Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки



Владельцы патента RU 2654228:

Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты. Изобретение обеспечивает увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови. 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления регенерации костного мозга лабораторных животных (мыши).

Известно использование сочетанной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для восстановления селезенки после лучевой нагрузки (Патент RU №2551937, МПК G09B 23/28, А61К 35/44, А61Р 43/00, опубл. 10.06.2015). В данном способе лабораторным мышам через час после облучения проводят внутривенную аллогенную трансплантацию ММСК в дозе 6,5 млн клеток/кг и ГСК в дозе 400 тыс. клеток/кг, полученных из плаценты самок-мышей при сроке гестации 14 дней.

Этот способ предназначен только для восстановления основных морфометрических показателей селезенки.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ активации кроветворения введением РНК в дозе 30 мкг/100 г массы животного (крысы) в условиях воздействия ионизирующего облучения в дозе 6 Гр (Геворкян Н.М. Влияние предварительного введения суммарной РНК клеток костного мозга на динамику восстановления эритропоэза у крыс после острого гамма-облучения / Н.М. Геворкян, Н.В. Тишевская, А.А. Болотов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. - Т. 161, №5. - С. 670-673.) - прототип.

Данный способ используют для восстановления эритропоэза у крыс, однако количество ретикулоцитов в периферической крови недостаточно высокое.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к активации эритропоэза.

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в увеличении количества ретикулоцитов в периферической крови.

Технический результат достигается путем сочетанной внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты.

Сущность изобретения состоит в эффективном взаимодействии заявляемого количественного состава ММСК и ГСК, выделенных из хориона плаценты, и эффективном влиянии их на восстановление гемопоэза.

Эффективность применения ММСК в качестве котрансплантата при введении ГСК обусловлена тем, что они вырабатывают цитокины и факторы роста, необходимые для хоуминга и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (Kavanagh D.J. et al., 2011, Kavanagh, D.J. Hematopoietic stem cell homing to injured tissues / D.J. Kavanagh, N. Kali // Stem Cell Revolution. - 2011. - Vol. 7. - P. 672-682.

ММСК синтезируют компоненты матрикса, в том числе фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны. При этом ММСК способны дифференцироваться в клетки стромы, которая обеспечивает синтез экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микроокружение, необходимое для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток (Chow A. et al., 2011; Jones Е. et al., 2011, Chow, A. Bone marrow CD169 macrophages promote the retention of hematopoietic stem and progenitor cells in the mesenchymal stem cell niche / A. Chow, D. Lucas, A. Hidalgo, S. Mendez-Ferrer, D. Hashimoto, C. Scheiermann // Journal of Experimental Medicine. - 2011. - Vol. 208. - P. 261-271; Jones, E. Mesenchymal stem cells and bone regeneration: current status / E. Jones, X. Yang // Injury. - 2011. - Vol. 42. - P. 562-568).

Кроме того, ММСК обладают свойством продуцировать противовоспалительные цитокины, а также обеспечивать стимуляцию ангиогенеза (Kavanagh Н. et al., 2011; Kidd S. et al., 2010).

Способность ММСК оказывать иммуносупрессивное действие может обеспечить приживление аллогенного трансплантата (Aldinucci A. et al., 2010; Gebler A. et al., 2012; Han Z. et al., 2012, Aldinucci, A. Inhibition of immune synapse by altered dendritic cell actin distribution: a new pathway of mesenchymal stem cell immune regulation / A. Aldinucci, L. Rizzetto, L. Pieri // Journal of Immunology. - 2010. - Vol. - 185, №9. - P. 5102-5110).

Выделение ММСК хемоаттрактантов для ГСК обеспечивает направленный хоуминг ГСК, а формирование соответствующего микроокружения дополнительно улучшает приживление трансплантированных аллогенных ГСК (Zhang Y. et al., 2004, Jorgensen С. et al., 2010).

Из анализа научно-технической и патентной литературы эффективного влияния на активацию эритропоэза заявляемой совокупности признаков нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных мышах-самцах в возрасте 6-8 месяцев с массой 20-22 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.

