Микроорганизм для продуцирования путресцина и способ получения путресцина с его использованием

Группа изобретений относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему повышенной путресцин-продуцирующей способностью, и способу получения путресцина с его использованием. В указанному микроорганизме активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, инактивирована. Предложен также способ получения путресцина с использованием указанного микроорганизма, включающий культивирование микроорганизма и выделение путресцина из подвергнутого культивированию микроорганизма или культуральной среды, полученных на указанной выше стадии. Группа изобретений обеспечивает получение путресцина с высоким выходом. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 3 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму для продуцирования путресцина и способу получения путресцина с его использованием.

Предшествующий уровень техники

Биогенные амины (ВА) представляют собой азотистые соединения, которые получаются главным образом в результате декарбоксилирования аминокислот, аминирования альдегида и кетона и трансаминирования. Такие биогенные амины являются низкомолекулярными соединениями, которые синтезируются в ходе метаболизма микроорганизмами, растениями и животными, и поэтому они известны как компоненты, легко обнаруживаемые в их клетках. В частности, такие полиамины, как спермидин, спермин, путресцин (или 1,4-бутандиамин) и кадаверин, являются веществами, присутствующими в большинстве живых клеток.

Среди них путресцин является важным исходным веществом в синтезе полиамина найлона-4,6, осуществляемом путем взаимодействия с адипиновой кислотой, и его обычно получают путем химического синтеза из пропилена через акрилонитрил и сукцинонитрил.

Помимо этого описан способ получения путресцина в высокой концентрации с использованием трансформации Е. coli и микроорганизмов рода Corynebacterium (международная публикация заявки № WO06/005603; международная публикация заявки № WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng., 104(4): 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 88(4): 859-868, 2010; и Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 95: 169-178, 2012). Кроме того, было проведено активное исследование переносчика путресцина, относящегося к Е. coli, дрожжам, клеткам растений и животных (K. Igarashi, Plant Physiol. Biochem., 48: 506-512, 2010).

В то же время, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что мембранные белки, кодируемые NCgl2522, функционируют в качестве экспортера путресцина в микроорганизме рода Corynebacterium, который имеет путь синтеза путресцина, и подтвердили, что путресцин можно получать с высоким выходом посредством повышения активности NCgl2522 по сравнению с его эндогенной активностью (заявка на патент Кореи (KR) №10-2013-0030020).

Кроме того, ген NCgl2523 представляет собой транскрипционный фактор, связанный с множественной лекарственной устойчивостью, принадлежащий семейству TetR и, как известно, действующий в качестве ингибитора экспрессии NCgl2522 (Hirochi et al., J. Biol. Chem., 280: 46, 38711-38719, 2005).

Авторы настоящего изобретения в течение длительного времени проводили исследования в этом направлении и подтвердили, что продуцирование путресцина усиливается, аналогично эффектам повышения активности NCgl2522, в результате истощения NCgl2523, который входит в состав оперона NCgl2522, с решением тем самым задачи настоящего изобретения.

Описание

Техническая проблема

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить рекомбинантный микроорганизм, способный продуцировать путресцин с высоким выходом.

Другой задачей настоящего изобретения является предложение способа получения путресцина с высоким выходом с использованием данного микроорганизма.

Техническое решение

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, для решения указанных выше задач предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, в котором инактивирован белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.

В одном из типичных воплощений настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, причем в данный микроорганизм дополнительно введена активность орнитиндекарбоксилазы (ODC).

В другом типичном воплощении настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, в котором ODC имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.

В еще одном типичном воплощении настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, причем в данном микроорганизме дополнительно инактивирована ацетилтрансферазная активность.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, где ацетилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15 или 16.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, причем данный микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutaminicum.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения путресцина, включающий:

1) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего путресцин-продуцирующей способностью, в котором инактивирован белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, в культуральной среде; и

2) выделение путресцина из подвергнутого культивированию микроорганизма или культуральной среды, полученных на указанной выше стадии.

В типичном воплощении настоящего изобретения предложен способ получения путресцина, в котором микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutaminicum.

Далее, настоящее изобретение будет описано подробно.

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему путресцин-продуцирующей способностью, в котором инактивирован белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, такой как NCgl2523.

Использованный в данном описании термин «NCgl2523» относится к связанному с множественной лекарственной устойчивостью транскрипционному фактору, принадлежащему семейству TetR и, как известно, действующему в качестве ингибитора экспрессии NCgl2522 (Hirochi et al., J. Biol. Chem., 280: 46, 38711-38719, 2005).

В настоящем изобретении NCgl2523 представляет собой белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, имеющую гомологию с этой последовательностью, составляющую 70% или более, более конкретно 80% или более, еще конкретнее 90% или более, еще конкретнее 98% или более и наиболее конкретно 99% или более, и не ограничивающуюся таковой, при условии, что он представляет собой белок, обладающей активностью ингибитора экспрессии NCgl2522.

Кроме того, поскольку аминокислотные последовательности белков, демонстрирующих такую активность, могут отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов, это не является ограничением. Очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность, часть которой изменена с использованием делеций, модификаций, замен или вставок, включен в объем настоящего изобретения, при условии, что белок с последовательностью, имеющей гомологию с данной последовательностью, демонстрирует биологическую активность, по существу эквивалентную или соответствующую активности белка с SEQ ID NO: 2.

