Рекомбинантное антитело, специфичное к фактору некроза опухоли и маркеру иммунных клеток миелоидного ряда

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено рекомбинантное антитело, состоящее из двух однодоменных антител VHH, специфичных к ФНО, содержащее домен специфичности к ФНО и к гликопротеину CD11b, содержащее домен специфичности к маркеру иммунных клеток миелоидного ряда CD11b, соединенных между собой белковым линкером. Техническим результатом предлагаемого изобретения является уменьшение размера антитела в 2 раза и способность блокировать ФНО на клетках миелоидного ряда человека, включая моноциты и гранулоциты, и экспрессироваться в бактериальной системе в растворимом виде. 5 ил.

 

Изобретение относится к области иммунологии, а именно к выделенным биспецифическим аффинным реагентам, таким как антитела или фрагменты антител, которые связываются с фактором некроза опухоли (ФНО) и маркером молекул макрофагов и/или нейтрофилов, и может быть использовано для лечения аутоиммунных заболеваний, например, таких, как ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, псориаз и др.

Открытие важной роли ФНО в патогенезе аутоиммунных заболеваний привело к разработке новых лекарственных средств, представляющих собой моноклональные антитела, блокирующие физиологическую активность этого цитокина.

Блокировка ФНО моноклональными терапевтическими антителами при таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, псориаз и др., приводит к прерыванию порочного круга активации иммунной системы, эффективному контролю симптомов патологического воспалительного процесса, замедлению разрушения суставов и вызывает у пациентов стойкую ремиссию даже после отмены приема анти-ФНО препаратов.

Хотя данные ингибиторы ФНО доказали свою эффективность в лечении аутоиммунных заболеваний, применение данных средств требует тщательной оценки соотношения польза/риск для конкретного больного. Это определяется частотой негативных последствий, таких как развитие множественного склероза, тромбоэмболии, инфекции верхних дыхательных путей, развитие латентных оппортунистических инфекций, в том числе туберкулеза, и т.д.

Поэтому перед исследователями по-прежнему стоит задача поиска новых более эффективных технических решений для решения проблемы побочных эффектов ингибиторов и обеспечения минимального влияния на физиологические механизмы функционирования иммунной системы.

Одним из перспективных подходов в анти-ФНО терапии, потенциально позволяющим избежать большинства побочных эффектов, является применение антител, избирательно удерживающих этот цитокин на поверхности ФНО-продуцирующих клетки миелоидного ряда, не препятствуя при этом его высвобождению из других клеточных источников.

Известны технические решения по созданию антител, включающие использование неприродных биоинженерных белков на основе антител верблюдовых, в частности их единственного антиген-распознающего домена VHH, малый размер которых обеспечивает лучшее проникновение в ткани и позволяет узнавать необычные, «скрытые», для классических антител конформационные эпитопы.

Примеры антител-специфичных к ФНО на основе VHH, отражены в следующих патентах: RU 2530553 С2, RU 2455312 С2.

Однако данные антитела блокируют системный ФНО и по характеру действия сходны с препаратами, представляющими собой классические моноклональные антитела.

Наиболее близким к заявляемому является техническое решение, выбранное авторами предлагаемого изобретения в качестве прототипа и описанное в заявке на выдачу патента (US 20150284460 А1, дата публикации 8.10.15 г.).

Изобретение-прототип относится к рекомбинантным биспецифическим аффинным реагентам, таким как антитела или фрагменты антител, которые связываются с ФНО и маркером молекул макрофагов и/или нейтрофилов.

Использование биспецифических аффинных реагентов согласно изобретению позволяют нейтрализовать патогенную субпопуляцию ФНО, в то время как субпопуляция ФНО, выполняющая защитную функцию, не затрагивается.

В заявке на патент, поставленной задачей является получение рекомбинантных биспецифических антител против ФНО и маркера иммунных клеток миелоидного ряда F4/80.