Лабораторные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Лабораторным животным опытной группы внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 5,9 млн. клеток/кг и 295 тыс. клеток/кг, суспендированных в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольной подгруппы вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно. Забой лабораторных животных осуществлялся на 7 сутки трансплантации клеток.

Клеточные культуры

Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США, Kidder В. L.HDAC1 regulates pluripotency and lineage specific transcriptional networks in embryonic and trophoblast stem cells / B.L. Kidder, S. Palmer // Nucleic Acids Res. - 2011. - P. 1-15) обработки ткани плаценты.

Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (Uchida, N. ABC transporter activities of murine hematopoietic stem cells vary according to their developmental and activation status / N. Uchida, B. Dykstra, K. Lyons, F. Leung, M. Kristiansen, C. Eaves // Blood. - 2004. - Vol. 103, №12. - P. 4487-4495).

Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD117, Sca-1 и отрицательных по Lin-(CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119).

В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).

Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.

Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-), был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).

Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из хориона плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×106 клеток на 1 см2. Культивирование ММСК проводилось в условиях СО2 - инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.

При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.

Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagen type I и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).

Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCell Technologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски von Kossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil Red О (J.J. Minguell et al., 2004, Minguell, J.J. Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease / J.J. Minguell, A. Erices // Experimental Biology and Medicine. - 2006. - Vol. 231, №1. - P. 39-49

Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.

Морфологическое исследование крови

Кровь для исследования брали у мышей из хвостовой вены. Подсчет количества эритроцитов проводили в счетной камере Горяева (Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.).

При определении числа ретикулоцитов их подсчитывали в окрашенных бриллиант - крезил - блау мазках крови на 2000 эритроцитов. (Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.).

Препараты были исследованы с помощью микроскопа Micros МС-50 (Австрия), фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой cam V400.

Статистический анализ

Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено по критерию Манна-Уитни (U). Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17.0). Вероятность различий считалась достоверной при значениях р<0,05.

Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу содержание ретикулоцитов в периферической крови существенно выше, чем в прототипе. Таким образом выявлено, что трансплантация плацентарных ММСК и ГСК по заявляемому способу обеспечивает активацию эритропоэза в существенно большей степени, чем способ по прототипу.

Способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 5,9 млн клеток/кг и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в количестве 295 тыс. клеток/кг, выделенных из хориона плаценты.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генетически-модифицированным TCR-дефицитным Т-клеткам, и может быть использовано в медицине для лечения рака.

Изобретение относится к области биохимии. Изобретение представляет собой способ культивирования выделенных клеток, полученных из ткани пуповины человека, в культуральной среде, содержащей аминокислоты, витамины, соли, нуклеозиды, инсулин, трансферрин, этаноламин и натрия селенит, где культуральная среда обогащена сывороткой.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам скрининга чувствительности клеток лейкоза ex vivo к действию различных веществ, в частности препаратов и перспективных лекарственных субстанций, а также их сочетаний, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к соединению для применения в лечении комплемент-опосредованного расстройства. Также раскрыта композиция, содержащая указанное соединение, для лечения комплемент-опосредованного расстройства.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к созданию биорезорбируемого клеточного скаффолда на основе фибрина плазмы крови. Способ включает смешивание плазмы крови или криопреципитата плазмы крови с раствором коллагена I типа, имеющим рН 7,4, введение суспензии животных клеток и добавление тромбин-кальциевой смеси в соотношении 3,94:2,86:1:1,09 соответсвенно.

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к получению биодеградируемых скаффолдов на основе тканей из натурального шелка. Способ включает обработку ткани из натурального шелка водно-спиртовым раствором хлорида кальция при молярном соотношении хлорида кальция, этилового спирта и воды 1:2:8 соответственно, при 20-80°С в течение 10-120 минут, нанесение на ткань из натурального шелка по меньшей мере одного вещества, способного к адгезии и пролиферации клеток млекопитающего.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения способности микобактерий туберкулеза к размножению в альвеолярных макрофагах пациентов после противотуберкулезной терапии.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине, в частности к применению подкожного ксенографта клеточной линии беспигментной меланомы кожи человека mel Rac с мутацией гена NRAS и с адаптацией к росту со стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c nude для доклинического изучения таргетных противоопухолевых средств.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ изоляции микровезикул из крови, включающий разделение крови на плазму и клеточную фракции центрифугированием при 300 g.

