Способ ранней диагностики острого инфекционного эндокардита

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ранней диагностики острого инфекционного эндокардита (ИЭ). Проводят забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию и генотипирование полиморфного локуса -455G-A гена FGB у лиц группы риска. У носителей генотипа -455А-А диагностируют острый ИЭ с 13,09-кратным риском его развития. Изобретение позволяет дифференцировать острый ИЭ от сепсиса на основании генетически детерминированной предрасположенности к ИЭ русских мужчин, носителей генотипа -455А-А гена FGB. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и хирургии, и может быть использовано для ранней дифференциальной диагностики острого инфекционного эндокардита и сепсиса.

Инфекционный эндокардит (ИЭ) - одно из самых тяжелых заболеваний сердечно-сосудистой системы с летальным исходом в 20-30% случаев. В группу повышенного риска входят лица с ревматическими пороками сердца, дегенеративными изменениями клапанов, ПМК, искусственными клапанами, врожденными и приобретенными пороками сердца, после операций на сердце, а так же употребляющие наркотики внутривенно. В последние годы участились случаи возникновения ИЭ без наличия известных предрасполагающих факторов риска.

Основными осложнениями ИЭ являются прогрессирующая сердечная недостаточность и тромбоэмболии. По клиническому течению традиционно выделяют острый и подострый эндокардит [Руководство по кардиологии: Учебное пособие в 3 т. / Под ред. Г.И. Сторожакова, А.А. Горбаченкова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008; Т. 1. 672 с]. Острый ИЭ нередко протекает по типу сепсиса с выраженной интоксикацией, от которого его отличает наличие вегетаций на клапанах сердца - тромбов с обильным содержанием микроорганизмов. Оба заболевания имеют сходные факторы риска и характеризуются диссеминацией инфекции и неблагоприятным прогнозом. Диагностика острого ИЭ часто представляет большие трудности даже с использованием современных критериев Duke [Тюрин В.П., Шевченко Ю.Л., ред. Инфекционные эндокардиты. 2-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2012. 358 с]. Перечень заболеваний, с которыми приходится дифференцировать острый ИЭ на ранних стадиях развития, чрезвычайно широк и охватывает системные, злокачественные, инфекционные заболевания, в том числе сепсис [А.А Свистунов, М.А Осадчук. Заболевания миокарда, эндокарда и перикарда - М.: Лаборатория знаний; 2016. с. 78-101]. У пациентов с сепсисом при проведении эхокардиографии микробные вегетации и другие признаки поражения эндокарда не выявляются. [Поляков В.П., Николаевский Е.Н., Пичко Г.А. Некоронарогенные и инфекционные заболевания сердца (современные аспекты клиники, диагностики, лечения): Монография. - Самара, 2010 г. - 355 с.]. Для обнаружения признаков поражения эндокарда - тромбов с большим содержанием микроорганизмов, чаще применяется трансторакальная эхокардиография, но она недостаточно эффективна в диагностике начальных стадий ИЭ, т.к. с ее помощью выявляются подвижные вегетации размером более 5 мм. В диагностике ранних стадий ИЭ все большее значение приобретает чреспищеводная эхокардиография. В диагностике вегетаций на нативных и протезированных клапанах чувствительность трансторакальной эхокардиографии составляет 70% и 50%, чреспищеводной эхокардиографии - 96% и 92%, соответственно. Специфичность для обоих методов - примерно 90%. Выявление вегетаций может быть затруднено при наличии предшествовавшего поражения клапанов (пролапс митрального клапана, дегенеративные кальцифицированные участки), на протезах клапанов, при небольшом (<2-3 мм) их размере.

Диагноз может быть особенно сложным при вовлечении в ИЭ внутрисердечных устройств, даже при использовании чреспищеводной эхокардиографии. Ошибка в диагнозе ИЭ может быть обусловлена трудностью в распознавании вегетаций и тромбов на клапанах при синдроме Труссо, марантическом эндокардите и СКВ (эндокардит Либмана-Сакса), антифосфолипидном синдроме. Потому данные эхокардиографического исследования следует интерпретировать с осторожностью, принимая во внимание клиническую картину и вероятность ИЭ [Российский кардиологический журнал 2016, 5 (133): 65-116. Клинические рекомендации].

Острый ИЭ имеет длительность течения до 2 месяцев. Однако деструкция клапана может развиться очень быстро - через 7-10 дней от появления первых признаков болезни, что нередко требует хирургического лечения - протезирования пораженного клапана. Заболевание вызывается обычно высоковирулентной флорой (золотистый стафилококк, синегнойная палочка), протекает тяжело, быстро развивается сердечная недостаточность [Руководство по кардиологии: Учебное пособие в 3 т. / Под ред. Г.И. Сторожакова, А.А. Горбаченкова. - М.: ГЭОТАР-Медиа; 2008. Т. 1. 672 с.].

Трудность диагностики ИЭ, частые неблагоприятные исходы и появление группы лиц с высоким риском инфекции (использующие наркотики внутривенно) требуют дополнительных методов его диагностики.

Вероятность развития ИЭ может быть связана с генетически детерминированной предрасположенностью индивида к данному заболеванию. Молекулярно-генетические исследования ИЭ, проводимые в последнее десятилетие, немногочисленны и неоднозначны, посвящены, в основном, изучению ассоциаций ИЭ с полиморфизмом генов системы врожденного иммунитета [Bustamante J., Tamayo Е., Florez S., Telleria J.J., Bustamante E., Lopez J., San Roman J.A., Alvarez F.J. Toll-Like Receptor 2 R753Q Polymorphisms Are Associated With an Increased Risk of Infective Endocarditis. Rev. Esp. Cardiol. 2011; 64 (11):1056-9; Понасенко A.B., Кутихин А.Г., Хуторная M.B., Южалин А.Е., Рутковская Н.В., Головкин А.С., Барбараш Л.С. Связь полиморфизмов генов системы TLR с риском развития инфекционного эндокардита. Медицина в Кузбассе. 2015; XIV (4): 4-10].

