Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека



Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека
C12N2320/00 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2652895:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) (RU)
Общество с ограниченной ответственностью "Геномная диагностика" (ООО "Геномная диагностика") (RU)

Изобретение относится к области биохимии. Описан набор олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной ДНК человека, характеризующийся тем, что данный набор позволяет определить генотип митохондриальной ДНК человека в 38 однонуклеотидных сайтах, расположенных в различных участках митохондриального генома и полиморфных в популяциях населения России различного этнического происхождения, с помощью метода ферментативного однонуклеотидного удлинения гибридизированной пробы, причем структура олигонуклеотидных проб учитывает вариабельность ДНК в близлежащих сайтах и группировку генотипируемых сайтов в 3 панели для мультиплексных реакций. 3 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано для определения генотипа человека по совокупности однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальной ДНК с целью установления/исключения родства индивидов по материнской линии.

Полиморфизм митохондриальной ДНК (мтДНК) человека, обладающей высоким темпом мутирования и наследованием по материнской линии, широко изучается с целью решения задач популяционной и эволюционной генетики. В криминалистике митохондриальная ДНК используется чаще всего для установления вероятности родства индивидов по материнской линии или исключения такового. Преимущества мтДНК заключаются в большом числе ее копий в клетке (до нескольких тысяч, в отличие от дзух копий ядерных генов), вследствие чего генотипирование мтДНК возможно даже в образцах с высокой степенью деградации ДНК. В числе наиболее известных примеров идентификации личности с помощью изучения мтДНК - идентификация останков царской семьи Романовых [1].

В настоящее время для решения задач криминалистики и судебной медицины в нашей стране обычно проводят определение нуклеотидной последовательности только первого или первого и второго гипервариабельных сегментов (ГВС1 и ГВС2) главной некодирующей области мтДНК (D-петли) с помощью секвенирования. Данные участки, расположенные соответственно в 16024-16365 и 73-340 нуклеотидах, согласно нумерации референсной последовательности ДНК человека [2], отличаются наиболее высокой степенью полиморфизма. Существуют и этнические особенности полиморфизма этих участков. Тем не менее, их дискриминирующий потенциал не всегда оказывается достаточным для подтверждения или исключения родства: например, около 10% русских обладают последовательностью ГВС1, идентичной референсной последовательности, а около 10% тувинцев - последовательностью ГВС1, отличающейся от референсной по трем позициям (замены С16223Т, Т16298С, С16327Т) [3-4]. В целом, вероятность случайного совпадения последовательностей ГВС1 и ГВС2 у неродственных индивидов составляет 0,0234 для ГВС1, 0,0374 для ГВС2 и 0,0068 для объединенного генотипа ГВС1 и ГВС2 [5]. В то же время в остальной части мтДНК расположены полиморфные позиции, генотипирование которых может дифференцировать последовательности мтДНК, совпадающие в области ГВС1 [5-6].

