Композиция для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте и способ лечения с ее использованием

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к офтальмологии, и представляет собой композицию для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте, содержащую глицерин, касторовое масло, соевый лецитин, колифор EL, витамин Е, фенофибрат, бензалкония хлорид и физиологический раствор, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении, мас.%, а также способу лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте, заключающемуся в проведении инстилляции 4 раза в день с шестичасовым интервалом в один глаз вышеуказанной композиции мышам с моделью кислород-индуцированной ретинопатии с 12 по 17 день жизни включительно при комнатных условиях. Изобретение обеспечивает уменьшение площади ретинальной неоваскуляризации у мышей с моделью кислород-индуцированной ретинопатии. 2 н.п. ф-лы, 3 пр.

 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний глаз, сопровождающихся развитием ретинальной неоваскуляризации.

Неоваскуляризация сетчатки является основной причиной снижения остроты зрения, слепоты и инвалидности при ретинопатии недоношенных, диабетической ретинопатии, возрастной макулярной дегенерации и окклюзии центральной вены сетчатки.

Ближайшим аналогом изобретения по композиции для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте и способу лечения с использованием композиции является способ лечения ретинальной неоваскуляризации с использованием избирательных ингибиторов рецепторной тирозинкиназы. Изобретение обеспечивает антиангиогенный эффект при патологиях, связанных с глазной неоваскуляризацией. С этой целью применяют композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ингибитора рецепторной тирозинкиназы, который блокирует аутофосфорилирование по тирозину рецептора 2 VEGF, рецептора 1 VEGF и PDGFR. (патент РФ на изобретение №2445096).

Недостатком данного способа является его направленность на блокирование неоваскуляризации только по одному пути - через ингибирование рецепторной тирозинкиназы. В силу многофакторности патогенеза неоваскуляризации, такая терапия не всегда бывает эффективной, поскольку в патологическом процессе принимают участие и другие факторы ангиогенеза.

Результаты исследований последних лет свидетельствуют, что еще одной из возможных терапевтических мишеней при патологии, связанной с формированием неоваскуляризации, могут являться Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs). PPARs - ядерные рецепторы, активируемые пероксисомным пролифератором и регулирующие экспрессию генов.

Задачей изобретения является создание композиции для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте и способа лечения с ее использованием, позволяющих неинвазивно воздействовать на PPARs.

Техническим результатом по композиции для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте и способу лечения с ее использованием является уменьшение площади ретинальной неоваскуляризации у мышей с моделью кислород-индуцированной ретинопатии (КИР).

Технический результат по композиции для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте достигается тем, что композиция содержит в мас. %:

глицерин 0,5-2,5%

касторовое масло 1,0-8,0%

соевый лецитин 5,0-10,0%

колифор EL 0,5-4,5%

витамин Е 0,001-0,002%

фенофибрат 0,5-5,0%

бензалкония хлорид 0,005-0,01%

физилогический раствор - остальное.

Технический результат по способу лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте согласно изобретению достигается тем, что проводят инстилляции 4 раза в день с шестичасовым интервалом в один глаз вышеуказанной композиции мышам с моделью кислород-индуцированной ретинопатии с 12 по 17 день жизни включительно при комнатных условиях.

Между совокупностью существенных признаков и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь.

При экспрессии в эндотелиальных клетках PPARα (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α) - ядерные рецепторы α, активируемые пероксисомным пролифератором, регулируют процессы клеточной пролиферации, ангиогенеза, адгезии, агрегации и воспаления. PPARα обладают преимущественно антиангиогенными свойствами (увеличивают экспрессию антиангиогенных и ингибируют экспрессию проангиогенных факторов).

К PPAR-α-агонистам относятся препараты фармакологической группы фибраты - Фенофибрат, Трайкор и др. с основным механизмом действия гиполипидемическим.

При активации PPAR-α блокируется VEGF - индуцированная неоваскуляризация роговицы за счет повышения продукции антиангиогенных факторов (тромбоспондин-1, эндостатин) и ингибирования фактора роста фибробластов, обладающего проангиогенными свойствами [Panigrahy D., Kaipainen A., Huang S., Butterfield C.E. et al. PPARα agonist fenofibrate suppresses tumor growth through direct and indirect angiogenesis inhibition // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. Vol. 105. P. 985-990.].

При культивировании клеток пигментного эпителия сетчатки с добавлением фенофиброевой кислоты (активного метаболита, образующегося из фенофибрата в процессе метаболизма) значительно снижается индуцированное нарушение плотности клеточного монослоя и, соответственно его гиперпроницаемость [Trudeau K., Roy S., Guo W. et al. Fenofibric acid reduces fibronectin and collagen type IV overexpression in human retinal pigment epithelial cells grown in conditions mimicking the diabetic milieu: functional implications in retinal permeability // Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011. Vol. 52. P. 6348-6354.].

Фенофибрат может быть использован в качестве ингибитора неоваскуляризации в офтальмологии.

