или «конъюгата антитело-токсин»), радиоизотопа (т.е. «радиоиммуноконъюгата» или «конъюгата антитело-радиоизотоп») и т.д.

В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат состоит из связывающего белка, связанного по меньшей мере с лекарственным средством или медикаментом. Когда связывающий белок представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, такой иммуноконъюгат называется конъюгат антитело-лекарственное средство (или «ADC»).

В первом варианте осуществления такие лекарственные средства могут быть раскрыты в зависимости от способа их действия. В качестве неограничивающего примера можно привести алкилирующие агенты, такие как азотистый иприт, алкилсульфонаты, нитрозомочевина, оксазофорины, азиридины или иминэтилены, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы митоза, ингибиторы функций хроматина, противоангиогенные агенты, антиэстрогены, антиандрогены, хелатирующие агенты, стимуляторы поглощения железа, ингибиторы циклооксигеназы, ингибиторы фосфодиэстеразы, ингибиторы ДНК, ингибиторы синтеза ДНК, стимуляторы апоптоза, ингибиторы синтеза тимидилата, ингибиторы Т-клеток, агонисты интерферона, ингибиторы рибонуклеозид-трифосфат-редуктазы, ингибиторы ароматазы, антагонисты рецептора эстрогена, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы клеточного цикла, таксаны, ингибиторы тубулина, ингибиторы ангиогенеза, стимуляторы макрофагов, антагонисты рецептора нейрокинина, агонисты каннабиноидных рецепторов, агонисты дофаминовых рецепторов, агонисты фактора, стимулирующего гранулоциты, агонисты рецептора эритропоэтина, агонисты рецептора соматостатина, агонисты LHRH, сенсибилизаторы кальция, антагонисты VEGF рецепторов, антагонисты рецепторов интерлейкина, ингибиторы остеокластов, стимуляторы образования радикалов, антагонисты рецепторов эндотелина, алкалоид барвинка, антигормоны или иммуномодуляторы или любое другое новое лекарственное средство, которое соответствует критериям активности цитотоксического агента или токсина.

Такие лекарственные средства приведены, например, в VIDAL 2010 на странице, посвященной соединениям, отнесенным к онкологической и гематологической рубрике «Цитотоксические агенты», эти цитотоксические соединения, приведенные со ссылкой на этот документ, рассматриваются в настоящем документе в качестве предпочтительных цитотоксических агентов.

В частности, без ограничения, следующие лекарственные средства являются предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением: мехлорэтамин, хлорамбукол, мелфалан хлоргидрат, пипоброман, преднимустин, динатрийфосфат, эстрамустин, циклофосфамид, алтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид, ифосфамид, тиотепа, триэтиленамин, алтретамин, кармустин, стрептозоцин, фотемустин, ломустин, бусульфан, треосульфан, импросульфан, дакарбазин, цисплатин, оксалиплатин, лобаплатин, гептаплатин, мириплатина гидрат, карбоплатин, метотрексат, пеметрексед, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозинарабинозид, 6-меркаптопурин (6-МР), неларабин, 6-тиогуанин (6-TG), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, дезоксикоформицин, тегафур, пентостатин, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, вальрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин, прокарбазин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, топотекан, иринотекан, этопозид, валрубицин, амрубицина гидрохлорид, пирарубицин, эллиптиниум ацетат, зорубицин, эпирубицин, идарубицин и тенипозид, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023A, галофугинон, COL-3, неовастат, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, интерферон-альфа, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол, экземестан, флутамид, нилутамид, спиронолактон, ципротерона ацетат, финастерид, цимитидин, бортезомиб, Велкейд, бикалутамид, ципротерон, флутамид, фулвестрант, эксеместан, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, нилотиниб, сорафениб, сунитиниб, ретиноид, рексиноид, метоксален, метиламинолевулинат, альдеслейкин, ОСТ-43, денилейкин дифлитокс, интерлейкин-2, тазонермин, лентинан, сизофилан, рохинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли I:C, прокодазол, Tic BCG, Corynebacterium parvum, NOV-002, украин, левамизол, 1311-chTNT, Н-101, целмолейкин, интерферон альфа 2а, интерферон альфа 2b, интерферон гамма 1а, интерлейкин-2, мобенакин, Rexin-G, тецелейкин, акларубицин, актиномицин, арглабин, аспарагиназа, карзинофилин, хромомицин, дауномицин, лейковорин, мазопрокол, неокарциностатин, пепломицин, саркомицин, соламаргин, трабектедин, стрептозоцин, тестостерон, кунекатехины, синекатехины, алитретиноин, белотекана гидрохлорид, калустерон, дромостанолон, эллиптиниум ацетат, этинилэстрадиол, этопозид, флуоксиместерон, форместан, фосфэстрол, гозерелина ацетат, гексиламинолевулинат, гистрелин, гидроксипрогестерон, иксабепилон, лейпролид, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, милтефозин, митобронитол, нандролона фенилпропионат, норэтиндрона ацетат, преднизолон, преднизон, темсиролимус, тестолактон, триамцинолон, трипторелин, вапреотида ацетат, зиностатин стималамер, амсакрин, триоксид мышьяка, бисантрена гидрохлорид, хлорамбуцил, хлортрианизен, цис-диаминдихлорплатина, циклофосфамид, диэтилстилбестрол, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, леналидомид, лонидамин, мехлорэтамин, митотан, недаплатин, нимустина гидрохлорид, памидронат, пипоброман, порфимер натрия, ранимустин, разоксан, семустин, собузоксан, мезилат, триэтиленмеламин, золедроновая кислота, камостат мезилат, фадрозол HCl, нафоксидин, аминоглутетимид, кармофур, клофарабин, цитозинарабинозид, децитабин, доксифлуридин, эноцитабин, флударабина фосфат, фторурацил, фторафур, урамустин, абареликс, бексаротен, ралтитрексед, тамибаротен, темозоломид, вориностат, мегестрол, динатрий клодронат, левамизол, ферумокситол, изомальтозид железа, целекоксиб, ибудиласт, бендамустин, алтретамин, митолактол, темсиролимус, пралатрексат, TS-1, децитабин, бикалутамид, флутамид, летрозол, динатрия клодронат, дегареликс, торемифена цитрат, гистамина дигидрохлорид, DW-166HC, интракаин, децитабин, иринотекана гидрохлорид, амсакрин, ромидепсин, третиноин, кабазитаксел, вандетаниб, леналидомид, ибандроновая кислота, милтефозин, витеспен, мифамуртид, надропарин, гранисетрон, ондансетрон, трописетрон, ализаприд, рамосетрон, доласетрона мезилат, фосапрепитант димеглюмин, набилон, апрепитант, дронабинол, TY-10721, лизурида гидромалеат, эпицерам, дефибротид, дабигатран этексилат, филграстим, пэгфилграстим, редитукс, эпоэтин, молграмостим, опрелвекин, сипулейцел-Т, M-Vax, ацетил L-карнитин, донепезила гидрохлорид, 5-аминолевулиновая кислота, метиламинолевулинат, цетрореликса ацетат, икодекстрин, лейпрорелин, метилфенидат, октреотид, амлексанокс, плериксафор, менатетренон, анетол дитиолетион, доксеркальциферол, цинакальцета гидрохлорид, алефацепт, ромиплостим, тимоглобулин, тималфазин, убенимекс, имиквимод, эверолимус, сиролимус, Н-101, лазофоксифен, трилостан, инкадронат, ганглиозиды, октанатрия пегаптаниб, вертепорфин, минодроновая кислота, золедроновая кислота, нитрат галлия, алендронат натрия, этидронат динатрия, динатрия памидронат, дутастерид, натрия стибоглюконат, армодафинил, дексразоксан, амифостин, WF-10, темопорфин, дарбэпоэтин альфа, анцестим, сарграмостим, палифермин, R-744, непидермин, опрелвекин, денилейкин дифтитокс, крисантаспаза, бузерелин, деслорелин, ланреотид, октреотид, пилокарпин, босентан, калихеамицин, майтанзиноиды и циклоникат.

За более подробной информацией специалист в данной области может обратиться к руководству, изданному «Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique» под названием «traite de chimie therapeutique, vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003».

Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат состоит из связывающего белка, связанного по меньшей мере с радиоактивным изотопом. Когда связывающий белок представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, такой иммуноконъюгат называется конъюгат антитело-радиоизотоп (или «ARC»).