Нами впервые был проведен успешный поиск генетических маркеров риска ИЭ среди ферментов системы детоксикации ксенобиотиков (СДК) и найдены варианты генов цитохрома Р450 1А1 (CYP1A1) и глутатион-S-трансферазы-Пи1 (GSTP1), носительство которых повышает риск заболеть ИЭ при наличии таких факторов, как внутривенная наркомания, врожденные и приобретенные пороки сердца, протезированные клапаны сердца, пролапс митрального клапана 2-3 степени с систолическим шумом, атеросклеротическая деформация митрального и аортального клапанов [Мальцева Н.В., Лапутенко Т.А., Лыкова О.Ф., Горбатовский Я.А. Полиморфизмы генов ферментов системы детоксикации ксенобиотиков и риск развития инфекционного эндокардита. Клиническая медицина. 2016; 94(8):596-601].

Известен способ определения высокого риска развития ИЭ у носителей гетерозиготного генотипа I105V гена GSTP1 [Мальцева Н.В., Лапутенко Т.А., Горбатовский Я.А., Онищенко А.Л., Лыкова О.Ф., Панченко В.А., Батаева М.Е. Способ прогнозирования риска развития инфекционного эндокардита. Патент РФ №2587753; 2016]. Способ заключается в выделении геномной ДНК из образцов крови, взятой в пробирки с антикоагулянтом - этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), определении полиморфизма I105V в гене GSTP1 пациентов группы риска с помощью полимеразной цепной реакции и электрофоретического анализа полученных ПЦР-продуктов. При выявлении на электрофореграмме гетерозиготного варианта I105V у его носителей прогнозируют 13-кратный риск развития ИЭ. В группу риска входят лица с внутривенной наркоманией, с врожденными и приобретенными пороками сердца, наличием пролапса клапанов, после протезирования клапанов сердца, при кальцинозе клапанов сердца, с клапанной недостаточностью, с очагами хронической инфекции и клиникой вторичных иммунодефицитных состояний.

Однако при разработке вышеуказанного способа для выявления генетического маркера риска развития ИЭ нами было проведено генотипирование 32 больных ИЭ без учета течения заболевания (острое и подострое), в сравнении с 55 практически здоровыми индивидами, т.е. не было учтено, что ИЭ может существовать в двух нозологических формах - острой, т.е. септической, и подострой [Т.Л. Виноградова. Инфекционный эндокардит: современное течение. Клиницист. 2011; 3:4-9].

Образованию тромбов с обильным содержанием микроорганизмов при ИЭ (вегетаций) может способствовать генетически детерминированная склонность к тромбообразованию, которая зависит от многих генов, кодирующих факторы системы гемостаза.

Назначением настоящего изобретения является разработка способа ранней диагностики острого инфекционного эндокардита у септических больных посредством определения аллельных вариантов генов, способствующих образованию вегетаций на эндокарде.

Назначение изобретения достигается способом ранней диагностики острого инфекционного эндокардита (ИЭ), характеризующимся тем, что проводят забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение аллель-специфической полимеразной цепной реакции, определение однонуклеотидного полиморфизма -455G-A в гене β-фибриногена FGB (G/A-455, rs1800790) при генотипировании лиц русской национальности мужского пола с сепсисом и у носителей генотипа -455А-А гена FGB диагностируют инфекционный эндокардит с 13,09-кратным риском его развития.

Новизна изобретения

1. Генотипирование по полиморфному локусу -455G-А в гене FGB лиц группы риска позволяет дифференцировать острый инфекционный эндокардит от сепсиса на основании выявления гомозиготного носительства аллеля -455А гена FGB.

2. У носителей генотипа -455А-А гена FGB среди лиц группы риска диагностируют острый инфекционный эндокардит с 13,09-кратным риском его развития.

3. В группу риска входят лица русской национальности мужского пола с сепсисом.

В патентной и научной литературе отсутствуют сведения об аналогичном способе дифференциальной диагностики инфекционного эндокардита и сепсиса лиц русской национальности мужского пола.

Совокупность существенных признаков изобретения позволила получить новый технический результат, позволяющий дифференцировать острый ИЭ от сепсиса на основании генетически детерминированной предрасположенности к ИЭ русских мужчин, носителей генотипа -455А-А гена FGB, что позволит своевременно верифицировать острый инфекционный эндокардит и поможет определить тактику ведения пациентов.

Давний повышенный интерес ученых к плазменному белку фибриногену обусловлен результатами нескольких эпидемиологических исследований, показавших выраженную связь между плазменным уровнем фибриногена и риском развития инфаркта миокарда (Meade T.W., Brozovic М., Haines А.Р., Imenson J.D., Mellows S., Miller G.J., North M.R.S, Stirling Y., Thompson S.G. Haemostatic function and ischaemic heart disease: principal results of the Northwick Park Heart Study. Lancet. 1986; 2: 533-8.; Yarnell J.W.G, Baker LA, Sweetnam P.M., Bainton D., O'Brien J.R., Whitehead P.J., Elwood P.C. Fibrinogen, viscosity, and white blood cell count are major risk factors for ischemic heart disease: the Caerphilly and Speedwell Collaborative Heart Disease Studies. Circulation. 1991; 83: 836-44; Heinrich J., Balleisen L., Schulte H., Assmann G., van de Loo J. Fibrinogen and factor VII in the prediction of coronary risk: results from the PROCAM study in healthy men. Arterioscler. Thromb. 1994; 14: 54-9. Correction: 1994; 14: 1392].

