Способ микроскопической оценки цитотоксичности компонентов материалов скаффолдов

Изобретение относится к медицине, биологии, биотехнологии, фармакологии и может быть использовано для оценки цитотоксичности компонентов, входящих в состав скаффолдов, используемых в тканевой инженерии, а именно при пластике или замещении дефектов тканей организма с обеспечением стимуляции их регенерации. Для этого из крови выделяют эритроциты, промывают их и инкубируют с компонентами материалов скаффолдов при 37оС в течение 30 мин. Затем эритроциты смешивают с аутологичной плазмой крови, помещают каплю на предметное стекло и проводят микрофотосъемку с объективом 100х. Цитотоксичность компонентов скаффолдов оценивают по изменению морфологии эритроцитов и их агрегатов в аутологичной плазме крови. Изобретение позволяет оценивать цитотоксичность компонентов скаффолдов быстрым и доступным способом с высокой чувствительностью. 4 ил., 2 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биологии, биотехнологии, фармакологии и может быть использовано для микроскопической оценки цитотоксичности компонентов, входящих в состав скаффолдов, используемых в тканевой инженерии, а именно при пластике или замещении дефектов тканей организма с обеспечением стимуляции их регенерации.

В настоящее время в связи с увеличивающимся объемом разработок новых материалов и скаффолдов из них важное значение приобретает разработка методов оценки цитотоксичности компонентов скаффолдов, на заселение клетками которых влияет множество факторов, в частности цитотоксичность материалов скаффолда.

Известен способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов, включающий биосенсор на основе кислородного электрода, иммобилизацию целых клеток бактерий E.coliK-12 на поверхность кислородного электрода. После иммобилизации измеряют дыхательную активность микроорганизмов в присутствии пробы и стандартных образцов положительного и отрицательного контроля. Далее рассчитывают индекс токсичности (см. Пономарева О.Н. и др. Способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов. Патент 2518306 РФ, 2012).

Метод достаточно сложен, трудоемок, длителен и требует специального оборудования.

В настоящее время доказано, что эритроцит можно рассматривать как универсальную модель для изучения изменений цитоплазматических мембран и метаболизма клеток.

В качестве прототипа выбран способ определения цитотоксичности малорастворимых производственных пылей, включающий инкубацию эритроцитов человека с равными дозами различных пылей, регистрацию измерения в эталонном водном растворе окислительно-восстановительного потенциала (ОВП), где в качестве показателя цитотоксичности при действии определенной дозы на эритроциты является выраженное в процентах повышение среднего за период инкубации уровня ОВП в активированной эталонной воде при воздействии контрольной эритроцитарной суспензии без пыли (см. Петров С.Б., Петров Б.А. Способ определения цитотоксичности малорастворимых производственных пылей. Патент 2480751 РФ, 2013).

Однако этот способ является сложным, трудоемким и требует длительного времени.

Задача предлагаемого изобретения - усовершенствование способа.

Технический результат - упрощение и сокращение времени процесса определения цитотоксичности компонентов материалов скаффолдов.

Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем выделение эритроцитов из крови, их промывание и инкубирование с компонентами материалов скаффолдов, эритроциты смешивают с аутологичной плазмой крови, помещают на предметное стекло, опускают в каплю смеси объектив 100х, проводят микрофотосъемку. Оценивают цитотоксичность компонентов материалов скаффолдов по изменению морфологии эритроцитов и их агрегатов в аутологичной плазме крови.

Способ микроскопической оценки цитотоксичности компонентов материалов скаффолдов осуществляют следующим образом. Кровь от здоровых добровольцев забирают в вакуумные пробирки, содержащие 3.8% цитрат натрия (9:1). Пробирки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Бестромбоцитарную плазму и клетки белой крови убирают, а эритроциты трижды промывают физиологическим раствором. К 1 мл забуференного физиологического раствора (10 мМ трис-HCI; 150 мМ NaCI) с pH, доведенной до 7,4, добавляют 50 мкл промытых эритроцитов и 0.1 мл исследуемого материала. Инкубируют при 37°C в течение 30 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант убирают, после чего бестромбоцитарную плазму смешивают с эритроцитами в соотношении 2:1, каплю смеси помещают на предметное стекло, опускают в нее объектив (100х) светового микроскопа и после достижения фокуса (×1000) проводят микрофотосъемку. После этого изучают морфологию клеток и их агрегатов.

