Способ оценки степени окислительного стресса по содержанию карбонилированного тиоредоксина в клетках

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественной оценки степени окислительного стресса в клетках. Для этого на первом этапе проводят инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НСl, связывающегося с карбонильными группами белков. Затем пробы инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляют 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугируют при 11000 g 10 мин. Осадок промывают 3 раза 1 мл раствора этанол: этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, затем высушивают и ресуспендируют. Далее 0,25 мл клеточного лизата, содержащего связанные с 2,4-динитрофенилгидразином карбонилированные белки, инкубируют с 0,5 мл магнитных частиц, нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу, при 25°C и непрерывном перемешивании в течение 3 ч. Магнитные частицы со связавшимся комплексом антиген-антитело собирают с помощью магнитного штатива, трижды отмывают 0,5 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером и инкубируют в термостате 10 мин при 95°C. На втором этапе освободившиеся от карбонилированных белков магнитные частицы собирают в магнитном штативе. Далее для полученного раствора суммарных модифицированных белков проводят вестерн-блоттинг с антителами к тиоредоксину, что обеспечивает выделение только карбонилированного тиоредоксина и его количественную оценку. Степень окислительного стресса считают высокой при достижении уровня карбонилированного тиоредоксина более 0,52 условных единиц. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента маркеров для количественной оценки степени окислительного стресса в биохимической лабораторной диагностике. 1 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, может быть использовано в биохимической лабораторной диагностике.

В настоящее время среди основных направлений исследований особое место занимает изучение патологий, сопровождающихся активацией свободно-радикального окисления, таких как сердечно-сосудистые, нейро-дегенеративные, воспалительные, онкологические заболевания. Активные формы кислорода, гиперпродукция которых регистрируется при окислительном стрессе, наряду с продуктами окислительной модификации липидов, вызывают и окислительную модификацию белков, приводящую к патологическим изменениям их структуры, свойств и функций [Stadtman E.R., Levine R.L. Protein oxidation. // Annals of N.Y. Academy of Sciences, 2000, 899: 191-208]. Окислительная модификация белков в клетках затрагивает аминокислотные остатки, третичную структуру, вызывает агрегацию и денатурацию протеинов, что приводит к нарушению или исчезновению многообразной функциональной активности белков (ферментативной, регуляторной, участие в синтезах ДНК, РНК, транспорте ионов и липидов) при окислительном стрессе. При окислительной модификации белков в них образуются карбонильные группы - альдегидные и кетоновые группы аминокислотных остатков, повышенный уровень которых, наряду с гидроперекисями липидов, является показателем-маркером окислительного стресса [Зенков Н.К., Панкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты // М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001, 343 с.; Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты // СПб.: Медицинская пресса, 2006, 400 с.].

Согласно современным представлениям окислительной модификации могут подвергаться все остатки аминокислот в белках, но наиболее чувствительными являются остатки триптофана, тирозина, гистидина и цистеина [Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. // СПб.: Медицинская пресса, 2006, 400 с.]. Поскольку тиоредоксин содержит несколько аминокислотных остатков цистеина, он способен подвергаться окислительной модификации с образованием карбонилированных форм белка.

Процессы окислительной модификации белков имеют место при различных свободно-радикальных патологиях. Поскольку тиоредоксин является одним из внутриклеточных антиоксидантов, защищающих клетки от повреждения активными формами кислорода, в то же время выступает коферментом для работы рибонуклеотидредуктазы, необходимой для синтеза ДНК, а следовательно, деления клеток, принимает участие в восстановлении других антиоксидантных молекул, то большой интерес на сегодняшний день представляется определение окислительной модификации тиоредоксина в клетках. Поскольку концентрация тиоредоксина является диагностически значимым маркером состояния антиоксидантной системы клеток в условиях окислительного стресса при различных патологиях, сопровождающихся активацией свободно-радикального окисления [Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах // Успехи биологической химии, 2008, 48, 319-358.; Shan W., Zhong W., Zhao R., Oberley T.D. Thioredoxin 1 as a subcellular biomarker of redox imbalance in human prostate cancer progression // Free Radic. Biol. Med., 2010, 49 (12), 2078-2087.; Lu J., Holmgren A. The thioredoxin antioxidant system // Free Radic. Biol. Med., 2014, (66), 75-87], то его окислительная модификация еще в большей степени может способствовать развитию и свободно-радикального окисления, нарушению внутриклеточных процессов.

