Композиции коктейля, содержащие антибактериальные фаги, и способы их применения

Настоящее изобретение относится к области фаговой терапии и касается композиции и способа ее использования. Представленная композиция содержит: первый и второй очищенные штаммы бактериофага, причем каждый из указанных штаммов имеет геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, демонстрирующие антибактериальную активность против Staphylococcus aureus; третий и четвертый очищенные штаммы бактериофага, имеющие геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно, демонстрирующие антибактериальную активность против Pseudomonas aeruginosa; и пятый очищенный штамм бактериофага, имеющий геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, демонстрирующий антибактериальную активность против Acinetobacter baumannii. При этом каждый из указанных первого, второго, четвертого и пятого штаммов бактериофага присутствует в композиции в количестве приблизительно в 10 раз больше, чем третий штамм бактериофага. Представленный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества указанной композиции. Изобретения могут быть использованы для лечения и контроля бактериальных инфекций, вызванных одной или несколькими из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, в частности, инфекций диабетической стопы. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл.

 

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в формате ASCII через EFS-Web и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 14 марта 2012 г., названа 16395105.txt, и ее размер составляет 574104 байт.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к области фаговой терапии для лечения и контроля бактериальных инфекций, в частности, таких хронических язв, как инфекции диабетической стопы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым коктейлям штаммов бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08, F1245/05, другого фага и/или их вариантов; и способам их применения в лечении и профилактике бактериальных инфекций, включая в себя кожные язвы, связанные с инфекциями диабетической стопы, вызванными, например, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Коктейли используются в качестве фармацевтических композиций либо отдельно, либо в дополнительной комбинации с другими видами терапии, например, антибиотиками, факторами роста или другими стандартными и нестандартными видами терапии для хронических язв.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Инфекции диабетической стопы (DFI) представляют собой частое и серьезное осложнение сахарного диабета (DM) и во всем мире они являются ведущей причиной нетравматической ампутации нижней конечности (Jeffcoate WJ, et al. 2003. Lancet 361:1545-1551). В современной клинической практике лечение DFI включает в себя иссечение нежизнеспособных тканей и применение системных антибиотиков (смотрите, например, Lipsky ΒΑ, et al. 2004. Clin Infect Dis. 39:885-910). Тем не менее вследствие неполноценной васкуляризации и локального микроокружения концентрации антибиотиков являются многократно субтерапевтическими (Lipsky ΒΑ, et al. 2009. Clin Infect Dis. 49:1541-1549). Более того, увеличивающаяся частота встречаемости таких мультирезистентных организмов, как резистентные к метициллину Staphylococcus aureus, а также панрезистентных неферментирующих отрицательных палочковидных бактерий, угрожает конечному результату в виде возрастающих количеств внебольничных и госпитализированных пациентов (Mendes JJ, et al. 2012. Diabetes Res Clin Pract. 95(1):153-161; Tascini C, et al. 2011. Diabetes Res Clin Pract 94 (1):133-139). Соответственно, остается потребность в определении новых стратегий лечения, контроля и управления DFI.

Местное лечение предоставляет преимущества в избегании системных побочных эффектов, обеспечивая повышенную концентрацию в целевом месте и позволяя использовать средства, не доступные для системной терапии. Механическое иссечение нежизнеспособных тканей улучшает местное лечение, поскольку оно снижает бионагрузку присутствующих бактерий, а также открывает зависимый от времени терапевтический диапазон для местной антибактериальной терапии (TAT) (Wolcott RD, et al. 2010. J Wound Care 19:320-328). Тем не менее в настоящее время ни одно средство ТАТ не было признано в качестве эффективного для лечения DFI (Nelson ЕА, et al. 2006. Diabet Med 23:348-359).

Бактериофаги (фаги) представляют собой вирусы, которые специфически инфицируют и лизируют бактерии. Фаговая терапия, способ применения целых фагов для лечения бактериальных инфекционных заболеваний, был введен в 1920-ых гг. Феликсом Д'Эрелем. Тем не менее с разработкой антибиотиков в 1940-ых гг. интерес к терапевтическим средствам на основе фагов в западном мире снизился. Одним из наиболее важных факторов, которые содействовали этому снижению, было отсутствие стандартизированных протоколов испытания и способов получения. Неспособность разработать стандарты промышленного масштаба для испытания видов фаговой терапии препятствовало ведению документации о результатах исследований, что привело к видимому отсутствию эффективности, а также проблемам с достоверностью, касающейся объема фаговой терапии. Другая проблема в получении фагов была связана со степенью чистоты коммерческих препаратов фагов, при этом препараты содержали нежелательные бактериальные компоненты, например, эндотоксины. Соответственно, с препаратами часто были связаны побочные события, особенно у пациентов, получающих их внутривенно.

Тем не менее в Восточной Европе и бывшем Советском Союзе, где доступ к антибиотикам был ограничен, разработка и применение фаговой терапии продолжались совместно с антибиотиками или вместо них. Кроме того, с ростом резистентных к антибиотикам штаммов многих бактерий в западном мире возродился интерес к терапевтическим средствам на основе фагов. Иными словами, даже если могут быть разработаны новые классы антибиотиков, перспектива того, что бактерии рано или поздно приобретут резистентность к новым лекарственным средствам, приводит к необходимости интенсивного поиска не химиотерапевтических средств для контроля, профилактики и лечения бактериальных инфекций.

Литический бактериофаг, особенно если он дополнен адекватным механическим иссечением нежизнеспособных тканей, предлагает решение для лечения DFI, например, для применения в качестве новых средств ТАТ. Логические бактериофаги могут предложить преимущества в специфичности и результативности в лизировании патогенных бактерий, даже с мультирезистентностью (Rossney AS, et al. 1994. J Hosp Infect 26:219-234.) Дополнительные преимущества могут включать в себя отсутствие патогенности в отношении людей и животных (Burrowes В, et al. 2011. Expert Rev Anti Infect Ther 9:775-785), антибактериальную активность против бактерий в биопленках и активность микроаэрофильном окружении, даже с высокой бактериальной нагрузкой (Azeredo J, et al. 2008. Curr Pharm Biotechnol 9:261-266), а также, как правило, приемлемую безопасность бактериофаговой терапии в некоторых частях света (Sulakvelidze A, et al., 2001, Antimicrob Agents Chemother. 45(3):649-659). Недавние испытания бактериофаговой терапии на животных показали ее потенциал в заживлении или улучшении кожных бактериальных заболеваний, как при внутренних (McVay CS, et al. 2007. Antimicrob Agents Chemother 51:1934-1938), так и наружных применениях (Soothill JS. 1994. Burns 20:209-211; Wills QF, et al. 2005. Antimicrob Agents Chemother 49:1220-1221). Тем не менее существует мало опубликованных данных в поддержку применения бактериофагов для лечения инфекций, продолжающихся в течение более длительного периода, чем несколько часов (Ryan ЕМ, et al. 2011 J Pharm Pharmacol 63:1253-1264).

В частности, фаговые коктейли могут обеспечивать преимущества для применения фагов отдельно, например, для увеличения литической активности против конкретного бактериального штамма и для снижения возможности появления бактерий, резистентных в отдельному бактериофагу. Иными словами, различные бактериофаги могут быть смешаны в виде коктейлей для расширения их свойств, предпочтительно давая в результате обобщенно больший спектр антибактериальной активности, например, расширенный круг хозяев, по отношению к которым менее вероятно развитие резистентности. Тем не менее в настоящее время существуют лишь несколько фаговых коктейлей с антибактериальной активностью против различных бактерий, возможно вследствие сложности в комбинировании различных специфичностей бактериофага при сохранении стабильности при хранении.

Следовательно, существует необходимость в разработке новых фаговых продуктов в качестве терапевтических и/или профилактических средств для применения in vivo против патогенных бактерий. Также существует потребность в лучших видах лечения, в частности, местных видов лечения для DFI. В частности, существует необходимость в бактериофаговых коктейлях, способных лизировать бактерии, обуславливающие DFI, включающие в себя Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Настоящая заявка направлена на указанные и другие потребности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фаговые коктейли. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции, содержащие по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага, причем каждый характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 (F44/10), SEQ ID NO: 2 (F125/10), SEQ ID NO: 3 (F770/05), SEQ ID NO: 4 (F510/08) и SEQ ID NO: 5 (F1245/05), или ее вариант, причем вариант характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности относительно соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты и демонстрирует антибактериальную активность против по меньшей мере одного из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Согласно некоторым вариантам осуществления один по меньшей мере из двух штаммов бактериофага представляет собой штамм с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере два штамма бактериофага представляют собой штаммы с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, или их варианты. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий и четвертый штамм бактериофага, причем каждый из третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления один по меньшей мере из двух штаммов бактериофага представляет собой штамм с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере два штамма бактериофага представляют собой штаммы с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий и четвертый штаммы бактериофага, причем каждый из третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления один по меньшей мере из двух штаммов бактериофага представляет собой штамм с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция дополнительно содержит по меньшей мере третий и четвертый штаммы бактериофага, причем каждый из третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или ее вариант.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере пять выделенных штаммов бактериофага, причем штаммы характеризуются геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 или их вариант, где вариант характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности по отношению к соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты и демонстрирует антибактериальную активность против по меньшей мере одного из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из штаммов бактериофага с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, 2, 4 и 5 или их варианты, присутствует в композиции в количестве, соответствующем приблизительно в 10 раз по сравнению с количеством штамма бактериофага с геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция содержит штаммы бактериофага с геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим фаговые коктейли, в частности, фармацевтическим композициям, содержащим любую из описанных выше композиций и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция составлена для местного применения. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит стерильный буфер, например, буфер, содержащий приблизительно 0,05 M трис-HCl, приблизительно 0,1 M NaCl и приблизительно 10 мМ MgSO4.7H2O. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержится в ампуле.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительное средство, например, средство, выбранное из группы, состоящей из антибиотика, противовоспалительного средства, противовирусного средства, местноанестезирующего средства, фактора роста и кортикостероида. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, например, антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus; или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Более конкретно, согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Staphylococcus aureus, или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Staphylococcus aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Pseudomonas aeruginosa, или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Pseudomonas aeruginosa. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное средство представляет собой антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Acinetobacter baumannii, или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от Acinetobacter baumannii. Согласно некоторым вариантам осуществления введение антибиотика предусматривает системное введение.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция предназначения для применения в лечении бактериальной инфекции, связанной с областью неинтактной кожи, и каждый из штаммов фага присутствует в композиции в количестве, соответствующем 103-1013 фаговых частиц/см2 площади. Согласно некоторым вариантам осуществления каждый из штаммов фага присутствует в композиции в количестве, соответствующем 107-109 фаговых частиц/см2 площади.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения или профилактики бактериальной инфекции у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающим введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную одним или несколькими из Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят местно. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой млекопитающего, например, человека. Согласно некоторым вариантам осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию диабетической стопы. Согласно некоторым вариантам осуществления инфекция диабетической стопы включает в себя кожную язву. Согласно некоторым вариантам осуществления бактериальная инфекция связана с областью неинтактной кожи, выбранной из поражения кожи, связанного с воспалением подкожной клетчатки, рожистым поражение, ожоговой раной, хронической язвой, пролежнем и намином. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предусматривает местное введение фармацевтической композиции на кожную язву, связанную с инфекцией диабетической стопы. Согласно предпочтительным вариантам осуществления введение следует за механическим иссечением нежизнеспособных тканей язвы. Согласно некоторым вариантам осуществления введение предусматривает применение по меньшей мере одного из повязки, инстилляционного устройства и устройства для терапии ран отрицательным давлением.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят каждые 4 часа или каждые 6 часов в течение первых 24 часов. Согласно некоторым вариантам осуществления после первых 24 часов фармацевтическую композицию вводят каждые 12 часов или каждые 24 часа в течение по меньшей мере 3 дополнительных дней. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят каждые 12 часов или каждые 24 часа в течение по меньшей мере 4 дополнительных дней.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ используется в комбинации со стандартной терапией инфекции диабетической стопы, например, стандартной терапией, выбранной из группы, состоящей из заместительной терапии внеклеточным матриксом, влажной терапии раны, терапии раны отрицательным давлением, терапии путем артериальной реваскуляризации, гипербарической оксигенотерапии, введения антибиотика и введения фактора роста. Согласно некоторым вариантам осуществления влажная терапия раны предусматривает применение пленки с адгезивной основой, покрытой силиконом пены, гидрогеля и/или гидроколлоида. Согласно некоторым вариантам осуществления заместительная терапия внеклеточным матриксом предусматривает применение биоконструкционной ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления введение антибиотика предусматривает системное введение. Согласно некоторым вариантам осуществления фактор роста представляет собой по меньшей мере фактор роста, выбранный из группы, состоящей из тромбоцитарного фактора роста, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов, фактора роста нервов и фактора роста сосудистого эндотелия. Согласно некоторым вариантам осуществления введение фактора роста предусматривает местное введение. Согласно некоторым вариантам осуществления способ используется в комбинации с нестандартной терапией инфекции диабетической стопы, например, если инфекция диабетической стопы рефрактерна к стандартной терапии.

Определения

Используемый в настоящем документе термин "выделенный" в контексте молекул нуклеиновой кислоты относится к первой молекуле нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в естественном источнике первой молекулы нуклеиновой кислоты. Более того, "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, по существу не содержит другой клеточный материал или культуральную среду, если она получена с помощью рекомбинантных техник, или по существу не содержит химические предшественники или другие химические средства, если она синтезирована химически, и может не содержать другие молекулы кДНК или другие молекулы геномной ДНК, например, если она была выделена из других клонов в библиотеке нуклеиновых кислот. Кроме того, "выделенная" геномная ДНК по существу не содержит другой вирусный клеточный материал или культуральную среду, если она получена с помощью рекомбинантных техник, или по существу не содержит химические предшественники или другие химические средства, если она химически синтезирована, и может не содержать другие молекулы кДНК или другие молекулы геномной ДНК, например, если она была выделена из препаратов, содержащих больше, чем штамм бактериофага и/или бактерии.

Термин "очищенный" в отношении бактериофага означает, что концентрация фага была заметно увеличена с помощью любого способа очистки, включая в себя без ограничения выделение из окружения или культуры, например, выделение из культуры после размножения и/или амплификации, центрифугирования и т.д., тем самым частично, существенно, почти полностью удаляя такие примеси, как клетки - хозяева и компоненты клеток - хозяев. Специалист в настоящей области техники определит уровень очистки, необходимый для заданного применения. Например, выделенный фаг, предусмотренный для применения в терапевтических композициях, предназначенных для введения людям, как правило, должен характеризоваться высокой степенью чистоты согласно нормативам и надлежащим способам производства.