Одним из наиболее часто используемых материалов, входящих в скаффолды, является коллаген, составляющий основу соединительной ткани организма и обеспечивающий ее прочность и эластичность. Коллаген имеет несколько преимуществ, которые позволяют использовать данный материал для получения скаффолдов в тканевой инженерии: биосовместимость, волокнистая структура, хорошая сочетаемость с другими материалами, биодеградируемость. Кроме того, коллаген обладает свойствами, обуславливающими высокую клеточную адгезию скаффолда.

Используя разные виды коллагена, проводилась проверка эффективности предполагаемого способа оценки цитотоксичности.

Способ микроскопической оценки цитотоксичности компонентов материалов скаффолдов поясняется следующими чертежами.

Фиг. 1 - Морфология эритроцитов и их агрегация при исследовании на цитотоксичность коллагена №1.

Фиг. 2 - Морфология эритроцитов и их агрегация при исследовании на цитотоксичность коллагена №2.

Фиг. 3 - ДФЧ в скаффолде с коллагеном №1, (6 сутки инкубации; ×100).

Фиг.4 - ДФЧ в скаффолде с коллагеном №2, (6 сутки инкубации; ×100).

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Промытые эритроциты здоровых людей инкубировали с образцом коллагена №1 в течение 30 мин при 37°C. Далее суспензию эритроцитов центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант убирали, плазму крови смешивали с эритроцитами в соотношении 2:1, каплю смеси помещали на предметное стекло, опускали в нее объектив 100х и проводили микрофотосъемку. На фиг.1 видно, что коллаген №1 обладает токсическим действием на эритроциты. Об этом свидетельствует появление большого количества патологических форм эритроцитов (эхиноцитов). При этом наблюдается нарушение образования монетных столбиков в аутологичной плазме крови.

Пример 2. Промытые эритроциты здоровых людей инкубировали с образцом коллагена №2 в течение 30 мин при 37°C. Далее суспензию эритроцитов центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант убирали, плазму крови смешивали с эритроцитами в соотношении 2:1, каплю смеси помещали на предметное стекло, опускали в нее объектив 100х и проводили микрофотосъемку. На фиг. 2 видно, что коллаген №2 не оказывает токсического действия на эритроциты. Об этом свидетельствует незначительное количество измененных эритроцитов. При этом сохраняется образование монетных столбиков в аутологичной плазме крови.

Для дополнительной проверки точности и чувствительности предложенного способа проводилось исследование заселения скаффолдов, в состав которых входили различные виды коллагена и дермальные фибробласты. Для этого уксуснокислый коллаген с pH, доведенной до 7,4, смешивали с плазмой крови. В полученный композитный раствор вводили суспензию фибробластов в культуральной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в объеме 0,5 мл. Количество клеток в суспензии составляло от 400 до 600 тыс. Композитный раствор, содержащий суспензию клеток, в объеме 2,5 мл заливали в форму для скаффолда. После завершения манипуляций к композитному раствору, содержащему суспензию клеток, немедленно добавляли тромбин-кальциевую смесь. Выдерживали полученный скаффолд в форме в течение 20 мин (для более полной полимеризации фибрина), затем перемещали его в пластиковую чашку Петри и заливали 5 мл культуральной среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Помещали чашку Петри с полученным скаффолдом в клеточный инкубатор с 5% содержанием CO2 и температурой 37°C. В течение последующих 3 часов происходила полная полимеризация содержащегося в скаффолде коллагена. Наблюдали формирование развития клеточной сети с 3D-структурой. В этих условиях установлено, что при использовании коллагена №1 заселение клетками скаффолда и развитие клеточной сети происходило значительно хуже (Фиг. 3), чем при использовании коллагена №2 (Фиг. 4).

