Способ сканирования генных мутаций в опухолях человека

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ сканирования генных мутаций в опухолях человека, включающий амплификацию исследуемого фрагмента гена, плавление дуплексов зондов TaqMan с однонитевыми ампликонами, построение пиков плавления, идентификацию мутаций по асимметрии пиков плавления, отличающийся двунитевым сканированием генных мутаций посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, используемыми для пост-амплификационного плавления ДНК. Способ позволяет проводить количественные измерения числа копий анализируемого гена в исходном образце ДНК, а также сканировать мутации одновременно в обеих нитях ампликона, что повышает надежность и чувствительность анализа и дает дополнительную информацию о типе мутации. 6 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике, молекулярной диагностике и онкологии, и касается способа сканирования генных мутаций в опухолях человека для использования таргетной терапии.

При многих онкологических заболеваниях, в частности при раке легких, толстой кишки, меланоме, обязательными объектами сканирования генных мутаций являются гены KRAS, NRAS, BRAF. С этой целью используют секвенирование по Сэнгеру - «золотой стандарт» клинической генодиагностики.

Недостатки способа: низкая чувствительность, трудоемкость, риск перекрестного загрязнения клинических образцов.

Известен способ сканирования генных мутаций посредством плавления ДНК (DNA Melting Analysis, DMA) с использованием интеркалирующих красителей (SYBR Green, EvaGreen и др.), реализуемый в режиме высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRMA) (Erali and Wittwer, High resolution melting analysis for gene scanning. Methods, 2010, 50, 250-261; Krypuy et al., High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer. BMC Cancer, 2006, 6, 295).

Недостатки способа: низкая специфичность, необходимость дорогостоящего оборудования.

Прототипом заявляемого способа является способ сканирования генных мутаций посредством DMA с использованием флуоресцентных зондов TaqMan (Huang et al., Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS ONE, 2011, 6, e19206). Сущность прототипа заключается в том, что зонды TaqMan могут гибридизоваться только с однонитевой ДНК; при этом образуются дуплексы, плавление которых позволяет судить о присутствии мутации в гене KRAS. В прототипе используется асимметричная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, в результате которой одна нить ампликона, синтезированная в большем числе копий, чем другая, оказывается в избытке и доступна для взаимодействия с зондом TaqMan. Прототип включает следующие приемы: а) выделение ДНК из образца опухолевой ткани; б) амплификацию определенного фрагмента гена в асимметричной ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного зонда TaqMan; в) использование зонда TaqMan также на этапе плавления ДНК. Характерные изменения пиков плавления дуплексов зонда с однонитевой ДНК позволяют обнаружить в анализируемой последовательности мутацию.

Недостатки прототипа: необходимость проведения ПЦР в реальном времени в асимметричном варианте, не позволяющем проводить количественную оценку числа копий анализируемого генного фрагмента; возможность мутационного сканирования в одной реакции лишь одной из двух нитей ампликона.

Задачей заявляемого изобретения является создание нового способа сканирования генных мутаций в опухолях человека, позволяющего проводить симметричную ПЦР для количественной оценки числа копий анализируемого генного фрагмента и проводить в одной реакции одновременное мутационное сканирование обеих нитей ампликона.

Технический результат: заявляемый способ позволяет в процессе стандартной симметричной ПЦР в реальном времени сканировать мутации в обеих нитях ампликона одновременно, что дает дополнительную информацию о типе мутации; повышает надежность и чувствительность анализа, сохраняя при этом возможность количественно оценивать число копий анализируемого генного фрагмента. Способ прост в исполнении, реализуется в одной пробирке без промежуточных или дополнительных процедур с однократной регистрацией результатов и без риска перекрестного загрязнения клинических образцов ДНК.

Сущность способа заключается в двунитевом сканировании генных мутаций в опухолях человека посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, используемыми для пост-амплификационного плавления ДНК. Анализ результатов плавления осуществляют с помощью стандартного модуля плавления (DNA Melting Analysis) аппарата ПЦР (Bio-Rad CFX-96).