Термин "очищенный" означает, что концентрации пептида, полипептида, белка слияния или молекулы нуклеиновой кислоты увеличили с помощью любого способа очистки, включая в себя без ограничения колоночную хроматографию, ВЭЖХ, осаждение, электрофорез и т.д., тем самым частично, существенно, почти полностью или полностью удаляя такие примеси, как предшественники или другие химические средства, вовлеченные в получение пептида, полипептида, белка слияния или молекулы нуклеиновой кислоты. Специалист в настоящей области техники определит уровень очистки, необходимый для заданного применения. Например, выделенная геномная ДНК, предусмотренная для применения в терапевтических композициях, предназначенных для введения людям, как правило, должна характеризоваться высокой степенью чистоты согласно нормативам и надлежащим способам производства.

Используемый в настоящем документе термин "вариант" в контексте последовательностей нуклеиновой кислоты относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующейся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. Может быть выбран вариант, который сохраняет одну или несколько функций эталонной последовательности нуклеиновой кислоты. Например, вариантный бактериофаг может проявлять по меньшей мере одну биологическую активность, например, антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) бактериофага, из которого он происходит.

Используемый в настоящем документе термин "клетка - хозяин" относится к конкретной клетке субъекта, трансфектированной молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки, которое содержит молекулу нуклеиновой кислоты или ее хромосомно интегрированную версию. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфектированной молекулой нуклеиновой кислоты, вследствие мутаций или воздействий окружающей среды, которые могут происходить в последующих поколениях, или интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки - хозяина. Для поколения бактериофага клетка - хозяин может относиться или не относиться к тому же виду или штамму, из которого был выделен или культивирован бактериофаг.

Используемый в настоящем документе термин "в комбинации" или "в дополнительной комбинации" или "дополнительно в комбинации" относится к применению дополнительного профилактического и/или терапевтического средства, а также фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Использование термина "в комбинации" не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические средства вводят субъекту. Первое профилактическое или терапевтическое средство могут вводить перед (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель до), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель после) введения второго профилактического или терапевтического средства (отличного от первого профилактического или терапевтического средства) субъекту.

Используемые в настоящем документе термины "профилактическое средство" и "профилактические средства" относятся к такому средству, как бактериофаговый коктейль согласно настоящему изобретению, который может использоваться в профилактике, ведении или контроле одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения, в частности, заболевания или нарушения, связанного с такой бактериальной инфекцией, как инфекция диабетической стопы.

Используемые в настоящем документе термины "терапевтическое средство" и "терапевтические средства" относятся к такому средству, как бактериофаговый коктейль согласно настоящему изобретению, который может использоваться в лечении, ведении или контроле одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения, в частности, заболевания или нарушения, связанного с такой бактериальной инфекцией, как инфекция диабетической стопы.

Используемые в настоящем документе термины "лечить", "лечение" и "проведение лечение" относятся к получению терапевтического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию. В отношении достижения терапевтического эффекта, целью является устранить, уменьшить, снизить тяжесть, улучшить или замедлить прогрессирование симптомов или первопричины (например, бактериальной инфекции), связанных с патологическим состоянием или нарушением. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству такого терапевтического средства, как фармацевтическая композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению, достаточному для достижения по меньшей мере одного терапевтического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию.

Используемые в настоящем документе термины "предотвратить", "профилактика" и "осуществление профилактики" относятся к получению профилактического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию. В отношении достижения профилактического эффекта целью является отсрочить или предотвратить симптомы или первопричину (например, бактериальную инфекцию), связанные с патологическим состоянием или нарушением. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству такого профилактического средства, как фармацевтическая композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению, достаточному для достижения по меньшей мере одного профилактического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию.

Используемые в настоящем документе термины "антибактериальная активность" и "противомикробная активность" в отношении бактериофага (или его варианта или фрагмента) или продукта бактериофага, используются взаимозаменяемо для обозначения способности уничтожать и/или ингибировать рост или репродукцию микроорганизма, в частности, бактерий того вида или штамма, который инфицирует бактериофаг. Согласно определенным вариантам осуществления антибактериальная или противомикробная активность оценивается путем культивирования бактерий, например, грамположительных бактерий (например, S. aureus), грамотрицательных бактерий (например, A. baumannii, Ε. coli, и/или P. aeruginosa) или бактерий, не классифицированных ни как грамположительные, ни как грамотрицательные, согласно стандартным техникам (например, в жидкой культуре или на планшетах с агаром), приведения культуры в контакт с бактериофагом или его вариантом согласно настоящему изобретению и мониторинга роста клеток после указанного приведения в контакт. Например, в жидкой культуре бактерии могут выращивать до оптической плотности ("OD"), представляющей собой среднее значение в экспоненциальном росте культуры; культуру подвергают воздействию одной или нескольких концентраций одного или нескольких бактериофагов согласно настоящему изобретению или их вариантов, и OD подвергают мониторингу относительно контрольной культуры. Сниженная OD относительно контрольной культуре характерна для бактериофага, проявляющего антибактериальную активность (например, проявляется литическую цитотоксическую активность). Аналогично, на планшете с агаром могли формировать бактериальные колонии, планшет подвергали воздействию одного или нескольких бактериофагов согласно настоящему изобретению или их вариантов, и последующий рост колоний оценивали относительно контрольных планшетов. Уменьшенный размер колоний или уменьшенные общие количества колоний указывают на бактериофаг с антибактериальной активностью.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 проиллюстрировано получение иллюстративной композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 2 проиллюстрирован протокол исследования, используемый для демонстрации in vivo эффективности на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 3 проиллюстрирован протокол исследования, используемый для демонстрации in vivo эффективности на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 4 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Staphylococcus aureus 743/06, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 5 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Pseudomonas aeruginosa 433/07, демонстрирующих in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 6 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Acinetobacter baumannii 1305/05, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 7 проиллюстрированы результаты анализов микробиологической нагрузки для контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 8 проиллюстрированы результаты анализов закрытия раны для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животные, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 9 проиллюстрированы результаты гистологических анализов для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 10 проиллюстрированы результаты анализов микробиологической нагрузки для контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 11 проиллюстрированы результаты анализов закрытия раны для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 12 проиллюстрированы результаты гистологических анализов для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 13 проиллюстрированы классификации инфекций диабетической стопы и применение к ним фаговой терапии с использованием иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

На фиг. 14 проиллюстрирована схема клинического исследования для иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению для применения в терапии язв диабетической стопы.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к фаговой терапии для лечения и контроля бактериальных инфекций, в частности, инфекций диабетической стопы. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к новым композициям коктейля различных штаммов бактериофага. "Коктейль" может содержать по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше различных выделенных штаммов бактериофага. Коктейль может использоваться отдельно или в дополнительной комбинации с другими видами терапии, например, антибиотиками и/или факторами роста.

Фаговые коктейли предоставляют преимущества в применении фагов отдельно, например, для увеличения литической активности против конкретного бактериального штамма и/или для снижения возможности появления бактерий, резистентных в отдельному бактериофагу. Различные бактериофаги могут быть смешаны в виде коктейлей для расширения их свойств, предпочтительно давая в результате обобщенно больший спектр антибактериальной активности. Тем не менее существует лишь несколько фаговых коктейлей с антибактериальной активностью против различных бактерий, вероятно, вследствие сложности комбинирования различных специфичностей штаммов бактериофага при сохранении инфицирующей способности и/или литической активности отдельного бактериофага в присутствии отличающихся штаммов бактериофага.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую пять выделенных штаммов бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05, причем композиция коктейля составлена в виде местного состава и находит применение в лечении и/или профилактике инфекций диабетической стопы.

Настоящее изобретение согласно некоторым вариантам осуществления предусматривает композиции коктейля, содержащие по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага с антибактериальной активностью против одинаковых или различных бактериальных видов или штаммов. Согласно предпочтительным вариантам осуществления терапевтические компоненты коктейля нацелены на два или больше видов или штаммов бактерий. Согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит по меньшей мере 2 штамма фага, по меньшей мере 3 штамма фага, по меньшей мере 4 штамма фага, по меньшей мере 5 штаммов фага, по меньшей мере 6 штаммов фага, по меньшей мере 7 штаммов фага, по меньшей мере 8 штаммов фага, по меньшей мере 9 штаммов фага, по меньшей мере 10 штаммов фага или больше. Согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит 2-20 штаммов фага, 2-15 штаммов фага, 2-10 штаммов фага, 3-8 штаммов фага или 4-6 штаммов фага. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления комбинация не ослабляет или не снижает (или существенно или значительно не ослабляет или не снижает) инфицирующую способность и/или литическую активность отдельного бактериофага в присутствии отличающихся штаммов бактериофага.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один штамм фага коктейля представляет собой штамм с антибактериальной активностью против по меньшей мере одной грамотрицательной бактерии, включая в себя без ограничения Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa; и/или против по меньшей мере одной грамположительной бактерии включая в себя без ограничения Staphylococcus aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага, где штаммы демонстрируют антибактериальную активность против по меньшей мере одной из S. aureus, P. aeruginosa и/или A. baumannii. Согласно предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля демонстрирует антибактериальную активность против по меньшей мере двух из S. aureus, P. aeruginosa и/или A. baumannii. Согласно некоторым даже более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля демонстрирует антибактериальную активность против каждой из S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере один штамм фага, демонстрирующий антибактериальную активность против Staphylococcus aureus. S. aureus представляет собой грамположительный сферический факультативный анаэроб, который растет в виде гроздевидных кластеров с характерным золотым цветом и является самой распространенной причиной стафилококковых инфекций. Он часто является частью флоры кожи человека и отвечает за спектр инфекций, включая в себя угри, карбункулы, синдром ошпаренной кожи, воспаление легких, гастроэнтерит, менингит, остеомиелит, эндокардит, синдром токсического шока, бактериемию и сепсис. Также он часто вовлечен в инфекции диабетической стопы, включая в себя без ограничения кожные язвы. Такие кожные язвы также в настоящем документе называются "язвы диабетической стопы".

Следует отдельно упомянуть резистентные к метициллину штаммы Staphylococcus aureus (MRSA). MRSA оставался редким случаем в стационарах до 1990-ых гг., когда наблюдалась вспышка распространенности MRSA в стационарах. В настоящее время MRSA считается эндемическим для госпиталей, особенно в Великобритании (Johnson АР et al. 2001 J. Antimicrobial Chemotherapy 48(1): 143-144). Более того, MRSA представляет новую угрозу в инфекциях диабетической стопы (данные от 17 января 2009 на интернет сайте CDC: Centers for Disease Control and Prevention). Язвы и открытые кожные поражения, которые могут возникать в диабетических стопах, подвергают пациентов риску контакта с MRSA, и недавние исследования показали доказательства того, что MRSA ослабляет заживление, если он присутствует в диабетической ране (Bowling FL, et al. 2009 Curr Diab Rep 9(6):440-444). Смотрите также Kosinski, MA, et al. 2010. Expert Rev Antiinfect Ther. 8(11):1293-1305.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1. Конкретный пример согласно настоящему варианту осуществления представляет собой выделенный бактериофаг F44/10, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Staphylococcus, включая в себя S. aureus. Штамм F44/10 был депонирован 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Национальные коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий) (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK), и ему присвоен регистрационный номер 41867. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 2. Конкретный пример согласно настоящему варианту осуществления представляет собой выделенный бактериофаг F125/10, который также нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Staphylococcus, включая в себя S. aureus. Штамм F125/10 был депонирован 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK), и ему присвоен регистрационный номер 41866. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля включает в себя по меньшей мере штаммы фага как F44/10, так и F125/10. Согласно определенным вариантам осуществления фаговый коктейль содержит по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против одного или нескольких штаммов S. aureus (например, F44/10 и/или F125/10) и по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против различных бактерий. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит штамм фага, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1 или 2 или ее варианта, в комбинации по меньшей мере с одним другим штаммом фага, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 3, 4 или 5 или их варианта.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере один штамм фага, демонстрирующий антибактериальную активность против Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa представляет собой обычную грамотрицательную палочковидную бактерию, встречающуюся в почве, воде, флоре кожи и большинстве антропогенных окружающих средах. Указанная бактерия хорошо развивается не только в нормальных атмосферных условиях, но также с небольшим содержанием кислорода как факультативный анаэроб, и может инфицировать поврежденные ткани или особей с ослабленным иммунитетом, включая в себя пациентов с сахарным диабетом. В действительности, P. aeruginosa часто вызывает тяжелое повреждение ткани в язвах диабетической стопы, и главной проблемой в отношении инфекции P. aeruginosa является то, что указанный патоген проявляет высокую степень резистентности к широкому спектру антибиотиков (Murugan, S. et al. 2010 Intl J of Microbiol Res 1(3):123-128). Например, в исследовании Murugan с соавт. было обнаружено, что 100% изолятов P. aeruginosa из язв диабетической стопы являлись резистентными к меропенему, и обнаружено, что свыше 71% являлись резистентными к имипенему.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3. Конкретный пример согласно настоящему варианту осуществления представляет собой выделенный бактериофаг F770/05, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Pseudomonas, включая в себя P. aeruginosa. Смотрите также международную патентную публикацию WO 2010/090542, раскрывающую указанный штамм бактериофага. Штамм F770/05 был депонирован 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK), и ему присвоен регистрационный номер 41864. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 4. Конкретный пример согласно настоящему варианту осуществления представляет собой выделенный бактериофаг F510/08, который также нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Pseudomonas, включая в себя P. aeruginosa. Штамм F510/08 был депонирован 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK), и ему присвоен регистрационный номер 41868. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля включает в себя по меньшей мере штаммы фага как F770/05, так и F510/08. Согласно определенным вариантам осуществления фаговый коктейль содержит по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против одного или нескольких штаммов Р. aeruginosa (например, F770/05 и/или F510/08), и по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против различных бактерий. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит штамм фага, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 3 или 4, или ее варианта, в комбинации по меньшей мере с одним другим штаммом фага, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1, 2 или 5, или их варианта.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере один штамм фага, демонстрирующий антибактериальную активность против Acinetobacter baumannii. A. baumannii представляет собой вид бактерий, который вызывает ряд тяжелых клинических инфекций, особенно у лиц с ослабленной иммунной системой, включая в себя пациентов с сахарным диабетом. Например, A. baumannii была выделена от пациентов с сахарным диабетом с инфекцией нижней конечности (Colayco, CAS, et al 2002 PhilJ Microbiol Infect Dis 31(4):151-106). A. baumannii представляет собой плеоморфную аэробную грамотрицательную палочковидную бактерию, которая часто проникает в организм через такие открытые раны, как язвы диабетической стопы. Также известно, что она является резистентной к многочисленным антибиотикам, и за последние годы увеличился ряд госпитальных инфекций, вызванных A. baumannii. Смотрите также Browne АС, et al. 2001 Ostomy Wound Management 47(10):44-49 (обсуждающую распространение видов & aureus, P. aeruginosa и Acinetobacter в язвах диабетической стопы). Acinetobacter baumannii представляет собой колониеобразующий микроорганизм, который, как правило, появляется позже в процессе раневой инфекции. Соответственно, согласно определенным вариантам осуществления важно, чтобы композиция фагового коктейля содержала бактериофаг, который инфицирует Acinetobacter baumannii.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5. Конкретный пример согласно настоящему варианту осуществления представляет собой выделенный бактериофаг F1245/05, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Acinetobacter, включая в себя A. baumannii. Смотрите также международную патентную публикацию WO 2010/090542, раскрывающую указанный штамм бактериофага. Штамм F1245/05 был депонирован 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK), и ему присвоен регистрационный номер 41865. Согласно определенным вариантам осуществления фаговый коктейль содержит по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против одного или нескольких штаммов A. baumannii (например, F1245/05), и по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против различных бактерий. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль содержит штамм фага, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 5 или ее варианта, в комбинации по меньшей мере с одним другим штаммом фага, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID ΝΟ: 1, 2, 3 или 4, или их варианта.