Одним из подходов к мультиплексному генотипированию SNP в разных участках генома является мини-секвенирование (однонуклеотидное удлинение цепи): реакция, аналогичная полимеразной цепной реакции, в которой вместо дезоксинуклеозидтрифосфатов используются дидезоксинуклеозидтрифосфаты (это делает невозможным дальнейший синтез цепи). Располагая олигонуклеотидную пробу (праймер) непосредственно перед полиморфной позицией генома, можно затем определить, какой именно единственный нуклеотид присоединился к пробе. Способы детекции результатов мини-секвенирования могут различаться: это может быть детекция флюоресценции при твердофазном мини-секвенировании [7] или при капиллярном электрофорезе [8], а также масс-спектрометрия, основанная на различиях массы мономеров ДНК [9]. Для целей криминалистики наиболее часто используют метод, в котором генотипирование осуществляется по результатам регистрации флюоресценции в процессе капиллярного электрофореза - этот метод можно применять при наличии практически любого из массово производимых капиллярных ДНК-анализаторов. В основе метода лежит использование дидезоксинуклеотидов, меченых четырьмя различными флюоресцентными красителями, и олигонуклеотидных проб, различающихся по длине (это позволяет мультиплексировать реакцию). Существуют коммерческие наборы основных реагентов, позволяющие проводить этот анализ, используя наборы олигонуклеотидных проб, разработанных для конкретных задач. Технической задачей в этой области является разработка набора маркеров, подбираемых в зависимости от географической и этнической (популяционной) специфики населения территории, где планируется применение данного набора, а также подбор нуклеотидной последовательности используемых олигонуклеотидных проб, которые должны обеспечивать уверенное генотипирование и достаточное разделение продуктов реакции при капиллярном электрофорезе. В настоящее время имеются наборы полиморфизмов в мтДНК для этого метода, разработанные за рубежом, которые предназначены для исследования соответствующих популяций: например, населения Западной Европы [10-11] или Восточной Азии [12], в то время как население России имеет свою популяционную специфику полиморфизма мтДНК, которая заключается в высоком этническом разнообразии, наличии популяций как европеоидного, так и монголоидного и смешанного происхождения, а также распространенности специфичных именно для населения России линий мтДНК, особенно у представителей кавказских и сибирских этносов. Например, набор, предложенный в статье [13], позволяет определять лишь основные гаплогруппы; при этом он включает гаплогруппу Е, которая практически не встречается на территории России, не дифференцирует наиболее распространенные «европейские» гаплогруппы Н и U и не детектирует распространенные у коренных народностей Сибири гаплогруппы Y и Z. Набор полиморфизмов, предложенный в публикации [14], направлен на дифференциацию только гаплогруппы Н. Набор из 21 SNP, разработанный немецкими исследователями [11], определяет только те гаплогруппы, которые распространены в Западной Европе, и 18% исследованных образцов имеют одно и то же сочетание генотипов по исследованным сайтам. Генотипирование «азиатских» полиморфизмов в мтДНК было предложено китайскими исследователями [12] - набор содержит 23 SNP, характеризующих основные гаплогруппы, распространенные у населения Китая. Но в этот набор не входят SNP, определяющие гаплогруппы западноевразийского происхождения. Таким образом, наборы маркеров, используемые в зарубежных разработках, являются недостаточно информативными для населения России. В то же время отечественные разработки, использующие подход мультиплексного генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов в мтДНК с помощью капиллярного электрофореза, фактически отсутствуют.

Новая техническая задача - подбор последовательности (структуры) олигонуклеотидных проб для генотипирования полиморфизмов мтДНК, выбранных с учетом этнической (популяционной) специфики населения России.

Данная задача решена путем разработки набора синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной ДНК человека, который позволяет определить генотип митохондриальной ДНК человека в 38 однонуклеотидных сайтах, расположенных в различных участках митохондриального генома и полиморфных в популяциях населения России различного этнического происхождения, с помощью метода ферментативного однонуклеотидного удлинения гибридизированной пробы, причем структура олигонуклеотидных проб учитывает вариабельность ДНК в близлежащих сайтах и группировку генотипируемых сайтов в 3 панели для мультиплексных реакций.

Техническим результатом изобретения является повышение разрешающей способности митохондриальной ДНК при использовании в криминалистике. Применение разработанной системы маркеров позволяет в большинстве случаев дискриминировать индивидуальные мтДНК, имеющие одинаковую последовательность гипервариабельных сегментов D-петли, обычно используемых для криминалистики и установления родства.

Описание изобретения

Разработанный набор полиморфизмов мтДНК включает 38 сайтов, расположенных в различных участках митохондриального генома человека и обладающих минимум одной из следующих характеристик:

1) полиморфизм, маркирующий наиболее распространенные гаплогруппы мтДНК, характерные для населения России;

2) полиморфизм в гипервариабельных сайтах мтДНК, расположенных как в кодирующей, так и в некодирующей части мтДНК.

Выбор полиморфных сайтов проведен на основе анализа данных о популяционном полиморфизме мтДНК у населения России (собственные исследования и опубликованные данные). В качестве порогового значения популяционной частоты гаплогруппы мтДНК, т.е. минимального значения, при котором целесообразно введение полиморфизма в панель, было принято 5%.

Все полиморфизмы, исходя из ограничений возможностей мультиплексирования, организованы в 3 панели. Панель №1 содержит маркеры, определяющие «крупные» ветви филогенетического древа мтДНК и основные гаплогруппы (12 полиморфизмов). Панель №2 определяет генотип в гипервариабельных сайтах (12 полиморфизмов). Панель №3 генотипирует гаплогруппы и субгаплогруппы, наиболее распространенные на территории России (14 полиморфизмов).