В процессе симметричной ПЦР в реальном времени обе комплементарные нити ампликона синтезируются в равных количествах и некоторая их часть принимает конформацию «сковородок» (pans), однонитевые участки которых взаимодействуют с зондами TaqMan, но не друг с другом. Конформация «сковородки» обусловлена использованием комбинированных праймеров, состоящих из двух частей: специфической последовательности и присоединенной к ее 5'-концу «универсальной» последовательности (Universal Primer Sequence, UPS). В результате на концах каждой из двух комплементарных нитей ампликона формируются «липкие концы» (cohesive ends), способные гибридизоваться друг с другом с образованием «ручки сковородки» (panhandles) (Guthrie Р.А. et al. Amplification ratio control system for copy number variation genotyping. Nucleic Acids Res 2011; 39:e54). По окончании амплификации в инкубационной среде оказываются структуры, способные гибридизоваться с зондами TaqMan.

Способ включает следующие этапы: амплификацию исследуемого фрагмента гена KRAS посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, смысловым и антисмысловым (sense и antisense); плавление дуплекса зонд-«сковородка»; построение пиков плавления встроенной программой Bio-Rad CFX Manager. Способ осуществляют в одном приборе и одной пробирке без вмешательства оператора.

Способ осуществляли следующим образом:

а) Получение биологического материала - опухолевой ткани, замороженной в жидком азоте или фиксированной формальдегидом и заключенной в парафиновые блоки.

б) Выделение ДНК из опухолевой ткани депротеинизацией фенолом и хлороформом, а из парафиновых блоков - с использованием коммерческого набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen).

в) Амплификация фрагмента гена KRAS в симметричной ПЦР в реальном времени. Реакцию проводили в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Инкубационная смесь (25 мкл) содержала 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 0,01% Tween 20; 2,5 мМ MgCl2; по 0,2 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов; по 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров; по 0,1 мкМ зондов TaqMan K2-ROX(25)s и K2-Cy5(25)as (см. табл. 1); 1,5 ед. Hot-rescue Taq полимеразы; 5 мкл раствора ДНК (30-100 нг) в воде. Условия ПЦР: начальная денатурация - 5 мин при t=95°C, после чего 50 циклов плавления (15 сек при t=95°C), отжига (30 сек при t=56°C) и элонгации (30 сек при t=72°C) с регистрацией флуоресценции.

г) Плавление дуплексов однонитевых ампликонов с зондами TaqMan: продукты реакции денатурировали 3 мин при t=95°С, выдерживали 3 мин при t=55°С, после чего повышали температуру до t=85°C с шагом 0,4°С (выдержка 10 сек); данные анализировали с помощью программы Bio-Rad CFX Manager (version 1.6).

Продолжительность ПЦР и плавления ДНК составляет ~2,5 часа.

Способ иллюстрирован табл. 1, фиг. 1 (А, В, С), 2, 3, 4, 5 (А и В), 6 (А и В).

В табл. 1 представлены последовательности праймеров и зондов, использованных для мутационного сканирования экзона 2 гена KRAS (кодоны 12 и 13). Специфические последовательности праймеров указаны строчными буквами; в комбинированных праймерах универсальная последовательность показана прописными буквами и выделена жирным шрифтом, а специфическая последовательность - строчными буквами. В названии зонда TaqMan указаны соответствующий ампликон, флуорофор, длина олигонуклеотида и его направление (смысловой или антисмысловой).

На фиг. 1 (А, В, С) представлены этапы сканирования генных мутаций методом симметричной ПЦР в реальном времени с последующим плавлением ДНК с зондами TaqMan в приборе Bio-Rad CFX96: на фиг. 1(A) - симметричная ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan сопровождается усилением флуоресценции из-за гидролиза зонда, что позволяет в реальном времени судить о ходе реакции; на фиг. 1 (В) - плавление дуплексов приводит к фазовому переходу ДНК из двунитевой в однонитевую форму, что сопровождается падением флуоресценции; на фиг. 1 (С) - пики плавления (отрицательные первые производные кривых плавления по температуре): симметричный пик, гомодуплекс (кривая 1) свидетельствует о присутствии только аллеля дикого типа, тогда как дополнительный пик гетеродуплекса слева (кривая 2) свидетельствует о присутствии мутантного аллеля.