Согласно определенным вариантам осуществления коктейль согласно настоящему изобретению содержит бактериофаг, который представляет собой вариант любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, причем вариантный бактериофаг проявляет по меньшей мере одну биологическую активность, например, антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность), одного или нескольких из штаммов бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вариант штаммов бактериофага F44/10 или F125/10 сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких из штаммов вида Staphylococcus, более предпочтительно включая в себя S. aureus. Согласно предпочтительным вариантам осуществления коктейль содержит вариант штаммов бактериофага F770/05 или F510/08, который сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Pseudomonas, более предпочтительно включая в себя P. aeruginosa. Согласно предпочтительным вариантам осуществления коктейль содержит вариант штамма бактериофага Ρ1245/05, который сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Acinetobacter, более предпочтительно включая в себя A. baumannii.

Вариантный штамм бактериофага может содержать или состоять из генома, характеризующегося идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, причем бактериофаг проявляет по меньшей мере одну биологическую активность, например, антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность), бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05 соответственно. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вариант штамма бактериофага F44/10 содержит или состоит из генома, характеризующегося идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 и сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Staphylococcus, более предпочтительно включая в себя S. aureus. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вариант штамма бактериофага F125/10 содержит или состоит из генома, характеризующегося идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 2 и сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Staphylococcus, более предпочтительно включая в себя S. aureus. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вариант штамма бактериофага F770/05 содержит или состоит из генома, характеризующегося идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3, и сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Pseudomonas, более предпочтительно включая в себя P. aeruginosa. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вариант штамма бактериофага F510/08 содержит или состоит из генома, характеризующегося идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 4, и сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Pseudomonas, более предпочтительно включая в себя P. aeruginosa. Согласно предпочтительным вариантам осуществления вариант штамма бактериофага Ρ1245/05 содержит или состоит из генома, характеризующегося идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5, и сохраняет антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) против одного или нескольких штаммов вида Acinetobacter, более предпочтительно включая в себя A. baumannii.

Альтернативно или дополнительно коктейль согласно настоящему изобретению содержит вариант, который характеризуется геномом, содержащим функциональный фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, причем вариант бактериофаг проявляет по меньшей мере одну биологическую активность, например, антибактериальную или противомикробную активность (например, литическую цитотоксическую активность) бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05 соответственно, предпочтительно как описано выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую по меньшей мере два различных выделенных штамма бактериофага, причем каждый штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 (F44/10), SEQ ID NO: 2 (F125/10), SEQ ID NO: 3 (F770/05), SEQ ID NO: 4 (F510/08), и SEQ ID NO: 5 (F1245/05), или ее описанный выше вариант. Согласно предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере один из штаммов бактериофага, характеризующийся геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или ее вариант. Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере оба штамма бактериофага, характеризующиеся геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 или их варианты. Согласно некоторым еще более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем указанный третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или их вариант. Согласно некоторым даже более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере третий и четвертый штамм бактериофага, причем каждый из указанного третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, или ее вариант.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере один из штаммов бактериофага, характеризующийся геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, или ее вариант. Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере оба штамма бактериофага, характеризующихся геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 или их вариант(ы). Согласно некоторым еще более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере третий штамм бактериофага, причем указанный третий штамм характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, и SEQ ID NO: 5, или ее варианты). Согласно некоторым даже более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит по меньшей мере третий и четвертый штамм бактериофага, причем каждый из указанного третьего и четвертого штаммов характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, и SEQ ID NO: 5, или ее вариант(ы).

Согласно предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля включает в себя штамм бактериофага, характеризующийся геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 или ее вариант.Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля содержит штамм бактериофага, характеризующийся геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 или ее вариант, вместе с одним, двумя или тремя дополнительными штаммами бактериофага, каждый из которых характеризуется геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или ее вариант.

Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую по меньшей мере пять выделенных штаммов бактериофага, причем указанные штаммы характеризуются геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 или их вариант. Согласно некоторым таким вариантам осуществления вариант, выбранный для любой одной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, характеризуется no меньшей мере 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности по отношению к соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты и проявляет антибактериальную активность против по меньшей мере одного из S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii. Особенно предпочтительные варианты осуществления комбинируют антибактериальные активности против всех трех бактериальных штаммов. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля дополнительно содержит один или несколько дополнительных штаммов фага, причем указанный дополнительный штамм фага характеризуется антибактериальной активностью против по меньшей мере одного из S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii и/или против других бактерий.

Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию коктейля, содержащую пять выделенных штаммов бактериофага, причем указанные штаммы характеризуются геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 или их вариант, дополнительно в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным штаммом фага. Согласно предпочтительным вариантам осуществления дополнительный штамм фага выбран из группы, состоящей из штамма бактериофага F168/08, характеризующегося антибиотической активностью против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium (как раскрыто в международной патентной публикации WO 2011/065854 и публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F170/08, характеризующегося антибиотической активностью против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium (как раскрыто в международной патентной публикации WO 2011/065854 и публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F197/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F86/06, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F87s/06, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F91a/06, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F391/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Klebsiella pneumoniae (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/384015), штамма бактериофага F394/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Acinetobacter baumannii (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/38401), штамма бактериофага F488/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Escherichia coli (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/38401) и штамма бактериофага F387/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Klebsiella pneumoniae (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/384015) (содержания каждой патентной заявки полностью включены в настоящий документ посредством ссылки). Содержания предварительной заявки на выдачу патента США №61/384015, поданной 17 сентября 2010 г., и международной заявки РСТ/РТ2011/000031, поданной 19 сентября 2011 г., также полностью включены посредством ссылки в настоящий документ.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию, содержащую по меньшей мере пять выделенных штаммов бактериофага, причем указанные штаммы характеризуются геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 или их вариант, причем каждый из штаммов бактериофага, характеризующихся геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, 2, 4 и 5 или их указанные варианты, присутствуют в указанной композиции в больших количествах по сравнению с количеством указанного штамма бактериофага, характеризующегося геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или ее указанный вариант. Согласно предпочтительным вариантам осуществления каждый из штаммов бактериофага, характеризующихся геномами, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, 2, 4 и 5 или их варианты, присутствуют в композиции коктейля в количестве, соответствующем приблизительно в 2 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 8 раз, приблизительно в 9 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 11 раз, приблизительно в 12 раз, приблизительно в 15 раз или приблизительно в 20 раз больше, чем количество штамма бактериофага, характеризующегося геномом, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 или ее вариант.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция фагового коктейля может включать в себя или не включать в себя фаг, выбранный для увеличенного периода полужизни in vivo, например, как раскрыто в патенте США №5688501, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления коктейль вводят при отсутствии выделенного полипептида, например, при отсутствии лиазы.

Настоящее изобретение также предусматривает выделенные бактерии, инфицированные одним или несколькими бактериофагами согласно настоящему изобретению. Согласно определенным вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный S. aureus, инфицированный бактериофагом, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 и/или 2 или ее варианта. Согласно определенным вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный P. aeruginosa, инфицированный бактериофагом, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 и/или 4 или ее варианта. Согласно определенным вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный A. baumannii, инфицированный бактериофагом, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 или ее варианта.

Бактериофаг для применения в фаговых коктейлях согласно настоящему изобретению может быть получен и/или выделен с помощью любых способов, известных в настоящей области техники и/или раскрытых в настоящем документе. Например, специалист в настоящей области техники может использовать один или несколько способов для получения и/или выделения бактериофага, характеризующегося геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, в также их вариантов. Способ получения и/или выделения бактериофага, характеризующегося геномом, который содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2, и/или варианта любой из них, может предусматривать (i) получение культуры S. aureus; (ii) ее инфицирование бактериофагом, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID ΝΟ: 1 и/или SEQ ID NO: 2, и/или варианта любой из них; (iii) культивирование, пока не будет наблюдаться значительный лизис культуры; и (iv) выделение из культуры бактериофага. Используемая клетка - хозяин может представлять собой любой бактериальный штамм, например, любой штамм S. aureus, чувствительный к инфицированию бактериофагом и который может использоваться для его репликации. Согласно некоторым вариантам осуществления используемая клетка - хозяин представляет собой штамм S. aureus 743/06, депонированный 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK) с регистрационным номером NCIMB 41862. Способ получения и/или выделения бактериофага, характеризующегося геномом, который содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4, и/или варианта любой из них, может предусматривать (i) получение культуры P. aeruginosa, (ii) ее инфицирование бактериофагом, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4, и/или варианта любой из них; (iii) культивирование, пока не будет наблюдаться значительный лизис культуры; и (iv) выделение из культуры бактериофага. Используемая клетка - хозяин может представлять собой любой бактериальный штамм, например, любой штамм P. aeruginosa, чувствительный к инфицированию бактериофагом и который может использоваться для его репликации. Согласно некоторым вариантам осуществления используемая клетка - хозяин может представлять собой, например, штамм P. aeruginosa 433/07, депонированный 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK) с регистрационным номером NCIMB 41861. Способ получения и/или выделения бактериофага, характеризующегося геномом, который содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 и/или ее варианта, может предусматривать (i) получение культуры A. baumannii; (ii) ее инфицирование бактериофагом, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5 и/или ее варианта; (iii) культивирование, пока не будет наблюдаться значительный лизис культуры; и (iv) выделение из культуры бактериофага. Используемая клетка - хозяин может представлять собой любой бактериальный штамм, например, любой штамм A. baumannii, чувствительный к инфицированию бактериофагом и который может использоваться для его репликации. Согласно некоторым вариантам осуществления используемая клетка - хозяин может представлять собой, например, штамм A. baumannii 1305/05, депонированный 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK) с регистрационным номером NCIMB 41863.

Бактериофаг может быть выделен из бактериального образца с применением любого способа, описанного в настоящем документе или известного в настоящей области техники (смотрите, например, Carlson, "Working with bacteriophage: common techniques and methodological approaches," B, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophage: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press (2005); полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки). Конкретные бактериальные штаммы, которые можно использовать, включают в себя, например, штамм Staphylococcus aureus 743/06 (например, для выделения фага F44/10 и F125/10), штамм Pseudomonas aeruginosa 433/07 (например, для выделения фага F770/05 и F510/08) и штамм Acinetobacter baumannii 1305/05 (например, для выделения фага F1245/05). Штаммы Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05 были депонированы 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK), и им присвоены регистрационные номера NCIMB 41862, NCIMB 41861 и NCIMB 41863 соответственно. Бактериофаг также может быть выделен из любого другого бактериального штамма, чувствительного к инфекции, с помощью одного или нескольких бактериофагов, и в котором бактериофаг реплицируется.

Антибиотические композиции

Фаговые коктейли согласно настоящему изобретению включены в фармацевтическую композицию для применения в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций (например, инфекций диабетической стопы), вызванных бактериями, включающими в себя без ограничения A. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus. Коктейль различных штаммов фага, например, раскрытых в настоящем документе, можно комбинировать с фармацевтически приемлемым носителем, таким как вспомогательное вещество или стабилизатор. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ и стабилизаторов включают в себя без ограничения такие буферы, как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая в себя аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды; такие белки, как сывороточный альбумин и желатин; такие гидрофильные полимеры, как поливинилпирролидон; такие аминокислоты, как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая в себя глюкозу, маннозу или декстрины; такие хелатирующие средства, как EDTA; такие сахарные спирты, как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или такие неионные поверхностно-активные вещества, как TWEEN™, полиэтиленгликоль (PEG) и PLURONICS™. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению (например, антибактериальные композиции) могут также включать в себя обеспечивающее скольжение средство, смачивающее средство, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор, суспендирующее средство и консервант, например, в дополнение к вышеперечисленным ингредиентам.

Композиции бактериофагового коктейля согласно настоящему изобретению также можно комбинировать с одним или несколькими нефаговыми терапевтическими и/или профилактическими средствами, применимыми для лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, описанными в настоящем документе и/или известными в настоящей области техники (например, одним или несколькими антибиотиками). Другие терапевтические и/или профилактические средства, которые можно использовать в комбинации с фаговыми коктейлями согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения антибиотики, противовоспалительные средства, противовирусные средства, местноанестезирующие средства, факторы роста и кортикостероиды. Согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция составлена для лечения и/или профилактики инфекций диабетической стопы и содержит одно или несколько дополнительных терапевтических и/или профилактических средств, выбранных из антибиотиков, местноанестезирующих средств и факторов роста. Согласно некоторым вариантам осуществления фаговый коктейль вводят при отсутствии антибиотика.