Использованный в данном описании термин «гомология» относится к сходству между заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и гомология может быть выражена в процентах. В данной заявке, гомологию последовательности, обладающей идентичной или схожей активностью с заданной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, выражают в виде «% гомологии». Например, гомология может быть установлена с использованием традиционного программного обеспечения, с помощью которого рассчитывают относящиеся к ней параметры, такие как балл, идентичность, сходство и т.д., и более конкретно BLAST 2.0, либо путем сравнения последовательностей в эксперименте с использованием гибридизации по Саузерну в условиях определенной жесткости. Определение соответствующих условий гибридизации не выходит за рамки объема данной области техники и может быть выполнено средним специалистом в данной области техники с использованием известных методов (т.е. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

При том условии, что он кодирует белок, имеющий активность, схожую с активностью белков NCgl2523, полинуклеотид, кодирующий NCgl2523 по настоящему изобретению, может кодировать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий гомологию с данной последовательностью, составляющую 70% или более, конкретно 80% или более, более конкретно 90% или более, еще более конкретно, гомологию с ней, составляющую 95% или более, еще более конкретно 98% или более и наиболее конкретно 99% или более, может, в частности, включать нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 1 или 3.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий NCgl2523 по настоящему изобретению, может гибридизоваться в жестких условиях с зондом с нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1 или 3, или с зондом, происходящим из этой нуклеотидной последовательности, и может представлять собой вариант, кодирующий функционально нормальный NCgl2523. Использованный в данном описании термин «жесткие условия» относится к условиям, в которых возможно осуществление специфической гибридизации между полинуклеотидами. Например, такие жесткие условия описаны подробно в литературе (т.е. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

В настоящем изобретении было подтверждено, что, когда NCgl2523, который входит в состав оперона NCgl2522, был делетирован в микроорганизме рода Corynebacterium, обладающем путресцин-продуцирующей способностью, продуцирование путресцина усиливалось аналогично тому, как это происходит в случае повышения активности NCgl2522. В связи с этим, согласно настоящему изобретению может быть предложен рекомбинантный микроорганизм, демонстрирующий способность продуцировать путресцин с высоким выходом благодаря ингибирования экспрессии NCgl2522 в результате инактивации активности NCgl2523. Таким образом, как раскрыто в этом воплощении настоящего изобретения, инактивируя соответствующий NCgl2523 и гены, кодирующие схожие с ним аминокислотные последовательности, можно повысить путресцин-продуцирующую способность микроорганизма, в котором имеются аминокислотные последовательности, схожие с последовательностью NCgl2523, где такие аминокислотные последовательности состоят из NCgl2522 и оперона, или повысить путресцин-продуцирующую способность микроорганизма, в котором NCgl2523 действует аналогично модулятору экспрессии NCgl2522.

Использованный в данном описании термин «инактивация» относится к неосуществлению экспрессии гена, кодирующего соответствующий полипептид, к демонстрации некоторого ослабления генной экспрессии, неосуществлению продуцирования соответствующего функционального полипептида, даже в случае его экспрессии.

Помимо этого, термин «инактивация» относится не только к полной инактивации гена, кодирующего соответствующий полипептид, но также к ослаблению или существенному снижению экспрессии по сравнению с диким типом, в результате чего данный ген практически не экспрессируется. Таким образом, инактивация гена может быть полной (нокаут (К/О)) или частичной (например, с получением гипоморфа, для которого продемонстрирован уровень генной экспрессии ниже нормального, или с получением продукта мутантного гена, для которого продемонстрировано частичное снижение активности в результате образования гипоморфа).

В частности, в настоящем изобретении инактивация NCgl2523 может быть вызвана посредством:

1) частичного или полного делетирования полинуклеотида, кодирующего данный белок;

2) модификации регуляторной последовательности с целью ослабления экспрессии этого полинуклеотида;

3) модификации полинуклеотидной последовательности в хромосоме с целью снижения активности белка; и

4) их комбинации,

но конкретно этим не ограничивается.

1) Частичное или полное делетирование полинуклеотида, кодирующего данный белок, может быть осуществлено путем замены полинуклеотида, кодирующего эндогенные целевые белки, на хромосомы с частично удаленным полинуклеотидом или маркерным геном с использованием вектора для встраивания в хромосому микроорганизма. Термин «частичный» может пониматься по-разному в зависимости от типа полинуклеотидов, но относится, в частности, к 1-300, более конкретно 1-100 и еще конкретнее 1-50 нуклеотидам.

Использованный в данном описании термин «вектор» относится к конструкции на основе ДНК, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую желаемый белок, функционально связанную с соответствующей регулирующей экспрессию последовательностью с целью экспрессии желаемого белка в подходящей клетке хозяина. Такая регуляторная последовательность включает промотор, который может инициировать транскрипцию, возможно последовательность оператора для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы с мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. После введения вектора посредством трансформации в подходящую клетку хозяина он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина и может быть встроен в сам геном.

Вектор, используемый в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений при условии, что он способен реплицироваться в клетках-хозяинах, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры традиционных векторов могут включать существующую в природе или рекомбинантную плазмиду, космиду, вектор на основе вируса и бактериофага. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A и Charon21A, а плазмиды pBR типа, pUC типа, pBluescriptll типа, pGEM типа, pTZ типа, pCL типа и рЕТ типа и т.д. можно использовать в качестве плазмидного вектора. Вектор, который можно использовать в настоящем изобретении, не имеет конкретных ограничений, и можно использовать любой известный экспрессирующий вектор. В частности, может быть использован вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 или pCC1BAC.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий желаемый белок в хромосомах, можно заменить на мутированный полинуклеотид, используя вектор для встраивания в хромосому. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть осуществлена любым методом, известным в данной области техники, таким как метод гомологической рекомбинации, но конкретно этим не ограничивается.