Положительная ассоциация между повышенным уровнем фибриногена в плазме крови и тромбообразованием в кровеносных сосудах была также обнаружена [Smith Е.В. Fibrinogen, fibrin and fibrin degradation products in relation to atherosclerosis. Clin Haematol. 1986; 15: 355-70; Naito M., Hayashi Т., Ku-zuya M., Funaki C., Asai K., Kuzuya F. Effects of fibrinogen and fibrin on the migration of vascular smooth muscle cells in vitro. Atherosclerosis. 1990; 83: 9-14].

Фибриноген, растворимый предшественник фибрина, является плазменным гликопротеином, синтезируемым в печени. Он состоит из трех структурно различных субъединиц: альфа (α), бета (β) и гамма (γ). При свертывании крови растворимые молекулы фибриногена подвергаются ферментативному расщеплению тромбином, образуя далее под действием активированного фибрин-стабилизирующего фактора FXIII осадок в виде фибрина, который формирует тромб, завершая процесс свертывания. Каждая из субъединиц фибриногена (α, β, γ) кодируется отдельным геном. Все три гена находятся в 50 kb области локуса 4q28 [Kant J.A., Fornace A.J. Jr., Saxe D., Simon M.I., McBride O.W., Crabtree G.R. Evolution and organization of the fibrinogen locus on chromosome 4: gene duplication accompanied by transposition and inversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985; 82 (8): 2344-8].

Ген FGB кодирует β-полипептидную цепь фибриногена. Несколько полиморфизмов выявлены в этом гене. Некоторые аллели этих локусов ассоциируются с концентрацией фибриногена в плазме крови и влияют на развитие предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям [Van't Hooft F.M., von Bahr S.J., Silveira A., Iliadou A., Eriksson P., Hamsten A. Two common, functional polymorphisms in the promoter region of the beta-fibrinogen gene contribute to regulation of plasma fibrinogen concentration. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19 (12): 3063-70].

Один из полиморфизмов, определяющий замену нуклеотидов G→A в позиции -455 промотора гена FGB, ассоциирован с повышенной концентрацией фибриногена в плазме крови и усиленным риском тромбообразования [Green F.R. Fibrinogen polymorphisms and atherothrombotic disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001; 936: 549-59]. Его вариант, аллель -455A, с частотой встречаемости в популяции Копенгагена 0,20 (редкий аллель) связан с увеличением плазменного уровня фибриногена как у мужчин, так и у женщин [Tybjaerg-Hansen A., Agerholm-Larsen В., Humphries S.E., Abildgaard S., Schnohr P., Nor-destgaard B.G. A common mutation (G-455-->A) in the beta-fibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen, but not of ischemic heart disease. A study of 9,127 individuals based on the Copenhagen City Heart Study. J. Clin. Invest. 1997; 99 (12): 3034-9].

Показано, что у здоровых индивидов, являющихся гомозиготами по редкому аллелю (-455А) данного полиморфизма, определяется повышенный уровень фибриногена в крови, у индивидов-гомозигот по дикому аллелю (-455G) - сниженный его уровень, в то время как уровень фибриногена у гетерозигот промежуточный [Humphries S.E., Cook М., Dubowitz М., Stirling Y., Meade T.W. Role of genetic variation at the fibrinogen locus in determination of plasma fibrinogen concentrations. Lancet. 1987; 1: 1452-5; Cook M., Godiner N., Green F., Stirling Y., Meade T.W., Humphries S.E. Genetic control of plasma fibrinogen levels. In: Mosseson M.W., Amran D.L., Siebenlist K.R., DiOrio J.P., eds. Fibrinogen 3: Biochemistry, Biological Functions, Gene Regulations and Expression. New York, NY: Elsevier Science Publishing; 1988: 11-5; Berg K., Kierulf P. DNA polymorphisms at fibrinogen loci and plasma fibrinogen concentration. Clin Genet. 1989; 36: 229-235; Green F., Hamsten A., Blomback M., Humphries S. The role of β-fibrinogen genotype in determining plasma fibrinogen levels in young survivors of myocardial infarction and healthy controls from Sweden. Thromb. Haemost. 1993; 70: 915-20].

Найдено, что индивиды-носители редкого -455А аллеля гена β-фибриногена склонны к развитию инфаркта миокарда [Scarabin Р., Вага L., Ricard S., Poirier О., Cambou J.P., Arveiler D., Luc G., Evans A.E., Samama M.M., Cambien F. Genetic variation at the β-fibrinogen locus in relation to plasma fibrinogen concentrations and risk of myocardial infarction: the ECTIM study. Ar-terioscler Thromb. 1993; 13: 886-91; Behague I., Poirier O., Nicaud V., Evans A., Arveiler D., Luc G., Cambou J., Scarabin P., Bara L., Green F., Cambien F. β-Fibrinogen gene polymorphisms are associated with plasma fibrinogen and coronary artery disease in patients with myocardial infarction: the ECTIM study. Circulation. 1996; 93: 440-9].

Полагают, что у пациентов с ишемической болезнью сердца, носителей -455А аллеля гена FGB, может наблюдаться усиленная прогрессия заболевания, т.к. у них уровень фибриногена в крови резко повышается с запуском острофазового ответа [Moniek P.М. de Maat, John J.P. Kastelein, J. Wouter Jukema, Aeilko H. Zwinderman, Hans Jansen, Bjorn Groenemeier, Albert V.G. Bruschke, Cornelis Kluft. -455G/A Polymorphism of the β-Fibrinogen Gene is Associated With the Progression of Coronary Atherosclerosis in Symptomatic Men. Proposed Role for an Acute-Phase Reaction Pattern of Fibrinogen. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 1998; 18: 265-71].