Исследование было выполнено на 18 мышах (36 глаз) линии BALB, выращенных в питомнике лабораторных животных Филиал "Андреевка" Федерального Государственного бюджетного учреждения науки "Научный центр биомедицинских технологий" Федерального медико-биологического агентства Филиал «Андреевка» ФГБУН "РЩБМТ" ФМБА России. Исследования проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (National Academy press, 1996). Способ осуществляют следующим образом: С 7 по 11 день жизни включительно животные (n=18) вместе с кормящими матерями находились в условиях гипероксии - в инкубаторе, подключенном к кислородному концентратору Atmung 5L-I с непрерывной подачей 100% кислорода под давлением (насыщенность кислорода в инкубаторе составляла 75±5%). Для предотвращения формирования респираторного дистресс-синдрома у самок производилась их замена; с этой целью для подкорма и проведения очистительных работ инкубатор ежедневно открывался не более чем на 5 минут. В комнатные условия - условия относительной гипоксии (содержание кислорода 21%) животные переводились на 12 день жизни.

Инстилляции проводили в правый глаз в течение 6 дней (12-17 день жизни включительно), четыре раза в день, с интервалом 6 часов, композицией. содержащей в мас. %: глицерин - 0,5-2,5, касторовое масло - 1,0-8,0, соевый лецитин - 5,0-10,0, колифор EL - 0,5-4,5, витамин Е 0,001-0,002, фенофибрат 0,5-5,0, бензалкония хлорид 0,005-0,01, физиологический раствор -остальное. (Композиция с фенофибратом)

В контроле (левый глаз) использовали для инстилляции композицию, содержащую в мас.%: глицерин - 0,5-2,5, касторовое масло - 1,0-8,0, соевый лецитин - 5,0-10,0, колифор EL - 0,5-4,5, витамин Е - 0,001-0,002, бензалкония хлорид - 0,005-0,01, физиологический раствор - остальное. (Композиция без фенофибрата).

Композицию с фенофибратом получают следующим образом.

В стеклянном стакане смешивают глицерин, касторовое масло, колифор EL и витамин Е. В полученную смесь вводят фенофибрат и продолжают перемешивание в течение 10 минут. Затем в несколько приемов добавляют соевый лецитин и перемешивают в течение 30 минут. Прибавляют бензалкония хлорид, физиологический раствор и гомогенизируют до получения однородной суспензии.

В результате получается водная эмульсия белого цвета с кремовым оттенком.

Композицию без фенофибрата получают следующим образом.

В стеклянном стакане смешивают глицерин, касторовое масло, колифор EL и витамин Е. Затем в несколько приемов добавляют соевый лецитин и перемешивают в течение 30 минут. Прибавляют бензалкония хлорид, физраствор и гомогенизируют до получения однородной суспензии.

Для проведения исследования животные были подвергнуты эвтаназии согласно требованиям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986). Энуклеация проводилась по стандартному протоколу.

После энуклеации глаза препарировали под бинокулярным микроскопом. Извлеченную сетчатку фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение суток при температуре +4°С. После тщательной промывки в фосфатном буфере сетчатку погружали в раствор биотинилированного изолектина В4 Griffonia simplicifolia (Vector Laboratories США) в разведении 1:100 в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) рН 7,2-7,4 в течение 12 часов при +4°С. В дальнейшем сетчатку погружали в раствор стрептавидина, конъюгированного с флуоресцентными красителями Су3 или FITC (Jackson ImmunoResearch, Великобритания) на 1 час при комнатной температуре для визуализации сосудистой сети. После трехкратной промывки в фосфатном буфере сетчатку помещали на предметное стекло, покрывали глицерином и покровным стеклом.

Производили компьютерный анализ изображений сетчатки, полученных с помощью инвертированного микроскопа Olimpus KХ-100 с цифровой фотокамерой Olympus DP72 и объективами 10х, 20х, 40х в свете флуоресценции Су3 и FITC. С помощью автоматизированного программного обеспечения SWIFT_NV была проведена количественная оценка средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя.

Проведенные исследования показали, что средняя площадь ретинальной неоваскуляризации у мышей с КИР при инстилляциях композиции с фенофибратом на 18 день жизни была достоверно меньше, чем у мышей с КИР при инстилляциях композиции без фенофибрата.