Стандартные антибиотики, которые можно использовать с фармацевтическими композициями, содержащими фаговый коктейль согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, паромомицин, родострептомицин, стрептомицин, тобрамицин, апрамицин, рифамицин, нафтомицин, мупироцин, гелданамицин, ансамитоцин, карбацефемы, имипенем, меропенем, эртапенем, фаропенем, дорипенем, панипенем/бетамипрон, биапенем, PZ-601, цефалоспорины, цефацетрил, цефадроксил, цефалексин, цефалоглицин, цефалониум, цефалоридин, цефалотин, цефапирин, цефатризин, цефазафлур, цефазедон, цефазолин, цефрадин, цефроксадин, цефтезол, цефаклор, цефоницид, цефпрозил, цефуроксим, цефузонам, цефметазол, цефотетан, цефокситин, цефкапен, цефдалоксим, цефдинир, цефдиторен, цефетамет, цефиксим, цефменоксим, цефтерам, цефтибутен, цефтиофур, цефтиолен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим латамоксеф, цефклидин, цефепим, цефлупренам, цефоселис, цефозопран, цефпиром, цефхином, фломоксеф, цефтобипрол, азитромицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин, азтреонам, пенициллин и производные пенициллина, актиномицин, бацитрацин, колистин, полимиксин В, циноксацин, флумеквин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, пиромидиксовую кислоту, пипемидиксовую кислоту, розоксацин, ципрофлоксацин, эноксацин, флероксацин, ломефлоксацин, надифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, руфлоксацин, балофлоксацин, гатифлоксацин, грепафлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, пазуфлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, тосуфлоксацин, клинафлоксацин, гареноксацин, гемифлоксацин, стифлоксацин, тровалфлоксацин, прулифлоксацин, ацетазоламид, бензоламид, буметанид, целекоксиб, хлорталидон, клопамид, дихлорфенамид, дорзоламид, этоксизоламид, фуросемид, гидрохлоротиазид, индапамид, майфендид, мефрусид, метолазон, пробенецид, сульфацетамид, сульфадиметоксин, сульфадоксин, сульфаниламиды, сульфаметоксазол, сульфасалазин, сультиам, суматриптан, ксипамид, тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин, доксициклин, лимециклин, меклоциклин, метациклин, миноциклин, ролитетрациклин, метициллин, нафциллин, оксациллин, клоксациллин, ванкомицин, тейкопланин, клиндамицин, ко-тримоксазол, флуклоксациллин, диклоксациллин, ампициллин, амоксициллин и любую их комбинацию в количествах, которые эффективны для аддитивного или синергического усиления терапевтического и/или профилактического эффекта фагового коктейля согласно настоящему изобретению для данной инфекции.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против одного или нескольких из A. baumannii, Р. aeruginosa и/или S. aureus. Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против A. baumannii, Р. aeruginosa и S. aureus. Согласно некоторым другим вариантам осуществления фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от А. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций, вызванных видом Staphylococcus, например, S. aureus. Согласно некоторым таким вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1, такой как выделенный бактериофаг F44/10, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Staphylococcus, включая в себя S. aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, содержащий бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 2, такой как выделенный бактериофаг F125/10, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Staphylococcus, включая в себя S. aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя по меньшей мере оба штамма фага, F44/10 и F125/10. Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против одного или нескольких штаммов S. aureus, (например, F44/10 и/или F125/10), и по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против различных бактерий. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя штамм фага, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1 или 2 или ее варианта, в комбинации по меньшей мере с одним другим штаммом фага, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 3, 4, или 5 или ее варианта. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительное средство, например, антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против S. aureus; и/или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от S. aureus.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций, вызванных видом Pseudomonas, например, Р. aeruginosa. Согласно некоторым таким вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 3, такой как выделенный бактериофаг F770/05, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Pseudomonas, включая в себя Р. aeruginosa. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 4, такой как выделенный бактериофаг F510/08, который также нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Pseudomonas, включая в себя P. aeruginosa. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя по меньшей мере оба штамма фага, F770/05 и F510/08. Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против одного или нескольких штаммов P. aeruginosa (например, F770/05 и/или F510/08), и по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против различных бактерий. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя штамм фага, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 3 или 4 или ее варианта, в комбинации по меньшей мере с одним другим штаммом фага, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1, 2 или 5, или их варианта. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительное средство, например, антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против Р. aeruginosa; и/или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от P. aeruginosa.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций, вызванных видом Acinetobacter, например, А. baumannii. Согласно некоторым таким вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 5, такой как выделенный бактериофаг F1245/05, который нацеленно воздействует на ряд штаммов вида Acinetobacter, включая в себя A. baumannii. Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против одного или нескольких штаммов А. baumannii (например, F1245/05), и по меньшей мере один штамм фага, проявляющий антибактериальную активность против различных бактерий. Например, согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит коктейль, включающий в себя штамм фага, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 5 или ее варианта, в комбинации по меньшей мере с одним другим штаммом фага, характеризующимся геномом, содержащим или состоящим из SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, или их варианта. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительное средство, например, антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против А. baumannii; и/или антибиотик, характеризующийся антибактериальной активностью против бактерий, отличных от A. baumannii.

Местноанестезирующие средства, которые могут быть введены в состав для применения с фармацевтическими композициями согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения тетракаин, тетракаин гидрохлорид, лидокаин гидрохлорид, диметизоквин гидрохлорид, дибукаин, дибукаин гидрохлорид, бутамбенпикрат и прамоксин гидрохлорид. Иллюстративная концентрация местноанестезирующего средства составляет приблизительно 0,025% - приблизительно 5% по массе общей композиции. Согласно предпочтительным вариантам осуществления анестезирующее средство введено в состав вместе с коктейлем согласно настоящему изобретению в фармацевтической композиции, которая представляет собой местный состав.

Кортикостероиды, которые можно использовать с фармацевтическими композициями согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения бетаметазон, дипропионат, флуоцинолон, актинид, бетаметазон валерат, триамцинолон актинид, клобетазол пропионат, дезоксиметазон, дифлоразон диацетат, амцинонид, флурандренолид, гидрокортизон валерат, гидрокортизон бутират и дезонид. Иллюстративная концентрация кортикостероида составляет приблизительно 0,01% - приблизительно 1% по массе общей композиции.

Факторы роста, которые можно использовать с фармацевтическими композициями согласно настоящему изобретению, включают в себя без ограничения тромбоцитарный фактор роста, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста нервов и фактор роста сосудистого эндотелия.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления факторы роста, используемые в лечении и контроле язв диабетической стопы, могут использоваться также в комбинации с фармацевтической композицией фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Например, тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF) представляют собой важные факторы роста в лечении и контроле язв диабетической стопы (Papanas et al. 2007. Lower Extremity Wounds 6(1):37-53). Полагают, что PDGF содействует миграции макрофагов к язве, а также стимулирует синтез коллагена, таким образом, улучшая заживление (смотрите, например, Meyer-Ingold W et al. 1995 Cell Biol Int 19:389-398). PDGF является коммерчески доступным. Коммерчески доступные формы включают в себя Procurn (Curative Technologies In., New York), который содержит раствор всех тромбоцитарных факторов роста, суспендированных в коллагеновой основе; и бекаплермин (гель Regranex, Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc., Titusville, NJ), который содержит рекомбинантный гомодимерный PDGF. Полагаю, что GCSF усиливает бактерицидную и фагоцитарную активность нейтрофилов, активности, которые могут быть ослаблены у пациента с сахарным диабетом (Roilides Ε et al 1991 J Infect Dis 163:579-583). PDGF также является коммерчески доступным. Коммерчески доступные формы включают в себя филграстим (негликозилированный GCSF; Neupogen, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) и ленограстим (гликозилированный GCSF; Granocyte, Sanofi Aventis Inc., Paris France).

Дополнительные факторы роста, используемые в лечении и контроле язв диабетической стопы, включают в себя без ограничения эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF) и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). Считается, что EGF стимулирует синтез коллагена, эпителизацию и ангиогенез (Brown GL et al 1986 J Exp Med 163:1319-1342; и Brown GL et al 1991 Plast Reconstr Surg 88:189-194). Полагают, что FGF также стимулирует синтез коллагена, эпителизацию и ангиогенез, а также содействует пролиферации фибробластов (Sasaki Τ 1992 J Dermatol 19:664-666; и Auirinia A et al 1998 Scand J Plast Reconstr Hand Surg 32:9-18). Считается, что NGF стимулирует заживление путем стимуляции роста кератиноцитов и формирования новых сосудов (Generini S et al 2004 Exp Clin Endocrinol Diabetes 112:542-544). Также было показано, что VEGF ускоряет заживление кожи и, как полагают, мобилизирует клетки-предшественники сосудов и эндотелиальные клетки из костного мозга (Galiano RD et al. 2004 Am J Pathol 164:1935-1947). Один или несколько факторов роста, раскрытых в настоящем документе и/или известных в настоящей области техники, можно использовать в комбинации с фармацевтической композицией, содержащей фаговый коктейль согласно настоящему изобретению.

Фармацевтические композиции, содержащие фаговый коктейль согласно настоящему изобретению, могут быть введены в однодозовый или многодозовый состав. Предпочтительные составы представляют собой составы, которые могут быть нанесены местно, например, составы, выбранные из мазей, растворов и спреев. Другие подходящие составы включают в себя суспензии, эмульсии, экстракты, порошки или гранулы; и дополнительно могут включают в себя диспергирующее средство или стабилизирующее средство.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят местно (например, в форме лосьона, раствора, крема, мази или присыпки), или эпи- или трансдермально (например, путем применения кожного пластыря). Дополнительно или альтернативно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить с помощью ингаляции, в форме суппозитория или пессария, перорально (например, в виде таблетки, которая может содержать такие вспомогательные вещества, как крахмал или лактозу, в виде капсулы, вагинального суппозитория, эликсира, раствора или суспензии, каждый из которых необязательно содержит ароматизаторы, красители и/или вспомогательные вещества), или их можно ввести инъекцией парентерально (например, внутривенно, внутримышечно или подкожно). Для парентерального введения композиции можно использовать в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточно солей или моносахаридов, чтобы сделать раствор изотоничным крови. Для буккального или сублингвального введения композиции могут быть введены в форме таблеток или леденцов, которые могут быть составлены общепринятым способом. Согласно предпочтительному варианту осуществления фаговый коктейль согласно настоящему изобретению составлен для местного введения, либо в виде отдельного средства, либо в комбинации с другими терапевтическими и/или профилактическими средствами, как описано в настоящем документе или известно в настоящей области техники.

Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению составлены для местного введения, например, для области неинтактной кожи. Неинтактная кожа может включать в себя без ограничения повреждения кожи, пузырьки, хронические язвы, кисты, буллезное поражение, волдыри, такие открытые кожные поражения, как пролежни и другие намины, воспаления подкожной клетчатки, рожистые поражения, раны, ожоговые раны, карбункулы, кожные язвы, например, кожные язвы, связанные с инфекциями диабетической стопы, или другие состояния, при которых кожа повреждается, разрывается, трескается, нарушается целостность кожи и/или иным образом подвергается повреждению. Местные составы, как правило, включают в себя такой стерильный буфер, как стерильный PBS, вода или солевой буфер, или стерильный SM буфер. Один конкретный SM буфер, подходящий для применения согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, содержит трис-HCl, NaCl и/или MgSO4.7H2O, например, приблизительно 0,05 M трис-HCl (pH 7,4-7,5), приблизительно 0,1 M NaCl и/или приблизительно 10 мМ MgSO4.7H2O. Согласно другим вариантам осуществления состав дополнительно содержит SM буфер и 10 мМ MgCl2. Согласно еще одним вариантам осуществления состав дополнительно содержит SM буфер и приблизительно 20% - приблизительно 30% этанола.

Для местного применения на коже фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут комбинировать с одним или комбинацией носителей для местных составов, которые могут включать в себя без ограничения водную жидкость, жидкость на спиртовой основе, водорастворимый гель, лосьон, мазь, неводную жидкую основу, основу - минеральное масло, смесь минерального масла и вазелина, ланолин, липосомы, такие белковые носители, как сывороточный альбумин или желатин, порошкообразная целлюлоза, и их комбинации.

Носители для местных составов могут включать в себя полутвердые и/или гелеобразные инертные носители, которые могут включать в себя полимерный загуститель, воду, консерванты, активные поверхностно-активные вещества, эмульгаторы и/или растворитель или систему смешанных растворителей. В патенте США №5863560 раскрыт ряд комбинаций различных носителей, которые могут содействовать в осуществлении воздействия лекарственного средства на кожу, и ее содержание включено в настоящий документ посредством ссылки. Носитель может включать или не включать в себя состав контролируемого высвобождения, например, как раскрыто в заявке на выдачу патента США №2008/0260697, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Носитель может включать или не включать в себя фаг, адсорбированный на матрице, например, как описано в любом документе из заявок на выдачу патента США №№2008/0038322, 2008/0138311, 2009/0130196, европейских патентах №№ЕР 1812025, ЕР 1817043 и ЕР 1833497, содержания которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления носитель может включать или не включать в себя вязкий состав, например, гель, например, раскрытый в заявке на выдачу патента США №2009/0191254, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления местные фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предусмотрены в герметичном контейнере. Контейнер может представлять собой флакон, пробирку, бутылку, ампулу или подобное; и может содержать или состоять из стекла, пластика или другого подходящего материала. Ампулы, например, как правило, изготовлены в промышленных условиях из коротких отрезков ампульного стекла, которым придали форму с помощью нагревания газовыми горелками и силой тяжести. Техники компьютерного зрения часто используются, например, для контроля качества. Заполнение и запаивание ампул можно провести с помощью автоматизированного оборудования. Ампулы-заготовки можно купить у фирм-поставщиков лабораторной стеклянной посуды и запаять, например, с помощью небольшой газовой горелки, предпочтительно в условиях инертной атмосферы. Согласно некоторым вариантам осуществления контейнер также может быть заполнен инертным газом, в дополнение к фармацевтической композиции. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию фагового коктейля обеспечивают в ампуле или другом подходящем контейнере, и переносят для применения на основу, подходящую для прямого контакта с неинтактной кожей, например, пластырь, салфетку, бинт, повязку, описанные ниже.

Местный способ доставки может включать в себя тампон, спрей, бинт, пластырь медленного высвобождения, абсорбирующую жидкость салфетку и их комбинации. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению предоставлена, или напрямую, или в носителе(ях), в пластыре, салфетке, бинте, повязке или другой основе, подходящей для прямого контакта с кожей, в частности, неинтактной кожей.

Согласно некоторым вариантам осуществления местное введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению предусматривает применение повязки. Фармацевтическая композиция, содержащая фаговый коктейль согласно настоящему изобретению, может быть введена в повязку и/или нанесена отдельно вместе с применением повязки. Повязка стимулирует заживление, сохраняя рану увлажненной, создавая барьер против инфекции и/или сохраняя окружающую кожу сухой.

Согласно некоторым вариантам осуществления повязка включает в себя влажную раневую повязку. Влажная терапия раны, предусматривающая применение влажных раневых повязок, представляет собой стандартную терапию в лечении и контроле незаживающих ран, включая в себя, например, язвы диабетической стопы. При влажной терапии раны раны перевязывают материалами, которые обеспечивают защиту от внешних загрязнений, предотвращают высыхание раны и обеспечивают среду, способствующую закрытию раны. Степень увлажнения в ране необходимо учитывать при лечении диабетической язвы. Высокие уровни экссудата служат основанием для выбора абсорбирующего влагу материала, включая в себя без ограничения альгинаты, пены, коллагеново-альгинатные комбинации, карбоксиметилцеллюлозные материалы или марли. Низкое содержание экссудата и высушенные раны, как правило, хорошо отвечают на гидрогели. Листы гидрогеля содержат трехмерные сети поперечно-сшитых гидрофильных полимеров. Аморфные гидрогели сходны по составу с листами гидрогеля, но в них отсутствует поперечные сшивки. Гель также может содержать такие дополнительные ингредиенты, как коллагены, альгинат или сложные углеводы.