На сегодняшний день исследования и разработки в области рассматриваемой научной проблемы носят приоритетный характер и входят в перечень приоритетных направлений развития науки, технологий и техники Российской Федерации - науки о жизни, относятся к критической технологии Российской Федерации - биомедицинские и ветеринарные технологии и поддержаны грантом президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых «Карбонилирование редокс-белков как способ управления пролиферацией при персонифицированном подходе к диагностике и терапии опухолей молочной железы» (Договор №14.W01.17.1742-MK от 22.02.17). В рамках указанного научного исследования и на основании имеющегося научного задела проведена разработка заявляемого изобретения.

Известны способы оценки уровня свободно-радикального окисления в биологических жидкостях (патенты RU 2200320 С1 от 10.03.2003, «Способ оценки окислительного стресса в головном мозге при реперфузионном синдроме травматического и нетравматического генеза», RU 2226276 С2 от 27.03.2004 «Способ интегральной оценки окислительного стресса при неотложных состояниях», RU 2140633 С1 от 27.10.1999 «Способ оценки состояния свободно-радикального окисления в ротовой жидкости при воспалительных заболеваниях пародонта»). В этих патентах описано использование хемилюминисценции в крови, показателей свободно-радикальных реакций (диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, степени окисленности общих липидов) в сыворотке крови, хемилюминисценции в ротовой жидкости.

Недостатком данных способов оценки уровня свободно-радикального окисления является ограниченная область применения ввиду невозможности их использования для определения степени окислительной модификации белков, являющихся важным компонентом антиоксидантной защиты клеток и играющих ключевую роль в защите от окислительных повреждений.

Новый технический результат - расширение ассортимента маркеров для количественной оценки степени окислительного стресса.

Для достижения нового технического результата в способе оценки степени окислительного стресса по содержанию карбонилированного тиоредоксина в клетках определяют содержание карбонилированного тиоредоксина до и после развития окислительного стресса, для чего на первом этапе проводят инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М HCl, связывающегося с карбонильными группами белков, инкубируют пробу при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляют 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугируют при 11000 g 10 минут, осадок промывают 3 раза 1 мл раствора этанол: этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, осадок высушивают и ресуспендируют. Затем клеточный лизат 0,25 мл, содержащий карбонилированные белки, связанные с 2,4-динитрофенилгидразином, инкубируют с 0,5 мл магнитных частиц («Силекс», Россия), нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу («Sigma-Aldrich», США), в течение 3 ч при 25°C и непрерывном перемешивании. Используемое количество магнитных частиц, длительность инкубации и температура нами были определены после серии экспериментов как оптимальные для возможности использования полученных белков для последующей количественной оценки модифицированного белка методом вестерн-блоттинга. Связывание антител с молекулами 2,4-динитрофенилгидразина, соединенных с карбонильными группами белков, является специфичным и обеспечивает присутствие в растворе окисленных модифицированных суммарных белков. Магнитные частицы со связавшимся комплексом антиген-антитело собирают с помощью магнитного штатива и трижды отмывают 0,5 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером, инкубируют в термостате 10 мин при 95°C, после чего перемешивали. Эта процедура необходима для отделения карбонилированных белков от магнитных частиц. На втором этапе, освободившиеся от карбонилированных белков магнитные частицы собирают в магнитном штативе, а белковый надосадок используют для проведения вестерн-блоттинга [Protocol Western Blotting Transfer and Detection Procedure MitoSciences http://www.mitosciences.com/PDF/western.pdf] с антителами к тиоредоксину («Thermo Scientific)), США), обеспечивающими выделение из суммарного количества модифицированных белков только карбонилированный тиоредоксин и количественную его оценку. Содержание модифицированного тиоредоксина выражали в условных единицах. И при достижении уровня карбонилированного тиоредоксина более 0,52 условных единиц степень окислительного стресса считали высокой.

Для исследований использовали культуры клеток эпителия молочной железы линии HBL-100, содержащихся без пероксида водорода и в присутствии 0,3 мМ пероксида водорода, индуцирующего окислительный стресс. Концентрация пероксида водорода была подобрана из диапазона 0,1-1,0 мМ в результате серии экспериментов как наиболее эффективно вызывающих свободно-радикальное окисление с сохранением наибольшего количества жизнеспособных клеток. Проводили 10 раз количественное определение карбонилированного тиоредоксина в клетках линии HBL-100, содержащихся в отсутствии или присутствии пероксида водорода.