При этом домен против ФНО представляет собой биоинженерный белок на основе антиген-распознающего домена верблюдовых VHH, а домен против F4/80 представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) классического антитела.

Основным недостатком прототипа является то, что маркер F4/80 характерен для клеток миелоидного ряда мышей, а у человека он экспрессируется лишь на эозинофилах, что ограничивает применение данного биспецифического антитела в лечении заболеваний человека.

Кроме этого, из-за своего относительно большого размера (~48 кДа) данный белок экспрессируется в бактериальных системах в малых количествах и преимущественно в нерастворимом виде.

Задачей, на решение которой направленно предлагаемое изобретение, является создание антител против ФНО и маркера иммунных клеток миелоидного ряда, способных нейтрализовать патогенную субпопуляцию ФНО при одновременном сохранении защитной популяции в организме человека.

Поставленная задача решается тем, что рекомбинантное биспецифическое антитело против ФНО и маркера иммунных клеток миелоидного ряда, содержащее биоинженерные белки на основе антиген-распознающего домена верблюдовых VHH, состоит из двух однодоменных антител, специфичных к ФНО и к гликопротеину CD11b, соединенных между собой белковым линкером. При этом домен специфичный к ФНО имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO. 1); домен, специфичный к маркеру иммунных клеток миелоидного ряда CD11b, имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO. 2); линкер имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO.3).

Сущность изобретения состоит в том, что создано биспецифическое антитело, состоящее из двух однодоменных антител разной специфичности. Одно из этих антител способно специфично связываться с ФНО человека, блокируя его физиологическую активность (SEQ ID NO: 1), второе специфично связывается с гликопротеином CD11b, экспрессирующимся на поверхности миелоидных клеток (SEQ ID NO: 2). Антитела соединены между собой «жестким» линкером (SEQ ID NO. 3).

Для этого однодоменное антитело VHH, специфично связывающееся с ФНО человека, имеет следующую аминокислотную последовательность:

Второе антитело, специфично связывающееся с гликопротеином CD11b, экспрессирующемся на поверхности миелоидных клеток, имеет следующую аминокислотную последовательность:

Линкер, связывающий антитела, имеет следующую аминокислотную последовательность:

Перечень последовательностей представлен в таблице на Фиг. 1.

Техническим результатом изобретения является уменьшение размера антитела в 2 раза и способность блокировать ФНО на клетках миелоидного ряда человека, включая моноциты и гранулоциты, и экспрессироваться в бактериальной системе в растворимом виде.

Новизна заявляемого изобретения подтверждается тем, что по доступной научной и практической информации для решения поставленной задачи предлагаемое техническое решение не использовалось, а так как предлагаемое решение обеспечивает наличие свойств, не совпадающих со свойствами известных решений, то оно обладает изобретательским уровнем.

Существенность отличительных признаков изобретения состоит в том, что достигается новый положительный эффект, а именно новые антитела имеют специфичность к маркеру человеческих клеток миелоидного ряда и характеризуются меньшим размером (~25 кДа).

Созданное биспецифическое антитело способно распознавать ФНО на поверхности продуцирующих его человеческих клеток миелоидного ряда, удерживать его, блокируя его физиологическую активность, в то же время не препятствуя высвобождению ФНО, продуцируемого другими клеточными источниками, и, предположительно, играющих защитную роль.

Кроме этого, данное биспецифическое антитело успешно продуцируется в бактериальной системе экспрессии в растворимом виде.

Научно-технический уровень изобретения обусловлен научно-исследовательскими опытными и экспериментальными работами по объединению двух однодоменных антител разной специфичности в одно, что потребовало:

- проведения субклонирования;

- проведения генно-инженерных манипуляций с кодирующими последовательностями однодоменных антител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества использовали бактериальные культуры E.coli);

- выбора оптимального белкового линкера, связывающего две последовательности однодоменных антител;

- разработки протокола получения биспецифического белка;

- оценки функциональной характеристики полученного белка, включающей в себя оценку связывания биспецифического антитела с CD11b и ФНО и оценку его блокирующих свойств.