В результате исследования установлено, что средняя площадь ретинальной неоваскуляризации относительно общей площади сетчатки у мышей с кислород-индуцированной ретинопатией при инстилляциях на 18 день жизни составила 2,21%±0,17, а в группе контроля - 5,06±1,19

Пример 1

Мышонок №2 с рождения до 7 дня содержался в условиях комнатного воздуха, с 7 по 11 день жизни включительно находился в условиях гипероксии - в инкубаторе, подключенном к кислородному концентратору с непрерывной подачей 100% кислорода под давлением (насыщенность кислорода в инкубаторе составляла 75±5%). На 12 день жизни был переведен в комнатные условия - условия относительной гипоксии (содержание кислорода 21%). С 12 по 17 день жизни включительно мышонку производили инстилляции композиции следующего состава, мас.%: глицерин 1,5, касторовое масло 4, соевый лецитин 7,5, колифор EL 2, витамин Е 0,001, фенофибрат 3, бензалкония хлорид 0,005 и физиологический раствор остальное, 4 раза в день в правый глаз, в левый - инстилляции композиции без фенофибрата следующего состава, мас.%: глицерин - 1,5, касторовое масло - 4, соевый лецитин - 7,5, колифор EL - 2, витамин Е - 0,001, бензалкония хлорид - 0,005 и физиологический раствор - остальное. Интервал между инстилляциями составлял 6 часов. Животное было выведено из эксперимента на 18 день жизни. Площадь ретинальной неоваскуляризации правого глаза относительно всей площади сетчатки составила 1,9%, а левого глаза - 3,8%. Таким образом, на 18 день жизни площадь патологической ретинальной неоваскуляризации опытного глаза мышей с моделью кислород- индуцированной ретинопатии была в несколько раз меньше таковой в опытном глазу.

Пример 2

Мышонок №5 с рождения до 7 дня содержался в условиях комнатного воздуха, с 7 по 11 день жизни включительно находился в условиях гипероксии - в инкубаторе, подключенном к кислородному концентратору с непрерывной подачей 100% кислорода под давлением (насыщенность кислорода в инкубаторе составляла 75±5%). На 12 день жизни был переведен в комнатные условия - условия относительной гипоксии (содержание кислорода 21%). С 12 по 17 день жизни включительно мышонку производили инстилляции композиции следующего состава в мас.%: глицерин - 0,5, касторовое масло - 8, соевый лецитин - 5, колифор - EL 0,5, витамин Е - 0,002%, фенофибрат - 5, бензалкония хлорид - 0,001 и физиологический раствор - остальное, 4 раза в день в правый глаз, в левый - инстилляции композиции без фенофибрата следующего состава в мас.%: глицерин - 0,5, касторовое масло - 8, соевый лецитин - 5, колифор EL - 0,5, витамин Е - 0,002, бензалкония хлорид - 0,001 и физилогический раствор - остальное. Животное было выведено из эксперимента на 18 день жизни. Площадь ретинальной неоваскуляризации правого глаза относительно всей площади сетчатки составила 2,4%, а левого глаза - 4,6%. Таким образом, на 18 день жизни площадь патологической ретинальной неоваскуляризации опытного глаза мышей с моделью кислород-индуцированной ретинопатии была в несколько раз меньше таковой в опытном глазу.

Пример 3

Мышонок №11 с рождения до 7 дня содержался в условиях комнатного воздуха, с 7 по 11 день жизни включительно находился в условиях гипероксии - в инкубаторе, подключенном к кислородному концентратору с непрерывной подачей 100% кислорода под давлением (насыщенность кислорода в инкубаторе составляла 75±5%). На 12 день жизни был переведен в комнатные условия - условия относительной гипоксии (содержание кислорода 21%). С 12 по 17 день включительно жизни мышонку производили инстилляции композиции следующего состава в мас.%: глицерин - 2,5, касторовое масло - 1, соевый лецитин - 10, колифор EL - 4,5, витамин Е - 0,0015, фенофибрат - 0,5, бензалкония хлорид - 0,005 и физиологический раствор - остальное, 4 раза в день в правый глаз, в левый - инстилляции композиции без фенофибрата следующего состава в мас.%: глицерин - 2,5, касторовое масло - 1, соевый лецитин - 10, колифор EL - 4,5, витамин Е - 0,0015, бензалкония хлорид - 0,005 и физиологический раствор - остальное. Животное было выведено из эксперимента на 18 день жизни. Площадь ретинальной неоваскуляризации правого глаза относительно всей площади сетчатки составила 2,4%, а левого глаза - 4,3%. Таким образом, на 18 день жизни площадь патологической ретинальной неоваскуляризации опытного глаза мышей с моделью кислород-индуцированной ретинопатии была в несколько раз меньше таковой в опытном глазу.

1. Композиция для лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте, отличающаяся тем, что она состоит из следующих компонентов, мас.%:

глицерин	0,5-2,5
касторовое масло	1,0-8,0
соевый лецитин	5,0-10,0
колифор EL	0,5-4,5
витамин Е	0,001-0,002
фенофибрат	0,5-5,0
бензалкония хлорид	0,005-0,01
физиологический раствор	остальное

2. Способ лечения ретинальной неоваскуляризации в эксперименте, отличающийся тем, что проводят инстилляции 4 раза в день с интервалом 6 часов в один глаз композиции, полученной по п. 1, мышам с моделью кислород-индуцированной ретинопатии с 12 по 17 день жизни включительно при комнатных условиях.