Стандартный уход за повязками для лечения язв диабетической стопы в США все еще заключается в использовании влажно-высыхающих или влажных солевых марлевых повязок. Альгинатные повязки часто содержат кальциевые или кальций-натриевые соли натуральных полисахаридов, полученных из бурых водорослей. Когда альгинатный материал приходит в контакт с насыщенными натрием раневыми экссудатами, происходит обмен ионами, давая в результате гидрофильный гель.

Дополнительные альтернативы повязок включают в себя без ограничения пленки, включая в себя пленки с адгезивной основой, гели и пены, включая в себя покрытые силиконом пены, гидроколлоиды, повязки на основе коллагена, полимеры-абсорбенты и подобное. Гидроколлоидные повязки часто содержат адгезивные, эластомерные компоненты и абсорбенты. Карбоксиметилцеллюлоза, например, представляет собой обычный абсорбирующий ингредиент. Гидроволоконная повязка также часто содержит карбоксиметилцеллюлозу, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия. Пенные повязки часто содержат полимер, часто полиуретан, с небольшими, открытыми ячейками, которые способны удерживать жидкости. Некоторые разновидности пенных повязок содержат водоотталкивающую пленку, покрывающую верхнюю поверхность, и могут содержать адгезивное покрытие на стороне контакта с раной или на краю раны. Пленочные повязки часто содержат один тонкий прозрачный лист полиуретана, нанесенного на одну сторону с помощью клея. Лист является проницаемым для газов и водяного пара, но непроницаемым для раневых жидкостей. Гидроволоконные повязки часто содержат волокна из карбоксиметил целлюлозы натрия. Повязки на основе коллагена часто содержат очищенный коллаген, полученный от коров, свиней, лошадей или птиц. Повязки на основе коллагена, как полагают, содействуют заживлению раны, например, путем стимуляции продукции фибробластов.

Согласно некоторым вариантам осуществления местное введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению предусматривает инстилляцию. Фармацевтическая композиция, содержащая фаговый коктейль согласно настоящему изобретению, может быть введена в инсталляционной устройство и/или нанесена отдельно наряду с использованием инсталляции. Инсталляция относится к введению путем постепенного введения жидкой фармацевтической композиции, например, по капле жидкости. В типичной инсталляционной терапии жидкость вводят в рану по каплям под низким положительным давлением. Устройства для применения в инстилляции включают в себя, например, инсталляционные катетеры типа Kritter (смотрите, например, Brent H. et al. 2005. Wounds 17(2):37-48). Техники, известные в настоящей области техники для улучшения инстилляции и распределения жидкости, включают в себя без ограничения заполнение раны инстилляционной жидкостью, нанесение пористого наполнителя раны и/или комбинацию с терапией раны отрицательным давлением.

Согласно некоторым вариантам осуществления местное введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению предусматривает терапию раны отрицательным давлением. Терапия раны отрицательным давлением (NPWT) относится к применению пониженного давления вблизи от раны или на другой области неинтактной кожи для увеличения и/или ускорения роста новой ткани. Терапия предусматривает контролируемое приложение субатмосферного давления к области с применением герметичной раневой повязки, соединенной с вакуумным насосом. "Терапия раны отрицательным давлением" может также называться "терапия пониженным давлением" или "вакуумная терапия". Как правило, пониженное давление прикладывают к области неинтактной кожи через пористую прокладку. Пористая прокладка будет содержать поры, способные распределять пониженное давление по области и/или образовывать каналы для отведения жидкостей.

В NPWT может использоваться ряд устройств. Устройства NPWT часто содержат вакуумный насос, систему дренажных трубок и/или набор повязок. Насос может быть стационарным или портативным, питаться от сети или на батарейках и/или в нем может быть предусмотрено регулирование силы аспирации. Наборы повязок могут содержать пенную или марлевую повязку, например, которую необходимо поместить на рану, и хирургическую салфетку с адгезивной пленкой для закрытия области. Дренажные трубки могут принимать различные конфигурации в зависимости от используемых повязок или раны, подлежащей лечению. Как только повязку герметично закрывают, можно установить вакуумный насос на подачу постоянного или периодического давлений, с уровнями, как правило, варьирующими от -125 до -75 мм рт. ст. NPWT может использоваться для введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, например, когда используемое устройство NPWT обеспечивает доставку таких жидкостей как жидкая фармацевтическая композиция. (Смотрите, например, Gerry R, et al. 2007. Ann Plast Surg 59(1):58-62).

Способы введения, описанные в настоящем документе и/или известные в настоящей области техники, можно использовать для доставки необходимых дозировок фаговых коктейлей согласно настоящему изобретению и в соответствии с подходящими режимами дозирования. Дозировки и режимы дозирования могут варьировать в зависимости от конкретного состава, пути введения, состояния подлежащего лечению, и других факторов. Эксперименты на животных могут предоставить надежное руководство для определения эффективной дозы в терапии людей, например, что находится в пределах компетенции врача. Межвидовое приведение эффективных доз может быть проведено специалистом в настоящей области техники согласно принципам, описанным, например, Mordenti, J. et al. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" в Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp 42-96.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в соответствии с режимом дозирования. При лечении хронических язв и инфекций диабетической стопы, например, включая в себя без ограничения лечение кожных язв, связанных с ними, первому режиму дозирования могут следовать вначале, например, во время фазы индукции, а второму режиму дозирования могут следовать после, например, во время фазы поддержания дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления режиму дозирования фазы индукции следуют в течение первых приблизительно 12 часов лечения, или в течение первых приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 36 часов или приблизительно 48 часов. Согласно предпочтительным вариантам осуществления режим дозирования фазы индукции предусматривает введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению приблизительно каждый час, приблизительно каждые 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов или 12 часов. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления режим дозирования фазы индукции предусматривает введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению приблизительно каждые 4 часа или приблизительно каждые 6 часов, например, в течение первых 24 часов. Согласно даже более предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят местно в соответствии с режимом дозирования фазы индукции.

Согласно некоторым вариантам осуществления за фазой индукции следует фаза поддержания дозы, например, когда могут соблюдать различный режим дозирования. Фаза поддержания дозы может продолжаться в течение нескольких дней, недель, месяцев или дольше, после начального лечения. Согласно некоторым вариантам осуществления фаза поддержания дозы продолжается в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней после фазы индукции. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят в течение 2, 3 или 4 недель; 2, 4, 6, 8, 10 или 12 месяцев; или 2, 3, 4, 5 или больше лет. Согласно еще некоторым вариантам осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят хронически, например, в течение нескольких лет или в течение жизни пациента.

Согласно некоторым вариантам осуществления режим дозирования фазы поддержания дозы предусматривает введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению с более низкой частотой доз по сравнению с режимом дозирования фазы индукции. Например, согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят приблизительно каждые 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 16 часов, 20 часов, 24 часа, 30 часов, 36 часов, 42 часов или 48 часов. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления режим дозирования фазы поддержания дозы предусматривает введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению приблизительно каждые 12 часов или приблизительно каждые 24 часа, например, в течение по меньшей мере приблизительно 3 или 4 дополнительно после фазы индукции. Согласно даже более предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическую композицию вводят местно в соответствии с режимом дозирования фазы поддержания дозы.

Терапевтическое применение

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению композиций фагового коктейля в профилактике и/или лечении бактериальных инфекций. Согласно конкретным вариантам осуществления субъект, получающий фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, представляет собой млекопитающего (например, корову, овцу, козу, лошадь, примата (например, человека), грызуна, зайцеобразного или птицу (например, курицу, утку, гуся)). Согласно предпочтительным вариантам осуществления субъект, получающий фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, представляет собой человека и, в частности, пациента с сахарным диабетом, который страдает от хронических язв или подвергается риску развития хронических язв, включая в себя инфекции диабетической стопы. В контексте настоящего изобретения "лечение" относится к получению терапевтического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию. В отношении достижения терапевтического эффекта целью является устранить, уменьшить, справиться, уменьшить тяжесть, предотвратить ухудшение, улучшить или замедлить прогрессирование симптомов или первопричины (например, бактериальной инфекции), связанных с патологическим состоянием или нарушением. Оно также может подразумевать, что фаговые коктейли согласно настоящему изобретению согласно определенным вариантам осуществления могут действовать в качестве профилактической или превентивной меры, профилактики возникновения инфекции, вызванной одной или несколькими бактериями. "Профилактика" относится к получению профилактического эффекта у субъекта, получающего фармацевтическую композицию. В отношении достижения профилактического эффекта целью является замедлить или предотвратить симптомы или первопричину (например, бактериальную инфекцию), связанные с патологическим состоянием или нарушением.

Фаговые коктейли согласно настоящему изобретению характеризуются активностью против многочисленных бактериальных штаммов. Согласно предпочтительным вариантам осуществления фаговые коктейли характеризуются активностью против многочисленных штаммов A. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus. Соответственно, другой аспект настоящего изобретения предусматривает способы лечения и/или профилактики инфекций, связанных с A. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus, как у людей, так и у животных с применением композиции фагового коктейля. Согласно другим аспектам настоящее изобретение предусматривает способы лечения и/или профилактики инфекций, связанных с родственными видами или штаммами указанных бактерий. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, связанную с такими инфекциями нижней конечности больных сахарным диабетом, как инфекции диабетической стопы.

A. baumannii, P. aeruginosa и S. aureus ответственны за многие тяжелые оппортунистические инфекции, особенно у лиц с ослабленной иммунной системой, включая в себя пациентов с сахарным диабетом. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предусмотрены для лечения и/или профилактики любой инфекции, связанной с A. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus, или связанной с другими видами или штаммами бактерий, включая в себя без ограничения инфекции кожи, инфекции в ране и вокруг нее, хронические язвы, язвы, связанные с ожоговыми ранами, послеоперационные инфекции, инфекции, связанные с катетерами и дренажными трубками, и инфекции крови. Согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению находят применение в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций, связанных с областями неинтактной кожи. Инфекции, связанные с областями неинтактной кожи включают в себя без ограничения инфекции, связанные с кожными язвами, такими как язвы диабетической стопы, кожные поражения, пузырьки, кисты, буллезное поражение, волдыри, такие открытые кожные поражения, как пролежни и другие намины, хронические язвы, воспаление подкожной клетчатки и повреждения кожи, связанные с ним, рожистое воспаление и поражения, связанные с ним, раны, ожоги и раны, связанные с ними, карбункулы, или другие состояния, при которых кожа повреждается, разрывается, трескается, нарушается целостность кожи и/или иным образом подвергается повреждению.

Согласно особенно предпочтительным вариантам осуществления композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению находят применение в лечении хронических язв. Хронические язвы могут возникать из ран, вызванных различными факторами, особенно у пациентов с ослабленным кровообращением, например, вызванным проблемами с сердечно-сосудистой системой или внешним давлением кровати или кресла-каталки. Ежегодно только в США хронические кожные язвы диагностируются более чем у 8 миллионов пациентов (Harsha, A. et al., 2008, Journal of Molecular Medicine, 86(8): 961-969), что обходится больше чем в 10 миллиардов долларов в год (Margolis, DJ, et al., 2002, Journal of the American Academy of Dermatology 46(3): 381-386). Хронические язвы могут развиваться во рту, глотке, желудке и на коже. Хронические кожные язвы включают в себя диабетические язвы, венозные язвы, лучевые язвы и пролежневые язвы, из которых тремя основными категориями хронических кожных язв являются диабетические язвы, трофические язвы и пролежневые язвы. Хронические язвы могут вызывать утрату целостности больших участков кожи, приводя даже к заболеваемости и смертности.

Согласно даже более конкретным предпочтительным вариантам осуществления композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению находят применение в лечении таких инфекций нижней конечности у пациентов с сахарным диабетом, как инфекции диабетической стопы. Инфекция диабетической стопы представляет собой одно из основных осложнений сахарного диабета, возникающее приблизительно у 15% всех пациентов с сахарным диабетом и приводящее приблизительно в 85% к полной ампутации голени. (Brem, et al., J. Clinical Invest., 2007, 117(5):1219-1222). Сахарный диабет препятствует нормальным стадиям процесса заживления раны так, что инфекции диабетической стопы могут приводить к незаживающим, хроническим кожным язвам.

Хроническая рана представляет собой утрату нормальных процессов заживления острой раны. Заживление раны традиционно делили на три различных фазы: воспаление, пролиферация и ремоделирование. Фаза воспаления в заживлении раны начинается во время повреждения путем формирования сгустка посредством тромбоцитарной пробки, тем самым инициируя ответ нейтрофилов и макрофагов. Нейтрофилы вначале очищают рану от бактерий и детрита путем высвобождения разнообразных протеаз и реакционноспособных свободных кислородных радикалов. Макрофаги затем привлекаются к месту раны с помощью хемоаттрактантов и впоследствии высвобождают свои собственные хемоаттрактанты для стимуляции фибробластов и большего количества макрофагов. Во время фазы пролиферации фибробласты инициируют эпителизацию, ангиогенез и синтез коллагена. Эпителизация, как правило, начинается с базальной мембраны, если она остается интактной, и с краев раны, если она не интактна. Фибробласты синтезируют коллаген III типа во время этой фазы и трансформируются в миофибробласты, которые помогают стимулировать закрытие раны. Во время фазы ремоделирования коллаген III типа начинает замещаться коллагеном I типа. Коллаген сплетается в организованную, поперечно-сшитую сеть, чья сила достигает 80% от исходной неповрежденной ткани.