Для каждой панели разработаны олигонуклеотидные пробы, структура которых учитывает следующие условия:

1) расчетная температура гибридизации пробы на матрицу (мтДНК) варьирует в пределах 55°C-60°C;

2) если известен популяционный полиморфизм, затрагивающий нуклеотиды, находящиеся в непосредственной близости от генотипируемого, разрабатываются дополнительные пробы, комплементарные вариантам последовательности, с целью обеспечить спефицичную гибридизацию в любом случае;

3) олигонуклеотидные пробы могут быть ориентированы как по прямой, так и по обратной цепи мтДНК;

4) длина проб, генотипирующих аналогичные нуклеотидные замены (например, A-G и G-A), должна различаться на несколько нуклеотидов, чтобы при анализе избежать перекрывания идентичных сигналов от разных полиморфизмов; различия в длине проб достигаются добавлением к последовательности пробы с 5'-конца повторяющейся некомплементарной последовательности "GACT";

5) Если пробы генотипируют различные нуклеотидные замены (например, A-G и С-Т), то их длина может быть одинаковой.

Структура разработанных олигонуклеотидных проб и их распределение по панелям представлены в таблице 1.

Для апробации набора было осуществлено генотипирование ДНК в двух выборках из популяций различного этнического происхождения: 60 русских и 65 хакасов. Кроме того, для этих образцов ДНК были также получены последовательности ГВС1 и ГВС2 мтДНК с целью сравнения дискриминирующей способности этих локусов с данной разработкой.

Генотипирование с помощью набора проб осуществляли по известному протоколу генотипирования методом SNaPshot (Applied Biosystems) следующим образом.

1. В качестве материала для исследования можно использовать препарат ДНК индивида, выделенный из любого биообразца любым способом, позволяющим использование ДНК в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции. Участки митохондриальной ДНК, содержащие генотипируемые сайты и примыкающие к ним области (комплементарные последовательностям проб), амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Для этого можно использовать любые праймеры, удовлетворяющие этому условию. При апробации набора были использованы праймеры, амплифицирующие весь митохондриальный геном человека в 11 перекрывающихся ПЦР-продуктах [15].

2. ПЦР-продукты должны быть очищены от dNTP и праймеров, оставшихся неиспользованными в ходе реакции. Очистку можно проводить любым способом, эффективно удаляющим эти компоненты из реакционной смеси. При апробации набора использовали обработку термочувствительными ферментами щелочной фосфатазой и экзонуклеазой I, согласно протоколу к набору SNaPshot Multiplex kit (Applied Biosystems, США). Все ПЦР-продукты для каждого индивида смешивали в равных пропорциях.

3. Для каждой панели готовили смесь проб с концентрацией 0,2 мкМ каждой пробы (в т.ч. в случае двух или трех проб для одного полиморфизма - для каждой из этих проб).

4. Проводили реакцию мини-секвенирования, используя набор SNaPshot Multiplex kit (Applied Biosystems, США), в соответствии с протоколом производителя. В результате реакции мини-секвенирования флюоресцентно меченый дидезоксинуклеотид, комплементарный нуклеотиду в исследуемом полиморфном сайте, достраивает пробу, гибридизованную на ПЦР-продукт.

5. Удаляли неинкорпорированные флюоресцентно меченые дидезоксинуклеозидтрифосфаты путем инкубации с термочувствительной щелочной фосфатазой, согласно протоколу к набору SNaPshot Multiplex kit (Applied Biosystems, США).

6. Для каждого образца смешивали 0,3 мкл продукта реакции, 0,2 мкл стандарта длины LIZ-120 (Applied Biosystems, США) и 9,5 мкл деионизованного формамида. Полученную смесь денатурировали в течение 5 минут при 95°C с последующим охлаждением и выполняли электрофорез на автоматическом генетическом анализаторе GA 3730 (Applied Biosystems, США) в соответствии с руководством пользователя. Во время электрофореза пробы разделяются в капилляре в зависимости от длины, и происходит регистрация флюоресценции проб (сигналы различаются в зависимости от генотипа) и размерного стандарта.