Для селективного разрушения опухоли антитело может содержать высокорадиоактивный атом. Для получения ARC доступно множество радиоактивных изотопов, таких как, без ограничения, At²¹¹, С¹³, N¹⁵, О¹⁷, F¹⁹, I¹²³, I¹³¹, I¹²⁵, In¹¹¹, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Тс⁹⁹, Bi²¹², P³², Pb²¹², радиоактивные изотопы Lu, гадолиния, марганца или железа.

Чтобы включить такой радиоизотоп в ARC, могут быть использованы любые методы или процессы, известные специалисту в данной области (см., например, «Monoclonal Antibodies in lmmunoscintigraphy», Chatal, CRC Press 1989). В качестве неограничивающего примера, Tc⁹⁹m или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ и In¹¹¹ могут быть присоединены через остаток цистеина. Y⁹⁰ может быть присоединен через остаток лизина. I¹²³ может быть присоединен с помощью метода IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57).

Чтобы проиллюстрировать знания специалиста в области ARC, можно привести несколько примеров, таких как Zevalin^®, который представляет собой ARC, состоящий из моноклонального антитела против CD20 и изотопа In¹¹¹ или Y⁹⁰, связанного через линкер-хелатор из тиомочевины (Wiseman et at (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et at (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69), или Mylotarg^®, который состоит из антитела против CD33, связанного с калихеамицином (US 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Можно также упомянуть ADC, называемый Adcetris (соответствующий Brentuximab vedotin), который недавно был одобрен FDA для лечения лимфомы Ходжкина (Nature, vol. 476, pp. 380-381, 25 августа 2011 г.).

В третьем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат состоит из связывающего белка, соединенного по меньшей мере с токсином. Когда связывающий белок представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, такой иммуноконъюгат называется конъюгатом антитело-токсин (или «АТС»).

Токсины являются эффективными и специфическими ядами, производимыми живыми организмами. Обычно они состоят из цепи аминокислот, которая может иметь молекулярную массу от пары сотен (пептиды) до ста тысяч (белки). Они также могут быть низкомолекулярными органическими соединениями. Токсины производятся многочисленными организмами, например, бактериями, грибами, водорослями и растениями. Многие из них очень ядовиты, обладая токсичностью, которая на несколько порядков превышает токсичность нервно* паралитических веществ.

Токсины, используемые в АТС, могут включать, без ограничения, все виды токсинов, которые могут оказывать свое цитотоксическое действие Посредством таких механизмов как связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор из momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.

В настоящем документе также предусмотрены низкомолекулярные токсины, такие как доластатины, ауристатины, трихотецены и СС1065, и производные этих токсинов, которые имеют активность токсина. Показано, что доластатины и ауристатины препятствуют динамике микротрубочек, гидролизу ГТФ и делению ядер и клеток и имеют противоопухолевое и противогрибковое действие.

«Линкер», «линкерный сегмент» или «связь» означает химическую группу, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которая ковалентно присоединяет связывающий белок к по меньшей мере одному цитотоксическому агенту.

Линкеры могут быть получены с использованием множества бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-L-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Меченая углеродом-14 L-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации цитотоксических агентов с системой адресной доставки. Другими реагентами для кросс-сшивания могут быть BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, III., USA).

Линкер может быть «не расщепляемым» или «расщепляемым».

В предпочтительном варианте он представляет собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического агента в клетке. Например, может быть использован кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер. В предпочтительном варианте линкер расщепляется внутри клетки, так что расщепление линкера освобождает цитотоксический агент от связывающего белка во внутриклеточной среде.

Например, в некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется с помощью расщепляющего агента, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в лизосомах, или эндосомах, или кавеолах). Линкер может представлять собой, например, пептидный линкер, который расщепляется внутриклеточной пептидазой или ферментом протеазой, включая, без ограничения, лизосомальную или эндосомальную протеазу. Как правило, пептидный линкер имеет по меньшей мере две аминокислоты в длину или по меньшей мере три аминокислоты в длину. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, которые, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней. Например, может быть использован пептидный линкер, который расщепляется тиол-зависимой протеазой катепсином-В, которая экспрессируется на высоком уровне в раковой ткани (например, Phe-Leu или линкер Gly-Phe-Leu-Gly). В отдельно взятых вариантах осуществления пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой линкер Val-Cit или линкер Phe-Lys. Одним из преимуществ использования внутриклеточного протеолитического высвобождения цитотоксического агента является то, что агент, как правило, ослаблен при конъюгации, и стабильность конъюгатов в сыворотке, как правило, является высокой.

В других вариантах осуществления расщепляемый линкер является рН-чувствительным, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Обычно рН-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Например, может быть использован кислотолабильный линкер, который гидролизуется в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь или тому подобное). Такие линкеры относительно стабильны при нейтральных значениях рН, например, в таких условиях, как кровь, но нестабильны при рН ниже 5,5 или 5,0, приблизительно соответствующем рН лизосомы. В некоторых вариантах осуществления гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, прикрепленный к терапевтическому агенту через ацилгидразоновую связь).

В других вариантах осуществления линкер расщепляется в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). В данной области известно множество дисульфидных линкеров, в том числе, например, линкеры, которые могут быть образованы с использованием SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)толуол), SPDB и SMPT.

В качестве неограничивающего примера нерасщепляемых или «не восстанавливающихся» линкеров можно привести иммуноконъюгат Trastuzumab-DM1 (TDM1), который сочетает трастузумаб со связанным химиотерапевтическим агентом майтансином (Cancer Research 2008; 68: (22). 15 ноября 2008 г.).

В предпочтительном варианте осуществления иммуноконъюгат согласно изобретению может быть получен любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, без ограничения, i) реакция нуклеофильной группы антиген-связывающего белка с бивалентным линкерным реагентом с последующей реакцией с цитотоксическим агентом или ii) реакция нуклеофильной группы цитотоксического агента с бивалентным линкерным реагентом с последующей реакцией с нуклеофильной группой антиген-связывающего белка.

Нуклеофильные группы антиген-связывающего белка включают, без ограничения, N-концевые аминогруппы, аминогруппы боковой цепи, например, аминогруппу боковой цепи лизина, тиольные группы боковой цепи и гидроксильные или аминогруппы Сахаров, если антиген-связывающий белок гликозилирован. Аминные, тиольные и гидроксильные группы являются нуклеофильными группами и способны вступать в реакцию с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных фрагментах и линкерных реагентах, включающими, без ограничения, активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Антиген-связывающий белок может иметь восстанавливаемые межцепочечные дисульфидные связи, т.е. цистеиновые мостики. Антиген-связывающие белки могут быть подготовлены к реакции соединения с линкерными реагентами путем обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотреитол). Теоретически, каждый цистеиновый мостик будет таким образом образовывать два активных тиольных нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы могут быть введены в антиген-связывающий белок любой реакцией, известной специалисту в данной области. В качестве неограничивающего примера, активные тиольные группы могут быть введены в антиген-связывающий белок путем введения одного или нескольких остатков цистеина.

Иммуноконъюгаты также могут быть получены путем модификации антиген-связывающего белка введением электрофильных групп, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями линкерного реагента или цитотоксического агента. Сахара гликозилированного антиген-связывающего белка могут быть окислены с образованием альдегидных или кетонных групп, которые могут реагировать с аминогруппой линкерного реагента или цитотоксического агента. Полученные в результате иминные группы - основания Шиффа - могут образовывать стабильную связь или могут быть восстановлены с образованием стабильных аминных связей. В одном варианте осуществления реакция углеводной части гликозилированного антиген-связывающего белка либо с галактозоксидазой, либо с метапериодатом натрия может дать карбонильные (альдегидные и кетонные) группы в белке, которые могут реагировать с соответствующими группами лекарственного средства. В другом варианте осуществления белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут реагировать с метапериодатом натрия, в результате чего на месте первой аминокислоты образуется альдегид.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления линкерный сегмент может иметь следующую общую формулу:

где:

-Т- представляет собой удлиняющий сегмент;

а представляет собой 0 или 1;

-W- представляет собой аминокислотный сегмент;

w независимо представляет собой целое число от 1 до 12;

-Y- представляет собой спейсерный сегмент;

у представляет собой 0, 1 или 2.