Существует много факторов, которые могут препятствовать трехфазному процессу заживления и превращать острую рану в хроническую. Они могут включать в себя низкую пролиферативную способность фибробластов, отрицательную регуляцию рецепторов, сниженное содержание факторов роста или отсутствие подходящей белкового матрикса в дерме. Кроме того, слабое кровоснабжение и/или питание могут вызывать задержку раны в фазе воспаления и приводить к чрезмерному накоплению экссудата в ране. Хроническая язва может рассматриваться незаживающей областью неинтактной кожи, такой как область неинтактной кожи, которая не проходит нормальные процессы заживления раны, например, описанные выше, и/или которая не отвечает или не отвечает адекватно на начальное лечение. Хроническая язва на коже может быть охарактеризована как раневое поражение, длящееся больше четырех недель без заметной тенденции к заживлению, или как часто рецидивирующая рана (Fonder, M. et al., 2012, Journal of the American Academy of Dermatology 58(2): 185-206). Хронические раны могут появляться с красной грануляцией и желтым гноем, темно-пурпурной кожей вкруг зернистых тканей или серо-белой и набухшей грануляцией. Стандартные процедуры ухода для хронической кожной язвы включают в себя, например, следующее: удаление некротической или инфицированной ткани; установление адекватного кровообращения; поддержание влажной раневой среды; лечение раневой инфекции; очищение раны; и нутритивная поддержка, включая в себя контроль содержания глюкозы в крови для субъектов с диабетическими язвами. Например, у пациента с сахарным диабетом слабый контроль содержания глюкозы в крови обеспечивает более быстрый рост бактерий в ране; более того, нейронная дегенерация при диабете представляет собой состояние, которое может не быть болезненным и, таким образом, оно протекает необнаруженным, по меньшей мере на начальных стадиях. Хронические язвы, включая в себя язвы диабетической стопы, часто дополнительно инфицируется оппортунистическими бактериями, приводящими к обострению состояния. A. baumannii, P. aeruginosa и S. aureus связаны с такими инфекциями.

A. baumannii, P. aeruginosa и S. aureus также связаны с инфекциями, которые охватывают системы органов, которые характеризуются высоким содержанием жидкостей, и предусмотрено, что фаговые коктейли согласно настоящему изобретению характеризуются терапевтическим и/или профилактическим применением в отношении таких инфекций. Например, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут использоваться для профилактики или лечение инфекций респираторного тракта, спинномозговой жидкости, перитонеальной жидкости и мочевыводящих путей. Композиции согласно настоящему изобретению также можно использовать для профилактики и/или лечения госпитальной пневмонии, инфекций, связанных с хроническим перитонеальным диализом в амбулаторных условиях (CAPD), связанной с катетерами бактериемии и госпитального менингита. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению используется профилактически, например, в условиях стационара. Например, композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению может находить применение в профилактике инфекций, связанных с ранами или поврежденной кожей, например, вследствие катетеризации и любых других медицинских процедур или устройств.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в способах лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, вызванных A. baumannii, Р. aeruginosa и/или S. aureus. Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в способах лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, вызванных A. baumannii, P. aeruginosa и S. aureus. Согласно некоторым другим вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в способах лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, вызванных бактериями, отличными от A. baumannii, Р. aeruginosa и/или S. aureus.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для применения в способах лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, вызванных таким видом Staphylococcus, как S. aureus; таким видом Pseudomonas, как P. aeruginosa и таким видом Acinetobacter, как A. baumannii. Согласно некоторым таким вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит композицию коктейля, содержащую бактериофаг, характеризующийся геномом, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID ΝΟ: 1, 2, 3, 4 и 5 или их варианта, такой как выделенные штаммы бактериофага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05 или их варианты. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления фармацевтическая композиция коктейля применяется в лечении, профилактике, контроле и/или ведении таких хронических язв, как инфекции диабетической стопы и связанные с ними кожные язвы.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения и/или профилактики хронических язв, предусматривающие введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительным вариантам осуществления введение предусматривает местное введение на область неинтактной кожи, связанную с хронической язвой. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления местное введение следует за иссечением нежизнеспособных тканей области, подлежащей лечению.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения и/или профилактики инфекций диабетической стопы, предусматривающие введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительным вариантам осуществления введение предусматривает местное введение на область неинтактной кожи, связанную с инфекцией диабетической стопы, например, кожной язвой. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления местное введение следует за иссечением нежизнеспособных тканей области, подлежащей лечению.

Иссечение нежизнеспособных тканей может осуществляться с помощью ряда подходов. Хирургическое иссечение нежизнеспособных тканей предусматривает удаление мертвых тканей раны или другой области неинтактной кожи. Механическое иссечение нежизнеспособных тканей используется различные способы для разрыхления и удаления раневого детрита, такие как устройство промывания под давлением, вихревая водная ванна или специализированные повязки. Аутолитическое удаление нежизнеспособных тканей усиливает естественные процесс организма в рекрутинге ферментов для разрушения мертвой ткани, например, с применением соответствующей повязки, которая сохраняет рану влажной и чистой. Ферментативное удаление нежизнеспособных тканей использует химические ферменты и соответствующие повязки для дополнительного содействия в разрушении мертвых тканей в месте раны или другой области неинтактной кожи.

Иссечение нежизнеспособных тканей улучшает местное лечение, поскольку оно снижает бионагрузку присутствующих бактерий, а также открывает зависимый от времени терапевтический диапазон для местной антибактериальной терапии (TAT) (Wolcott RD, et al. 2010. J Wound Care 19:320-328). В отношении времени иссечения нежизнеспособных тканей, раннее или немедленное иссечение нежизнеспособных тканей является предпочтительным по сравнению с отсроченным иссечением нежизнеспособных тканей, как только эта возможность лечения выбрана в ведении раны. Более того, могут быть назначены многократные иссечения нежизнеспособных тканей во время ведения раны (Wolcott RD, et al. 2009. J Wound Care 18(2):54-6). Например, согласно некоторым вариантам осуществления иссечение нежизнеспособных тканей предшествует местному нанесению композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению, и его повторяют перед каждым введением композиции коктейля. Согласно некоторым вариантам осуществления иссечение нежизнеспособных тканей проводят только перед каждым вторым введением композиции коктейля или только перед каждым 3им, 4ым, 5ым или 6ым введением композиции коктейля. Согласно некоторым вариантам осуществления независимо от того, проводят ли иссечение нежизнеспособных тканей раны перед местным введением композиции коктейля согласно настоящему изобретению, это находится в пределах клинической оценки, проводимой медицинским работником, проводящим лечение, например, лечащего врача, фельдшера или персонала экстренной медицинской помощи.

Композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению могут находить применение в лечении, ведении, контроле и/или профилактике инфекций, связанных с хроническими язвами, включая в себя инфекции диабетической стопы и кожные язвы, связанные с ними. Согласно другим вариантам осуществления композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению находят применение в лечении, ведении, контроле и/или профилактике бактериальных инфекций, связанные с другими областями неинтактной кожи, такими как воспаление подкожной клетчатки, рожистое поражение, пролежень, ожоговая рана и намин. Согласно некоторым таким вариантам осуществления используемая композиция может представлять собой местную композицию, составленную для местного введения, например, для непосредственного нанесения на область неинтактной кожи, как описано выше.

Композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению также находят применение в лечении, ведении, контроле и/или профилактике пролежней. Пролежни, также называемые намины или пролежневые язвы, представляют собой повреждения кожи и нижележащих тканей в результате длительного давления на данную область. Например, пролежни чаще всего развиваются на коже, которая покрывает костные области тела, такие как пятки, щиколотки, бедра или ягодицы.

Пролежни попадают в одну из четырех стадий на основании их тяжести. Стадия I представляет собой начальную стадию намина, при этом кожа все еще остается интактной. Кожа может становиться красной, пепельной, голубоватой или пурпурной, и не белеет при прикосновении. Стадия II часто включает в себя открытую рану неинтактной кожи. На этой стадии верхний слой кожи (эпидермис) и часть нижележащего слоя кожи (дермы) повреждаются или утрачиваются. Язва может иметь вид поверхностной, розовато-красной раной в форме чаши. На стадии III язва представляет собой глубокую рану, где потеря кожи может обнажать некоторое количество жировой клетчатки, и язва характеризуется кратероподобным внешним видом. Дно раны также может содержать некоторое количество желтоватой мертвой ткани (отторгающиеся некротические массы). На стадии IV язва проявляет обширную утрату ткани, где рана может обнажать мышцу, кость и сухожилия. Дно раны будет вероятно содержать отторгающиеся некротические массы или темную, грубую, мертвую ткань (струп).

Как и при лечении язв диабетической стопы, иссечение нежизнеспособных тканей можно использовать для удаления поврежденной, мертвой или инфицированной ткани из раны, облегчая правильное заживление, например, как описано в настоящем документе и/или известно в настоящей области техники. Согласно некоторым вариантам осуществления введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению следует за иссечением нежизнеспособных тканей. Например, фармацевтическая композиция, содержащая фаговый коктейль, раскрытый в настоящем документе, может быть введена местно на пролежень после хирургического, механического, аутолитического или ферментативного удаления нежизнеспособных тканей из него.

Композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению также находят применение в лечении, ведении, контроле и/или профилактике воспаления подкожной клетчатки и/или рожистого воспаления, включая в себя без ограничения кожные воспаления и поражения, связанные с воспалением подкожной клетчатки и рожистым воспалением. Воспаление подкожной клетчатки и рожистое воспаление представляют собой кожные инфекции, которые развиваются в результате проникновения бактерий через бреши в защитном барьере кожи. Например, трещины на коже, порезы, волдыри, ожоги, укусы насекомых, укусы пауков, татуировки, хирургические раны, внутривенная инъекция лекарственных препаратов или места введения внутривенных катетеров могут представлять пути проникновения для бактерий. Streptococcus и Staphylococcus группы А представляют собой наиболее распространенные бактерии, вовлеченные в воспаление подкожной клетчатки. Воспаление подкожной клетчатки чаще всего наблюдается среди лиц среднего и пожилого возраста, в то время как рожистое воспаление возникает у детей младшего возраста и пожилых людей (Ellis Simonsen SM et al. 2006. Epidemiol Infect. 134(2):293; и Eriksson B. et al. 1996 Clin Infect Dis 23:1091). Кроме того, люди с иммунодефицитом, диабетом, алкоголизмом, грибковыми инфекциями и ослабленным оттоком лимфы подвергаются риску их появления. Пациенты с сахарным диабетом особенно подвергнуты воспалению подкожной клетчатки на стопах, поскольку заболевание вызывает ослабление кровообращения в ногах. Нижние конечности представляют собой наиболее частое место инфекции как для рожистого воспаления, так и воспаления подкожной клетчатки (Ellis Simonsen SM et al. 2006. Epidemiol Infect. 134(2):293; Charrier С et al 1996 Int J Dermatol 35:779).

Воспаление подкожной клетчатки и рожистое воспаление часто сосуществуют и, как правило, проявляются как области эритемы кожи, отека и жара. Они отличаются в том, что рожистое воспаление охватывает верхнюю дерму и поверхностные лимфатические сосуды, тогда как воспаление подкожной клетчатки охватывает более глубокую дерму и подкожную жировую клетчатку. Соответственно, рожистое воспаление имеет больше отличительных анатомических признаков, чем воспаление подкожной клетчатки - рожистые поражения могут подниматься выше уровня окружающей кожи с явной линией раздела между вовлеченной и невовлеченной тканью (Bisno AL et al. 1996 N Engl J Med 334:240). Поражение может становиться красным, набухшим, теплым, затвердевшим и/или принимать вид сыпи, аналогичной по консистенции с апельсиновой кожурой. Рожистое воспаление может появляться на лице, например, с рисунком в виде "бабочки". Более тяжелые инфекции могут приводить к волдырям, буллезному поражению и петехии, с возможным некрозом кожи. Кроме того, пациенты с рожистым воспалением обычно характеризуются острым появлением симптомов с системными проявлениями, включая в себя лихорадку и озноб.

Пациенты с воспалением подкожной клетчатки обычно характеризуются более постепенным течением развития с симптомами, возникающими в течение нескольких дней. Различные формы воспаления подкожной клетчатки включают в себя периорбитальное воспаление подкожной клетчатки, воспаление подкожной клетчатки брюшной стенки (у страдающих болезненным ожирением лиц), буккальное воспаление подкожной клетчатки (вызванное Streptococcus pneumoniae), гнилостно-некротическую флегмону дна рта (воспаление подкожной клетчатки в поднижнечелюстном пространстве) и перианальное воспаление подкожной клетчатки (вызванное группой А бета-гемолитического стрептококка) (Barzilai A, et al, 1998 Pediatr Infect Dis J. 17(4):358; Thorsteinsdottir B, et al. 2005 Scand J Infect Dis. 37(8):605). Воспаление подкожной клетчатки также может приводит к напоминающим грипп симптомам в высокими значениями температуры и лихорадкой.

Согласно некоторым вариантам осуществления лечение воспаления подкожной клетчатки или рожистого воспаления дополнительно предусматривает введение антибиотика. Например, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена местно на рожистое поражение в комбинации с антибиотиком, выбранным из группы, состоящей из пенициллина, клиндамицина и эритромицина. В качестве другого примера фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена местно на кожное поражение, связанное с воспалением подкожной клетчатки, в комбинации с антибиотиком, выбранным из группы, состоящей из флуклоксацина, диклоксациллина, пенициллинов, ампициллина и амоксициллина. Антибиотик может быть введен перорально, внутривенно или местно, например, вместе с местным введением коктейля согласно настоящему изобретению.

Композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению также находят применение в лечении, ведении, контроле и/или профилактике инфекций, связанных с ожоговыми ранами. Ожоговая рана представляет собой любую область неинтактной кожи, вызванную, напрямую или опосредованно, ожогом. Ожог представляет собой тип повреждения кожи, который может быть вызван тепловым воздействием, а также электричеством, химическими средствами, светом, облучением или трением. Ожоги могут поражать только кожу (эпидермальную ткань), но в некоторых случаях также повреждают более глубокие ткани, такие как мышцу, кость и кровеносные сосуды. Ожоги можно классифицировать по механизму повреждения, глубине, распространению и связанным повреждениям и сопутствующим заболеваниям. Ожоги традиционно описывают на основании глубины повреждения дермы, в общих чертах классифицируя как ожоги первой, второй, третьей и четвертой степени. Walls et al., 2009, Rosen's Emergency Medicine: Expert Consult Premium Edition (Rosen's Emergency Medicine: Concepts & Clinical Practice (2v). Важные характеристики ожоговой раны включают в себя ее причину (термическую, химическую, электрическую), анатомическое положение, глубину (полная или неполная толщина), длительность и величина (процент общей площади поверхности тела). Характеристики пациента, которые влияют на заживление ожоговой раны, включают в себя возраст, пищевой статус, фоновые заболевания и сопутствующее повреждение (например, травма головы, повреждение при отравлении дымом, переломы костей).