Таким образом, в большинстве случаев носители -455А аллеля гена FGB имеют более высокий уровень плазменного фибриногена, который может приводить к гиперкоагуляции и увеличивать риск артериального тромбоза (Green F.R. Fibrinogen polymorphisms and atherothrombotic disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001; 936: 549-59).

Следовательно, скрининг по -455А аллелю гена FGB может помочь идентифицировать пациентов с высоким риском тромбообразования, развития инфекционного эндокардита с локальным образованием вегетаций на эндокарде и возможными последующими тромбоэмболическими осложнениями. Идентификация этих пациентов крайне важна для применения ранней терапии.

Способ осуществляется следующим образом.

Геномную ДНК выделяют из клеток периферической крови с помощью коммерческих реагентов «ДНК-экспресс-кровь-плюс» или «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех», Москва). Для генотипирования используют коммерческие комплекты реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека - «SNP-экспресс» (НПФ Литех, Москва). Генотипирование проводят по полиморфному локусу -455G-A гена FGB (Мутация фибриногена, бета) [НПФ Литех, Москва] с помощью метода аллель-специфической полимеразной реакции. Согласно инструкции к комплектам, с образцом выделенной ДНК осуществляют одновременно две реакции амплификации - с двумя парами аллель-специфичных праймеров, на параллельное выявление аллелей мутантного (редкого) и нормального (дикого) типа. Реакционная смесь для ПНР состоит из 5 мкл исследуемого образца ДНК и 20 мкл рабочей амплификационной смеси, содержащей 0,2 мкл рабочего раствора Taq полимеразы. Амплификацию проводят в автоматическом термоциклере Терцик («ДНК-Технология», Москва). Программа амплификации, соответственно инструкции, включает следующий температурный режим - 1 цикл при 93°C в течение 1 мин, 35 циклов с этапами денатурации ДНК в течение 10 сек при 93°C, отжига праймеров в течение 10 сек при 64°C и синтеза цепей в течение 20 сек при 72°C, и 1 цикл при 72°C в течение 1 мин. Анализ ПЦР-продуктов проводят после их электрофоретического разделения в 50 мл 3%-агарозного геля на 50×ТАЕ-буфере, в который до застывания вносят 5 мкл 1% раствора бромистого этидия. В каждом геле вырезают два ряда лунок - для детекции аллеля нормального типа и мутантного аллеля. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся полос. Гели анализируют в УФ-трансиллюминаторе ЕСХ-15М (Vilber Lourmat, Франция) с помощью гельдокументирующей видеосистемы GL-2 (Россия) и/или фотографируют при помощи цифрового фотоаппарата Canon PowerShot А590 IS в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм.

Изобретение иллюстрируется фотографиями Фиг. 1 и Фиг. 2.

На Фиг. 1 представлены результаты проведения генотипирования 18 обследуемых пациентов с диагнозом инфекционного эндокардита по полиморфизму -455G-A гена FGB в виде электрофореграммы, на которой показаны продукты амплификации исследуемого локуса в виде светящихся полос. К- - отрицательный контроль; K+ - положительный контроль; дорожки 1, 5, 8, 9, 12, 14, 17, 18 - гомозиготный нормальный генотип -455G-G; дорожки 3, 6, 10, 15 - гомозиготный мутантный генотип -455А-А, дорожки 2, 4, 7, 11, 13, 16 - гетерозиготный генотип -455G-A.

На Фиг. 2 представлены результаты проведения генотипирования 17 обследуемых пациентов с диагнозом сепсиса по полиморфизму -455G-A гена FGB в виде электрофореграммы, на которой показаны продукты амплификации исследуемого локуса в виде светящихся полос. K- - отрицательный контроль; K+ - положительный контроль; дорожки 1, 2, 4, 5, 6, 10, 11, 13-17 - гомозиготный нормальный генотип -455G-G; дорожки 3, 7, 8, 9, 12 - гетерозиготный генотип -455G-A.

Был обследовано 43 пациента (12 женщин и 31 мужчина) в возрасте от 26 до 67 лет, находившихся на стационарном лечении в терапевтических клиниках г. Новокузнецка с диагнозом острый инфекционный эндокардит, выставленным на основании критериев DUKE. Значительная часть из них принимали наркотики внутривенно (39 человек), у большинства обнаружено поражение трикуспидального клапана сердца (ТК). 1 человек страдал хронической болезнью почек с необходимостью проведения гемодиализа. У 3 больных выявлен ревматический порок митрального и аортального клапанов сердца (МК, АК), у всех проведено протезирование клапанов. Врожденные пороки сердца, пролапс митрального клапана 2-3 степени с систолическим шумом - обнаружены у 2-х пациентов, у 1 пациента - эндокардит с поражением ТК развился на фоне тяжелой вирусной инфекции. У всех пациентов неоднократно проводилось исследование крови на стерильность. У 26 больных выявлены золотистый стафилококк и зеленящий стрептококк, у 5 человек - другие возбудители (энтеробактерии, клебсиеллы, кишечная и синегнойная палочки). У остальных больных инфекционный агент не был обнаружен.

В качестве группы сравнения обследовано 60 пациентов (27 женщин и 33 мужчины) в возрасте от 26 до 75 лет, находившихся на стационарном лечении в терапевтических и хирургических клиниках г. Новокузнецка с диагнозом сепсиса, выставленным на основании критериев SOFA. У большей части пациентов (26 человек) сепсис был связан с острой патологией желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), развился после проведенного оперативного вмешательства, у 8 больных сепсис сформировался при внутривенной наркомании, у остальных пациентов - возник на фоне гнойных процессов кожи, подкожной клетчатки, острой гнойной патологии почек и простаты. При исследовании крови на стерильность у 7 пациентов с сепсисом выделена культура золотистого стафилококка, у 5 - зеленящий стрептококк, у остальных - энтеробактерии и другая флора.