В результате было получено рекомбинантное биспецифическое антитело, решающее поставленную задачу.

Осуществление настоящего изобретения

Стадия 1. Получение генетического конструкта биспецифического антитела, специфично связывающего CD11b и человеческий ФНО.

Методом полимеразной цепной реакции получены кДНК, кодирующие человеческий антиФНО и антиCD11b. В качестве матрицы используют синтетические последовательности, кодирующие искомые белки (SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 2 соответственно).

кДНК, кодирующую анти-CD1lb, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции NcoI и NotI.

кДНК, кодирующую антитело против ФНО, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции NotI и XhoI.

Для клонирования используют вектор pET28b, обработанный рестриктазами NcoI и XhoI.

Т.о. получают конечную генетическую конструкцию следующей структуры: анти-CD1lb-линкер-анти-ФНО-гексагистидиновый модуль. Транскрипция мРНК, кодирующей «химерный» белок, находится под контролем Lac-оператора E.coli, промотора и терминатора бактериофага Т7.

Стадия 2. Продукция биспецифических антител

Продукцию однодоменных антител проводят в Е. coli (штамм Rosetta 2 (DE3) pLysS). Экспрессию белка индуцируют добавлением 0,5 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубируют при интенсивном перемешивании в течение 6 часов при 25°C. Биспецифическое антитело выделяют из лизата бактериальных клеток с использованием металлхелатной хроматографии с помощью колонок Poly-Prep gravity-flow column (BioRad, Франция), содержащих смолу на сефарозной матрице, заряженную Со2+ (Invitrogen, кат. № R 90115).

Макрофаги, выделенные из бедренной кости гуманизированных по гену ФНО мышей линии 750huTNFKI, культивируют в течение 10 дней при температуре 37°C в СО2-инкубаторе на кондиционной среде клеток линии L929 (АТСС® CCL-1™). Затем в концентрации 100000 кл/мл клетки переносят в 96-луночные микропланшеты (Eppendorf, 30730127) и культивируют в течение суток. Затем в культуру макрофагов добавляют полученные биспецифические антитела в диапазоне концентраций от 2 пг/мл до 20 мг/мл, культивируют в течение 30 мин при температуре 37°C в присутствии 5% СО2. После этого культуру макрофагов отмывают от среды, содержащей биспецифические антитела, и добавляют к ней липополисахарид в концентрации 100 нг/мл. Затем культуру макрофагов культивируют в течение 4 часов при температуре 37°C в присутствии 5% СО2 и собирают надосадочную жидкость.

Полученную в результате описанной процедуры надосадочную жидкость используют для оценки эффективности связывания ФНО на поверхности макрофагов биспецифическими антителами с помощью метода иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ проводят с помощью набора реагентов Human TNF alpha ELISA (Affymetrix, кат. №88-7346-88).

Эффективность нового рекомбинантного антитела подтверждена приводимыми ниже данными.

На Фиг. 2 представлена электрофореграмма полиакриламидного геля с образцами. полученными в ходе очистки биспецифических антител (БАТ), по сравнению с прототипом, где М - маркер молекулярных масс; 1 - лизат клеточной биомассы; 2 - несвязавшаяся с колонкой фракция белков; 3 - очищенный биспецифический белок (растворимая фракция); 4 - очищенный прототип (растворимая фракция).

Чистота полученных биспецифических антител составила более 95%.

На Фиг. 3 представлены результаты иммуноферментного анализа, из которых следует, что созданное биспецифическое антитело эффективно связывается с макрофагами и блокирует высвобождение макрофагального ФНО.

Величина столбцов на чертеже соответствует количеству ФНО в образцах, рассчитанных согласно калибровочной кривой. ЛПС - высвобождение ФНО из макрофагов после стимуляции их липополисахаридом. ЛПС+БАТ - высвобождение ФНО из макрофагов после их стимуляции ЛПС и блокировки биспецифическим антителом. ЛПС+КАТ - высвобождение ФНО из макрофагов после их стимуляции ЛПС и блокировки контрольным антителом. В качестве контрольного антитела использовалось биспецифическое антитело, один домен которого связывается с белком, экспрессирующимся на поверхности макрофагов F4/80, а второй домен связывается с ФНО, не блокируя его физиологических функций.