Инфекции среди пациентов с ожогами являются основной проблемой с зарегистрированной частотой возникновения госпитальных инфекций, варьирующей от 63-240 на 100 пациентов до 53-93 на 1000 пациентов в день, в основном, в зависимости от используемых критериев определения (Chim H, et al, 2007, Burns 33:1008-1014; и Wibbenmeyer L, et al., 2006, J Burn Care Res 27:152-60). Более того, бактериальная инфекция ожоговых ран связана с неблагоприятными исходами и смертностью. В серии из 175 пациентов с тяжелыми ожогами, например, у 83% пациентов инфекции предшествовали мультиорганной дисфункции и считались прямой причиной смерти 36% пациентов, которые не выжили (Fitzwater J, et al., 2003, J Trauma 54:959-66). Ожоговые раны могут инфицироваться из многочисленных источников. Ожоговые раны могут изначально инфицироваться грам положительными бактериями, в основном, стафилококками, которые представляют собой обычных глубоких обитателей потовых желез и волосяных луковиц, которые поражаются при ожоге (Sharma BR., 2007, Infect Dis Clin North Am 21:745-59; ix). Влажный, васкулярный ожоговый струп дополнительно может благоприятствовать росту микроорганизмов. Грамотрицательные бактериальные инфекции могут являться результатом переноса из кишечника, например, вследствие сниженного мезентериального кровотока во время ожога и последующих повреждений (Herndon DN, et al., 2000, Crit Care Med 28:1682-3). Кроме того, у пациентов с ожогами могут развиваться иммунные дефициты, включая в себя ослабленный ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, остановка созревания костного мозга, ведущая к нейтропении, ослабленная функция нейтрофилов и сниженная продукция макрофагов (Sharma BR., 2007, Infect Dis Clin North Am 21:745-59, ix; Gamelli RL, et al., 2000, J Burn Care Rehabil 21:64-9; Hunt JP, et al., 1998, J Surg Res 80:243-51; и Shoup M, et al., 1998, Ann Surg 228:112-22). В конце концов, пациенты с ожогами чувствительны к госпитальным инфекциям, свойственным другим пациентам в блоках интенсивной терапии, включая в себя связанные с внутривенными катетерами инфекции и ИВЛ-ассоциированную пневмонию, с более высокой общей частотой возникновения инфекции, чем таковая у других пациентов в блоках интенсивной терапии (Chim H, et al., 2007, Burns 33:1008-14; и Wibbenmeyer L, et al., 2006, J Burn Care Res 27:152-60). Фактически, большинство случаев инфекций крови у пациентов с ожогами после первой недели вызваны госпитальными мультирезистентными бактериями (Wibbenmeyer L, et al., 2006, J Burn Care Res 27:152-60; и Ressner RA, et al., 2008, J Am Coll Surg 206:439-44).

Традиционное лечение ожогов включает в себя удаление и иссечение нежизнеспособных тканей, наложение повязок на рану, ушивание раны, пересадку кожи, жидкостная реанимация, ведение раневой инфекции, например, введение антибиотиков, контроль боли, нутритивную поддержку и/или меры для ингибирования формирования избыточного рубца. Ожог можно покрыть чистым и сухим листом или повязкой (такой как пластиковая пленка). Раннее охлаждение холодной водой в течение 30 минут после ожога, снижает глубину ожога и боль. Иссечение нежизнеспособных тканей, очистка и наложение повязок являются важными аспектами ухода за ожоговой раной.

Согласно некоторым вариантам осуществления лечение ожоговой раны дополнительно предусматривает введение антибиотика. Было показано, что антибиотикопрофилактика может снизить смертность, бактериемию и ИВЛ-ассоциированную пневмонию у пациентов в блоках интенсивной терапии (Silvestri L, et al, 2007, J Hosp Infect 65:187-203; и De Smet AM, et al., 2009, N Engl J Med 360:20-31). У пациентов с ожогами кожа представляет собой дополнительный источник инфекции (Avni Τ, et al., 2010, BMJ 340: c241). Согласно некоторым вариантам осуществления лечение ожоговой раны дополнительно предусматривает введение средства для контроля боли. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена местно на ожоговую рану в комбинации с обезболивающим средством, выбранным из группы, состоящей из простого анальгетика, ибупрофена, ацетаминофена и наркотического средства. Антибиотик и/или обезболивающее средство могут быть введены перорально, внутривенно или местно, например, наряду с местным введением коктейля согласно настоящему изобретению. Один или несколько других аспектов традиционного лечения ожогов также можно использовать в комбинации с композицией фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам осуществления обезболивающее средство для применения в комбинации с композицией фагового коктейля согласно настоящему изобретению включает в себя одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из следующего: парацетамол (ацетаминофен), нестероидное противовоспалительное лекарственное средство, ибупрофен, кетопрофен, пироксикам, гирокодон, морфин, гидроморфин, оксиморфон, фентанил, оксикодон, диаморфин, метадон, бупренорфин, меперидин, пентазоцин, дексотроморамид, дипипанон, амитриптилин, дилаудид, тапентадол и метадон. Обезболивающее средство может включать в себя любое другое обезболивающее средство, описанное в настоящем документе и/или известное в настоящей области техники.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления обезболивающее средство представляет собой средство, которое может быть нанесено местно, такое как местноанестезирующее средство. Местноанестезирующее средство представляет собой местноанестезирующее средство, которое используется, чтобы вызвать онемение поверхности части тела, например, любой области кожи, передней области глазного яблока, внутренней части носа, уха или глотки, ануса или области гениталий. Согласно некоторым вариантам осуществления обезболивающее средство для применения в комбинации с композицией фагового коктейля согласно настоящему изобретению включает в себя одно или несколько местноанестезирующих средств, выбранных из группы, состоящей из бензокаина, бутамбена, дибукаина, лидокаина, оксибупрокаина, прамоксина, прилокаина, пропаракаина, проксиметакаина и тетракаина (аметокаина). Местноанестетзирующие средства доступны в форме кремов, мазей, аэрозолей, спреев, лосьонов и гелеобразных средств. Согласно дополнительным вариантам осуществления местноанестезирующее средство можно использовать с одним или несколькими дополнительными обезболивающими средствами, такими как другое местноанестезирующее средство, или другим обезболивающим средством, таким как любое(ые) другое(ие) средство(а) для обезболивания, описанное(ые) в настоящем документе и/или известное(ые) в настоящей области техники.

Композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению будут содержать терапевтически и/или профилактически эффективное количество одного из нескольких штаммов фага, описанных в настоящем документе. Терапевтически и/или профилактически эффективное количество относится к количеству, необходимому, чтобы привести приблизительно к терапевтическому и/или профилактическому эффекту соответственно, у субъекта, получающего указанное количество. Терапевтически и/или профилактически эффективное количество будет зависеть от конкретного состава, пути введения, состояния, подлежащего лечению, используются ли другие средства или виды терапии в комбинации со способами согласно настоящему изобретению, и других факторов.

Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению составляют в виде фармацевтических композиций для применения в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций, связанных с областями неинтактной кожи. Терапевтически и/или профилактически эффективное количество будет зависеть от площади неинтактной кожи, и фармацевтические композиции могут быть составлены, чтобы это отражать. Например, согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит штаммы фага, причем каждый присутствует в количестве, соответствующем приблизительно 103 - приблизительно 1013 фаговых частиц/см2 указанной площади. Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления терапевтическое и/или профилактическое количество может соответствовать по меньшей мере приблизительно 104, по меньшей мере приблизительно 105, по меньшей мере приблизительно 106, по меньшей мере приблизительно 107, по меньшей мере приблизительно 108, или по меньшей мере приблизительно 109 фаговых частиц/см2 площади неинтактной кожи, подлежащей лечению. Согласно некоторым более предпочтительным вариантам осуществления терапевтическое и/или профилактическое количество может соответствовать меньше чем приблизительно 1013, меньше чем приблизительно 1012, меньше чем приблизительно 1011, меньше чем приблизительно 1010, меньше чем приблизительно 109, или меньше чем приблизительно 108 фаговых частиц/см2 площади неинтактной кожи, подлежащей лечению. Согласно более предпочтительным вариантам осуществления каждый штамм фага присутствует в фармацевтической композиции в количестве, соответствующем 107-109 фаговых частиц/см2 площади неинтактной кожи.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению приводит к улучшенному закрытию раны, например, к сокращению площади неинтактной кожи (раневой площади) по сравнению с площадью перед началом лечения. Раневая площадь может быть выражена как процентное отношение начальной раневой площади, в одной или нескольких временных точках после начала лечения. Например, согласно предпочтительным вариантам осуществления раневая площадь уменьшается по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%; или по меньшей мере приблизительно на 90% в течение курса лечения с помощью композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления уменьшение раневой площади происходит по меньшей мере в 1 день после начала лечения (ti), на 2 день после начала лечения (t2), на 3 день после начала лечения (t3), на 4 день после начала лечения (t4), на 5 день после начала лечения (t5), на 6 день после начала лечения (t6), на 7 день после начала лечения (t7), на 8 день после начала лечения (t8), на 9 день после начала лечения (t9), на 10 день после начала лечения (t10), на 12 день после начала лечения (t12), на 15 день после начала лечения (t15), на 20 день после начала лечения (t20), на 25 день после начала лечения (t25) или на 30 день после начала лечения (t30). Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления раневая площадь уменьшается на приблизительно 30% - приблизительно 40% по меньшей мере на 9 день после начала лечения (t9). Согласно дополнительному особенно предпочтительному варианту осуществления раневая площадь уменьшается на приблизительно 40% - приблизительно 50%, по меньшей мере на 9 день после начала лечения (t9). Согласно дополнительному особенно предпочтительному варианту осуществления раневая площадь уменьшается на приблизительно 50% - приблизительно 60%, по меньшей мере на 9 день после начала лечения (t9). Согласно еще более особенно предпочтительные варианту осуществления раневая площадь уменьшается на приблизительно 60% - приблизительно 70%, по меньшей мере на 9 день после начала лечения (t9).

Согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению приводит к улучшенному заживлению раны, например, к улучшению в степени язвы на основании классификации PEDIS по сравнению со степенью язвы до начала лечения. PEDIS представляет собой рутинно используемую, утвержденную систему классификации инфекций, связанных с ранами, которая была разработана Международной рабочей группой по диабетической стопе (IWGDF). IWGDF специально разработала систему классификации ран, связанных с инфекциями диабетической стопы, которая использует акроним PEDIS, который означает кровоток, площадь (размер), глубину (потерю ткани), инфекцию, чувствительность (нейропатию). Изначально классификацию была разработана как инструмент исследования (Schaper NC., 2004, Diabetes Metab Res Rev 20(Suppl 1):S90-5), и предлагает полуколичественную градацию тяжести каждой из категорий. В частности, степень PEDIS 1 соответствует отсутствию симптомов или признаков инфекции; степень 2 соответствует локальной инфекции, охватывающую только кожу и подкожную ткань (без вовлечения более глубоких тканей и без системных признаков), при этом любая сопутствующая эритема должна находиться в диапазоне 0,5 см - 2 см; степень 3 соответствует локальной инфекции, как описано для степени 2, но охватывая эритему, больше чем 2 см или охватывая структуры, глубже чем кожа и подкожные ткани (например, абсцесс, остеомиелит, септический артрит, фасциит), но без каких-либо признаков системных воспалительных реакций; и степень 4 соответствует локальной инфекции, как описано для степеней 2 и 3, но с признаками синдрома системных воспалительных реакций, что проявляется в виде больше чем двух из следующего: температура >38°С или <36°С; частота сердечных сокращений >90 ударов/мин; частота дыхания >20 вдохов/мин или парциальное давление артериального диоксида углерода <32 мм рт. ст.; и содержание лейкоцитов >12000 или <4000 клеток/мкл или ≥10% незрелых (палочкоядерных нейтрофилов) форм (смотрите, например, Lipsky, ΒΑ, et al., 2012, CID 54:el32-el73). Другая система классификации была разработана IDSA (Сообщество инфекционных заболеваний США), которая производит оценку тяжести инфекции инфицированных ран, в частности, инфекций диабетической стопы. В частности, ID SA оценивает степени PEDIS 1-4 как "неинфицированная", "слабая", "умеренная" и "тяжелая" соответственно (смотрите снова Lipsky, ΒΑ, et al., 2012, CID 54:e132-e173).

Согласно предпочтительным вариантам осуществления степень PEDIS снижается от степени 4 до степени 3, степени 2 или степени 1 в течение курса лечения с помощью композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления степень PEDIS снижается от степени 3 до степени 2 или степени 1 в течение курса лечения с помощью композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Согласно еще одним предпочтительным вариантам осуществления степень PEDIS снижается от степени 2 до степени 1 в течение курса лечения с помощью композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым конкретным вариантам осуществления снижение степени язвы происходит по меньшей мере в 1 день после начала лечения (t1), на 2 день после начала лечения (t2), на 3 день после начала лечения (t3), на 4 день после начала лечения (t4), на 5 день после начала лечения (t5), на 6 день после начала лечения (t6), на 7 день после начала лечения (t7), на 8 день после начала лечения (t8), на 9 день после начала лечения (t9), на 10 день после начала лечения (t10), на 12 день после начала лечения (t12), на 15 день после начала лечения (t15), на 20 день после начала лечения (t20), на 25 день после начала лечения (t25) или на 30 день после начала лечения (t30).

Согласно определенным вариантам осуществления композиция фагового коктейля согласно настоящему изобретению используется в качестве единственного средства для лечения или профилактики инфекций, вызванных A. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus, таких как инфекции диабетической стопы. Согласно другим вариантам осуществления фаговый коктейль согласно настоящему изобретению используется в дополнительной комбинации с другими средствами, включая в себя другие бактериофаги (например, которые нацеленно воздействуют на другой вид или штамм бактерий, вовлеченных в инфекции диабетической стопы), или с антибиотиками, которые нацеленно воздействуют на такие же или другие виды бактерий, включая в себя бактерии, выбранные из любых грамположительных бактерий, любых грамотрицательных бактерий и любых других групп бактерий, которые не классифицируются как грамположительные или грамотрицательные. Композиции согласно настоящему изобретению также могут использоваться в комбинации с любыми другими средствами лечения бактериальной инфекции, известными специалисту в настоящей области техники, в частности, любыми другими средствами лечения язв диабетической стопы.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиция коктейля согласно настоящему изобретению используется в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным штаммом фага против того же или других видов бактерий. Согласно предпочтительным вариантам осуществления композиция коктейля согласно настоящему изобретению используется в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным штаммом фага, выбранным из группы, состоящей из штамма бактериофага F168/08, характеризующегося антибиотической активностью против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium (как раскрыто в международной патентной публикации № WO 2011/065854 и публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F170/08, характеризующегося антибиотической активностью против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium (как раскрыто в международной патентной публикации № WO 2011/065854 и публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F197/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F86/06, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F87s/06, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F91a/06, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus (как раскрыто в публикации заявки на выдачу патента США №2012/0052048), штамма бактериофага F391/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Klebsiella pneumoniae (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/384015), штамма бактериофага F394/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Acinetobacter baumannii (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/38401), штамма бактериофага F488/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Escherichia coli (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/38401), и штамма бактериофага F387/08, характеризующегося антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Klebsiella pneumoniae (как раскрыто в предварительной заявке на выдачу патента США №61/384015) (содержания каждой из них полностью включены в настоящий документ посредством ссылки). Содержания предварительной заявки на выдачу патента США №61/384015, поданной 17 сентября 2010 г. и международной заявки РСТ/РТ2011/000031, поданной 19 сентября 2011 г. также полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Используемый в настоящем документе термин "в комбинации" или "в дополнительной комбинации" или "дополнительно в комбинации" относится к применению дополнительного профилактического и/или терапевтического средства, а также фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Использование термина "в комбинации" не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические средства вводят субъекту. Первое профилактическое или терапевтическое средство можно вводить перед (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 1 неделю, 2 неделю, 3 неделю, 4 неделю, 5 неделю, 6 недель, 8 недель или 12 недель до), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недели, 6 недели, 8 недели или 12 недель после) введения второго профилактического или терапевтического средства (отличного от первого профилактического или терапевтического средства) субъекту.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения и/или профилактики инфекций диабетической стопы, предусматривающие введение фагового коктейля согласно настоящему изобретению в комбинации со стандартной и/или нестандартной терапией для инфекций диабетической стопы. Стандартные виды терапии инфекций диабетической стопы, включая в себя без ограничения кожные язвы, связанные с ними, включают в себя заместительную терапию внеклеточным матриксом, влажную терапию раны, терапию раны отрицательным давлением, терапию путем артериальной реваскуляризации, гипербарическую оксигенотерапию, введение антибиотика и введение фактора роста (Blume et al. 2008 Diabetes Care 31: 631-636).

