Способ криопротекции свободноплавающих срезов мозга для иммуногистохимического исследования

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ криопротекции свободноплавающих срезов мозга для иммуногистохимического исследования, включающий фиксирование срезов мозга в растворе формальдегида, помещение их в раствор на основе фосфатно-солевого буфера NaCl, Na2HPO4 и NaH2PO4 с криопротектором и хранение при пониженной температуре, отличающийся тем, что в качестве криопротектирующего вещества в раствор добавляют глицерин в объемном соотношении 50:50. Изобретение позволяет создать более экономический способ криопротекции срезов мозга и менее трудоемкий процесс его приготовления из-за уменьшения числа компонентов криопротектирующего раствора. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине и биологии, а конкретно к способам заключения и хранения гистологических препаратов. Может быть использовано в нейробиологии для длительного хранения срезов мозга при низкой температуре и последующего иммуногистохимического исследования.

Существуют различные способы криопротекции срезов мозга. Общим для них является помещение срезов мозга в раствор, содержащий компоненты, предотвращающие замерзание раствора и ткани при пониженной температуре [1].

Наиболее близким (прототипом) является метод криопротекции, предложенный R. E. Watson с соавторами [2], который состоит в помещении свободноплавающих срезов мозга в раствор, содержащий 4 различных компонента: фосфатно-солевой буфер (содержащий соли NaCl, Na2HPO4 и NaH2PO4), сахарозу, поливинилпирролидон и этиленгликоль.

Задачей изобретения является создание более экономичного способа криопротекции срезов мозга и менее трудоемкого процесса его приготовления за счёт уменьшения числа компонентов криопротектирующего раствора.

Поставленная задача решается использованием в качестве криопротектора раствора, содержащего всего два компонента: фосфатно-солевой буфер (содержащий соли NaCl, Na2HPO4 и NaH2PO4) и глицерин в объемном соотношении 50:50.

Способ состоит в помещении предварительно зафиксированных в 4% формальдегиде срезов мозга в 50% раствор глицерина в фосфатно-солевом буфере, выдерживании в течение часа при комнатной температуре и последующем помещении раствора вместе со срезами на хранение при температуре ниже -20°С.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что раствор для криопротекции срезов мозга содержит только два компонента: фосфатно-солевой буфер и нейтральный для гистохимических препаратов глицерин. Использование раствора глицерина на основе фосфатно-солевого буфера в качестве средства криопротекции срезов мозга не описано в доступной литературе. Совокупность признаков явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники.

Предложенный метод криопротекции срезов мозга можно использовать в иммуногистохимических исследованиях нервной ткани мозга.

Пример

Для хранения срезов мозга 500 мл раствора, содержащего 86 г NaCl, 25 г Na2HPO4x12H2O и 4,7 г NaH2PO4x2H2O, смешали с 500 мл глицерина. Эксперимент проводился на 10 образцах мозга мыши, зафиксированных в 4% формальдегиде. Из каждого образца было получено по 15 коронарных двадцатимикронных (20 мкм) срезов обонятельной луковицы, которые были помещены в фосфатно-солевой буфер. Срезы от первых 5 образцов были сразу окрашены иммуногистохимически на белок даблкортин (DCX) – широко использующийся в нейробиологии маркер нейрогенеза.

Срезы от других 5 образцов были переведены в криопротектирующий раствор глицерина на основе фосфатно-солевого буфера и через час помещены в этом растворе на хранение при температуре ниже -20°С. После 4 месяцев хранения эти срезы были вновь переведены в фосфатно-солевой буфер и затем окрашены иммуногистохимически на белок даблкортин (DCX).

Тщательная оценка иммуногистохимических препаратов срезов мозга второй серии не позволила обнаружить повреждения, вызванные замораживанием, размораживанием и хранением.

На фиг. 1 представлены результаты иммуногистохимического окрашивания срезов мозга на белок даблкортин (маркер нейрогенеза). Синее: хроматин клеток, помеченный DAPI. Зелёное: белок даблкортин в молодых нейронах, помеченный антителом, связанным с красителем Alexa Flour 488. А – срез мозга, окрашенный до криопротекции и хранения. Б – срез мозга, окрашенный после криопротекции и хранения.

Статистический анализ результатов окрашивания на даблкортин (фиг. 2) показал отсутствие значимых различий между двумя сериями (P<0.05). Следовательно, замораживание, размораживание и хранение не привели к значимому разрушению или денатурации белка в срезах мозга.

Это говорит о том, что хранение срезов мозга в растворе 50% раствора глицерина на основе фосфатно-солевого буфера NaCl, Na2HPO4 и NaH2PO4 достаточно для криопротекции срезов мозга.

Таким образом, предложен более экономичный и менее трудоемкий способ криопротекции свободноплавающих срезов мозга, предназначенных для хранения при низкой температуре и последующего иммуногистохимического исследования.

Литература

1. Hoffman, G.E., Le, W.W., 2004. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides 25, 425-431.

2. Watson RE, Wiegand SJ, Clough RW, Hoffman GE. Use of cryoprotectant to maintain longterm peptide immunoreactivity and tissue morphology. J Peptides 1986; 7:155–9.