Способ позволяет вести оценку цитотоксичности материалов различного происхождения по изменению морфологии эритроцитов и их агрегатов в аутологичной плазме. Подтверждается высокая чувствительность предлагаемого способа, его доступность, информативность и быстрота выполнения.

Способ микроскопической оценки цитотоксичности компонентов материалов скаффолдов, включающий выделение эритроцитов из крови, их промывание и инкубирование, отличающийся тем, что промытые эритроциты инкубируют с компонентами материалов скаффолдов в течение 30 мин при 37°С, центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, супернатант удаляют, бестромбоцитарную плазму крови смешивают с эритроцитами в соотношении 2:1, помещают на предметное стекло, опускают в каплю смеси объектив 100х, проводят микрофотосъемку, оценивают цитотоксичность компонентов материалов скаффолдов по изменению морфологии эритроцитов и их агрегатов в аутологичной плазме крови.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к пищевой промышленности и может быть использована для определения сроков хранения плодов и ягод, способов их транспортирования и хранения.

Представленные изобретения касаются способа детектирования наличия аналита в жидком образце, способа детектирования наличия патогена в образце цельной крови, способа детектирования наличия вируса в образце цельной крови, способа детектирования присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце цельной крови, способа детектирования наличия организмов, относящихся к видам Candida в жидком образце, системы для детектирования одного или более аналитов нуклеиновой кислоты в жидком образце и сменного картриджа для размещения реагентов для анализа и расходных материалов в указанной системе.

Изобретение относится к области термических методов анализа полимеров и может быть использовано для анализа электропроводности полимеров от условий его нагрева. Заявлен способ термического анализа полимеров, включающий нагрев исходного образца полимера в инертной среде, определение и анализ его свойства за счет структурных изменений в полимере.

Изобретение относится к измерительному устройству и к способу отбора образцов. Способ содержит следующие этапы: а) добавление образца в камеру, в которой обеспечены магнитные частицы, при этом образец содержит целевой компонент, и камера имеет поверхность обнаружения; b) приложение силы магнитного поля к магнитным частицам, чтобы притянуть магнитные частицы к поверхности обнаружения.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно гематологии. Способ определения пригодности слизи кожи рыб для осуществления гемостаза путем активации агрегации тромбоцитов и свертывания крови IN VITRO включает внесение слизи в плазму крови овец, обогащенную тромбоцитами (ОТП), в нативную кровь и определение времени образования сгустка визуально и путем фотометрии на фотоэлектроколориметре (ФЭК) в опытной и контрольной пробах.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественной оценки степени окислительного стресса в клетках. Для этого на первом этапе проводят инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НСl, связывающегося с карбонильными группами белков.

Изобретение относится к чайной промышленности и направлено на разработку новых ускоренных методов оценки качества сырья и готовой продукции. Способ определения общего содержания золы в чае заключается в том, что измельченную пробу чая массой 1,0-1,5 г помещают в фарфоровый тигель объемом 10 см3, добавляют к пробе 2 см3 спиртового раствора ацетата магния, приготовленного путем растворения 1,61 г (CH3COO)2Mg⋅2Н2О в 100 мл 96%-ного водного раствора этанола, спустя 1-2 минуты находящийся в тигле раствор поджигают и после его прогорания тигель с обуглившейся пробой помещают в муфельную печь, в которой проводят прокаливание пробы при температуре 525±25°С в течение 1,5 ч до образования золы, затем тигель с золой охлаждают и взвешивают, общее содержание золы в измельченной пробе чая, выраженное в процентах по массе в перерасчете на сухое вещество пробы, вычисляют по формуле.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, к лабораторным способам исследования в физиологии и гематологии. Способ определения М-холинореактивности эритроцитов крови включает забор крови (0,2 мл) у человека или животного, подготовку раствора атропина с концентрацией 0,4 мг/мл, инкубацию образца крови в гипоосмотической среде в отсутствии (контрольная проба) и присутствии атропина в конечной концентрации 15×10-6 мг/мл (опытная проба), определение оптической плотности надосадочной жидкости проб, расчет значения M-холинореактивности эритроцитов как процента, на который гемолиз в опытных пробах ниже, чем в контрольных.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*4 (1846G>A) rs3892097.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*9 (2615-2617delAAG) rs5030656.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для выбора антимикробного препарата (антибиотика) или комбинации антибиотиков, наиболее эффективных при лечении гнойных осложнений синдрома диабетической стопы микробной этиологии.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для выбора антимикробного препарата (антибиотика) или комбинации антибиотиков, наиболее эффективных при лечении гнойных осложнений синдрома диабетической стопы микробной этиологии.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно гематологии. Способ определения пригодности слизи кожи рыб для осуществления гемостаза путем активации агрегации тромбоцитов и свертывания крови IN VITRO включает внесение слизи в плазму крови овец, обогащенную тромбоцитами (ОТП), в нативную кровь и определение времени образования сгустка визуально и путем фотометрии на фотоэлектроколориметре (ФЭК) в опытной и контрольной пробах.