На фиг. 2 схематически представлены ампликоны размером 114 пар оснований, синтезированные согласно прототипу с использованием специфических праймеров, и размером 174 пар оснований, синтезированные заявляемым способом с использованием комбинированных праймеров. Указано расположение праймеров, зондов и кодонов 12 и 13, где мутации возникают особенно часто. Зонды смещены друг относительно друга (перекрывание - 8 оснований) для того, чтобы исключить возможность их гибридизации, конкурентной по отношению к гибридизации каждого из них с ДНК (во время ПЦР в реальном времени и плавления).

На фиг. 3 схематически представлены продукты ПЦР в реальном времени, возникающие при реализации прототипа и заявляемого способа. После денатурации при t=95°C и при последующем охлаждении продукты прототипа представляют собой линейные дуплексы, состоящие из двух комплементарных нитей; в заявляемом способе наряду с линейными двунитевыми дуплексами формируются структуры типа «сковородки», «ручка» которой образована комплементарными «липкими концами», а однонитевая последовательность способна взаимодействовать с зондом TaqMan.

На фиг. 4. представлена электрофореграмма продуктов ПЦР в реальном времени, синтезированных в соответствии с заявляемым способом. Ампликоны разделяли методом SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), позволяющим эффективно разделять однонитевые ДНК (12% полиакриламидный гель; отношение акриламид/бисакриламид 1:50; 0,5 х кратный трис-ацетатный буфер, рН 8; 400 V, 2,5 час при t=4°C). Показано положение маркеров молекулярного веса (дорожка М), линейного дуплекса размером 174 п.о., а также смысловой и антисмысловой «сковородок», которые обозначены как Ск-с и Ск-ас соответственно (дорожка 1). При добавлении к среде зондов TaqMan K2-ROX(25)s и K2-Cy5(25)as раздельно или вместе (дорожки 2, 3 и 4) электрофоретические подвижности антисмысловой и смысловой «сковородок» меняются (соответствующие сдвиги указаны стрелками), что свидетельствует об образовании соответствующих гибридов (а и b). Эффект более выражен в в случае K2-ROX(25)s вследствие, по-видимому, более высокой способности связывания этого зонда.

На фиг. 5 (А и В) представлены результаты количественной симметричной ПЦР с использованием комбинированных праймеров TaqMan K2-ROX(25)s (кривые 1) и К2-Cy5(25)as (кривые 2), отражающих амплификацию антисмысловой и смысловой нитей ампликона соответственно. Стандартные кривые (В) свидетельствуют о высокой эффективности использованных комбинированных праймеров (эффективность обоих зондов превышает 98%; коэффициент R2 в обоих случаях 0,988). Таким образом, в отличие от прототипа, в котором проводится асимметричная ПЦР, не пригодная для количественных измерений, заявляемый способ совместим с количественной симметричной ПЦР, позволяющей оценивать амплификацию обеих нитей.

На фиг. 6 (А и В) представлены результаты двунитевого мутационного сканирования в соответствии с заявляемым способом гена KRAS в ДНК нормальной ткани (А) и гена KRAS, содержащего мутацию GGC13GAC, в ДНК рака толстой кишки (В). Кривая 1 - сканирование антисмысловой нити ампликона зондом K2-ROX(25)s; кривая 2 - сканирование смысловой нити ампликона зондом K2-Cy5(25)as. Стрелками указаны гомодуплексы (дикий тип, wt) и идентифицирующие мутацию гетеродуплексы (mut).