Изобретение относится к области клеточной биологии, конкретно к получению клеток, экспрессирующих инсулин и индукции экспрессии инсулина в клетках панкреатической энтодермы.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к комбинированному применению ловушек gdf и активаторов рецепторов эритропоэтина, и может быть использовано в медицине для лечения анемии или гемоглобинопатии у пациента.

Изобретение относится к соединению формулы (I') (где W представляет формулу -CR11R12CR13R14-; R11 представляет атом водорода, атом фтора, С1-4 алкил или фенил; R12 представляет атом водорода, атом фтора или С1-4 алкил; при условии, что R11 и R12, вместе со смежным углеродным атомом, необязательно образуют С3-8 циклоалкан или тетрагидропиран; R13 представляет атом водорода, карбамоил, С1-4 алкил (С1-4 алкил необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из гидрокси, C1-3 алкокси и ди-С1-3 алкиламино), галоген-С1-4 алкил, фенил, пиридил, бензил или фенэтил; R14 представляет атом водорода, C1-4 алкил или галоген-С1-4 алкил; Y представляет одинарную связь или C1-6 алкандиил (C1-6 алкандиил необязательно замещен одной гидроксигруппой, и один из углеродных атомов в C1-6 алкандииле необязательно замещен циклоалкпропан-1,1-диилом); R2 представляет атом водорода, C1-6 алкил, С3-8 циклоалкил {С3-8 циклоалкил необязательно замещен одной или двумя группами, которые являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из C1-6 алкила (C1-6 алкил необязательно замещен одной группой фенила), фенила (фенил необязательно замещен одним атомом галогена), C1-6 алкокси [C1-6 алкокси необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из С3-8 циклоалкила, фенила (фенил необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из атома галогена и C1-6 алкила) и пиридила (пиридил необязательно замещен одним атомом галогена)], С3-8 циклоалкокси, фенокси (фенокси необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из атома галогена, C1-6 алкила, С3-8 циклоалкила и галоген-C1-6 алкила) и пиридилокси (пиридилокси необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из атома галогена, C1-6 алкила, С3-8 циклоалкила и галоген-С1-6 алкила)}, фенил (фенил необязательно замещен одной-тремя группами, которые являются одинаковыми или различными и которые выбирают из группы α3 заместителей), нафтил, инданил, тетрагидронафтил, пиразолил [пиразолил необязательно замещен одной или двумя группами, которые являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из C1-6 алкила и фенила (фенил необязательно замещен одним C1-6 алкилом)], имидазолил [имидазолил необязательно замещен одной или двумя группами, которые являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из C1-6 алкила и фенила], изоксазолил [изоксазолил необязательно замещен одной группой фенила (фенил необязательно замещен одним атомом галогена)], оксазолил [оксазолил необязательно замещен одной или двумя группами, которые являются одинаковыми или различными и которые выбраны из группы, состоящей из C1-6 алкила и фенила], тиазолил [тиазолил необязательно замещен одной или двумя группами, которые являются одинаковыми или различными и которые выбирают из группы, состоящей из C1-6 алкила, фенила и морфолино], пиридил (пиридил необязательно замещен одной или двумя группами, которые являются одинаковыми или различными и которые выбирают из группы α5 заместителей), пиридазинил [пиридазинил необязательно замещен одной группой C1-6 алкокси (C1-6 алкокси необязательно замещен одной группой С3-8 циклоалкила)], пиримидинил [пиримидинил необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из галоген-С1-6 алкила, С3-8 циклоалкила, фенила и фенокси (фенокси необязательно замещен одной группой C1-6 алкила)], пиразинил [пиразинил необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из C1-6 алкокси (C1-6 алкокси необязательно замещен одним С3-8 циклоалкилом), и фенокси (фенокси необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из атома галогена, C1-6 алкила и С3-8 циклоалкила)], бензотиофенил, хинолил, метилендиоксифенил (метилендиоксифенил необязательно замещен одним или двумя атомами фтора), азетидинил (азетидинил необязательно замещен одной группой пиримидинила), пиперидинил (пиперидинил необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из пиримидинила, фенил-С1-3 алкила, С3-8циклоалкил-C1-3алкилкарбонила и фенил-С1-3алкоксикарбонила) или следующую формулу (I'') -CONR5CH2-R6 (I'') [где в формуле (I'') R5 представляет атом водорода или C1-3 алкил и R6 представляет фенил (фенил необязательно замещен одной группой, выбранной из группы, состоящей из атома галогена, галоген-С1-6 алкила и фенила)], Y4 представляет С1-4 алкандиил; R3 представляет атом водорода или метил; R4 представляет -СООН или -CONHOH), обладающему превосходящим ингибирующим PHD2 эффектом.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к комплексному соединению трехвалентного железа или его фармацевтически приемлемой соли, содержащему, по меньшей мере, один лиганд формулы (I): медикаментам и композиции, содержащим комплексное соединение трехвалентного железа.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к клинической фармакологии и терапии животных. Способ заключается во ведении комплексного железодекстранового препарата Седимин-Sе+ внутримышечно на 5-6-й день жизни животного в дозе 5 мл, после чего сразу же также внутримышечно вводят препарат Гидропептон в дозе 5 мл.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии и представляет собой фармакологическую композицию, содержащую сульфат железа(II), предназначенную для лечения железодефицитной анемии, отличающуюся тем, что она дополнительно содержит гексацианоферрат железа, гексацианоферрат железа-калия, сульфат калия и микроцеллюлозу, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении, в массовых процентах.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики и реабилитации детей школьного возраста с железодефицитным состоянием.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения и профилактики железодефицитной анемии сельскохозяйственных животных. Лечебно-профилактический хелатный железосодержащий препарат для сельскохозяйственных животных, включает глюконат железа, в III валентности, витамины В12, В3 и воду при следующем соотношении компонентов, мас.