Изобретение относится к области клинических диагностических приспособлений. Система кассеты для тестирования содержит кожух кассеты, включающий по меньшей мере одно впускное отверстие для образца, множество камер для хранения, множество камер для реакций и сеть для текучей среды, соединяющую по меньшей мере одно впускное отверстие для образца, по меньшей мере часть множества камер для хранения и по меньшей мере часть множества камер для реакций с первым множеством проходов, расположенных на внутренней поверхности кожуха кассеты.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественной оценки степени окислительного стресса в клетках. Для этого на первом этапе проводят инкубацию 0,25 мл лизированных 1% раствором тритона Х-100 клеток с 0,5 мл 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НСl, связывающегося с карбонильными группами белков.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ранней диагностики острого инфекционного эндокардита (ИЭ). Проводят забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию и генотипирование полиморфного локуса -455G-A гена FGB у лиц группы риска.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для прогнозирования результата дентальной имплантации. Для этого у пациента исследуют костную крошку, полученную в ходе подготовки костного ложа, путем определения в ней содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов, и при их значении более 0,01 прогнозируют неблагоприятный результат дентальной имплантации.
Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии и клинической лабораторной диагностике, и предназначено для прогноза возможности развития воспалительных осложнений дентальной имплантации.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, онкологии и лучевой терапии, и предназначено для прогнозирования эффективности применения лучевой терапии у больных злокачественными опухолями.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и предназначено для использования в качестве экспресс-теста для выявления риска злокачественной опухоли.

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, и может быть использовано для определения начала лечения программным гемодиализом пациентов с хронической болезнью почек С5 (ХБП С5). При скорости клубочковой фильтрации менее 15 мл/мин/1,73 м2 дополнительно определяют концентрацию в сыворотке крови кальция, неорганического фосфата, гемоглобина и десятичный логарифм значения C-реактивного белка, индекс коморбидности Чарльсон, наличие сахарного диабета, учитывают возраст пациента. Затем каждый показатель оценивают в баллах. При сумме баллов, равной 8 и более, начинают лечение программным гемодиализом. Способ позволяет определить начало лечения программным гемодиализом пациентов с ХБП С5 за счет оценки комплекса наиболее значимых показателей. 1 ил., 4 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, биологии, биотехнологии, фармакологии и может быть использовано для оценки цитотоксичности компонентов, входящих в состав скаффолдов, используемых в тканевой инженерии, а именно при пластике или замещении дефектов тканей организма с обеспечением стимуляции их регенерации. Для этого из крови выделяют эритроциты, промывают их и инкубируют с компонентами материалов скаффолдов при 37оС в течение 30 мин. Затем эритроциты смешивают с аутологичной плазмой крови, помещают каплю на предметное стекло и проводят микрофотосъемку с объективом 100х. Цитотоксичность компонентов скаффолдов оценивают по изменению морфологии эритроцитов и их агрегатов в аутологичной плазме крови. Изобретение позволяет оценивать цитотоксичность компонентов скаффолдов быстрым и доступным способом с высокой чувствительностью. 4 ил., 2 пр.

Наверх