Забор крови и молекулярно-генетические исследования осуществляли на основании информированного согласия обследованных лиц. Все обследованные лица проживали на территории Кемеровской области и принадлежали к русскому этносу.

Математическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакетов статистических программ InStatII, Microsoft Excel. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли стандартно при помощи программы Chi-sq Hardy-Weinberg equilibrium test calculator for biallelic markers. Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами обследованных лиц оценивали двусторонним точным критерием Фишера. Частота аллеля/генотипа определялась по соотношению количества его носителей к общему количеству носителей тестируемых аллелей/генотипов в исследуемой выборке. Относительный риск заболевания по исследуемому генотипу/аллелю вычисляли как соотношение шансов (OR-odds ratio): OR=(a×d)/(b×с), где а и b - количество больных с ИЭ, имеющих и не имеющих мутантный аллель (генотип) соответственно; с и d - количество больных с сепсисом, имеющих и не имеющих мутантный аллель (генотип) соответственно.

Результаты изучения распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса -455G-A гена FGB у обследованных лиц с острым ИЭ и сепсисом представлены в таблице 1. Они показывают, что гетерозиготный -455G-A и гомозиготный дикий -455G-G генотипы данного локуса встречались со сходной частотой как в группе с острым ИЭ, так и в группе пациентов с сепсисом (p>0,05). Однако носителей гомозиготного мутантного генотипа -455А-А среди пациентов с острым ИЭ было в 5 раз больше, чем при сепсисе (p=0,0034), что обусловило отклонение распределения генотипических вариантов тестируемого полиморфизма при ИЭ от равновесия Харди-Вайнберга (χ²=10,24; p=0,0014). В группе с сепсисом распределение частот генотипов не отличалось от указанного равновесия (χ²=0,10, p=0,7469) и частоты аллелей соответствовали популяционным данным, по которым частота встречаемости -455А аллеля гена FGB варьирует в этнических популяциях Европы и Восточной Азии от 0,160 до 0,280, а частота встречаемости -455G аллеля, соответственно, от 0,840 до 0,720 [https://alfred.med.yale.edu/alfred/SiteTable1A_working.asp?siteuid=SI000170I].

Полученные результаты позволили выявить высокий достоверный риск заболевания острым ИЭ у носителей генотипа -455А-А (OR=8,79, p=0,0034), аллеля -455А (OR=2,34, р=0,0097) и положительную корреляционную связь с ИЭ у носителей данного генотипического варианта (r=0,2999, р=0,0020).

Анализ частот встречаемости генотипов и аллелей тестируемого полиморфизма у обследуемых мужчин и женщин по отдельности выявил существенные тендерные различия. В группе с острым ИЭ среди 10 (24% человек от общего числа пациентов с острым ИЭ) обнаруженных гомозигот по мутантному аллелю -455А девять человек были мужчинами (90%) и только один (10%) - женщина. В группе с сепсисом таких носителей (-455А-А) было всего двое (3% от общего числа пациентов с сепсисом) - 1 мужчина и 1 женщина. Соответственно, риск заболевания острым ИЭ у мужчин оказался очень высоким и значимым (OR=13,09, p=0,0053), а у женщин выявлен не был. Корреляционная связь с заболеванием острым ИЭ у мужчин-носителей генотипа -455А-А была также выявлена (r=0,3579, p=0,0037).

Анализ возраста носителей гомозиготного генотипа -455А-А среди пациентов с ИЭ показал присутствие молодых людей (до 45 лет - 8 мужчин и 1 женщина) и зрелых (более 45 лет - 2 мужчины).

Таким образом, предложен способ ранней дифференциальной диагностики острого инфекционного эндокардита у септических больных на основании выявления высокого 13,09-кратного риска развития заболевания по результатам генотипирования по полиморфному локусу -455G-A в гене FGB лиц русской национальности мужского пола - носителей варианта 455А-А гена FGB.

Примечание: n - число вариантов генотипов/аллелей в абсолютном значении и в круглых скобках в долях (частота встречаемости); p - показатель статистической достоверности разницы частот генотипов/аллелей при ИЭ и сепсисе у обследованных лиц; OR - соотношение шансов (риск развития ИЭ); в квадратных скобках - 95%-доверительный интервал; r - коэффициент корреляции Спирмена; Р - показатель статистической достоверности корреляции.