На Фиг. 4 представлены результаты оценки способности и эффективности блокировки человеческого ФНО in vitro на клетках линии WEHI 164, из которых следует, что разработанное биспецифическое антитело (5) способно блокировать биологическую активность человеческого ФНО более эффективно по сравнению с прототипом (6). В качестве контроля (7) были использованы контрольные антитела (КАТ).

Для оценки способности биспецифического антитела блокировать человеческий ФНО использовали колориметрический МТТ-тест на вторичной культуре эукариотических клеток мышиной фибросаркомы WEHI 164 (АТСС® CRL-1751™), чувствительной к ФНО человека, а также рекомбинантный ФНО человека, предоставленный лабораторией молекулярных механизмов иммунитета ИМБ им. Энгельгардта РАН (Москва).

Клетки WEHI 164 культивировали в концентрации 100000 кл/мл на 96-луночных микропланшетах (Eppendorf, 30730127), затем добавляли биспецифическое антитело в диапазоне концентраций от 10 пМ до 100 мМ с рекомбинантным человеческим ФНО в летальной концентрации, инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°C в присутствии 5% CO2. Количество погибших клеток оценивали колориметрически с помощью планшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) на длине волны 570 нм.

На Фиг. 5 представлена диаграмма выживаемости экспериментальных животных в модели острой гепатотоксичности, индуцированной введением летальной дозы ЛПС (400 нг/г веса животного) и Д-галактозамина (800 мкг/г веса животного), где 8 - выживаемость мышей при введении физ. раствора; 9 - выживаемость мышей при введении 1,5 мкг/г веса БАТ; 10 - выживаемость мышей при введении 7,5 мкг/г веса БАТ; 11 - выживаемость мышей при введении 15 мкг/г веса БАТ. Из этих данных следует, что введение биспецифического антитела в дозе 15 мкг/г веса мыши обеспечивает 100% выживаемость животных.

Эти данные свидетельствуют об эффективной блокировке ФНО биспецифическими антителами в концентрации 15 мкг/г веса.

Рекомбинантное антитело, специфичное к фактору некроза опухоли и маркеру иммунных клеток миелоидного ряда, содержащее биоинженерный белок на основе антиген-распознающего домена верблюдовых VHH, отличающееся тем, что рекомбинантное антитело состоит из двух однодоменных антител VHH, специфичных к ФНО, содержит домен специфичности к ФНО с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 и к гликопротеину CD11b, содержит домен специфичности к маркеру иммунных клеток миелоидного ряда CD11b с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, соединенных между собой белковым линкером с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.



 

Похожие патенты:

Данное изобретение относится к иммунологии. Предложена выделенная молекула антитела, которая является селективной в отношении связывания человеческого бета-амилоидного 1-42 пептида (Aβ1-42), а не человеческого бета-амилоидного 1-40 пептида (Aβ1-40).

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено одноцепочечное антитело к раково-эмбриональному антигену, а также включающий его химерный мономолекулярный Т-клеточный рецептор, вектор и клетка-хозяин для получения химерного мономолекулярного Т-клеточного рецептора.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложены изолированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, связывающие CD30L (CD153) и охарактеризованные аминокислотными последовательностями гипервариабельных участков (CDR) и вариабельных доменов.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен способ получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей Fc домен и Fab фрагменты, специфично связывающиеся с первым и вторым антигенами, причем биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает моновалентное связывание с первым и/или вторым антигенами.

Изобретение относится к биохимии. Описано рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту c биспецифическим связыванием с CD40. Также раскрыты иммуноконъюгат, включающий указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело или его фрагмент, экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело или его фрагмент.