Использованный в данном описании термин «трансформация» относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевые белки, в клетки-хозяева таким образом, чтобы белки, кодируемые этим полинуклеотидом, экспрессировались в клетках-хозяевах. При условии, что введенный посредством трансформации полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, он относится к любому из двух вариантов, например, он встроен в хромосомы клеток-хозяев или существует экстрахромосомно. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевые белки. Полинуклеотид можно вводить в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетки-хозяева и экспрессирован в них. Например, полинуклеотид может быть введен в клетки-хозяева в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую в себя все элементы, необходимые для ее автономной экспрессии. Обычно, экспрессионная кассета включает в себя промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигналы терминации транскрипции, сайты связывания рибосомы или сигналы терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме самореплицирующегося экспрессирующего вектора. Помимо этого, полинуклеотид может быть введен в клетки-хозяева в том виде, как он есть, и может быть функционально связан с последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине, но этим не ограничивается.

Кроме того, термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между полинуклеотидной последовательностью, кодирующей желаемые белки, и последовательностью промотора, с использованием которой инициируется и опосредуется транскрипция данной полинуклеотидной последовательности.

Далее, 2) модификация регуляторной последовательности для ослабления экспрессии полинуклеотида может быть осуществлена путем введения модификации в регуляторную последовательность посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в нуклеотидной последовательности или их комбинации либо путем замены на нуклеотидную последовательность с более низкой активностью, с целью снижения активности регуляторной последовательности, но конкретно этим не ограничивается. Регуляторная последовательность может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но этим не ограничивается.

Кроме того, 3) модификация полинуклеотидной последовательности в хромосоме может быть осуществлена путем введения модификации в регуляторную последовательность посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в нуклеотидной последовательности или их комбинации либо путем замены регуляторной последовательности на нуклеотидную последовательность с более низкой активностью, с целью снижения активности белка, но этим не ограничивается.

Использованный в данном описании термин «микроорганизм, обладающий путресцин-продуцирующей способностью» или «микроорганизм, продуцирующий путресцин» относится к микроорганизму, от природы обладающему путресцин-продуцирующей способностью, или к микроорганизму, полученному путем придания способности продуцировать путресцин родительскому штамму, не обладающему путресцин-продуцирующей способностью.

Микроорганизм, продуцирующий путресцин, может представлять собой, но не ограничивается им, микроорганизм, обладающий улучшенной способностью к продуцированию орнитина, используемому в качестве исходного вещества для биосинтеза путресцина, причем данный микроорганизм модифицирован таким образом, что имеет более высокие активности ацетилглутаматсинтазы, катализирующей превращение глутамата в ацетилглутамат (N-ацетилглутамат), или орнитинацетилтрансферазы (ArgJ), катализирующей превращение ацетилорнитина в орнитин, ацетилглутаматкиназы (ArgB), катализирующей превращение ацетилглутамата в ацетил тутам ил фосфат (N-ацетилглутамилфосфат), ацетил-гамма-глутамил-фосфатредуктазы (ArgC), катализирующей превращение ацетилглутамилфосфата в ацетилглутамат-полуальдегид (N-ацетилглутамат-полуальдегид), или ацетилорнитинаминотрансферазы (ArgD), катализирующей превращение ацетилглутамат-полуальдегида в ацетилорнитин (N-ацетилорнитин), по сравнению с эндогенной активностью с целью усиления пути биосинтеза от глутамата до орнитина глутамата.

Кроме того, данный микроорганизм модифицирован таким образом, чтобы устранить эндогенные активности орнитинкарбамоилтрансферазы (ArgF), вовлеченной в синтез аргинина из орнитина, экспортера глутамата (NCgl1221) и/или ацетилтрансферазы, которая катализирует ацетилирование путресцина, и/или модифицирован с целью введения активности орнитиндекарбоксилазы (ODC).

В данной заявке, орнитинкарбамоилтрансфераза (ArgF), экспортер глутамата (NCgl1221), орнитиндекарбоксилаза (ODC), ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктаза (ArgC), ацетилглутаматсинтаза или орнитинацетилтрансфераза (ArgJ), ацетилглутаматкиназа (ArgB) и ацетилорнитинаминотрансфераза (ArgD) могут включать, в частности, аминокислотную последовательность, каждая их которых представлена SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14, или аминокислотную последовательность, имеющую с этой последовательностью гомологию, составляющую 70% или более, более конкретно 80% или более, еще конкретнее 90% или более, но конкретно этим не ограничивается.

Кроме того, ацетилтрансфераза, которая катализирует ацетилирование путресцина, может включать, в частности, аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15 или 16, или аминокислотную последовательность, имеющую с этой последовательностью гомологию, составляющую 70% или более, более конкретно 80% или более, еще конкретнее 90% или более, но конкретно этим не ограничивается.

В частности, повышение активности в настоящем изобретении может быть осуществлено посредством:

1) увеличения числа копий полинуклеотидов, кодирующих фермент;

2) модификации регуляторной последовательности для усиления экспрессии данного полинуклеотида;

3) модификации полинуклеотидной последовательности в хромосоме для повышения активности этого фермента; или

4) улучшающей модификации с использованием их комбинации,

но этим не ограничивается.