Удлиняющий сегмент (-Т-), если он присутствует, связывает антиген-связывающий белок с аминокислотным сегментом (-W-). Полезные функциональные группы, которые могут присутствовать на антиген-связывающем белке естественным образом или вследствие химической манипуляции, включают сульфгидрильные, амино, гидроксильные, аномерные гидроксильные группы углеводов и карбоксильные группы. Подходящими функциональными группами являются сульфгидрильная группа и аминогруппа. Сульфгидрильные группы могут быть получены путем восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей антиген-связывающего белка, если такие связи присутствуют. Кроме того, сульфгидрильные группы могут быть получены с помощью реакции аминогруппы лизина антиген-связывающего белка с 2-иминотиоланом или другими образующими сульфгидрильные группы реагентами. В конкретных вариантах осуществления антиген-связывающий белок является рекомбинантным антителом и сконструирован так, чтобы иметь один или несколько лизинов. Более предпочтительно, антиген-связывающий белок может быть сконструирован таким образом, чтобы иметь один или несколько цистеинов (см. ThioMabs).

В некоторых конкретных вариантах осуществления удлиняющий сегмент образует связь с атомом серы антиген-связывающего белка. Атом серы может быть получен из сульфгидрильной (-SH) группы восстановленного антиген-связывающего белка.

В некоторых других конкретных вариантах осуществления удлиняющий сегмент связан с антиген-связывающим белком через дисульфидную связь между атомом серы антиген-связывающего белка и атомом серы удлиняющего сегмента.

В других конкретных вариантах осуществления реакционноспособная группа удлиняющего сегмента содержит реакционноспособный центр, который может реагировать с аминогруппой антиген-связывающего белка. Аминогруппа может быть аргинином или лизином. Подходящие реакционноспособные в отношении аминов центры включают, без ограничения, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные эфиры, 4-нитрофениловые эфиры, пентафторфениловые эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты.

В еще одном аспекте реакционноспособная группа удлиняющего сегмента содержит реакционноспособный центр, который реагирует с модифицированной углеводной группой, которая может присутствовать на антиген-связывающем белке. В конкретном варианте осуществления антиген-связывающий белок ферментативно гликозилирован, чтобы обеспечить присутствие углеводной части (следует отметить, что, когда антиген-связывающий белок представляет собой антитело, указанное антитело, как правило, природно гликозилировано). Углевод может быть мягко окислен реагентом, таким как периодат натрия, и полученный карбонильный сегмент окисленного углевода может быть конденсирован с удлиняющим сегментом, который содержит функциональную группу, такую как гидразид, оксим, реакционноспособный амин, гидразин, тиосемикарбазид, гидразинкарбоксилат или арилгидразид.

Аминокислотный сегмент (-W-) связывает удлиняющий сегмент (-Т-) со спейсерным сегментом (-Y-), если спейсерный сегмент присутствует, и связывает удлиняющий сегмент с цитотоксическим агентом, если спейсерный сегмент отсутствует.

Как указано выше, -Ww- может быть дипептидом, трипептидом, тетрапептидом, пентапептидом, гексапептидом, гептапептидом, октапептидом, нонапептидом, декапептидом, ундекапептидом или додекапептидом.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотный сегмент может содержать аминокислотные остатки, такие как, без ограничения, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, защищенный ацетильной или формильной группами лизин, аргинин, защищенный тозильной или нитрогруппой аргинин, гистидин, орнитин, защищенный ацетильной или формильной группами орнитин и цитруллин. Примеры компонентов аминокислотного линкера включают, предпочтительно, дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид.

Примеры дипептидов включают: Val-Cit, Ala-Val, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg.

Примеры трипептидов включают: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

Примеры тетрапептидов включают: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 33), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO. 34).

Примеры пентапептидов включают: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO. 35).

Аминокислотные остатки, которые составляют аминокислотный компонент линкера, включают встречающиеся в природе, а также редкие аминокислоты и неприродные аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Аминокислотные компоненты линкера могут быть разработаны и оптимизированы по их селективности в отношении ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином В, С и D или протеазой плазмином.

Чтобы освободить цитотоксический агент, аминокислотный сегмент линкера может ферментативно расщепляться ферментом, в том числе ассоциированной с опухолью протеазой, но не ограничиваясь ею.

Аминокислотный сегмент может быть разработан и оптимизирован по его селективности в отношении ферментативного расщепления конкретной ассоциированной с опухолью протеазой. Подходящими сегментами являются такие сегменты, расщепление которых катализируется протеазами, катепсином В, С и D, и плазмином.

Спейсерный сегмент (-Y-), если присутствует, связывает аминокислотный сегмент с цитотоксическим агентом. Спейсерные сегменты подразделяются на два основных типа: самоотщепляющиеся и несамоотщепляющиеся. Несамоотщепляющимся спейсерным сегментом является такой спейсерный сегмент, при использовании которого часть спейсерного сегмента или весь спейсерный сегмент остается связанным с цитотоксическим агентом после ферментативного расщепления аминокислотного сегмента иммуноконъюгата. Примеры несамоотщепляющегося спейсерного сегмента включают, но не ограничиваются ими, спейсерный сегмент (глицин-глицин) и спейсерный сегмент глицин. Чтобы высвободить цитотоксический агент, в клетке-мишени должна происходить независимая реакция гидролиза для разрыва связи глицин-лекарственный препарат.

В другом варианте несамоотщепляющимся спейсерным сегментом (-Y-) является -Gly-.

В одном варианте осуществления в иммуноконъюгате отсутствует спейсерный сегмент (у=0). Кроме того, иммуноконъюгат, содержащий самоотщепляющийся спейсерный сегмент, может высвободить цитотоксический агент без необходимости в отдельной стадии гидролиза. В этих вариантах осуществления -Y- является сегментом п-аминобензилового спирта (РАВ), который связан с -Ww- через атом азота РАВ группы и соединен непосредственно с -D через карбонатную, карбаматную или эфирную группу.

Другие примеры самоотщепляющихся спейсеров включают ароматические соединения, которые изоэлектронны РАВ группе, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола и орто- или пара-аминобензилацетали, но не ограничиваются ими. Могут быть использованы спейсеры, которые легко подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты, соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] циклические системы и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты.

В альтернативном варианте осуществления спейсерный сегмент представляет собой разветвленный бис(гидроксиметил)стирол (BHMS), который может быть использован для включения дополнительных цитотоксических агентов.

Наконец, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, описанному выше, для применения при лечении рака.

Рак может быть предпочтительно выбран из раковых заболеваний, связанных с Axl, включая опухолевые клетки, экспрессирующие или сверхэкспрессирующие весь белок Axl или его часть на своей поверхности.

В частности, указанный рак является раком груди, раком толстой кишки, раком пищевода, гепатоцеллюлярной карциномой, раком желудка, глиомой, раком легких, меланомой, остеосаркомой, раком яичников, раком предстательной железы, рабдомиосаркомой, раком почки, раком щитовидной железы, эндометриальным раком и любым раком, устойчивым к лекарствам. Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат, описанный в настоящем документе.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат согласно изобретению и по меньшей мере эксципиент и/или фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем описании выражение «фармацевтически приемлемый носитель» или «эксципиент» означает соединение или комбинацию соединений, входящих в фармацевтическую композицию, не провоцирующих побочные реакции и обеспечивающих, например, облегчение введения активного(ых) соединения(ий), повышение продолжительности его активности и/или его эффективности в организме, увеличение его растворимости в растворе либо улучшение его хранения. Эти фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны и будут адаптированы специалистом в данной области в зависимости от природы и от способа введения выбранного(ых) активного(ых) соединения(ий).

Иммуноконъюгаты согласно изобретению предпочтительно вводить системным путем, в частности, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно или подкожно, или пероральным путем. Более предпочтительно, если композиция, содержащая иммуноконъюгаты в соответствии с изобретением, будет вводиться несколько раз последовательно.

Способы введения, дозировка и оптимальные лекарственные формы могут быть определены в соответствии с критериями, обычно учитываемыми при назначении лечения, подобранного для пациента, например, с учетом возраста или массы тела пациента, серьезности его/ее общего состояния, переносимости лечения и отмеченных побочных эффектов.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения раскрываются в продолжении описания, включающем примеры и фигуры, краткое описание к которым представлено ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: Анализ цитотоксичности in vitro с использованием конъюгированного вторичного антитела Mab-zap на клетках SN12C.