Способ // 2621681
Изобретение относится к новому способу получения соединения три(гидроксипирон) трехвалентного железа, включающему взаимодействие гидроксипирона с некарбоксилатной солью железа в водном растворе и осаждение соединения тригидроксипирон трехвалентного железа из водного раствора, имеющего рН больше 7, в котором гидроксипирон находится в водном растворе, содержащем основание, к которому добавляют некарбоксилатную соль, или в котором гидроксипирон добавляют к воде, воду нагревают, некарбоксилатную соль добавляют к нагретой воде и полученный раствор объединяют с водным щелочным раствором, содержащим гидроксипирон, и в котором гидроксипирон выбирают из мальтола, этилмальтола и их смесей.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для устранения нарушений активности каталазы тромбоцитов у новорожденных телят с дефицитом железа. Для коррекции активности каталазы тромбоцитов новорожденным телятам с дефицитом железа назначается ферроглюкин по 150 мг (2 мл) внутримышечно, двукратно с интервалом 4 суток, крезацин 5 мг/кг в сутки, начиная одновременно с первой инъекцией ферроглюкина, включив его в схему выпаивания на 4 суток, и гамавит внутримышечно один раз в сутки утром 0,05 мл/кг на 4 суток, начиная одновременно с ферроглюкином и крезацином.

Изобретение относится к биологии и ветеринарии и предназначено для устранения нарушений активности каталазы нейтрофилов у новорожденных телят с дефицитом железа.

Изобретение относится к медицине. Предложен способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из плаценты новорожденного (после родов на 38-40 неделе гестации).

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой способ активации эритропоэза лабораторных животных после лучевой нагрузки, отличающийся тем, что лабораторным животным проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в количестве 5,9 млн клетоккг и гемопоэтических стволовых клеток в количестве 295 тыс. клетоккг, выделенных из хориона плаценты. Изобретение обеспечивает увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови. 1 табл.

Наверх