1) Увеличение числа копий полинуклеотидов может быть осуществлено посредством использования формы, функционально связанной с вектором, или посредством встраивания в хромосомы клеток хозяина, но конкретно этим не ограничивается. В частности, это может быть осуществлено путем введения в клетки-хозяева вектора, с которым функционально связан полинуклеотид, кодирующий фермент по настоящему изобретению, и который может реплицироваться и функционировать независимо от клеток-хозяев, или путем введения в клетки-хозяева вектора, с которым функционально связан полинуклеотид и который способен обеспечить встраивание данного полинуклеотида в хромосомы клеток-хозяев, в результате чего увеличивается число копий полинуклеотидов в хромосомах клеток-хозяев.

Далее, 2) модификация регуляторной последовательности для усиления экспрессии полинуклеотидов может быть осуществлена путем введения модификации в последовательность посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации либо путем замены на нуклеотидную последовательность с повышенной активностью, с целью повышения активности регуляторной последовательности, но конкретно этим не ограничивается. Регуляторная последовательность может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, и т.д., но конкретно этим не ограничивается.

Сильный гетерологичный промотор может быть присоединен вместо исходного промотора в обратном направлении по отношению к полинуклеотид-экспрессирующей единице. Примерами сильного промотора являются промотор CJ7, промотор lysCPI, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА или асеВ и т.д., и более конкретно, могут представлять собой промотор, происходящий из коринебактерий, промотор lysCPI (WO 2009/096689) или промотор CJ7 (патент KR №0620092 и заявка KR WO 2006/065095), функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим фермент, и усиливающий его экспрессию, но ими не ограничиваются.

Кроме того, 3) модификация полинуклеотидной последовательности в хромосоме может быть осуществлена путем введения модификации в регуляторную последовательность посредством делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в нуклеотидной последовательности или их комбинации либо путем замены на полинуклеотидную последовательность, модифицированную для приобретения повышенной активности, с целью повышения активности полинуклеотидной последовательности, но конкретно этим не ограничивается.

Кроме того, инактивация орнитинкарбамоилтрансферазы (ArgF), экспортера глутамата и ацетилтрансферазы может быть осуществлена методами инактивации NCgl2523, которые упомянуты выше:

1) частичного или полного делетирования полинуклеотида, кодирующего данный белок;

2) модификации регуляторной последовательности с целью ослабления экспрессии этого полинуклеотида;

3) модификации полинуклеотидной последовательности в хромосоме с целью снижения активности белка; и

4) их комбинации,

но конкретно этим не ограничивается.

Что касается микроорганизма по настоящему изобретению, то он представляет собой микроорганизм, обладающий путресцин-продуцирующей способностью и включает прокариотические микроорганизмы, экспрессирующие белки, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Примерами таких микроорганизмов являются микроорганизмы Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomanas sp., V/b/7'0 sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Arcanobacterium sp., Alcaligenes sp. и т.д. Микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой, в частности, микроорганизм рода Corynebacterium и более конкретно, Corynebacterium glutamicum, но им не ограничивается.

В одном из типичных воплощений настоящего изобретения используются штаммы, обладающие способностью продуцировать путресцин в высокой концентрации благодаря усилению пути биосинтеза путресцина из глутамата, которые представляют собой микроорганизмы рода Corynebacterium, депонированные с №№ доступа КССМ11138Р (патент KR №2012-0064046) и КССМ11240Р (патент KR 2012-0003634).

В другом типичном воплощении настоящего изобретения используются КССМ11138Р и КССМ11240Р, представляющие собой путресцин-продуцирующие штаммы, происходящие из Corynebacterium glutaminicum АТСС13032, и DAB12-a (патент KR №2013-0082478) и DAB12-D (KR №2013-0082478; DAB12-a ΔNCgl1469), представляющие собой путресцин-продуцирующие штаммы, происходящие из Corynebacterium glutaminicum АТСС13869, при этом все они имеют идентичные генотипы. Штамм АТСС13869 может быть получен из Американской коллекции типовых культур (АТСС).

В частности, авторы настоящего изобретения обозначили микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной путресцин-продуцирующей способностью благодаря инактивации активности NCgl2523 в Corynebacterium glutaminicum КССМ11240Р, который представляет собой путресцин-продуцирующий штамм, как Corynebacterium glutaminicum СС01-0844 и депонировали его в Корейский центр культур микроорганизмов (КССМ) в соответствии с Будапештским договором 25 февраля 2014 г. с номером доступа КССМ11520Р.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения путресцина, включающий:

1) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего повышенной путресцин-продуцирующей способностью, в котором инактивирован белок, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, в культуральной среде; и

2) выделение путресцина из подвергнутого культивированию микроорганизма или культуральной среды, полученных на указанной выше стадии.

В данном способе культивирование микроорганизма может быть осуществлено с использованием известных методов периодического культивирования, методов непрерывного культивирования и методов периодического культивирования с подпиткой и т.д., но конкретно этим не ограничивается. В данной заявке культивирование можно поддерживать в условиях оптимальных значений рН (например, рН 5-9, конкретно рН 6-8 и наиболее конкретно рН 6,8), используя основные соединения (например, гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак) или кислотные соединения (например, фосфорную кислоту или серную кислоту), и в аэробных условиях, добавляя к клеточной культуре кислород или газовую смесь, содержащую кислород, но конкретно этим не ограничиваясь. В процессе культивирования можно поддерживать температуру 20-45°С и конкретно 25-40°С, и культивирование проводить в течение примерно 10-160 часов. Путресцин, образованный в результате культивирования, может быть экспортирован в культуральную среду или может оставаться в клетках.