7. Анализ образцов (оценка генотипа) был проведен в программе Fragment Analysis (Applied Biosystems, США). В результате анализа оцениваются длины фрагментов и показатели их флюоресценции. Генотип по каждому локусу определяли по присутствию соответствующего сигнала (пика) в экспериментально определенном диапазоне длин фрагмента, зависящем от длины пробы. Диапазоны локализации сигнала для всех проб набора приведены в таблице 2. Примеры генотипирования для панелей 1-3 приведены на фиг.1-3 соответственно.

В результате генотипирования были получены индивидуальные генотипы (гаплотипы) мтДНК по входящим в набор сайтам. На основании частот встречаемости этих гаплотипов в выборках был рассчитан показатель генного разнообразия (h), который представляет собой вероятность того, что два случайно выбранных индивида будут иметь различные гаплотипы мтДНК. Для выборки хакасов значение этого показателя составило 0,9679, для выборки русских - 0,9853. Для выборки русских значение h, рассчитанное по гаплотипам ГВС1, было практически равно полученному с помощью нашего набора: 0,9864; тот же показатель, рассчитанный по гаплотипам ГВС2, был ниже - 0,9503. В случае популяции хакасов, которая характеризуется более низким генетическим разнообразием, h по гаплотипам ГВС1 составил 0,9396, а по гаплотипам ГВС2 - 0,9005, что существенно ниже, чем величина, полученная с помощью нашего набора проб (0,9679). Таким образом, разработанный нами набор олигонуклеотидных проб для генотипирования мтДНК характеризуется высоким дискриминационным потенциалом, в некоторых случаях превышающим возможности традиционно используемого секвенирования ГВС1 мтДНК.

Источники информации

1. Gill P., Ivanov P.L., Kimpton С, Piercy R., Benson N.. Tully G., Evett I., Hagelberg E., Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis // Nat. Genet. - 1994. - Vol. 6. - P. 130-135.

2. Andrews R.M., Kubacka I., Chinnery P.F., Lightowlers R.N., Turnbull D.M., Howell N. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet. - 1999. - Vol. 23. - No. 2. - P. 147.

3. Морозова И.Ю. Полиморфизм митохондриальной ДНК у русских европейской части России. Дисс… канд. биол. наук. - Москва, 2007. - 148 с.

4. Деренко М.В. Молекулярная филогеография коренного населения Северной Азии по данным об изменчивости митохондриальной ДНК. Дисс. … доктора биологических наук. - Магадан, 2009. - 423 с.

5. Корниенко И.В. Непрямая молекулярно-генетическая идентификация личности при массовом поступлении неопознанных тел. Дисс… доктора биологических наук. - Санкт-Петербург, 2005. - 302 с.

6. Brandstatter A., Salas A., Niederstatter Н., Gassner С, Carracedo A., Parson W. Dissection of mitochondrial superhaplogroup H using coding region SNPs // Electrophoresis. - 2006. - Vol. 27. - P. 2541-2550.

7. Pastinen Т., Kurg A., Metspalu A., Peltonen L., Syvanen A. Minisequencing: A Specific Tool for DNA Analysis and Diagnostics on Oligonucleotide Arrays // Genome Research. - 1997. - Vol. 7. - No. 6. - P. 606-614.

8. Sanchez, JJ, Phillips, C, Borsting, С et al. (2006) A multiplex assay with 52 single nucleotide polymorphisms for human identification // Electrophoresis. 2006. V. 27, (9). P. 1713-1724.

9. Ikryannikova L.N., Shitikov E.A., Zhivankova D.G., IPina E.N., Edelstein M.V., Govorun V.M. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae // Journal of Microbiological Methods. - 2008. - Vol. 75. - P. 385-391.

10. Quintans В., Alvarez-Iglesias V., Salas A., Lareu M., Carracedo A. Typing mtDNA SNPs of forensic and population interest with snapshot // International Congress Series. - 2004 - Vol. 1261. -P. 419-421.

11. Kohnemann S., Sibbing U., Pfeiffer H., Hohoff C. A rapid mtDNA assay of 22 SNPs in one multiplex reaction increases the power of forensic testing in European Caucasians // Int J Legal Med. - 2008. - Vol. 122. - P. 517-523.