В соответствии с рекомендациями Р. Флетчера и соавт. [Р. Флетчер, С. Флетчер, Э. Вагнер. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. «Медиа Сфера», М., 1998, 352 с. - стр. 66] для оценки чувствительности, специфичности, распространенности и прогностической ценности предлагаемого нами способа ранней дифференциальной диагностики острого ИЭ у лиц русской национальности мужского пола с сепсисом полученные нами данные были проанализированы с помощью четырехпольной таблицы 2. Чувствительность предлагаемого теста (доля лиц с положительным результатом теста в популяции с изучаемым заболеванием, т.е. доля лиц-носителей генотипа -455А-А гена FGB среди пациентов с острым ИЭ оказалась равной 9/(9+22)=0,29 (29%). Специфичность данного теста (доля лиц с отрицательным результатом теста в популяции без изучаемой болезни, т.е. доля лиц-носителей генотипов -455G-G/-455G-A гена FGB среди лиц с сепсисом) составила 32/(1+32)=0,97 (97%). Распространенность генотипа -455А-А гена FGB среди обследованных лиц с острым ИЭ и сепсисом составила (9+1)/(9+22+1+32)=0,16 (16%), распространенность генотипа -455А-А гена FGB среди обследованных лиц с острым ИЭ составила 9/(9+22)=0,29 (29%), распространенность генотипа -455А-А гена FGB среди обследованных лиц с сепсисом составила 1/(1+32)=0,03 (3%). Прогностическая ценность положительного результата теста (вероятность наличия острого ИЭ при носительстве генотипа -455А-А гена FGB) равна 9/(9+1)=0,90 (90%). Прогностическая ценность отрицательного результата теста (вероятность отсутствия острого ИЭ при носительстве генотипов -455G-G/-455G-A) равна 32/(22+32)=0,59 (59%). Отношение правдоподобия положительного результата теста (показывает, во сколько раз выше вероятность получить данный результат теста у пациентов с ИЭ, чем у пациентов с сепсисом) равно 9/(9+22):1/(1+32)=9,7. Отношение правдоподобия отрицательного результата теста (показывает, во сколько раз ниже вероятность получить данный результат теста у пациентов с ИЭ, чем у пациентов с сепсисом) равно 20/(9+22):32/(1+32)=0,67.

Таким образом, предлагаемый способ дифференциальной диагностики острого ИЭ и сепсиса позволяет с высокой вероятностью диагностировать острый ИЭ у пациентов мужского пола русской национальности-носителей варианта -455А-А гена FGB и может быть использован в качестве теста с высокой диагностической ценностью на первых этапах клинического обследования при параллельном диагностическом подходе, когда положительный результат любого теста рассматривается в пользу наличия болезни [Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. «Медиа Сфера», М., 1998, 347 с. - стр. 89].

Клинический пример №1.

Пациент Т., 31 год, находился в отделении кардиологии МБЛПУ ГКБ №29 с 16.03.15 г. по 08.05.15 г. Поступил с жалобами на повышение температуры с ознобами, до 38°C, снижение массы тела, кашель с гнойной мокротой, боли в мышцах, суставах. Считает себя больным с 13.02.15 г., при появлении лихорадки до 40°C, ознобов, одышки при обычной нагрузке, сухого кашля. В течение 2-3 недель употреблял наркотики внутривенно (героин, соль). Госпитализирован в терапевтическое отделение клиники г. Майкопа, где находился с 16.02.15 по 14.03.15 г. При обследовании выявлен инфекционный эндокардит с поражением трикуспидального клапана (ТК), с формированием недостаточности клапана 3 степени, миокардит. Двусторонняя деструктивная пневмония. Диагноз подтвержден неоднократными посевами крови на гемокультуру (выявлен золотистый стафилококк), ЭХО КГ, рентгенологическими исследованиями. Получал антибактериальную терапию (кубицин, зивокс), иммуноглобулин человека, верошпирон, лизиноприл, бисопролол, сорбифер. Значительного эффекта от лечения не было. Самостоятельно покинул отделение, вернулся в Новокузнецк, обратился в санпропускник МБЛПУ ГКБ №29. Госпитализирован в кардиологическое отделение. В анамнезе: гепатит с 1998 г., туберкулез - отрицает, ВИЧ выявлена 11.03.2015 г. Прием наркотиков внутривенно с 1998 г. (героин, соли). Курит в течение 10 лет, по 1/2 пачки в сутки. Простудные заболевания 3-4 раза в год. Хр. заболевания отрицает. Постоянной работы нет. При осмотре состояние тяжелое за счет интоксикационного синдрома, сердечной и дыхательной недостаточности. Температура тела 38°C. Кожа умеренной влажности, бледная, отеков нет, чистая. Пониженного питания. Грудная клетка участвует в дыхании. В легких дыхание ослаблено в подлопаточных областях, мелкопузырчатые, влажные хрипы, частота дыхания 26-28 в мин. Cor тоны глухие ритмичные, частота сердечных сокращений 110 в мин, артериальное давление 110/70 мм. рт.ст. Верхушечный толчок в пятом межреберье на 2 см кнаружи от левой средней линии, перкуторно границы сердца расширены влево. Живот мягкий, безболезненный. Печень выступает из-под края реберной дуги на 3 см, селезенка - на 2 см. Стул, диурез в норме. При обследовании выявлены антитела к ВИЧ, вирусному гепатиту С, не выявлены к трепонеме, вирусному гепатиту В. Общий анализ крови - гемоглобин 73-97-119 г/л, эритроциты 2,5-3,4-5,7, лейкоциты - 22,8-9,2-6,7, палочкоядерные нейтрофилы 6-4-20, лимфоциты - 49-38-42, тромбоциты 483-503-280,0, СОЭ 61-48-31 мм/ч. Общий анализ мочи - удельный вес 1014, белок 0,165 г/л, лейкоциты, эритроциты - 1-2 в поле зрения, цилиндры гиалиновые 1-2 в поле зрения. Биохимический анализ крови: сахар 4,7, холестерин 2,28, триглицериды - 1,34, креатинин 69,3 мкмоль\л, мочевина 8,22, АЛТ 159, 1U/L, ACT- 189,1 U/L, белок 92,5, билирубин 12,1 mkmol/1, К 4,59, ЛДГ 788,7, щелочная фосфатаза 1801, Na 122,9, протромбин 126, MHO 1,08, АЧТВ 34,7, фибриноген 5,25. Кровь на стерильность и гемо-культуру трехкратно - выявлены Staphylococcus aureus, Candida albicans. УЗИ брюшной полости и почек - гепатоспленомегалия, диффузные изменения в паренхиме почек. ЭХО КГ - на ТК гипоэхогенный очаг вегетаций, регургитация - 3 степени, перикардит, признаков легочной гипертензии не выявлено, фракция выброса левого желудочка - 61%. ЭКГ - синусовая тахикардия 108 в мин, замедление проведения по правой ножке пучка Гиса. Флюорография органов грудной клетки - двусторонняя септическая пневмония с распадом. 20.04.15 г. развилось массивное легочное кровотечение. Переведен в отделение реанимации. Лечение: цефтриаксон, зивокс, гептрал, эуфиллин, ванкомицин, максипим, эреспал, кардиомагнил, фуросемид, инфузионная, гемастатическая терапия, переливалась одногруппная кровь. Выписан с улучшением на дальнейшее амбулаторное лечение: нормализовалась температура тела, кашель стал редким, гемодинамика стабильна. Рекомендована консультация кардиохирурга для решения вопроса о протезировании трикуспидального клапана. Результаты генотипирования по полиморфному локусу -455G-A гена FGB: выявлен генотип -455А-А, указывающий на 13,09-кратный риск заболевания острым ИЭ. Диагноз: Ангиогенный сепсис. В 20 IV В. Первичный эндокардит с поражением трикуспидального клапана. Выраженная трикуспидальная недостаточность. ХСН 2Б, ФК 2. Двусторонняя септическая деструктивная пневмония. Дыхательная недостаточность 2 степени. Хронический вирусный гепатит C умеренной степени активности. Массивное легочное кровотечение. Анемия 2 степени. Токсическая нефропатия.