Фигуры 2А, 2В и 2С: Специфичность связывания 1613F12 с иммобилизованным белком rhAxl-Fc (2А), белками rhDtk-Fc (2В) или rhMer-Fc (2С) по данным ELISA.

Фигура 3: FACS анализ связывания 1613F12 с опухолевыми клетками человека.

Фигура 4: Анализ ELISA с иммобилизованным белком rmAxl-Fc («rm» означает мышиный рекомбинантный).

Фигура 5: Связывание 1613F12 с клетками COS7, определенное по протоколу непрямого мечения с применением метода проточной цитометрии.

Фигура 6: Конкурентность связывания Gas6 с использованием 1613F12 по данным ELISA.

Фигура 7: Анализ связывания эпитопа методом вестерн-блоттинга с использованием лизата клеток SN12C. NH (без нагревания); NR (без восстановления); Н (нагревание); R (восстановление). Обнаружение GAPDH свидетельствует о правильном нанесении образца в гель.

Фигуры 8А и 8В: Изучение снижения экспрессии Axl после связывания 1613F12 с клетками SN12C путем вестерн-блоттинга, где Фигура 8А - изображение вестерн-блоттинга для 3 независимо проведенных экспериментов (вестерн-блоттинг проводили после 4 ч и 24 ч инкубации 1613F12 с клетками SN12C); и Фигура 8В - количественная оценка оптической плотности представленной пленки с использованием программного обеспечения «QuantityOne».

Фигуры 9А, 9В и 9С: Иммунофлуоресцентная микроскопия клеток SN12C после инкубации с 1613F12. Фигура 9А - фотографии условий изотипического контроля mlgG1 для окрашивания мембраны и внутриклеточного окрашивания. Фигура 9В - окрашивание мембраны. Фигура 9С - внутриклеточное окрашивание рецептора Axl с использованием 1613F12 и маркера ранних эндосом ЕЕА1. Наложенные изображения представлены ниже и визуализированная колокализация обозначена стрелками.

Фигура 10: Влияние 1613F12 на пролиферацию клеток SN12C in vitro в сравнении с действием антитела изотипического контроля mlgG1.

Фигура 11А-11K: Прямой анализ цитотоксичности иммуноконъюгата 1613F12-сапорин с использованием различных линий опухолевых клеток человека. А - SN12C, В - Calu-1, С - А172, D - А431, Е - DU145, F - MDA-MB435S, G - MDA-МВ231, Н - РС3, I - NCI-H226, J - NCI-H125, K - Panc1.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Интернализация рецептора Axl

Так как подход с применением иммуноконъюгатов более эффективен, когда антиген-мишень является интернализующимся белком, была изучена интернализация рецептора Axl с помощью анализа цитотоксичности Mab-Zap на линиях опухолевых клеток человека. Точнее, реагент Mab-Zap является химическим конъюгатом, содержащим аффинно-очищенные козьи антитела к IgG мыши и сапорин - белок, инактивирующий рибосомы. Если интернализация иммунного комплекса происходит, сапорин отделяется от нацеливающего агента и инактивирует рибосомы, в результате чего подавляется синтез белка и, в конечном счете, клетка гибнет. Определение жизнеспособности клетки после 72 часов инкубации Axl-позитивных клеток с антителом против Axl или с антителом изотипического контроля mlgG1 позволяет сделать вывод об индуцированной 1613F12 интернализации рецептора Axl.

В этом примере использовали высоко Axl-позитивные клетки, определенные в качестве таковых с использованием реагента Qifikit (Dako). Данные представлены в следующей таблице 5.

В следующем примере в качестве неограничивающего примера использовали клетки SN12C. Могла использоваться и любая другая клеточная линия, экспрессирующая рецептор Axl на клеточной поверхности на подходящем уровне.

Различные концентрации 1613F12 или антитела изотипического контроля mlgG1 предварительно инкубировали с 100 нг вторичных антител Mab-Zap (Advanced targeting systems) в среде для культивирования клеток в течение 30 мин при комнатной температуре. Эти смеси добавляли к субконфлюэнтным клеткам SN12C, посеянным в прозрачный 96-луночный микропланшет. Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37°С в присутствии 5% CO₂. Жизнеспособность клеток определяли методом оценки клеточной пролиферации Cell Titer Glo в соответствии с инструкциями изготовителя (Promega). Выполняли несколько контролей: i) без вторичного иммуноконъюгата и ii) без первичного антитела. Параллельно выполняли анализы с изотипическим контролем mlgG1.

Полученные результаты представлены на Фигуре 1.

1613F12 показал максимальное цитотоксическое действие на клетки SN12C ~36%. В присутствии антитела 9G4, рассматриваемого в эксперименте как изотипический контроль mlgG1, никакого цитотоксического эффекта не наблюдали. В лунках, содержащих только первичные антитела, цитотоксичность не наблюдали (данные не показаны). Таким образом, рецептор Axl выглядит удобным антигеном для нацеливания в подходе с применением иммуноконъюгатов, так как иммунный комплекс, содержащий Axl-1613F12-MabZap, оказывает эффективное цитотоксическое воздействие на клетки-мишени.

Пример 2: Получение антитела к rhAxl-ECD

Для создания мышиных моноклональных антител (Mab) к внеклеточному домену (ECD) рецептора Axl человека 5 мышей BALB/c 5-кратно иммунизировали подкожно 15-20×10⁶ клеток CHO-Axl и дважды 20 мкг rhAxl-ECD. Первую иммунизацию проводили в присутствии полного адъюванта Фрейнда (Sigma, St Louis, MD, USA). При последующих иммунизациях добавляли неполный адъювант Фрейнда (Sigma).

За три дня до слияния иммунизированных мышей стимулировали 20×10⁶ клеток CHO-Axl и 20 мкг rhAxl-ECD с неполным адъювантом Фрейнда.

Для создания гибридом спленоциты и лимфоциты получали путем перфузии селезенки и измельчения проксимальных лимфатических узлов, соответственно, собранных от 1 из 5 иммунизированных мышей (выбрана после титрования сыворотки), и сливали их с клетками миеломы SP2/0-Agl4 (АТСС, Rockville, MD, USA). Протокол слияния описан Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Слившиеся клетки затем подвергали отбору с помощью HAT. В общем, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно обратиться к методикам, которые описаны, в частности, в руководстве «Antibodies» (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988).

Примерно через 10 дней после слияния исследовали колонии гибридных клеток. Для первичного скрининга оценивали супернатанты гибридом на секрецию моноклональных антител, полученных против ECD белка Axl, с помощью ELISA. Параллельно выполняли анализ FACS, чтобы выбрать моноклональные антитела, способные связываться с клеточной формой Axl, присутствующей на поверхности клеток СНО дикого типа и СНО, экспрессирующих Axl (АТСС).

Как только это стало возможно, выбранные гибридомы клонировали путем предельного разведения, а затем скринировали на их реактивность против ECD белка Axl. Клонированные моноклональные антитела затем изотипировали с использованием Isotyping kit (cat #5300.05, Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). Один клон, полученный из каждой гибридомы, отобрали и размножили.

Анализы ELISA выполняли, как описано ниже, либо с использованием чистого супернатанта гибридом, либо, если было определено содержание IgG в супернатантах, титрование начинали с 5 мкг/мл. Выполняли 14 серийное разведение в следующих 11 рядах. Если коротко, 96-луночные планшеты для ELISA (Costar 3690, Corning, NY, USA) покрывали белком rhAxl-Fc в количестве 50 мкл/лунка (R and D Systems, cat №154-AL) или rhAxl-ECD в количестве 2 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали PBS, содержащим 0,5% желатин (#22151, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) в течение 2 ч при 37°С. Как только насыщающий буфер был удален при встряхивании планшетов, добавляли 50 мкл чистого супернатанта гибридом или 50 мкл 5 мкг/мл раствора в планшеты для ELISA и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После трех промываний добавляли 50 мкл поликлональных козьих антител к IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) в разведении 1/5000 в PBS, содержащем 0,1% желатин и 0,05% Tween 20 (вес: вес), на 1 ч при 37°С. Затем планшеты для ELISA 3 раза промывали и добавляли субстрат ТМВ (#UP664782, Uptima, Interchim, France). После 10 мин инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали с помощью 1М серной кислоты и измеряли оптическую плотность при 450 нм.