12. Huang D., Gui C, Yi S., Yang Q., Yang R., Mei K. Typing of 24 mtDNA SNPs in a Chinese population using SNaPshot minisequencing // J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. - 2010. - Vol. 30. - P. 291-298.

13. Nelson TM, Just RS, Loreille O, Schanfield MS, Podini D. Development of a multiplex single base extension assay for mitochondrial DNA haplogroup typing // Croat Med J. 2007. Vol. 48. P. 460-472.

14. Grignani P., Peloso G., Achilli A., Turchi C, Tagliabracci A., Alu M., Beduschi G., Ricci U., Giunti L., Robino C, Gino S., Previdere C. Subtyping mtDNA haplogroup H by SNaPshot minisequencing and its application in forensic individual identification // Int J Legal Med. - 2006. - Vol. 120. - P. 151-156.

15. Torroni A., Rengo C, Guida V., Cruciani F., Sellitto D., Coppa A., Calderon F.L., Simionati В., Valle G., Richards M., Macaulay V., Scozzari R. Do the four clades of the mtDNA haplogroup L2 evolve at different rates? // Am. J. Hum. Genet. 2001. Vol. 69. P. 1348-1356.

Приложение

Фиг. 1 - Пример генотипирования панели №1, 2 образца ДНК.

Фиг. 2 - Пример генотипирования панели №2, 2 образца ДНК.

Фиг. 3 - Пример генотипирования панели №3, 2 образца ДНК.

Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной ДНК человека, характеризующийся тем, что данный набор позволяет определить генотип митохондриальной ДНК человека в 38 однонуклеотидных сайтах, расположенных в различных участках митохондриального генома и полиморфных в популяциях населения России различного этнического происхождения, с помощью метода ферментативного однонуклеотидного удлинения гибридизированной пробы, причем структура олигонуклеотидных проб учитывает вариабельность ДНК в близлежащих сайтах и группировку генотипируемых сайтов в 3 панели для мультиплексных реакций и имеет следующие характеристики:

Панель 1:

C3594T-F: 5'-CCCATACCCAACCCCCTGGT-3'
G3010A-F: 5'-TCGATGTTGGATCAGGACATCCC-3'
С14766T-F: 5'-GАСТСАССAATGACCCCAATACGCAAAА-3'
A12308G-F: 5'-GACTCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAA-3'
C7028T-F: 5'-GACTCGTACTACACGACACGTACTACGTTGTAGC-3'
G15301A-F: 5'-GACTTCACACGATTCTTTACCTTTCACTTCATCTT-3'
С12705T-F: 5'-CTCAGACCCAAACATTAATCAGTTCTTCAAATATCTACTCAT-3'
A10398G-F1: 5'-TAAGTCTGGCCTATGAGTGACTACAAAAAGGATTAGACTGA-3'
А10398G-F2: 5'-ТАAGTCTGGCCTATGAGTGACTACAAAAAGGATTAGACTGG-3'
G13708A-R: 5'-GACTGACTGACTGACTGACTGACTCTGCGAATAGGCTTCCGGCTG-3'
С10400T-R: 5'-TTAATGAGTCGАААТСATTCGTTTTGTTTAAACTATATACCAATTC-3'
А13263G-R: 5'-GACTGACTGACTGACTGACTTGATGCCGATTGTAACTATTATGAGTCCTAG-3'
G13368A-F: 5'-GACTGACTGACTGACTGACTGACTCAAAGCCATACTATTTATGTGCTCCGG-3'

Панель 2:

T16362C-R: 5'-AGGGGGGTCATCCATGGGG-3'
Т16519C-F: 5'-CCGACATCTGGTTCCTACTTCAGGG-3'
Т16189C-R1: 5'-GCTGTACTTGCTTGTAAGCATGGGG-3'
T16189C-R2: 5'-GCTGTACTTGCTTGTAAGCATGAGG-3'
G8251A-R: 5'-GACTGGGGGTGCTATAGGGTAAATACGGG-3'
T16356C-R1: 5'-GACTGACTGACTGTCATCCATGGGGACGAGA-3'
T16356C-R2: 5'-GACTGACTGACTGTCATCCATGGGGACGAGG-3'
G11914A-R: 5'-CCTGTAAGTAGGAGAGTGATATTTGATCAGGAGAA-3'
G1888A-F: 5'-GACTGACTGACTGAGGTTTCGGGGGTCTTAGCTTTGG-3'
T16093C-R: 5'-GACTGACTGACTGAATGGTGGCTGGCAGTAATGTACGA-3'
G709A-F: 5'-GACTGACTGACTGAGGTGATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAA-3'
Т16311C-R: 5'-GACTGACTGACTATGTGCTATGTACGGTAAATGGCTTTATGT-3'
T16304C-R1: 5'-GACTGACTGACTTGCTATGTACGGTAAATGGCTTTATGTACTATGT-3'
T16304C-R2: 5'-GACTGACTGACTTGCTATGTACGGTAAATGGCTTTATGTGCTATGT-3'
G16129A, C-R: 5'-GACTGACTGACTGGGTTTTTATGTACTACAGGTGGTCAAGTATTTATGGTAC-3'

Панель 3:

595insC-F: 5'-CCCCCCACAGTTTATGTAGCTTACCTCC-3'
A3816G-F: 5'-CTCCACCCTTATCACAACACAAGA-3'
A6047G-R: 5'-TGACTCGATAACGTTGTAGATGTGGTCGTTACC-3'
A12672G-F: 5'-AGAATTCTCACTGTGATATATAAACTCAGACCC-3'
A16162G-F: 5'-GACTGGTACCATAAATACTTGACCACCTGTAGTACAT-3'
A4769G-R: 5'-GACTGACTGGGCTATTCCTAGTTTTATTGCTATAGC-3'
T4336C-F: 5'-GACTGACTGACTGGAGCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGAC-3'
T14182C-R: 5'-GACTGACTGACTGTTACTGGTTGAACATTGTTTGTTGGTGT-3'
C5178A-F: 5'-ACTATCTCGCACCTGAAACAAG-3'
A4833G-R: 5'-CTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGAAGGCCGGATGTCAGAGGGG-3'
A14793G-F: 5'-GACTGACTGACTGACTGCAAAACTAACCCCCTAATAAAATTAATTAACC-3'
A14233G-R: 5'-GACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGACTGGTGCGGGGGCTTTGTATGA-3'
G4580A-F: 5'-GACTGACTGACTGACTGACTGATTTTTTACCTGAGTAGGCCTAGAAATAAACAT-3'
T9090C-F: 5'-GACTGACTGACTGACTCTAGCAATATCAACCATTAACCTTCCCTC-3'



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, и представляет собой штамм гибридных клеток mus musculus α - продуцент моноклональных антител к раково-тестикулярному антигену человека GAGE.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине, в частности к применению подкожного ксенографта клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией гена NRAS и с адаптацией к росту со стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c nude для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к молекуле искусственной нуклеиновой кислоты. Синергетический эффект, обусловленный наличием 3'-UTR гена альбумина и 3’-некодирующей области матричной РНК, уложенной во вторичную структуру типа «стебель-петля», в структуре искусственной нуклеиновой кислоты, позволяет повысить стабильность и продлить экспрессию кодируемого белка.

Настоящее изобретение относится к биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к новым полипептидам с антимикробной активностью в отношении энтерогеморрагических бактерий вида Escherichia coli.

Изобретение относится к биохимии. Описан антисмысловой олигомер, который вызывает пропуск 55-го экзона в гене дистрофина человека, состоящий из нуклеотидной последовательности, комплементарной любой из нуклеотидных последовательностей, состоящих из 14-го – 34-го или 15-го – 34-го нуклеотидов, считая от 5'-конца 55-го экзона гена дистрофина человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению L-лизина. Изобретение представляет собой способ получения L-лизина с использованием рекомбинантного коринеформного микроорганизма, в котором экспрессию гена-мишени, выбранного из группы, состоящей из гена, кодирующего субъединицу E1 пируватдегидрогеназы, гена, кодирующего гомосериндегидрогеназу, и гена, кодирующего УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигазу, ослабляют с использованием способа ингибирования транскрипции генов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены изолированный полинуклеотидный субстрат для каталитической нуклеиновой кислоты с ферментативной активностью и его применение, способ детектирования присутствия мишени в образце, использующий указанный субстрат, а также набор для детекции молекулы-мишени и комплект для детекции молекулы-мишени, содержащие указанный субстрат, и набор для применения в сигнальном каскаде, содержащий указанный комплект.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура. Представлен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к клеточной линии рака яичника человека 533 OOS. Указанная клеточная линия предназначена для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования активности различных фармацевтических препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к клеточной линии колоректального рака человека 485 colo can. Указанная клеточная линия предназначена для создания противоопухолевых вакцин и тестирования активности различных фармацевтических препаратов.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено применение варианта субтилизина 309 для удаления пятен от яиц, где указанный вариант имеет 80% идентичность по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного субтилизина и включает замены S9R, A15T, V68A, N218D, Q245R, где указанный вариант дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих модификаций: G61E, N62D, N76D, *97aG, A98S, S99G, S101G, H120{V,Q}, P131S, Q137H, A194P, A228V, A230V, N261D.