Кроме того, используемая культуральная среда может включать в себя сахар и углевод (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу), масло и жир (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирную кислоту (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирт (например, глицерин и этанол) и органическую кислоту (например, уксусную кислоту), по отдельности или в комбинации, в качестве источника углерода; азот-содержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной сок, экстракт солода, кукурузный раствор, порошок соевой муки и мочевину) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония), по отдельности или в комбинации, в качестве источника азота; дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующую им натрий-содержащую соль, по отдельности или в комбинации, в качестве источника фосфора; и другие необходимые стимулирующие рост вещества, включая соли металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины, но этим не ограничивается.

Выделение путресцина, образованного на стадии культивирования по настоящему изобретению, может быть выполнено с использованием подходящего, известного в данной области техники способа, в зависимости от способов культивирования, таких как способы периодического, непрерывного или периодического культивирования с подпиткой и т.д., со сбором, при этом, желаемых аминокислот из культуральной жидкости.

Полезные эффекты

Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной путресцин-продуцирующей способностью, по настоящему изобретению модифицирован с целью инактивации активности белка, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, тем самым индуцируя повышенную активность белка, который, как ожидается, является экспортером путресцина, конкретно NCgl2522, и усиливая экспорт путресцина во внеклеточное пространство, и вследствие этого может эффективно продуцировать путресцин.

Описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую комбинированные структуры из NCgl2523 и соседних единиц. В частности, на Фиг. 1 представлена схематическая диаграмма, показывающая комбинированную структуру NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524, представляющую собой комбинированную структуру соседних генов микроорганизма, включающую NCgl2523 (тип 1); структуру, составленную из комбинированных NCgl2522-NCgl2523 и расположенного отдельно NCgl2524 (тип 2); или комбинированную структуру NCgl2522-NCgl2523 (тип 3).

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако эти примеры приведены только в целях иллюстрации, и не подразумевается, что данное изобретение ограничено этими примерами.

Пример 1. Получение штаммов с делецией NCgl2523 и проверка их путресцин-продуцирующей способности

1-1. Получение штаммов с делецией NCgl2523 на основе путресцин-продуцирующих штаммов, происходящих из АТСС13032

Для проверки того, оказывает ли делеция NCgl2523, происходящего из Corynebacterium glutaminicum АТСС13032, влияние на путресцин-продуцирующую способность, готовили векторы для делеции гена, кодирующего NCgl2523.

В частности, с учетом нуклеотидной последовательности гена, кодирующего NCgl2523, представленной SEQ ID NO: 1, конструировали пару праймеров с SEQ ID NO: 4 и 5 для получения гомологичных рекомбинантных фрагментов, соответствующих N-концевому участку NCgl2523, и пару праймеров с SEQ ID NO: 6 и 7 для получения гомологичных рекомбинантных фрагментов, соответствующих С-концевому участку NCgl2523, которые приведены ниже в Таблице 1.

Проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР), используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13032 в качестве матрицы и две пары праймеров, амплифицируя тем самым ПЦР-фрагменты гена NCgl2523, соответствующие N-концевому и С-концевому участкам. С использованием электрофореза этих ПЦР-фрагментов получали желаемые фрагменты. В данной заявке ПЦР реакцию повторяли, применяя 30 циклов, включающих в себя денатурацию в течение 30 секунд при 95°С, отжиг в течение 30 секунд при 55°С и удлинение в течение 30 секунд при 72°С. Полученные таким образом фрагменты, соответствующие N-концевому и С-концевому участкам, обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SaiI и ферментами рестрикции SalI и XbaI, соответственно. Обработанные фрагменты клонировали в векторы pDZ, обработанные ферментами рестрикции BamHI и XbaI, конструируя тем самым плазмиды pDZ-1'NCgl2523(K/O).

Плазмиды pDZ-1'NCgl2523(K/O) вводили путем трансформации в каждый из штаммов КССМ11138Р (патент KR №10-1348461) и КССМ11240Р (патент KR №2013-0082478), используя электропорацию, с получением трансформантов. Для образования колоний трансформанты высевали и культивировали на чашках с BHIS (дополненной сердечно-мозговым экстрактом) средой (сердечно-мозговой экстракт (37 г/л), сорбит (91 г/л) и агар (2%)), содержащей канамицин (25 мкг/мл) и X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолин-D-галактозид). Среди образованных колоний отбирали голубые колонии, как колонии штаммов, в которые введены плазмиды pDZ-1'NCgl2523(K/O).

Отобранные штаммы культивируют в СМ среде (глюкоза (10 г/л), полипептон (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), мясной экстракт (5 г/л), NaCl (2,5 г/л), мочевина (2 г/л) и рН 6,8) при 30°С в течение 8 часов. После проведения серийного разведения в диапазоне от 10-4 до 10-10 для каждой клеточной культуры разведенные образцы высевали на чашки и культивировали на X-gal-содержащей твердой среде для образования колоний. Среди образованных колоний окончательно отбирали белые колонии, которые появлялись с относительно низкой частотой, в качестве колоний штаммов с делецией гена, кодирующего NCgl2523, в результате вторичного кроссинговера.

В окончательно отобранных штаммах проводили ПЦР, используя пару праймеров с SEQ ID NO: 4 и 7, для подтверждения делеции гена, кодирующего NCgl2523. Каждый мутант Corynebacterium glutamicum обозначали как КССМ11138Р ΔNCgl2523 и КССМ11240Р ΔNCgl2523.