При отборе с помощью проточной цитометрии в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащую PBS с 1% BSA и 0,01% азид натрия (FACS буфер), при 4°С поместили 105 клеток (СНО дикого типа или CHO-Axl). После 2 мин центрифугирования при 2000 оборотов в минуту буфер удалили и добавили тестируемые супернатанты гибридом или очищенные моноклональные антитела (1 мкг/мл). Через 20 мин инкубации при 4°С клетки дважды промыли, добавили козьи антитела к иммуноглобулину мыши, конъюгированные с Alexa 488, разведенные 1/500 FACS буфером (#А11017, Molecular Probes Inc., Eugene, USA), и инкубировали в течение 20 мин при 4°С. После последнего промывания FACS буфером и после добавления пропидия йодида в каждую пробирку до конечной концентрации 40 мкг/мл клетки анализировали с помощью FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Лунки, содержащие только клетки и клетки, инкубированные с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa 488, включили в эксперимент в качестве отрицательных контролей. В каждом эксперименте были использованы изотипические контроли (Sigma, ref M90351MG). Чтобы вычислить среднее значение интенсивности флуоресценции (MFI), оценивали по меньшей мере 5000 клеток.

Более точно, слияние проводили с 300×10⁶ собранных спленоцитов и 300×10⁶ клеток миеломы (1:1). Двести клеток полученной клеточной суспензии затем высеяли при плотности 2×10⁶ клеток/мл в 30 96-луночных планшетов.

Первый скрининг (примерно на 14-й день после слияния), проведенный как с помощью ELISA на белке rhAxl-ECD, так и с помощью анализа FACS с использованием как клеток СНО дикого типа, так и клеток СНО, экспрессирующих Axl, позволил выбрать 10 гибридом, демонстрирующих оптические плотности (OD) выше 1 на оболочке rhAxl-ECD и MFI ниже 50 на клетках СНО дикого типа и выше 200 на клетках CHO-Axl.

Эти 10 гибридом размножили и клонировали предельным разведением. Для каждого кода был подготовлен один 96-луночный планшет. Через девять дней после посева супернатанты из лунок с клонами сначала скринировали с помощью ELISA на их специфичность связывания с внеклеточным доменом белка rhAxl-ECD. Три клона каждого кода размножали и изотипировали. Сразу после получения антитела к Axl дополнительно изучали в отношении их способности к интернализации после связывания с Axl на клеточной поверхности.

Пример 3: Специфичность связывания Axl

В этом примере связывание 1613F12 сначала изучали на белке rhAxl-Fc. Затем изучали его связывание с двумя другими членами семейства ТАМ, rhDtk-Fc и rhMer-Fc.

Если коротко, рекомбинантным человеческим белком Axl-Fc (R and D systems, cat N° 5154AL/CF), белком rhDtk (R and D Systems, cat N° 859-DK) или белком rhMer-Fc (R and D Systems, cat N° 891-MR) покрывали 96-луночные планшеты Immulon II в течение ночи при 4°С, и после 1-часового этапа блокирования 0,5% раствором желатина добавляли очищенное антитело 1613F12 до начальной концентрации 5 мкг/мл (3,33 10^-8 М) и инкубировали дополнительно в течение 1 ч при 37°С. После этого в 12 колонках выполнили ¹/₂ серийные разведения. Планшеты промывали и добавляли козьи антитела к мышиным IgG, меченые HRP (Jackson), на 1 ч при 37°С. Реакцию проводили с использованием раствора субстрата ТМВ. Также параллельно использовали коммерческое антитело к Axl Mab 154 (данные не показаны). Контроль покрытия проводили в присутствии козьей поликлональной сыворотки против IgG Fc человека, меченой HRP (Jackson, ref 109-035-098), и/или в присутствии антитела против гистидина, меченого HRP (R and D Systems, ref: МАВ050Н). В отсутствие первичного антитела (разбавителя) неспецифическое связывание не наблюдали. Результаты представлены на Фигурах 2А, 2В и 2С, соответственно.

Этот пример показывает, что антитело 1613F12 связывается только с белком rhAxl-Fc и не связывается с двумя другими членами семейства ТАМ, rhDtk или rhMer. Между членами ТАМ кросс-специфичности связывания антитела 1613F12 не обнаружили.

Пример 4: 1613F12 распознал клеточную Форму Axl. экспрессируемую на опухолевых клетках

Уровень экспрессии Axl на клеточной поверхности опухолевых клеток человека сначала определяли, используя коммерческое антитело к Axl (R и D Systems, Ref: МАВ154) одновременно с калибровочными шариками, чтобы сделать возможным количественное определение уровня экспрессии Axl. Затем изучали связывание Axl на поверхности клетки, используя антитело 1613F12 к Axl. В обоих случаях экспериментальные условия были такими, как кратко описано ниже.

Для исследования связывания с клеточной поверхностью приготовили двукратные серийные разведения раствора первичного антитела (1613F12, коммерческое антитело к Axl МАВ154 или mlgG1 изотипический контроль 9G4 Mab) с концентрацией 10 мкг/мл (6,66 10^-8М) и нанесли на 2×10⁵ клеток на 20 мин при 4°С. После 3 промываний в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 1% BSA и 0,01% NaN₃ клетки инкубировали с вторичными козьими антимышиными антителами Alexa 488 (разбавление 1/500) в течение 20 минут при 4°С. После 3 дополнительных промываний в PBS с добавлением 1% BSA и 0,1% NaN₃ клетки анализировали с помощью FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Оценивали по меньшей мере 5000 клеток, чтобы вычислить среднее значение интенсивности флуоресценции.

Для количественного определения ABC (связывающей способности антитела) с использованием антитела МАВ154 к Axl применяли калибровочные шарики QIFIKIT®. Параллельно с шариками QIFIKIT® клетки инкубировали с поликлональными козьими антителами к мышиным иммуноглобулинам/FITC (Goat F(ab')₂) в насыщающей концентрации. Затем определяли количество антигенных сайтов на исследуемых клетках путем интерполяции по калибровочной кривой (интенсивность флуоресценции отдельных популяций шариков в зависимости от количества молекул Mab на шариках).

4.1. Количественное определение уровня экспрессии Axl на клеточной поверхности

Уровень экспрессии Axl на поверхности опухолевых клеток человека определяли с помощью проточной цитометрии, используя непрямой иммунофлюоресцентный анализ (метод QIFIKIT® (Dako, Denmark)), набор для проведения количественной проточной цитометрии для оценки антигенов клеточной поверхности. Сравнение средней интенсивности флуоресценции (MFI) известных уровней антигена на шариках с применением калибровочного графика позволяет определить связывающую способность антитела (ABC) клеточных линий.

В таблице 6 приведены данные об уровне экспрессии Axl на поверхности различных линий опухолевых клеток человека (SN12C, Calu-1, А172, А431, DU145, MDA-MB435S, MDA-MB231, РС3, NCl-H226, NCl-H125, MCF7, Panel) (АТСС, NCI), как определено с помощью QIFIKIT® с использованием коммерческого антитела к Axl МАВ154 (R и D Systems). Значения приведены в единицах антиген-связывающих комплексов (ABC).

Результаты, полученные с коммерческим моноклональным антителом к Axl (МАВ154) показали, что рецептор Axl экспрессируется на различных уровнях в зависимости от рассматриваемой опухолевой клетки человека.

4.2. Детекция Axl на опухолевых клетках человека с использованием 1613F12

Более конкретно изучали связывание Axl, используя 1613F12.

Выполнены кривые зависимости ответа от дозы 1613F12. Значения MFI, полученные с использованием различных опухолевых клеток человека, затем анализировали с помощью программного обеспечения Prism. Данные представлены на Фигуре 3.

Данные показывают, что 1613F12 специфически связывается с мембранным рецептором Axl, о чем свидетельствуют профили кривой насыщения.

