Способ определения потенциальной зимостойкости растений озимой мягкой пшеницы
Владельцы патента RU 2652390:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр "Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (ИЦиГ СО РАН) (RU)
Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ включает отбор семян на анализ, получение проростков и оценку признаков зимостойкости в срезах тканей проростков. При этом отобранные семена проращивают путем их выдерживания при температуре 2-5°C в течение 2-4 недель, затем получают от них срезы узла кущения толщиной 20-40 мкм и измеряют интенсивность флюоресценции тканей проростков на длинах волн 365 нм, 470 нм и 546 нм. Потенциально зимостойкими считают проростки с повышенной интенсивностью флюоресценции. Для измерения флюоресценции используют флюоресцентный микроскоп AxioImager Z1. Способ позволяет сократить длительность и упростить процесс получения селекционного материала с повышенной потенциальной зимостойкостью на ранних этапах селекционной работы. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к оценке потенциальной зимостойкости растений озимой мягкой пшеницы, и может быть использовано при селекции зимостойких сортов озимых зерновых культур.
Озимые посевы зерновых являются наиболее продуктивным компонентом агроценозов, но в условиях РФ большие потери урожая озимых зерновых культур происходят из-за повреждения и гибели растений при неблагоприятных условиях перезимовки, главным из которых является действие низких температур в позднеосенний, зимний и ранневесенний периоды. Задача определения зимостойкости озимых зерновых культур простым и быстрым способом является актуальной.
Известен способ определения морозостойкости растений озимой пшеницы путем промораживания целых растений при постепенно снижающейся с интервалом в одни сутки температуре (-7°С, -10°С, -13°С, -16°С). Затем их переносят для оттаивания в камеру с температурой 2°С. Через сутки эти растения высаживают в почву, а спустя три недели учитывают число отросших растений. Морозостойкость выражают в процентах от числа промороженных при определенной температуре (Алексидзе Г.Я., Королев Н.П., Семенов И.Л., Выскребенцева Э.И. // Физиология растений. 1983. Т. 30. В. 6. С. 1069).
Недостатком способа являются длительность и трудоемкость.
Известен способ определения морозостойкости зерновых культур путем промораживания фрагментов листьев, с последующей окраской резорцином, который окрашивает убитые холодом фрагменты листьев в темно-синий цвет, при этом в качестве оценочного показателя морозостойкости используют время промораживания, при котором происходит необратимо повреждение фрагментов листьев холодом (патент RU 2370942 C1, оп. 27.10.2009).
Недостатком этого способа является необходимость выращивания взрослых растений.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ отбора зимостойких растений озимой пшеницы, включающий посев, выращивание, отбор образцов, их оценку по селекционно-хозяйственным признакам, где отбор образцов осуществляют в фазу восковой спелости семян, причем в качестве зимостойких отбирают среднерослые растения - 81-110 см с красноватой окраской стеблей, а оценку признаков проводят по содержанию флавоноидов, причем в качестве зимостойких отбирают растения с содержанием флавоноидов более 8 мг/г. Отобранные растения могут быть использованы в работах по селекции озимой пшеницы для создания зимостойких сортов этой культуры (патент RU 2575100 C1, оп.10.02.2016).
Недостатком этого способа является необходимость выращивания образцов в полевых условиях, что значительно увеличивает время оценки признака выраженности зимостойкости образцов озимой пшеницы.
Задачей изобретения является разработка простого и менее длительного способа, позволяющего в лабораторных условиях определять потенциальную зимостойкость растений озимой мягкой пшеницы.
Технический результат: сокращение длительности и упрощение процесса получения селекционного материала с повышенной потенциальной зимостойкостью на ранних этапах селекционной работы.
Технический результат достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Сортообразцы озимой мягкой пшеницы отбирают для анализа, замачивают в воде и дают наклюнуться. Наклюнувшиеся зерновки закатывают в рулоны фильтровальной бумаги и помещают в холодильник при температуре 2-5°С. Через две-четыре недели проростки используют для анализа.
Для этого на замораживающем микротоме (Криостат НМ 550) получают срезы узла кущения проростка (т.е. основания проростка) толщиной 20-40 мкм и затем определяют интенсивность флюоресценции тканей проростка (без всякой окраски), на флюоресцентном микроскопе при возбуждении флюоресценции излучением с длинами волн 365, 470 и 546 нм. Сопоставляя результаты, отбирают генотипы с повышенной интенсивностью флюоресценции, обладающие повышенной зимостойкостью.