1-2. Получение штаммов с делецией NCgl2523 на основе путресцин-продуцирующих штаммов, происходящих из АТСС13869

Штаммы с делецией NCgl2523 конструировали на основе DAB12-a (патент KR №2013-0082478) и DAB12-D (патент KR №2013-0082478; DAB12-a ANCgl1469), которые представляют собой путресцин-продуцирующие штаммы, происходящие из Corynebacterium glutaminicum АТСС13869.

В частности, для проверки последовательности гена NCgl2523 и экспрессированного на его основе белка, происходящего из Corynebacterium glutaminicum АТСС13869, проводили ПЦР, используя геномную ДНК Corynebacterium glutaminicum АТСС13869 в качестве матрицы и пару праймеров с SEQ ID NO: 4 и 7. В данной заявке ПЦР реакцию повторяли, применяя 30 циклов, включающих денатурацию в течение 30 секунд при 95°С, отжиг в течение 30 секунд при 55°С и удлинение в течение 1 минуты 30 секунд при 72°С.

В результате разделения посредством электрофореза полученных таким образом продуктов ПЦР и анализа путем секвенирования обнаруживали, что ген, кодирующий NCgl2523, происходящий из Corynebacterium glutaminicum АТСС13869, включает нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3. Кроме того, сравнивали аминокислотную последовательность белков, кодируемых этим геном, с аминокислотной последовательностью NCgl2523 (SEQ ID NO: 2), происходящего из Corynebacterium glutaminicum ATCC13032, и в результате показано 100% гомологии.

Чтобы делетировать ген, кодирующий NCgl2523, происходящий из Corynebacterium glutaminicum АТСС 13869, проводили ПЦР, используя геномную ДНК Corynebacterium glutaminicum АТСС 13869 в качестве матрицы и две пары праймеров, описанных в Таблице 1, приведенной в примере 1-1, и амплифицировали ПЦР-фрагменты гена NCgl2523, соответствующие N-концевому и С-концевому участкам, получая в результате электрофореза желаемые фрагменты. В данной заявке ПЦР реакцию повторяли, применяя 30 циклов, включающих денатурацию в течение 30 секунд при 95°С, отжиг в течение 30 секунд при 55°С и удлинение в течение 30 секунд при 72°С. Полученные фрагменты, соответствующие N-концевому и С-концевому участкам, обрабатывали ферментами рестрикции BamHI и SalI и ферментами рестрикции SalI и XbaI, соответственно. Обработанные фрагменты клонировали в векторы pDZ, обработанные ферментами рестрикции BamHI и XbaI, конструируя таким образом плазмиды pDZ-2'NCgl2523(K/O).

После введения путем трансформации pDZ-2'NCgl2523(K/O) в каждый из штаммов Corynebacterium glutaminicum DAB12-a и DAB12-b аналогично тому, как описано в примере 1-1, отбирали штаммы с делецией гена, кодирующего NCgl2523. Отобранные мутанты Corynebacterium glutaminicum обозначали как DAB12-a ΔNCgl2523 и DAB12-D ΔNCgl2523.

1-3. Оценка путресцин-продуцирующей способности штаммов с делецией NCgl2523

Чтобы проверить влияние делеции NCgl2523 на продуцирование путресцина путресцин-продуцирующими штаммами, сравнивали мутанты Corynebacterium glutaminicum, сконструированные, как описано в примере 1-1 и 1-2, в отношении путресцин-продуцирующей способности.

В частности, каждый из 4 разных типов мутантов Corynebacterium glutamicum (КССМ11138Р ΔNCgl2523, КССМ11240Р ΔNCgl2523, DAB12-a ΔNCgl2523 и DAB12-D ΔNCgl2523) и 4 разных типов родительских штаммов (КССМ11138Р, КССМ11240Р, DAB12-a и DAB12-b) высевали на содержащую 1 мМ аргинин СМ среду для чашек (1% глюкозы, 1% полипептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,25% NaCl, 0,2% мочевины, 100 мкл 50%-ного раствора NaOH и 2% агара, рН 6,8; из расчета на 1 л) и культивировали при 30°С в течение 24 часов. После инокулирования в количестве 1 платиновой петли каждым из штаммов, подвергнутых культивированию, 25 мл среды для титрования (8% глюкозы, 0,25% соевых белков, 0,50% твердых веществ кукурузного экстракта, 4% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4⋅7H2O, 0,15% мочевины, 100 мкг биотина, 3 мг тиамина гидрохлорида, 3 мг кальциевой соли пантотеновой кислоты, 3 мг никотинамида и 5% CaCO3; из расчета на 1 л) проводили культивирование со встряхиванием при 30°С и 200 об./мин в течение 98 часов. В среды для культивирования всех штаммов добавляли 1 мМ аргинин. Измеряли концентрацию путресцина, образованного в каждой культуральной жидкости, и результаты показаны в Таблице 2.

Как показано в Таблице 2, продуцирование путресцина усиливалось у 4-х типов мутантов Corynebacterium glutamicum с делецией NCgl2523.

Пример 2. Оценка концентрации внутриклеточного путресцина для штаммов с делецией NCgl2523

Чтобы исследовать изменения концентрации внутриклеточного путресцина для мутантов Corynebacterium glutaminicum с устраненной активностью NCgl2523, измеряли концентрации внутриклеточного путресцина для мутанта Corynebacterium glutaminicum КССМ11240Р ΔNCgl2523 и родительского штамма КССМ11240Р, используя экстракцию с применением органического растворителя. Анализ внутриклеточных метаболитов проводили в соответствии с методом, описанным в литературе (Nakamura J. et al., Appl. Environ. Microbiol., 73(14): 4491-4498, 2007).