Пример 5: Межвидовая кросс-специфичность 1613F12 Для решения вопроса о видовой кросс-специфичности 1613F12 рассматривали два вида: мышь и обезьяна. Сначала изучали связывание на рекомбинантном мышином (rm) рецепторе Axl с помощью ELISA (Фигура 4). Затем проводили эксперименты проточной цитометрии с использованием клеток обезьяны COS7, поскольку эти клетки экспрессируют рецептор Axl на своей поверхности (Фигура 5). Линия клеток COS7 была получена иммортализацией клеточной линии CV-1, полученной из клеток почки африканской зеленой мартышки, с помощью версии SV40 генома, который может производить большой Т-антиген, но имеет дефект в репликации генома. rmAxl-Fc ELISA

Если коротко, рекомбинантным мышиным белком Axl-Fc (R and D systems, cat N° 854-AX /CF) покрывали 96-луночные планшеты Immulon II в течение ночи при 4°С и после 1-часового этапа блокирования 0,5% раствором желатина добавляли очищенное антитело 1613F12 и инкубировали в течение еще одного часа при 37°С при исходной концентрации 5 мкг/мл (3,33 10^-8 М). Затем выполняли ¹/₂ серийные разведения в 12 колонках. Затем планшеты промывали и добавляли козье антитело к IgG мыши с HRP (Jackson) на 1 ч при 37°С. Реакцию проводили с использованием раствора субстрата ТМВ. Параллельно также использовали коммерческое мышиное антитело Mab 154 к Axl. Контроль покрытия проводили в присутствии козьей поликлональной сыворотки к IgG Fc человека, связанной с HRP (Jackson, ref 109-035-098) и/или в присутствии связанного с HRP антитела против гистидина (R и D Systems, ref:. MAB050H). В отсутствие первичного антитела (разбавителя) специфического связывания не наблюдали.

Результаты представлены на Фигуре 4. Эта фигура показывает, что Mab 1613F12, раскрытое в настоящем изобретении, не связывается с доменом ECD мышиного белка Axl.

FACS COS7

Для исследований клеточного связывания 1613F12 с использованием клеток COS7 2×10⁵ клеток инкубировали в течение 20 мин при 4°С с различными концентрациями антитела, приготовленными путем ¹/₂ серийных разведений (12 точек) раствора антитела 1613F12 с концентрацией 10 мкг/мл (6,66 10^-8 М) или m9G4 (изотипический контроль Mab mlgG1). После 3 промываний фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 1% BSA и 0,01% NaN₃ клетки инкубировали с вторичным козьим антителом к иммуноглобулинам мыши Alexa 488 (разведение 1/500) в течение 20 минут при 4°С. После 3 дополнительных промываний в PBS с добавлением 1% BSA и 0,1% NaN₃ клетки анализировали с помощью FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Чтобы вычислить среднее значение интенсивности флуоресценции, оценивали по меньшей мере 5000 клеток. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Prism.

Результаты представлены на Фигуре 5. Кривая титрования, полученная на клетках COS7 с использованием либо 1613F12, либо изотипического контроля mlgG1, подтверждает, что 1613F12 способен распознавать клеточную форму рецептора Axl обезьяны, экспрессируемого на поверхности клеток COS7. Плато достигается при концентрациях 1613F12 выше 0,625 мкг/мл (4,2 10^-10 М). Как и следовало ожидать, связывание не наблюдается в присутствии изотипического контроля mlgG1.

Этот пример иллюстрирует тот факт, что 1613F12 не вступает в перекрестную реакцию с рецептором Axl мыши. Наоборот, оно сильно связывается с рецептором Axl обезьяны, экспрессируемым на поверхности клеток COS7.

Пример 6: Эксперименты по конкуренции связывания Gas6 в присутствии 1613F12

Для дальнейшей характеристики моноклональных антител к Axl провели анализ конкуренции связывания Gas6. В этом анализе свободный белок rhAxl-Fc и антитело к Axl инкубировали с образованием комплекса антиген-антитело, а затем комплексы помещали на поверхность с покрытием Gas6 в аналитический планшет.

Несвязанные комплексы антитело-антиген отмывали, а затем добавляли связанные с ферментом вторичные антитела к части Fc человека белка rhAxl-Fc. Затем добавляли субстрат и концентрацию антигена определяли по силе сигнала, вызываемого реакцией фермент-субстрат.

Если коротко, в отдельном насыщенном (0,5% желатин в 1Х PBS) планшете готовили реакционную смесь, содержащую белок rhAxl-Fc в присутствии или в отсутствие тестируемых моноклональных антител к Axl. Выполняли 1: 2 серийные разведения (начиная с 80 мкг/мл в 12 колонках) мышиных антител к Axl. Затем добавляли 0,5 мкг/мл белка rhAxl-Fc (R и D Systems, ref. 154AL/CF), за исключением линии для отрицательного контроля, которая содержит только разбавитель для ELISA (0,1% желатин, 0,05% Твин 20 в 1Х PBS). После гомогенизации образцы для анализа конкуренции связывания переносили в планшеты, покрытые Gas6 с помощью раствора 6 мкг/мл rhGas6 в PBS (R and D systems cat N° 885-GS-CS / CF). После инкубации и нескольких промываний связанные белки rhAxl-Fc детектировали, используя козье антитело к IgG человека с HRP (Jackson, ref. 109-035-098). После связывания в планшеты добавляли субстрат ТМВ. Реакцию останавливали добавлением 1 М раствора кислоты H₂SO₄ и полученные значения оптической плотности считывали при 450 нм с использованием сканера для микропланшетов.

Этот эксперимент (Фигура 6) показывает, что 1613F12 способен конкурировать с rhAxl-Fc, связываясь с его иммобилизованным лигандом. Конкуренция за связывание Gas6 происходит в присутствии антитела 1613F12 при концентрациях выше 2,5 мкг/мл (1,67 Ю^М). Связывание rhAxl-Fc с иммобилизованным Gas6 не наблюдали в присутствии 1613F12 при концентрации выше 10 мкг/мл (6,67 10^-8 М). 1613F12 блокирует связывание Gas6 с rhAxl-Fc.

Пример 7: Распознавание эпитопа методом вестерн-блоттинга Чтобы определить, распознает ли 1613F12 линейный или конформационный эпитоп, провели анализ вестерн-блоттинг с использованием лизата клеток SN12C. Образцы обрабатывали в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях. Если полоса визуализируется с восстановленным образцом, испытываемое антитело распознает линейный эпитоп домена ECD; если нет, оно активно против конформационного эпитопа ECD Axl.

Клетки SN12C выращивали в среде RPMI+10% инактивированной нагреванием FBS+2 мМ L-глутамина по 5×10⁴ клеток/см² во флаконах Т162 см² в течение 72 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Затем клетки дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и лизировали 1,5 мл охлажденного на льду буфера для лизиса [50 мМ Трис-HCl (рН 7,5); 150 мМ NaCl; 1% Nonidet Р40; 0,5% дезоксихолат; и 1 целая таблетка коктейля ингибиторов протеаз с 1% антифосфатаз]. Клеточные лизаты встряхивали в течение 90 мин при 4°С и осветляли при 15000 оборотов в минуту в течение 10 мин. Концентрацию белка определяли количественно с использованием ВСА. Разные образцы наносили. Сначала приготовили 10 мкг цельноклеточного лизата (10 мкг в 20 мкл) в восстанавливающих условиях (1х буфер для образцов (BIORAD)+1х восстанавливающий агент (BIORAD)) и наносили в SDS-PAGE после 2 мин инкубации при 96°С. Затем приготовили два других образца из 10 мкг цельноклеточного лизата в невосстанавливающих условиях (только 1х буфер для образцов (BIORAD)). До нанесения в гель SDS-PAGE один из этих двух последних образцов инкубировали 2 мин при 96°С; другой держали на льду. После разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны насыщали в течение 1 ч при комнатной температуре 0,1% TBS-Tween 20 (TBST), 5% обезжиренным молоком и обрабатывали 1613F12 в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Антитела разводили в Трис-солевом буфере, 0,1% Tween 20 (объем/объем) (TBST) с 5% обезжиренным сухим молоком. Затем мембраны промывали TBST и инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой, (разведение 1/1000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммунореактивные белки визуализировали с помощью ECL (Pierce # 32209). После визуализации Axl мембраны еще раз промывали TBST и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мышиным антителом к GAPDH (разведение 1/200000). Затем мембраны промывали TBST и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали и GAPDH выявляли с помощью ECL.

Результаты представлены на Фигуре 7.

1613F12 в основном распознает конформационный эпитоп, так как специфическая полоса наблюдается преимущественно в невосстанавливающих условиях. Однако слабый сигнал обнаружен в денатурирующих мигрирующих условиях лизата клеток SN12C, что указывает, что 1613F12 способно слабо связываться с линейным эпитопом.