Представленные изобретения касаются варианта исходного антитела против TNF-α или исходного связывающего фрагмента антитела против TNF-α, молекулы нуклеиновой кислоты, клетки-хозяина, фармацевтической композиции и способа лечения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с белком GITR человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуноцитокинам, и может быть использовано в медицине для лечения рака. Получают иммуноцитокин, содержащий: конъюгат интерлейкина 15 и домена sushi IL-15Rα, ковалентно связанный с антителом или его фрагмент, направленным против антигена, имеющего отношение к неоваскуляризации опухоли или к внеклеточному матриксу опухоли, или опухолевого антигена.

Данное изобретение относится к области иммунологии. Предложено изолированное антитело, которое обладает способностью специфично связываться с амилоидом бета (Аβ), а также антигенные циклические пептиды, способные вызывать специфический иммунный ответ против олигомерного Аβ.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено одноцепочечное антитело к раково-эмбриональному антигену, а также включающий его химерный мономолекулярный Т-клеточный рецептор, вектор и клетка-хозяин для получения химерного мономолекулярного Т-клеточного рецептора.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен способ получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей Fc домен и Fab фрагменты, специфично связывающиеся с первым и вторым антигенами, причем биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает моновалентное связывание с первым и/или вторым антигенами.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен способ получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей Fc домен и Fab фрагменты, специфично связывающиеся с первым и вторым антигенами, причем биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает моновалентное связывание с первым и/или вторым антигенами.

Изобретение относится к биохимии. Описано рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, направленное на две мишени, которое специфически связывается с VEGF и DLL4, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело, экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид, трансформированную клетку СНО для экспрессии вышеуказанного антитела, способ получения вышеуказанного антитела, фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую терапевтическое эффективное количество антитела, композицию для диагностики рака, способ диагностирования рака и способ лечения рака, включающий этап введения вышеуказанного антитела.

Изобретение относится к биохимии. Предложен способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, такой как антитело, где способ включает культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А из S.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлено одноцепочечное антитело для лечения или диагностики, содержащее один полипептид, содержащий следующие домены, расположенные относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу следующим образом: VL1-CL1-CLH линкер1-VH1-CH11-шарнир1-CH21-CH31-HD линкер-VL2-CL2-CLH линкер2-VH2-CH12-шарнир2-CH22-CH32, где каждый из CLH линкера1, CLH линкера2 и HD линкера содержит аминокислотную последовательность, расщепляемую эндопептидазой на N- и C-концах.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам определения комбинации антигенсвязывающих сайтов и получения биспецифического антитела, что может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения антител, подходящих для применения у собаки, которые специфично связываются с собачьим фактором роста нервов (NGF) и нейтрализуют способность собачьего NGF связываться с рецептором собачьего NGF р75 или TrkA, и соответствующим антителам.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения антител, подходящих для применения у собаки, которые специфично связываются с собачьим фактором роста нервов (NGF) и нейтрализуют способность собачьего NGF связываться с рецептором собачьего NGF р75 или TrkA, и соответствующим антителам.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, специфически связывающемуся с независимой от лиганда активированной формой cMet, нуклеиновой кислоте, его кодирующей, набору, его содержащему, применению вышеуказанного антитела для идентификации cMet, для диагностики in vitro онкогенного расстройства, а также к способу генерации вышеуказанного антитела.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено рекомбинантное антитело, состоящее из двух однодоменных антител VHH, специфичных к ФНО, содержащее домен специфичности к ФНО и к гликопротеину CD11b, содержащее домен специфичности к маркеру иммунных клеток миелоидного ряда CD11b, соединенных между собой белковым линкером. Техническим результатом предлагаемого изобретения является уменьшение размера антитела в 2 раза и способность блокировать ФНО на клетках миелоидного ряда человека, включая моноциты и гранулоциты, и экспрессироваться в бактериальной системе в растворимом виде. 5 ил.

Наверх