Способ криопротекции свободноплавающих срезов мозга для иммуногистохимического исследования, включающий фиксирование срезов мозга в растворе формальдегида, помещение их в раствор на основе фосфатно-солевого буфера NaCl, Na2HPO4 и NaH2PO4 с криопротектором и хранение при пониженной температуре, отличающийся тем, что в качестве криопротектирующего вещества в раствор добавляют глицерин в объемном соотношении 50:50.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к охране окружающей среды, и может быть использовано для безопасной утилизации инфицированных сибирской язвой трупов животных.

Изобретение относится к области криоконсервации биологического материала, в частности сосудистых аллотрансплантатов. Предлагаемый способ криоконсервации сосудистых аллотрансплантатов включает сверхбыстрое охлаждение аллотрансплантатов до температуры -80 С° и хранение при этой температуре, при этом аллотрансплантаты крепятся на стерильные силиконовые или пластиковые полые подложки с диаметром на 15% меньше внутреннего диаметра сосудов и предварительно охлаждаются до +4°С, а для криоконсервации в качестве хладагента и непроникающего криопротектора применяется полидиметилсилоксан (ПДМС) вязкостью в 1 сСт с температурой -80°С.

Изобретение относится к новым производным 2-меркаптобензтеллуразола, имеющим структурную формулу Соединения обладают биологической активностью, а именно обладают способностью снижать содержание тиоловых групп в плазме крови и содержание глюкозы, что позволяет применять их для борьбы с грызунами.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Гербицидная композиция содержит синергетически гербицидно эффективное количество (а) фенокссулама или его сельскохозяйственно приемлемой соли и (b) пентоксамида или его сельскохозяйственно приемлемой соли.
Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для получения донорской боуменовой мембраны удаляют эпителий с роговицы донорского глаза.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ хранения почек поросят при субнормальных температурах (0÷4°C) от 2 до 7 суток для получения монослоя первично трипсинизированных культур.
Изобретение относится к области криобиологии и медицине, а именно, к технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток крови (ЯКК) человека. Способ криоконсервирования ядросодержащих клеток крови предусматривает смешивание криопротектора ДМСО с 6% декстраном (полиглюкин) в условиях гипотермии +4°С до получения 10% концентрации, добавление к концентрату ЯКК в равных объемах, фасовку в пластиковую тару и помещение в программный замораживатель.

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии, и может быть использовано для приготовления учебных препаратов коленного сустава. Для изготовления влажного анатомического препарата коленного сустава используют отпрепарированный путем удаления кожи, подкожной клетчатки, поверхностной фасции, собственной фасции и параартикулярных мышц и сухожилий сустав.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к агрохимическим составам. Состав для протравливания семян сельскохозяйственных культур в качестве активных компонентов содержит, г/л: ацетамиприд 80-170, флудиоксонил 20-40, ципроконазол 5-10, 4-хлорфенилуксусную кислоту 0,1-0,3, алкилполисахарид с углеродной цепью С8-С10 30-100 и вспомогательные добавки в количестве до 1 л состава.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к средам для искусственного осеменения сельскохозяйственной птицы. Среда для разбавления спермы птицы изготовлена путем растворения в 100 мл бидистиллированной воды сухих компонентов, взятых при следующем соотношении (г): сахароза - 4,0-5,0, глюкоза - 0,3-0,5, уксуснокислый натрий - 1,1-1,6, углекислый кислый натрий - 0,1-0,2, щавелевая кислота - 0,02-0,04, при этом среда обеспечивает время хранения разбавленной спермы при сохранении оплодотворяющей способности для кур 24 часа, цесарок и индеек - 7 часов, уток - 4 часа, гусей - 3 часа.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены композиции для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов (варианты), а также средство для пропитки гигроскопичных материалов-носителей и осуществления смывов ДНК-содержащих биологических следов, наложений или ДНК с целью их хранения и/или транспортировки, где данное средство представляет собой вышеуказанные композиции. Причём композиции включают 1-40 мΜ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Твин 20, 0,05-1% об. Тритон Х-100, 1-200 мМ K2SO4, 1-200 мМ KCl, 0,01-0,5 мМ ЭДТА, 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN3 и воду. Изобретения обеспечивают стабильность ДНК биологических образцов в широком диапазоне температур в течение длительных периодов времени. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, ил.,0 табл., 6 пр.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ криопротекции свободноплавающих срезов мозга для иммуногистохимического исследования, включающий фиксирование срезов мозга в растворе формальдегида, помещение их в раствор на основе фосфатно-солевого буфера NaCl, Na2HPO4 и NaH2PO4 с криопротектором и хранение при пониженной температуре, отличающийся тем, что в качестве криопротектирующего вещества в раствор добавляют глицерин в объемном соотношении 50:50. Изобретение позволяет создать более экономический способ криопротекции срезов мозга и менее трудоемкий процесс его приготовления из-за уменьшения числа компонентов криопротектирующего раствора. 2 ил., 1 пр.

Наверх