Пример 8: Измерение снижения количества Axl, вызываемого 1613F12. методом вестерн-блоттинга

В следующем примере линия клеток почечно-клеточной карциномы человека SN12C (АТСС) была выбрана для направления активности антител Axl на экспрессию рецептора Axl. Клеточная линия SN12C сверхэкспрессирует рецептор Axl. Снижение экспрессии Axl изучали с помощью вестерн-блоттинга на цельноклеточных экстрактах, как показано на Фигурах 8А-8В.

Клетки SN12C выращивали в среде RPMI+10% инактивированной нагреванием FBS+2 мМ L-глутамина по 6×10⁴ клеток/см² в шестилуночных планшетах в течение 48 ч при 37°С в атмосфере 5% CO₂. После двух промываний фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) клетки подвергали голоданию по сыворотке в среде, содержащей либо 800 нг/мл мышиного рекомбинантного лиганда Gas6 (R и D Systems, Ref: 986-GS/CF), либо 10 мкг/мл антитела изотипического контроля mlgG1 (9G4), либо 10 мкг/мл антитела Axl согласно настоящему изобретению, и инкубировали в течение 4 ч или 24 дополнительных часов. Затем среду осторожно удаляли и клетки дважды промывали холодным PBS. Клетки лизировали 200 мкл охлажденного на льду буфера для лизиса [50 мМ Трис-HCl (рН 7,5); 150 мМ NaCl; 1% Nonidet Р40; 0,5% дезоксихолат; и 1 целая таблетка коктейля ингибиторов протеаз с 1% антифосфатаз]. Клеточные лизаты встряхивали в течение 90 мин при 4°С и осветляли при 15000 оборотов в минуту в течение 10 мин. Концентрацию белка определяли количественно с использованием метода ВСА. Цельноклеточные лизаты (10 мкг в 20 мкл) разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны насыщали в течение 1 ч при комнатной температуре 0,1% TBS-Tween 20 (TBST), 5% обезжиренным молоком и обрабатывали коммерческим антителом М02 к Axl в концентрации 0,5 мкг/мл (AbNova Н00000558-М02) в течение ночи при 4°С. Антитела разводили в Трис-солевом буфере, 0,1% Tween 20 (объем/объем) (TBST) с 5% обезжиренным сухим молоком. Затем мембраны промывали TBST и инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой, (разведение 1/1000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммунореактивные белки визуализировали с помощью ECL (Pierce # 32209). После визуализации Axl мембраны еще раз промывали TBST и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мышиным антителом к GAPDH (разведение 1/200000). Затем мембраны промывали TBST и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали и GAPDH выявляли с помощью ECL. Интенсивность полосы оценивали количественно с помощью денситометрии.

Результаты, представленные на Фигурах 8А и 8В, являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов и показывают, что 1613F12 способно снижать экспрессию Axl в сверхэкспрессирующей Axl линии опухолевых клеток человека. За 4 ч 1613F12 вызывает 66% снижение экспрессии Axl, а после 24-часовой инкубации с 1613F12 снижение экспрессии Axl составило до 87%.

Пример 9: Изучение воздействия 1613F12 на экспрессию Axl на поверхности клетки

с помощью проточной цитометрии Методика проточной цитометрии позволяет пометить рецептор Axl на поверхности клетки. Использование этой методики позволяет подчеркнуть влияние антитела на экспрессию Axl на мембране. В этом примере использовали опухолевые клетки опухоли почки человека SN12C, экспрессирующие Axl на высоком уровне.

Линию клеток опухоли SN12C культивировали в среде RMPI1640 с 1% L-глутамином и 10% FCS в течение 3 дней до эксперимента. Затем клетки отделяли, используя трипсин, и высевали в 6-луночный планшет в RPMI1640 с 1% L-глутамином и 5% FBS. На следующий день добавляли антитела, представляющие интерес, в концентрации 10 мкг/мл. Также оставляли необработанные лунки. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Через двадцать четыре часа клетки промывали PBS, отделяли и инкубировали с теми же антителами, представляющими интерес, в буфере FACS (PBS, 1% BSA, 0,01% азида натрия). Необработанные лунки также окрашивали тем же антителом с целью сравнения интенсивности сигнала, полученного с тем же Mab на обработанных и необработанных клетках. Клетки инкубировали в течение 20 минут при 4°С и три раза промывали буфером FACS. Затем добавляли меченые Alexa 488 козьи антитела к IgG мыши и инкубировали в течение 20 минут, клетки промывали три раза и подвергали FACS анализу, выявляя отрицательную по пропидийиодиду клеточную популяцию.

Определяли два параметра: (i) разность флуоресцентного сигнала, обнаруженного на поверхности необработанных (без Ab) клеток, в сравнении с обработанными Ab клетками через 24 ч, и (ii) процент оставшегося на поверхности клетки Axl. Процент оставшегося Axl рассчитан следующим образом:

% оставшегося Axl=(MFI_Аb24ч/ MFI_{6ез Ab24ч})×100

Данные одного репрезентативного эксперимента (из 3) представлены в Таблице 7. Результаты были воспроизведены в трех независимых экспериментах.

Разность MFI между окрашиванием Mab одним и тем же антителом в необработанной клетке и обработанной клетке отражает снижение экспрессии белка Axl на клеточной поверхности за счет связывания исследуемого Mab. В условиях без антитела получили сходные результаты с теми, что были получены в условиях присутствия антитела изотипического контроля (m9G4).

Эти данные показывают, что средняя интенсивность флуоресценции, обнаруженной на поверхности клеток, обработанных 1613F12 в течение 24 часов, уменьшена (-514) по сравнению с MFI, полученной на необработанных клетках, меченых 1613F12. После 24 часов инкубации с антителом 1613F12 на поверхности клеток SN12C остается 45,2% рецептора Axl клеточной поверхности.

Пример 10: Изучение интернализации 1613F12 с использованием Флуоресцентного иммуноцитохимического мечения

Дополнительные результаты по интернализации получены путем конфокальной микроскопии с использованием метода непрямого флуоресцентного мечения.

Если коротко, линию опухолевых клеток SN12C культивировали в среде RMPI1640 с 1% L-глутамином и 10% FCS в течение 3 дней до эксперимента. Затем клетки отделяли, используя трипсин, и высевали в 6-луночный планшет с покровным стеклом в RPMI1640 с 1% L-глутамином и 5% FCS. На следующий день добавляли 1613F12 в концентрации 10 мкг/мл. Также в анализ были включены клетки, обработанные нерелевантным антителом. Затем клетки инкубировали в течение 1 ч и 2 ч при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Для Т 0 ч клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°С для определения связывания антитела с поверхностью клеток. Клетки промывали PBS и фиксировали параформальдегидом в течение 15 минут.Клетки промывали и инкубировали с козьим антителом к IgG мыши с Alexa 488 в течение 60 минут при 4°С для идентификации оставшегося на поверхности клеток антитела. Чтобы отслеживать проникновение антитела в клетки, клетки фиксировали и пермеабилизовали сапонином. Для окрашивания антител как на мембране, так и внутри клеток использовали козье антитело к IgG мыши с Alexa 488 (Invitrogen). Ранние эндосомы определяли с использованием кроличьего поликлонального антитела к ЕЕА1, которые выявляли козьим антителом к IgG кролика с Alexa 555 (Invitrogen). Клетки промывали три раза и ядра окрашивали с использованием Draq5. После окрашивания клетки заключали в заливочную среду Prolong Gold (Invitrogen) и анализировали с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM510.

Фотографии представлены на фигурах 9А-9С.

Изображения были получены путем конфокальной микроскопии. В присутствии изотипического контроля mlgG1 (9G4) не наблюдали ни мембранного окрашивания, ни внутриклеточного мечения (Фигура 9А). Прогрессирующее снижение мембранного анти-Axl мечения наблюдали сразу после 1 ч инкубации клеток SN12C с 1613F12 (Фигура 9В). Внутриклеточное накопление антитела 1613F12 к Axl отчетливо наблюдали через 1 ч и 2 ч (Фигура 9С). Внутриклеточное антитело колокализуется с ЕЕА1, маркером ранних эндосом. Эти фотографии подтверждают интернализацию 1613F12 внутрь клеток SN12C.