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1) для анализа в лабораторных условиях используют двух-четырехнедельные проростки, что позволяет ускорить процесс селекции (в прототипе отбор образцов проводят на более поздних фазах развития растений);
2) у проростков готовят срезы узла кущения и оценивают потенциальную зимостойкость по интенсивности флюоресценции тканей проростка, измеренной на флюоресцентном микроскопе с длинами волн 365, 470 и 546 нм, при этом в качестве зимостойких отбирают образцы с повышенной флюоресценцией, что позволяет значительно упростить и ускорить процесс селекции за счет сокращения времени получения оценки и значительного уменьшения трудоемкости анализов.
В качестве оценочного признака зимостойкости выбрана интенсивность флюоресценции тканей проростка, прямо связанная с количеством в проростках ароматических гликозидов, способствующих гелификации клеточного сока и замерзанию воды в аморфном состоянии, без образования кристаллов льда, которые являются основным повреждающим фактором в зимний период (Cheyniera., et al. Plant phenolics: Recent advances on their biosynthesis, genetics, and ecophysiology. Plant Physiology and Biochemistry. 2013.V. 72. P. 1-20).
Все флавоноиды оптически активны, способны флуоресцировать в УФ-свете, имеют характерные УФ-спектры, характеризующиеся наличием двух максимумов поглощения, и ИК-спектры.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.
Пример
В качестве образцов для анализа использовали генотипы FF и ОО озимой мягкой пшеницы по локусу ароматической алкогольдегидрогеназы, которые различаются по зимостойкости. В таблице 1 представлены данные по перезимовке генотипов FF и ОО в течение трех сезонов (2013/2014, 2014/2015 и 2015/2016 г.г.), где зимостойкость определяли как число перезимовавших растений по отношению к числу посеянных семян (в скобках - в процентах от числа посеянных семян). Непараметрический критерий Пирсона χ2 позволяет оценить значимость различий между генотипическими группами FF и ОО.
Наклюнувшиеся зерновки в количестве 10 штук каждого генотипа закатывали в рулоны фильтровальной бумаги и помещали в холодильник при температуре 2-5°С. Через две-четыре недели проростки, находящиеся в фазе кущения, использовали для анализа. У 5 проростков, отобранных по наилучшим фенотипическим признакам, получали срезы узла кущения на замораживающем микротоме толщиной 30 мкм и затем определяли интенсивность флюоресценции тканей проростка (без всякой окраски), на флюоресцентном микроскопе Axiolmager Z1 с приставкой АроТоте и программой AxioVision (фирма Zeiss) при возбуждении флюоресценции излучением с длинами волн 365, 470 и 546 нм. На срезах измеряли флюоресценцию визуально и с помощью записи числовых значений интенсивности флюоресценции (табл. 2). Сопоставляя результаты, отбирали генотипы с повышенной флюоресценцией и соответственно с повышенным содержанием ароматических гликозидов.
Из таблицы 2 видно, что более зимостойкий генотип FF озимой мягкой пшеницы имеет повышенную флюоресценцию в синем и зеленом диапазоне и несколько большую в красном диапазоне. Эти результаты позволяют использовать интенсивность флюоресценции для отбора потенциально более зимостойких генотипов.
На фиг. 1 представлена запись автофлюоресценции среза генотипа ОО, а на фиг. 2 - генотипа FF. На фиг. 1, 2 видно, что генотип FF имеет выраженную повышенную флюоресценцию в синем спектре и для него наблюдаются скачки синего спектра от 0 до 450 нм, а генотипу ОО присуща меньшая амплитуда - от 0 до 65 нм. По красному и зеленому спектру также имеются различия.
Использование предлагаемого способа позволит:
1) упростить оценку зимостойкости генотипов (образцов) озимых форм за счет исключения ручного труда (прототип), поскольку в заявляемом способе срезы проростков делают с помощью криотома, а измерение интенсивности флюоресценции ткани проростков осуществляют на флюоресцентном микроскопе;
2) ускорить процесс анализа, т.к отбор образцов проводят в фазу двух-трехнедельных проростков, а в прототипе в более позднюю фазу восковой спелости семян;
3) снизить затраты на анализ, поскольку заявляемый способ предназначен для использования в лабораторных условиях, не требующих затрат на посев в поле, на проведение посевных работ (в том числе использование пестицидов и фунгицидов).
Способ определения потенциальной зимостойкости растений озимой мягкой пшеницы
1. Способ определения потенциальной зимостойкости растений озимой мягкой пшеницы, включающий отбор семян на анализ, получение проростков и оценку признаков зимостойкости в срезах тканей проростков, отличающийся тем, что отобранные семена проращивают путем их выдерживания при температуре 2-5°C в течение 2-4 недель, затем получают от них срезы узла кущения толщиной 20-40 мкм и измеряют интенсивность флюоресценции тканей проростков на длинах волн 365 нм, 470 нм и 546 нм, при этом потенциально зимостойкими считают проростки с повышенной интенсивностью флюоресценции.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для измерения флюоресценции используют флюоресцентный микроскоп AxioImager Z1.