Предложен способ получения L-метионина, в котором О-фосфо-L-гомосерин (OPHS) и метантиол ферментативно превращают в L-метионин и Н3РО4 согласно схеме реакции: О-фосфо-L-гомосерин + CH3-SH <=> L-метионин + H3PO4.

Группа изобретений касается онкологии и фармакологии. Предложено терапевтическое и/или профилактическое средство против опухоли с мутацией в RET и против метастазов опухоли, которое содержат соединение формулы (I), где R - C1-6-алкил, его соль или его сольват в качестве активного ингредиента; терапевтическое и/или профилактическое средство того же состава, используемое для пациента с мутацией в RET и против метастазов опухоли; способ идентификации рака или пациента, реагирующего на лечение соединением формулы (I).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения 2,4-дигидроксибутирата (2,4-ДГБ) из гомосерина, включающий два этапа: 1) замещение первичной аминогруппы гомосерина карбонильной группой для получения 2-оксо-4-гидроксибутирата (ОГБ), и 2) восстановление полученного ОГБ до 2,4-ДГБ.

Изобретение относится к биохимии. Описано антитело для снижения концентрации антигена в плазме, содержащее антигенсвязывающий домен и FcRn-связывающий домен человека, активность связывания антигена которого отличается в двух различных условиях концентрации кальция и является более низкой в условиях низкой концентрации кальция, чем в условиях высокой концентрации кальция, где низкая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 0,1 до 30 мкМ, а высокая концентрация кальция представляет собой концентрацию ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ, где указанное антитело содержит по крайней мере четыре аминокислоты, выбранные из группы, включающей аминокислоты в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 в соответствии с нумерацией по Kabat в легкой цепи, которые обладают хелатирующей активностью в отношении металла.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложена выделенная молекула антитела, специфически связывающаяся с областью экзосайта 1 тромбина, а также антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен полипептид, обладающий цитотоксической активностью, содержащий Fc-область IgG, которая состоит из гетеродимера, содержащего первый полипептид и второй полипептид, в аминокислотных последовательностях которых произведены серии мутаций.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения трансформированного растения розы, имеющего повышенное содержание в лепестках дельфинидина по сравнению с нетрансформированным растением розы, включающему стадию трансформации разновидности садовой розы (Rosa hybrida) плазмидой, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы, и 35S промотор вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ диагностики полиморфизма SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3 крупного рогатого скота.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой L-лизин-продуцирующую бактерию, принадлежащую к роду Corynebacterium или роду Brevibacterium и модифицированную таким образом, что ген ltbR, кодирующий транскрипционный регулятор, инактивирован.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к получению микробных продуцентов, и может быть использовано для получения микробного масла. Сконструирована жирообразующая клетка дрожжей, способная к конверсии источника углерода в жирную кислоту, производное жирной кислоты и/или триацилглицерин.

Изобретение относится к области биохимии. Описан набор олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной ДНК человека, характеризующийся тем, что данный набор позволяет определить генотип митохондриальной ДНК человека в 38 однонуклеотидных сайтах, расположенных в различных участках митохондриального генома и полиморфных в популяциях населения России различного этнического происхождения, с помощью метода ферментативного однонуклеотидного удлинения гибридизированной пробы, причем структура олигонуклеотидных проб учитывает вариабельность ДНК в близлежащих сайтах и группировку генотипируемых сайтов в 3 панели для мультиплексных реакций. 3 ил., 2 табл.

Наверх