Пример 11: Противоопухолевая активность, опосредованная анти-Axl, in vitro Исследование пролиферации SN12C

Десять тысяч клеток SN12C на лунку высевали в среду без FCS в 96-луночные планшеты на ночь при 37°С в атмосфере 5% CO₂. На следующий день клетки предварительно инкубировали с 10 мкг/мл каждого антитела в течение 1 часа при 37°С. Клетки обрабатывали rmGas6 (R and D Systems, cat №986-GS/CF) путем добавления лиганда непосредственно в лунку или не обрабатывали лигандом, а затем оставляли для роста на 72 часа. Пролиферацию измеряли по включению ³Н тимидина.

Данные представлены на Фигуре 10. Не наблюдали никакого эффекта от 1613F12, которое было неактивно при добавлении к клеткам SN12C.

Пример 12: Цитотоксическая активность иммуноконъюгата 1613F12-сапорин в различных линиях опухолевых клеток человека

В данном примере описана цитотоксическая активность сапорина, связанного с 1613F12. Для этого проводили анализы цитотоксичности непосредственно in vitro с использованием большого набора линий опухолевых клеточных человека (Фигуры 11А-11К). Этот набор линий опухолевых клеток обеспечивает различную экспрессию Axl.

Если коротко, 5000 клеток высевали в 96-луночные планшеты для культивирования в 100 мкл подходящей среды для культивирования с 5% FBS. После 24-часовой инкубации в атмосфере 5% CO₂ при 37°С клетки обрабатывали различными концентрациями иммуноконъюгата (1613F12-сапорин или 9G4-сапорин или чистые 1613F12 или 9G4). Планшеты для культивирования затем инкубировали при 37°С в инкубаторе с увлажнением и 5% CO₂ в течение 72 часов.

На четвертый день (D4) оценивали жизнеспособность клеток с помощью набора для оценки жизнеспособности клеток по люминесценции CellTiter-Glo® (Promega Corp., Madison, Wis.), который позволяет определить количество жизнеспособных клеток в культуре на основе количественной оценки присутствующего АТФ, показателя метаболически активных клеток. Интенсивность люминесценции регистрировали на люминометре.

По сигналу люминесценции вычисляли процент цитотоксичности, используя следующую формулу:

% цитотоксичности = 100- [(RLU_Ab-сап × 100)/ RLU_безАb]

На Фигурах 11А-11К собраны графики, отражающие процент цитотоксичности в зависимости от концентрации иммуноконъюгата, полученный в результате разных анализов клеточной цитотоксичности in vitro с опухолевыми клетками (A) SN12C, (В) Calu-1, (С) А172, (D) А431, (Е) DU145, (F) MDA-MB-435S, (G) MDA-MB-231, (Н) РС3, (I) NCl-H226, (J) NCl-H125 или (K) Panel, обработанными разными концентрациями иммуноконъюгата 1613F12-сапорин.

Фигуры 11А-11К показывают, что иммуноконъюгат 1613F12-сапорин оказывал цитотоксическое воздействие на эти разные линии опухолевых клеток человека. Степень полученного цитотоксического эффекта зависит от линии опухолевых клеток человека.

Пример 13: Кинетика связывания антител к Axl с ECD Axl человека

Измерение аффинности 1613F12 проводили с использованием Biacore.

Для измерения кинетики связывания антител к Axl с ECD Axl человека использовали Biacore X.

Прибор, основанный на оптическом явлении поверхностного плазмонного резонанса (SPR), используемый в системах Biacore, позволяет обнаруживать и измерять межбелковые взаимодействия в реальном времени без использования меток.

Если коротко, эксперименты проводили с использованием сенсорного чипа СМ5 в качестве биосенсора. IgG кролика иммобилизовали на проточных ячейках 1 и 2 (FC1 и FC2) сенсорного чипа СМ5 на уровне 9300-10000 единиц ответа (RU), используя реакцию связывания аминогрупп для иммобилизации антител.

Связывание оценивали с помощью нескольких циклов. Каждый цикл измерения проводили при скорости потока 30 мкл/мин в буфере HBS-EP. Затем тестируемое антитело Axl иммобилизовали на чипе в течение 1 мин только на FC2 до достижения среднего значения иммобилизации 311,8 RU (SD=5,1 RU) для антитела 1613F12. Аналит (антиген ECD Axl) вводили, начиная с 200 нМ, и с помощью двукратных серийных разведений измеряли приблизительные ка и kd в реальном времени.

В конце каждого цикла поверхности регенерировали путем введения 10 мМ раствора глицин гидрохлорида с рН 1,5 для удаления комплексов антиген-антитело, а также иммобилизованного антитела. Полученный сигнал соответствует разности наблюдаемых сигналов между FC1 и FC2 (FC2-FC1). Скорости ассоциации (ka) и скорости диссоциации (kd) рассчитаны с использованием модели связывания Ленгмюра один-к-одному. Равновесную константу диссоциации (KD) определяют как отношение ka/kd. Экспериментальные значения анализировали на программном обеспечении BIAevaluation версии 3.0. Для оценки точности данных будет проведен анализ χ2.

Данные приведены в следующей Таблице 8.

Для получения внеклеточного домена (ECD) Axl человека сначала с помощью ПЦР клонировали человеческую кДНК, кодирующую растворимый рецептор AXL человека, в экспрессионный вектор рСЕР4. Затем очищенный продукт расщепили рестриктазами HindIII и BamHI и лигировали в экспрессионный вектор рСЕР4, который был предварительно расщеплен теми же ферментами. И, наконец, выявленную рекомбинантную плазмиду pCEP[AXL]His₆ дополнительно подтвердили секвенированием ДНК.

Затем адаптированные к росту в суспензии клетки НЕК293Е культивировали в среде Ex-cell 293 (SAFC Biosciences) с 4 мМ глутамина. Все трансфекции проводили с использованием линейного 25 кДа полиэтиленимина (PEI). Трансфицированные культуры выдерживали при 37°С в шейкере-инкубаторе с 5% CO₂ и при перемешивании со скоростью 120 оборотов в минуту в течение 6 дней. Клетки собирали центрифугированием, а супернатант, содержащий рекомбинантный белок с гистидиновой меткой, обрабатывали для очистки на колонке с Ni-NTA агарозой.

1. Способ скрининга in vitro антитела или его связывающего фрагмента, способного доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в клетку млекопитающего, экспрессирующую на своей поверхности белок Axl, где молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с указанным антителом, отличающийся тем, что он включает следующие стадии:

a) отбор антитела, которое способно специфически связываться с белком Axl и лишено какой-либо значительной активности в отношении пролиферации опухолевых клеток;

b) ковалентное связывание молекулы, представляющей интерес, с антителом, выбранным на стадии а), с образованием комплекса;

c) контактирование комплекса, полученного на стадии b), с клеткой млекопитающего, экспрессирующей на своей поверхности белок Axl;

d) определение, был ли указанный комплекс внутриклеточно доставлен или интернализован в клетку млекопитающего, экспрессирующую на своей поверхности белок Axl, и

e) отбор указанного антитела в качестве соединения, способного доставлять молекулу, представляющую интерес, или вызывать ее интернализацию в клетку млекопитающего, экспрессирующую на своей поверхности белок Axl.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело, выбранное на стадии а), способно связываться с белком Axl человека, предпочтительно с внеклеточным доменом (ECD), имеющим последовательность SEQ ID NO. 31 или 32.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело, выбранное на стадии а), способно связываться с внеклеточным доменом (ECD) белка Axl человека с ЕС₅₀ по меньшей мере 10^-9 М, предпочтительно между 10^-9 и 10^-12 М.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отбор на стадии е) осуществляют методом, выбранным из FACS, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и методов оценки цитотоксичности/цитостатичности.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что молекула, представляющая интерес, представляет собой цитотоксическую молекулу.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с указанным антителом с помощью линкера.

7. Способ получения in vitro цитотоксического или цитостатического комплекса, способного доставлять цитотоксическое соединение в клетку млекопитающего, экспрессирующую на своей поверхности белок Axl, где способ включает стадию ковалентного связывания цитотоксического или цитостатического агента с антителом, которое:

i) лишено какой-либо значительной активности в отношении пролиферации опухолевых клеток;

ii) способно специфически связываться с белком Axl, предпочтительно с белком Axl человека, и

iii) интернализуется в клетку млекопитающего после его связывания с белком Axl, когда указанный белок Axl экспрессируется на поверхности указанной клетки млекопитающего.