Результаты исследования подвергали статистической обработке с использованием пакета программ SPSS vl1.0 с определением медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q₁-Q₃). Достоверность различий независимых выборок оценивали с помощью непараметрических критериев для малых групп Манна-Уитни.

При оценке окислительной модификации тиоредоксина концентрация карбонилированного тиоредоксина в лизатах клеток линии HBL-100, содержащихся в отсутствии пероксида водорода, составило 0,18 (0,09-0,14) условных единиц, в лизированных клетках эпителия молочной железы линии HBL-100, содержащихся в присутствии пероксида водорода, - 0,52 (0,38-0,73) условных единиц. Таким образом, концентрация карбонилированного тиоредоксина в лизатах клеток эпителия молочной железы линии HBL-100, содержащихся в присутствии пероксида водорода, в 2,9 раза (р<0,01) была выше значений показателя в клетках линии HBL-100, содержащихся в отсутствии пероксида водорода.

Полученные результаты объективно отражают высокий уровень окислительного стресса, поскольку степень окислительной модификации тиоредоксина при действии пероксида водорода, показывает интенсивные необратимые повреждения внутриклеточных белков-компонентов антиоксидантной системы клеток, что в дальнейшем приведет к несостоятельности защиты клеток от свободно-радикальных процессов, прогрессированию повреждений внутриклеточных структур и потенциированию патологического процесса, сопровождающегося окислительным стрессом.

Преимуществом данного способа является определение уровня окислительной модификации отдельного белка - тиоредоксина. Кроме того, предлагаемый способ является высокоинформативным и диагностически значимым в отношении свободно-радикального окисления, карбонилирование тиоредоксина усугубляет снижение резерва антиоксидантной защиты, компонентом которой является тиоредоксин, и сопровождается утратой этим белком способности участвовать в антиоксидантной защите клеток от повреждений при окислительном стрессе, что является важным аспектом патогенеза свободно-радикальных патологий.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для оценки степени окислительного стресса по содержанию карбонилированного тиоредоксина, ключевого компонента антиоксидантной системы при патологиях сопровождающихся развитием окислительного стресса. Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Заявляемый способ является информативным и диагностически значимым, так как позволяет количественно оценить степень свободно-радикального окисления по содержанию карбонилированного тиоредоксина - одного из ключевых белков антиоксидантной системы клеток в условиях окислительного стресса.

Предлагаемое изобретение в техническом исполнении достаточно простое и работа осуществляется одним врачом-лаборантом, для его выполнения требуется ограниченный набор недорогостоящего оборудования: камера для вестерн-блоттинга с источником питания, шейкер, термостат и необходимые реактивы. В связи с этим заявляемое изобретение может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий для оценки уровня свободно-радикального окисления в клетках.

Способ оценки степени окислительного стресса по содержанию карбонилированного тиоредоксина в клетках до и после развития окислительного стресса, включающий инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М HCl, связывающегося с карбонильными группами белков, инкубацию пробы при комнатной температуре в течение 1 ч, добавление 0,5 мл 20% ТХУ и центрифугирование при 11000 g 10 минут, промывание осадка 3 раза 1 мл раствора этанол : этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-динитрофенилгидразина, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, высушивание осадка и ресуспендирование, отличающийся тем, что клеточный лизат 0,25 мл, содержащий карбонилированные белки, связанные с 2,4-динитрофенилгидразином, инкубируют с 0,5 мл магнитных частиц, нагруженных антителами к 2,4-динитрофенолу, в течение 3 ч при 25°C и непрерывном перемешивании, далее магнитные частицы со связавшимся комплексом антиген-антитело собирают с помощью магнитного штатива и трижды отмывают 0,5 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером, инкубируют в термостате 10 мин при 95°C, после чего перемешивают, далее освободившиеся от карбонилированных белков магнитные частицы собирают в магнитном штативе, а из надосадка, содержащего карбонилированные белки, с помощью вестерн-блоттинга с антителами к тиоредоксину обеспечивали выделение из суммарного количества модифицированных белков только карбонилированный тиоредоксин и количественную оценку его содержания, и при достижении уровня карбонилированного тиоредоксина более 0,52 условных единиц степень окислительного стресса считали высокой.