Клинический пример №2.

Пациент М., 48 лет, служащий, поступил в плановом порядке в неврологическое отделение МБЛПУ ГКБ №1 10.08.2015 г. для лечения по поводу перенесенного острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) с жалобами на головную боль, слабость, ограничение движения в левых конечностях, сухой кашель, повышение температуры тела до 38°C, озноб, боль в грудной клетке при кашле. 26.03.2015 г. впервые терял сознание, был доставлен бригадой скорой помощи в нейрохирургическое отделение МБЛПУ ГКБ №1, где проведено оперативное лечение: удалена внутримозговая гематома лобно-теменной области справа, на следующий день - повторная операция по поводу рецидива внутримозговой гематомы. Пациент находился в отделении реанимации, где развилась двусторонняя пневмония. На фоне лечения сохранялась лихорадка до 39°C, озноб, слабость, боль в поясничной области. Выявлен апостематозный нефрит. Проведена правосторонняя нефрэктомия. В мае 2015 г. был выписан на амбулаторное лечение, наблюдался у участкового терапевта. За неделю до поступления в плановом порядке в неврологическое отделение МБЛПУ ГКБ №1 10.08.2015 г состояние ухудшилось: появился, в дальнейшем усилился кашель, лихорадка до 39°C с ознобом, нарастала слабость, одышка при незначительной нагрузке. Самостоятельно принимал парацетамол, амоксициллин, азитромицин. В отделении проведена Rn-графия ОГК, выявлена двусторонняя пневмония, осмотрен пульмонологом, переведен в отделение пульмонологии для дальнейшего лечения. В анамнезе: гипертоническая болезнь много лет, максимальное повышение артериального давления до 180/100 мм. рт.ст. Принимал небилет постоянно после ОНМК. Курил в течение 20 лет, по 1 пачке в сутки. При осмотре: состояние средней степени тяжести. Пониженного питания. Самостоятельно передвигается с трудом за счет грубого левостороннего гемипареза. В сознании, адекватен. Кожа бледная, влажная, отеков нет. В легких дыхание везикулярное, крепитация в базальных отделах с двух сторон, Частота дыхания в покое 22 в мин, усиливается одышка при незначительной нагрузке. Тоны сердца глухие, ритмичные, протодиастолический шум в зоне аускультации левого желудочка, Частота сердечных сокращений 110 в мин, артериальное давление 100/60 мм. рт.ст. Живот мягкий, б/болезненный. Печень + 5 см из-под края реберной дуги. При обследовании: общий анализ крови - гемоглобин 90 г/л, эритроциты 3,57, лейкоциты - 9,2, палочкоядерные нейтрофилы 8, лимфоциты 17, тромбоциты 272, СОЭ 50 мм/ч. Биохимический анализ крови: сахар 4,9, мочевина 5,1, креатинин 82, билирубин 9,5, АЛТ 0,26, ACT 0,22, Na 137, К 42, холестерин 3,3,амилаза 149. Коагулограмма: АЧТВ 30/к 28, ПТИ 855, фибриноген 9,3 ОАМ: Уд вес 1025, белок 0,3 гр/л, лейкоциты - 0-1 в п/зр., эритроциты до 5 в п/зр, кетонурия. Посев мокроты на флору: выделена культура Escherichia coli с гемолитической активностью, единичные дрожжеподобные грибы. ЭХО КГ: сократительная способность левого желудочка удовлетворительная, фракция выброса 57,63%, дилатировано левое предсердие, систолическая функция ЛЖ не нарушена, на створках аортального клапана дислоцируются массивные эхогенные флотирующие вегетации с умеренным стенозированием устья аорты и выраженной аортальной недостаточностью, относительная митральная регургитация, перикард интактен. По УЗИ - диффузные изменения паренхимы единственной левой почки. Посев крови на стерильность №3 - отрицательный. Rn-ОГК: нарушение гемодинамики в малом круге кровообращения: центральный смешанный застой. Гидроторакс справа, инфильтрации в легочной ткани в н/легочных полях с 2-х сторон, ЭКГ - ритм синусовый 89/мин, частые предсердные экстрасистолы, метаболические изменения в миокарде. Проводилось лечение: цефпар, ванкомицин, лефлабакт, цефтриаксон, сорбифер, инфузионная терапия, фраксипарин, лазикс, кардиомагнил. В течение недели состояние больного ухудшилось, нарастала одышка, слабость, сохранялась субфебрильная температура тела. Консультирован кардиологом, кардиохирургом - переведен в областную больницу в отделение кардиохирургии. Результаты генотипирования по полиморфному локусу -455G-A гена FGB: выявлен генотип -455А-А, указывающий на 13,09-кратный риск заболевания острым ИЭ. Диагноз: Первичный инфекционный эндокардит неуточненной этиологии, с поражением аортального клапана (АК). Стеноз и недостаточность АК, ХСН 2Б, ФК 3. Двусторонняя пневмония, тяжелое течение. ДН 2 ст. ОНМК. Левосторонний гемипарез. Состояние после оперативного лечения (удаление внутримозговой гематома лобно-теменной области справа 03.2015 г). Состояние после нефрэктомии справа (03.2015 г).