Одновременное сканирование обеих нитей ампликона повышает надежность и чувствительность анализа, поскольку разные мутации по-разному проявляют себя при тестировании комплементарных нитей, не требует проведения с этой целью двух независимых ПЦР, что сокращает вдвое затраты времени, труда и расходных материалов. Величина температурных сдвигов гетеродуплексов относительно соответствующих гомодуплексов позволяет судить во многих случаях о конкретном типе мутации.

Способ сканирования генных мутаций в опухолях человека, включающий амплификацию исследуемого фрагмента гена, плавление дуплексов зондов TaqMan с однонитевыми ампликонами, построение пиков плавления, идентификацию мутаций по асимметрии пиков плавления, отличающийся двунитевым сканированием генных мутаций посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, используемыми для пост-амплификационного плавления ДНК.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены изолированный полинуклеотидный субстрат для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью и его применение, способ детектирования присутствия мишени в образце, использующий указанный субстрат, а также набор для детекции молекулы-мишени и комплект для детекции молекулы-мишени, содержащие указанный субстрат, и набор для применения в сигнальном каскаде, содержащий указанный комплект.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены изолированный полинуклеотидный субстрат для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью и его применение, способ детектирования присутствия мишени в образце, использующий указанный субстрат, а также набор для детекции молекулы-мишени и комплект для детекции молекулы-мишени, содержащие указанный субстрат, и набор для применения в сигнальном каскаде, содержащий указанный комплект.

Представлен способ амплификации и секвенирования целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты. Способ включает (a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего целевые локусы, в контакт с библиотекой тестовых праймеров, содержащей по меньшей мере 1000 разных тестовых праймеров, при этом концентрация каждого тестового праймера составляет менее 20 нМ; (b) амплификация реакционной смеси с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), при этом ПЦР включает этап отжига с продолжительностью более 10 минут; при этом одновременно амплифицируют по меньшей мере 1000 разных целевых локусов и при этом (i) менее 20% амплифицированных продуктов представлено димерами тестовых праймеров, (ii) по меньшей мере 80% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами и (iii) амплифицируется по меньшей мере 80% целевых локусов; и (c) секвенирование амплифицированных продуктов.

Представлен способ амплификации и секвенирования целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты. Способ включает (a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего целевые локусы, в контакт с библиотекой тестовых праймеров, содержащей по меньшей мере 1000 разных тестовых праймеров, при этом концентрация каждого тестового праймера составляет менее 20 нМ; (b) амплификация реакционной смеси с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), при этом ПЦР включает этап отжига с продолжительностью более 10 минут; при этом одновременно амплифицируют по меньшей мере 1000 разных целевых локусов и при этом (i) менее 20% амплифицированных продуктов представлено димерами тестовых праймеров, (ii) по меньшей мере 80% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами и (iii) амплифицируется по меньшей мере 80% целевых локусов; и (c) секвенирование амплифицированных продуктов.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, эпидемиологии. Изобретение может быть использовано для внутривидовой дифференциации штаммов Histoplasma capsulatum специалистами референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней, а также научно-исследовательских организаций эпидемиологического и микробиологического профиля.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, эпидемиологии. Изобретение может быть использовано для внутривидовой дифференциации штаммов Histoplasma capsulatum специалистами референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней, а также научно-исследовательских организаций эпидемиологического и микробиологического профиля.

Изобретение относится к области наноконструирования и может быть использовано для получения новых систем доставки терапевтических и тераностических средств, для создания диагностикумов, рН-чувствительных биогелей, 3D элементов биоэлектроники.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Указанный набор предназначен для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) методом ПЦР и состоит из следующих праймеров: dr1in6s 5’-GGATCCTCCTCCAGCTCCTG-3’, dr1in2a 5’-CCGCTCCGTCCCATTGAAGA-3’, A1in1s 5’-CTCCGAACCCTCCTCCTGCTA-3’, A1in2a 5’-GCTGTCGAACCGCACGGACTG-3’.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Указанный набор предназначен для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) методом ПЦР и состоит из следующих праймеров: dr1in6s 5’-GGATCCTCCTCCAGCTCCTG-3’, dr1in2a 5’-CCGCTCCGTCCCATTGAAGA-3’, A1in1s 5’-CTCCGAACCCTCCTCCTGCTA-3’, A1in2a 5’-GCTGTCGAACCGCACGGACTG-3’.