Сначала, после инокулирования каждым штаммом из мутанта Corynebacterium glutaminicum КССМ11240Р ΔNCgl2523 и родительского штамма КССМ11240Р, 25 мл жидкой среды СМ, содержащей 1 мМ аргинин (1% глюкозы, 1% полипептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,25% NaCl, 0,2% мочевины и 100 мкл 50%-ного раствора NaOH, при рН 6,8; из расчета на 1 л), проводили культивирование со встряхиванием при 30°С и 200 об./мин. Когда в процессе культивирования клеточный рост достигал экспоненциальной фазы, клетки выделяли из культуральных сред посредством быстрой вакуумной фильтрации (Durapore HV; 0,45 мкм; Millipore, Billerica, MA). Фильтр с адсорбированными на нем клетками промывали дважды 10 мл охлажденной воды и экстрагировали в метанол-содержащей 5 М морфолин-этансульфоновой кислоте и 5 М метионинсульфоне в течение 10 минут. Жидкость, полученную посредством экстрагирования, хорошо перемешивали с равным объемом хлороформа и 0,4-кратным объемом воды. Для удаления белковых примесей на спин-колонку наносили только водную фазу. Отфильтрованную жидкость после экстрагирования анализировали с использованием капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией, и результаты показаны в Таблице 3.

Как показано в Таблице 3, концентрация внутриклеточного путресцина значительно уменьшалась для мутантов Corynebacterium glutaminicum с устраненной активностью NCgl2523 по сравнению с активным родительским штаммом КССМ11240Р.

Можно предположить, что, когда NCgl2523 делетирован у мутанта Corynebacterium glutaminicum КССМ11240Р, ингибирование экспрессии NCgl2522 прекращается, а активность NCgl2522 повышается, в результате чего повышается путресцин-экспортирующая способность, и соответственно экспорт путресцина, продуцируемого внутри клетки, во внеклеточное пространство протекает эффективно.

Пример 3. Поиск ортологов гена NCgl2523 и анализ геномного контекста

Проводили поиск ортологов для NCgl2523, происходящего из Corynebacterium glutaminicum АТСС13032, используя базу данных из KEGG (Энциклопедия генов и геномов Киото), MetaCyc и программу BlastP от Национального центра биотехнологической информации (NCBI). С использованием анализа кластеров генов изучали комбинированную структуру на основе NCgl2523 с NCgl2522 и NCgl2524, которые входят в состав оперона в геноме каждого из микроорганизмов.

Ген белка NCgl2522, который относится к пермеазе из суперсемейства основных переносчиков, принадлежащей семейству DHA2, обозначают как cgmA, а ген белка NCgl2523, который представляет собой регулятор транскрипции из TetR-семейства, обозначают как cgmR. Функция NCgl2524 пока еще не описана, тем не менее он представляет собой пермеазу из суперсемейства основных переносчиков, принадлежащую семейству UMF1 (неизвестный основной переносчик 1).

Согласно результатам анализа, в то время, как NCgl2522 и NCgl2523 главным образом входят в состав одного и того же оперона, NCgl2524, в зависимости от микроорганизмов, может присутствовать в этих же оперонах (тип 1), присутствовать в другом положении в геноме (тип 2) или не присутствовать в геноме (тип 3).

В связи с этим, каждый из анализируемых микроорганизмов классифицировали на 3 типа в соответствии с комбинированной структурой соседних с NCgl2523 генов. В частности, микроорганизмы, которые, как ожидается, имеют NCgl2523, классифицировали как имеющие: комбинированную структуру NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524 (тип 1); структуру, составленную из NCgl2522-NCgl2523 и расположенного отдельно NCgl2524 (тип 2); или комбинированную структуру NCgl2522-NCgl2523 (тип 3). (Фиг. 1). Результаты классификации показаны в Таблице 4.

Исходя из этих результатов ожидается, что путресцин-продуцирующую способность можно повысить, как в настоящем изобретении, посредством инактивации генов, кодирующих NCgl2523 и аминокислотную последовательность, схожую с ним, у микроорганизмов, у которых имеется аминокислотная последовательность, включая последовательность, схожую с NCgl2523, и входящих в состав оперона, при этом ожидается, что белок представляет собой экспортер путресцина, такой как NCgl2522, как в данной классификации.

На основании приведенного выше описания обычному специалисту в данной области техники следует понимать, что в осуществлении настоящего изобретения могут быть использованы и другие конкретные воплощения без отклонения от технической идеи или существенных признаков настоящего изобретения. В связи с этим, описанные выше примеры приведены только в целях иллюстрации, и не подразумевается, что данное изобретение ограничено этими примерами. Следует понимать, что объем настоящего изобретения включает в себя все модификации или модифицированную форму, проистекающие из смысла и объема следующей далее формулы изобретения или ее эквивалентных понятий, а не приведенного выше подробного описания.

Классификация объекта депонирования

Орган по депонированию: Корейский центр культур микроорганизмов.

№ доступа: КССМ11520Р.

Дата депонирования: 2014.02.25.

1. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной путресцин-продуцирующей способностью, где активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, в указанном микроорганизме рода Corynebacterium, способном продуцировать путресцин, инактивирована.

2. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, по п. 1, в который дополнительно введена активность орнитиндекарбоксилазы (ODC).

3. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, по п. 2, где ODC имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.

4. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, по п. 1, в котором дополнительно инактивирована ацетилтрансферазная активность.

5. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, по п. 4, где ацетилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15 или 16.

6. Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий путресцин-продуцирующей способностью, по п. 1, представляющий собой Corynebacterium glutamicum.

7. Способ получения путресцина, включающий: культивирование микроорганизма по п. 1 и

выделение путресцина из подвергнутого культивированию микроорганизма или культуральной среды, полученных на указанной выше стадии.

8. Способ получения путресцина по п. 7, где микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к генетической конструкции для обеспечения экспрессии целевых гомологичного и гетерологичного генов в клетках реципиентного гриба Penicillium verruculosum.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных белков человека, и может быть использовано для получения и очистки рекомбинантного белка GAGE1 человека.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения способности микобактерий туберкулеза к размножению в альвеолярных макрофагах пациентов после противотуберкулезной терапии.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ ферментативного получения серусодержащих аминокислот, включающий стадии, на которых: а) получают микроорганизм семейства Enterobacteriaceae или микроорганизм семейства Corynebacteriaceae, в котором происходит сверхэкспрессия гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы; б) ферментируют микроорганизм, полученный на стадии а), в среде, которая содержит неорганический источник серы, выбранный из группы, включающей соль тиосерной кислоты или смесь соли тиосерной кислоты и соли серной кислоты, получая ферментационный бульон, и в) концентрируют серусодержащую аминокислоту в ферментационном бульоне, полученном на стадии б).

Предложены коринеформный микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием указанного микроорганизма. Указанный коринеформный микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum, в котором инактивирован белок-инициатор формирования перегородки, где указанный белок-инициатор формирования перегородки представляет собой филаментный чувствительный к температуре белок В (FtsB).

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Предложен штамм гриба Eremothecium gossypii ВКПМ F-1321, являющийся продуцентом эфирного масла, аналогичного розовому маслу крымского происхождения.

Группа изобретений относится к вариантам штамма молочнокислых бактерий и их применению. Предложен штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25972, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25987, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus 25988, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25989 и штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25973.

Группа изобретений относится к биотехнологии и касается получения рекомбинантной барназы. Предложена рекомбинантная плазмида pET-STII-Ba, обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli барназы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID №3.

Группа изобретений относится к вариантам штамма Streptococcus и их применению. Предложены штамм Streptococcus CECT 7746, штамм Streptococcus CECT 7747, штамм Streptococcus CECT 7773, штамм Streptococcus CECT 7775, полезные как агенты против ротовых патогенных Streptococci.

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к производству заменителей сыра. Композиция для производства копии сыра содержит искусственное молоко, в котором, по крайней мере, 85% его нерастворимых твердых частиц было удалено, и сшивающего фермента.

Изобретение относится к способу очистки 1,5-диаминопентана. Предлагаемый способ включает концентрирование ферментативного бульона, содержащего карбонат 1,5-диаминопентана, добавление кислоты в концентрат ферментативного бульона с получением не содержащей карбоната кислой композиции, имеющей значение рН от 4,0 до менее 7,0, добавление основания в кислую композицию с получением основной композиции, имеющей значение рН от более 12,0 до 14, и выделение 1,5-диаминопентана из основной композиции.

Изобретение относится к улучшенному способу очистки 1,4-диаминобутана (путресцина), получаемого ферментационным путем. 1,4-Диаминобутан может быть использован для получения полиамидов.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной способностью продуцировать путресцин, где активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, в микроорганизме рода Corynebacterium, способном продуцировать путресцин, ослаблена или устранена по сравнению с его эндогенной активностью.

Группа изобретений относится к рекомбинантному микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему способностью продуцировать путресцин, и способу получения путресцина. В указанном рекомбинантном микроорганизме гидролазная активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, удалена.

Изобретение относится к способу получения 1,4-диаминобутана (ДАБ). Способ предусматривает по меньшей мере одну биокаталитическую стадию, содержащую биокаталитическое получение N-ацетилДАБ, с последующим превращением in vitro N-защищенного предшественника в ДАБ.

Предложены штамм Lactobacillus plantarum ВКПМ В-12076 и штамм Lactobacillus brevis ВКПМ В-12077, способные к синтезу гамма-аминомасляной кислоты и обладающие пробиотическими свойствами. Штаммы выделены из желудочно-кишечного тракта человека и депонированы в ВКПМ.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы выделения и очистки 1,4-диаминобутана из ферментационного раствора.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в электрохимии для получения антикоррозионных защитных покрытий меди. Предложен способ получения ингибитора коррозии меди, а именно олигомеров анилина.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ приготовления модифицированного природного каучука.

Предложены коринеформный микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием указанного микроорганизма. Указанный коринеформный микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum, в котором инактивирован белок-инициатор формирования перегородки, где указанный белок-инициатор формирования перегородки представляет собой филаментный чувствительный к температуре белок В (FtsB).

Группа изобретений относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему повышенной путресцин-продуцирующей способностью, и способу получения путресцина с его использованием. В указанному микроорганизме активность белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, инактивирована. Предложен также способ получения путресцина с использованием указанного микроорганизма, включающий культивирование микроорганизма и выделение путресцина из подвергнутого культивированию микроорганизма или культуральной среды, полученных на указанной выше стадии. Группа изобретений обеспечивает получение путресцина с высоким выходом. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 3 пр.

Наверх