Клинический пример №3.

Больная П., 35 лет, неработающая, поступила в отделение челюстно-лицевой хирургии МБЛПУ ГКБ№1 г. Новокузнецка с жалобами на боль при глотании, повышение температуры тела до 38°C, отек в подбородочной области. Неделю назад до поступления в клинику удалила зубы. На следующий день появился отек в подбородочной области, боль при глотании, повышение температуры тела до 38°C. Госпитализирована с диагнозом «острый одонтогенный остеомиелит нижней челюсти, флегмона дна полости рта». Под эндотрахеальным наркозом проведено вскрытие, ревизия флегмоны, улучшения не отмечено. В анамнезе: хронических заболеваний нет. Прием наркотиков, алкоголя, гепатит, туберкулез, лекарственную аллергию отрицает. При осмотре: состояние средней степени тяжести за счет интоксикации, определяется отек мягких тканей подбородочной области, инфильтрация, определяются свищевые ходы в подчелюстной области в верхней границе шеи, отделяемое по дренажам гнойное. Кожа бледная, влажная. Пониженного питания. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Частота дыхания 26 в мин. Тоны сердца глухие, ритмичные, в области мечевидного отростка выслушивается систолический шум, частота сердечных сокращений 120 в мин, артериальное давление 100/70 мм. рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Печень не пальпируется. Проводилась инфузионная, антибактериальная терапия, ревизия раны. На фоне лечения отмечает ухудшение состояния, сохранялась лихорадка с ознобом, нарастала слабость, появились боли в грудной клетке и одышка, на Rn-грамме ОГК - тромбоэмболия легочной артерии справа. К лечению добавлен варфарин 2 таблетки в сутки. Переведена в отделение реанимации. При обследовании: общий анализ крови - гемоглобин 93 г/л, эритроциты 4,07, лейкоциты - 15,6, палочкоядерные нейтрофилы 23, лимфоциты 22, СОЭ 15 мм/ч, тромбоциты 447. Биохимический анализ крови: сахар 9,7, мочевина 8,8, креатинин 69, билирубин 7,0, АЛТ 0,22, ACT 0,34, Na 141, К 3,7, белок 50,9, лактат 2,9, прокальцитонин 0,198-0,06-0,07, СРБ 31,5-39,6-50,7, просепсин 117. Общий анализ мочи: уд. вес 1025, белок 0,3 г/л, лейкоциты - 75 в поле зрения, кетонурия, эритроциты 50 в поле зрения. Коагулограмма: АЧТВ 21, ПТИ 96/1,05, фибриноген 7,5, РФМК 28. ЭХО КГ: сократительная способность ЛЖ удовлетворительная, фракция выброса 57%, концентрическая гипертрофия ЛЖ, регургитация митрального клапана (МК) 1 ст, незначительная на ТК, утолщены стенки аорты, створки АК. Посев крови на стерильность №3 - отрицательный. Посев из раны: выделена культура Staphylococcus epidermidis. ЭКГ-синусовая тахикардия 105 в мин, признаки очаговых изменений боковой стенки левого желудочка. СКТ шеи: состояние после операции вскрытия флегмоны дна полости рта, затеки в верхнее средостение. Флегмона шеи, медиастинит. Субсегментарные ателектазы в заднебазальных отделах легких. Сохраняющийся без динамики гнойный инфильтрат справа вдоль стенки трахеи с распространением в верхне-заднее средостение. Пролонгированный тотальный тромбоз внутренней яремной вены справа с распространением на концевые отделы сигмовидного синуса. Тромбоэмболия легочной артерии справа. Легочная гиперетензия. Малый гидроперикард. Дисателектатические изменения в задних отделах S2 доли левого легкого. Результаты генотипирования по полиморфному локусу -455G-A гена FGB: выявлен генотип -455А-А. Риск заболевания острым ИЭ отсутствует вследствие принадлежности пациентки к женскому полу. Диагноз: Сепсис, стафилококковый. Аденофлегмона подбородочного, подчелюстных пространств и верхней трети трети шеи (состояние после вскрытия флегмоны). Пролонгированный тотальный тромбоз внутренней яремной вены справа с распространением на концевые отделы сигмовидного синуса. Тромбоэмболия легочной артерии справа. Легочная гиперетензия. Малый гидроперикард. Проводилось лечение: цефтриаксон, таваник, меронем, гентамицин, фуросемид, верошпирон, фраксипарин, варфарин. Выписана с улучшением под наблюдение челюстно-лицевого хирурга.

1. Способ ранней диагностики острого инфекционного эндокардита (ИЭ), характеризующийся тем, что проводят забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию с целью генотипирования по полиморфному локусу -455G-A гена FGB лиц группы риска и у носителей генотипа -455А-А диагностируют острый ИЭ с 13,09-кратным риском его развития.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в группу риска входят пациенты русской национальности мужского пола с сепсисом.