Группа изобретений касается онкологии и фармакологии. Предложено терапевтическое и/или профилактическое средство против опухоли с мутацией в RET и против метастазов опухоли, которое содержат соединение формулы (I), где R - C1-6-алкил, его соль или его сольват в качестве активного ингредиента; терапевтическое и/или профилактическое средство того же состава, используемое для пациента с мутацией в RET и против метастазов опухоли; способ идентификации рака или пациента, реагирующего на лечение соединением формулы (I).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены изолированный полинуклеотидный субстрат для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью и его применение, способ детектирования присутствия мишени в образце, использующий указанный субстрат, а также набор для детекции молекулы-мишени и комплект для детекции молекулы-мишени, содержащие указанный субстрат, и набор для применения в сигнальном каскаде, содержащий указанный комплект.

Представлен способ амплификации и секвенирования целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты. Способ включает (a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего целевые локусы, в контакт с библиотекой тестовых праймеров, содержащей по меньшей мере 1000 разных тестовых праймеров, при этом концентрация каждого тестового праймера составляет менее 20 нМ; (b) амплификация реакционной смеси с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), при этом ПЦР включает этап отжига с продолжительностью более 10 минут; при этом одновременно амплифицируют по меньшей мере 1000 разных целевых локусов и при этом (i) менее 20% амплифицированных продуктов представлено димерами тестовых праймеров, (ii) по меньшей мере 80% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами и (iii) амплифицируется по меньшей мере 80% целевых локусов; и (c) секвенирование амплифицированных продуктов.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, эпидемиологии. Изобретение может быть использовано для внутривидовой дифференциации штаммов Histoplasma capsulatum специалистами референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней, а также научно-исследовательских организаций эпидемиологического и микробиологического профиля.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Указанный набор предназначен для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) методом ПЦР и состоит из следующих праймеров: dr1in6s 5’-GGATCCTCCTCCAGCTCCTG-3’, dr1in2a 5’-CCGCTCCGTCCCATTGAAGA-3’, A1in1s 5’-CTCCGAACCCTCCTCCTGCTA-3’, A1in2a 5’-GCTGTCGAACCGCACGGACTG-3’.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской генетике и офтальмологии, и предназначено для ДНК-диагностики врожденной формы катаракты. Из периферической крови выделяют ДНК.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле рекомбинантной ДНК, указывающей на присутствие трансгенного события, где показательный образец семени, содержащего указанное трансгенное событие, депонирован в ATCC как РТА-12669.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для диагностики метастазов рака толстой кишки. Из тканевых проб толстой кишки выделяют тотальную ДНК.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, гинекологии, репродуктологии и иммунологии, и предназначено для прогнозирования результативности программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству и гинекологии. Предложен способ выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья. Из периферической венозной крови выделяют ДНК. Методом полимеразной цепной реакции анализируют полиморфизмы генов rs1398217, rs1073768, rs4986938. В случае выявления сочетания аллеля G rs1398217 с аллелем A rs1073768 с генотипом АА rs4986938 прогнозируют повышенный риск развития гиперпластических процессов эндометрия. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития гиперпластических процессов эндометрия. 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ сканирования генных мутаций в опухолях человека, включающий амплификацию исследуемого фрагмента гена, плавление дуплексов зондов TaqMan с однонитевыми ампликонами, построение пиков плавления, идентификацию мутаций по асимметрии пиков плавления, отличающийся двунитевым сканированием генных мутаций посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, используемыми для пост-амплификационного плавления ДНК. Способ позволяет проводить количественные измерения числа копий анализируемого гена в исходном образце ДНК, а также сканировать мутации одновременно в обеих нитях ампликона, что повышает надежность и чувствительность анализа и дает дополнительную информацию о типе мутации. 6 ил., 1 табл.

Наверх