Согласно некоторым вариантам осуществления композицию фагового коктейля согласно настоящему изобретению вводят местно, например, на место язвы диабетической стопы, при этом дополнительное средство вводят системно. Например, согласно предпочтительным вариантам осуществления композицию фагового коктейля согласно настоящему изобретению вводят местно, например, на место язвы диабетической стопы, тогда как антибиотик вводят системно. Согласно еще более предпочтительным вариантам осуществления, предусматривающим лечение язвы диабетической стопы, системно введенный антибиотик характеризуется антибактериальной активностью против А. baumannii, P. aeruginosa и/или S. aureus. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию фагового коктейля согласно настоящему изобретению вводят местно, например, на место язвы диабетической стопы, наряду с дополнительным средством, также вводимым местно. Например, согласно предпочтительным вариантам осуществления фармацевтическую композицию фагового коктейля согласно настоящему изобретению вводят местно вместе с фактором роста, например, на место язвы диабетической стопы.

Терапия с помощью внеклеточного матрикса используется в лечении, ведении, контроле и/или профилактике незаживающих областей неинтактной кожи и представляет собой стандартную терапию для язв диабетической стопы. Синтез внеклеточного матрикса (ЕСМ) представляет собой ключевой признак в заживлении раны, особенно когда наблюдалась значительная потеря ткани. Терапию с помощью внеклеточного матрикса разрабатывают для снижения содержания протеаз в раневых жидкостях путем обеспечения конкурентного субстрата (коллагена) для протеаз, тем самым снижая протеолитическое разрушение необходимых компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ) и стимулирует заживление. Например, терапия ЕСМ может предусматривать введение средств, которые снижают протеолитическое разрушение фибронектина и/или тромбоцитарных факторов роста (PDGF); а также снижают синтез металлопротеиназ матрикса (ММР), таких как смесь катионов металлов. Терапия ЕСМ также может предусматривать введение амелогенина, белка ЕСМ с биологической активностью в регенерации и восстановлении кожи (Romanelli M. 2010 Wounds - Clinical Review 6(2):47-52).

Терапия ЕСМ также может предусматривать применение биоконструкционной ткани, например, для замещения утраченного ЕСМ. Биоконструкционные ткани, также называемые "замещающие кожу продукты" или "заместители кожи", часто содержат биологический матрицы, с живыми клетками или без них (Brian DL et al. 2011. Expert Rev Dermatol. 6(3):255-262). Большинство биоконструкционных тканей можно разделить на заместители живой ткани и биоактивные вспомогательные средства. Биоконструкционная ткань может выглядеть как тонкий, круглый кусочек настоящей кожи и может быть помещена непосредственно на область неинтактной кожи. Наряду с тем, что точный механизм заживление не полностью понятен, полагают, что биоконструкционные ткани улучшают заживление путем заполнения раны белками внеклеточного матрикса, а также, возможно, экспрессируя дополнительные факторы роста и цитокины, которые облегчают заживление. Конкретные примеры биоконструкционных тканях, используемых в лечении язв диабетической стопы, включают в себя Apligraf и Dermagraft, которые являются коммерчески доступными.

Терапия путем артериальной реваскуляризации (ART) также используется в лечении, ведении, контроле и/или профилактике незаживающих областей неинтактной кожи, и также представляет собой стандартную терапию язв диабетической стопы. Предпочтительный подход в лечении инфекций диабетической стопы включает в себя чрескожный способ ART, который предусматривает чрескожную баллонную ангиопластику, возможно с установкой стента. Другие подходы к реваскуляризации включают в себя аортально-подвздошную реконструкцию с аорто-бедренным шунтом и бедренно-подколенно-болыпеберцовым шунтом с применением подкожной вены.

Гипербарическая оксигенотерапия (НВОТ) также используется в лечении, ведении, контроле и/или профилактике незаживающих областей неинтактной кожи, и также представляет собой стандартную терапию язв диабетической стопы. НВОТ относится к периодическому воздействию на все тело давлений, превышающих нормальное атмосферное, часто с повышенным содержанием кислорода по сравнению с содержанием в нормальном воздухе. Например, с применением барокамеры, давление можно увеличить вплоть до двух раз выше нормального атмосферного давления. Кроме того, пациент может подвергаться воздействию кислорода в концентрации вплоть до 100%. Повышенное давление в комбинации с увеличением содержания кислорода растворяет кислород в плазме крови, клетках, тканях и жидкостях организма, что в свою очередь способствует процессу заживления раны. Считается, что НВОТ может стимулировать рост новых кровеносных сосудов в местах со сниженной циркуляцией крови, улучшая кровоток в областях с артериальной блокадой.

Согласно некоторым другим вариантам осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения и/или профилактики инфекций диабетической стопы, предусматривающие введение композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению в комбинации с нестандартной терапией для инфекций диабетической стопы. Нестандартные виды терапии, как правило, используются, если язва диабетической стопы рефрактерна к одному или несколькими стандартным видам терапии.

Примеры

Следует понимать, что последующие примеры и варианты осуществления, описанные в настоящем документе, приведены исключительно для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистами в настоящей области техники и они включены в объем и сущность настоящей заявки и объем прилагаемой формулы изобретения.

Если не указано иное, конкретные бактериофаги, раскрытые в настоящем документе, выделяли, обрабатывали и анализировали согласно следующим способам. Кроме того, исследование, описанное ниже, одобрили на местном уровне Комитетом по этике отношений к животным Instituto de Medicina Molecular и одобрили на государственном уровне Главным управлением ветеринарной службы Португалии (Direccão Geral de Veterinaria), согласно законодательству Португалии. Всех животных в исследовании содержали в соответствии с Директивой ЕС №86/609/ЕС (Совет ЕС. Директива Совета ЕС №86/609/ЕЕС от 24 ноября 1986 г. о соответствии законодательств, норм и административных положений стран-членов ЕС в отношении защиты животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Off J Eur Communities L358:1-28), законом Португалии (Закон Португалии 1005/92) (Министерство сельского хозяйства Португалии. Закон Португалии №1005/92 от 23 октября о защите животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Diário da República I - Série B245:4930-4942), и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (NRC 2011) (Институт исследования лабораторных животных. 2011. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Washington (DC): National Academies Press.).

Одна цель настоящего исследования представляла собой изучение антибактериальной активности и способности к заживлению раны доставленных местно растворов бактериофагов к ранам с хроническими инфекциями S. aureus, P. aeruginosa и А. baumannii в двух животных моделях DM (крысиной и свиной).

Получение бактериальных штаммов

Штаммы Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05 выделяли из клинических образцов кожных ран человека, собранных от пациентов и инфицировали в стационарах из района Лиссабона. Штаммы Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05 депонировали 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK) и им присвоены регистрационные номера NCIMB 41862, NCIMB 41861 и NCIMB 41863 соответственно. Каждый изолят сеяли штрихом на планшеты со средами, содержащими триптон-соевый агар (TSA, Biokar Diagnostics, PantinCedex, France) и инкубировали при 37°С в течение 18 ч. Все штаммы-хозяева хранили в триптон-соевом бульоне (TSB, Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, France) с 15% глицерином (масса/объем) при -70°С до использования.

Криоконсервированные штаммы при -70°С выращивали в течение ночи на TSA при 37°С.

Для экспериментов in vitro отдельные колонии выращивали в течение ночи в TSB при 37°С при перемешивании. Получали другую бактериальную суспензию (разведение ночной культуры), инкубировали при 37°С при перемешивании и собирали, когда она достигала экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 600 нм 0,3-0,5). Инокулят в концентрации приблизительно 2,0×107 КОЕ/мл использовали для кривых роста.

Для экспериментов in vivo отдельные колонии выращивали в течение ночи на триптон-соевом агаре (TSA, Biokar Diagnostics) при 37°С. Через 24 ч инкубации бактериальную суспензию получали в солевом растворе (NaCl 0,9%, Applichem, Darmstadt, Germany) и сравнивали со стандартом Мак-Фарланда, который доводили до шкалы Мак-Фарланда (bioMérieux, Craponne, France), с последовательным разведением 1:10, получая конечную концентрацию раствора, составляющую 2,0×107 КОЕ/мл. Однократную дозу, составляющую 2,0×106 КОЕ клинических штаммов использовали для инокуляции ран.

Получение штаммов бактериофага

Литические бактериофаги Staphylococcus aureus F44/10 и F125/10, Pseudomonas aeruginosa F770/05 и F510/08 и Acinetobacter baumannii F1245/05 выделяли из сточных вод в районе Лиссабона и амплифицировали в клинические штаммы Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05 соответственно. Стандартные способы (Adams M. Bacteriophages. New York: Interscience Publishers, Inc., 1959) для выделения и амплификации бактериофагов использовали с применением штаммов-хозяев, описанных выше. Для получения маточных растворов бактериофагов в достаточных количествах для экспериментов использовали ранее описанный протокол амплификации, концентрации с помощью высокоскоростного центрифугирования и очистки на градиенте хлорида цезия. (Miller H., 1987, Methods Enzymol. 152: 145-70). Конечные концентрации определяли с помощью анализа бляшкообразования с двойным агаровым покрытием (Kropinski et al., 2009, В: Clokie M, Kropinski A, editors. Bacteriophages Methods and Protocols, volume 1: isolation, characterization, and interactions. New York: Humana Press, Springer Science + Business Media, 69-76). Штаммы фага F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05 депонировали 16 сентября 2011 г. по условиям Будапештского договора в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland UK) и присваивали регистрационные номера NCIMB 41867, NCIMB 41866, NCIMB 41864, NCIMB 41868 и NCIMB 41865 соответственно.

Для выделения литического бактериофага против Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii использовали три клинических штамма (индикаторных штамма). Сточные воды различного происхождения городского района Лиссабона концентрировали с помощью высокоскоростного центрифугирования, перед использованием в анализе бляшкообразования с двойным агаровым покрытием для определения присутствия бактериофага.

Образцы воды по 50 мл центрифугировали при 8000xg в течение 10 минут при 4°С. Супернатанты фильтровали с помощью 0,45 мкм фильтров Millex (Millipore, Massachusetts, USA) и центрифугировали при 17000 об/мин (Beckman J2-21M/E, ротор JA-20) в течение 3 часов при 4°С. Осадок элюировали в 5 мл SM буфера (0,05 M трис-HCl рН 7,5, 0,1 M NaCl, 10 мМ MgSO4.7H2O, 0,03% желатина) и оставляли элюировать в течение ночи при 4°С. Ресуспендированный осадок хранили при 4°С до использования.

Образцы воды также обогащали для увеличения возможности выделения бактериофага (Van Twest and Kropinski 2009). Одну отдельную колонию индикаторного штамма Staphylococcus aureus 743/06 инокулировали в 5 мл триптон-соевого бульона, дополненного 0,5% экстрактом дрожжей (TSBY, Biokar Diagnostics, PantinCedex, France) и инкубировали в течение ночи при 37°С при перемешивании. Получали культуру с 5 мл TSBY, 50 мкл ночной бактериальной культуры, 100 мкл концентрированной воды и 5 мМ CaCl2 и MgCl2 и инкубировали в течение ночи при 37°С при перемешивании. Перед центрифугированием культуры при 8000xg в течение 10 минут при 4°С, хлороформ добавляли и инкубировали в течение 5-10 минут при комнатной температуре для лизиса клеток и освобождения внутриклеточного бактериофага в среду. Супернатант фильтровали с помощью 0,45 мкм фильтров Millex (Millipore, Massachusetts, USA) и хранили при 4°С до использования.

После концентрирования и/или обогащения образцы сточных вод исследовали в отношении присутствия бактериофага со способностью инфицировать клинические штаммы Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05 с помощью анализа бляшкообразования с двойным агаровым покрытием. Кратко, бактериальные индикаторные штаммы выращивали в течение ночи в TSB или TSBY (для выделения бактериофага Staphylococcus aureus) при 37°С при перемешивании. Получали другую бактериальную суспензию (разведение ночной культуры: 1:200 для индикаторного штамма Staphylococcus aureus, 1:50 для индикаторных штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), инкубировали при 37°С при перемешивании и собирали когда она достигала экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 600 нм 0,3-0,5). Каждую культуру дополняли CaCl2 и/или MgCl2 (штамм Staphylococcus aureus с помощью 5 мМ CaCl2 и MgCl2, штаммы Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii с помощью 10 мМ MgCl2) и помещали в стеклянные пробирки (200 мкл для штамма Staphylococcus aureus, 400 мкл для штамма Pseudomonas aeruginosa и 150 мкл для штамма Acinetobacter baumannii) с концентрированными и/или обогащенными образцами воды (100 мкл для выделения бактериофага Staphylococcus aureus и 50□ мкл для выделения бактериофагов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii). Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут, после чего добавляли 3 мл мягкого агара (0,35% для выделения бактериофаг Staphylococcus aureus и 0,7% для выделения бактериофага Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), предварительно уравновешенного при 50°С. После кратковременного встряхивания агар-водно-бактериальную суспензию наносили на планшеты с триптон-соевым агаром, дополненным 0,5% дрожжевым экстрактом (TSAY, Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, France) для выделения бактериофага Staphylococcus aureus или TSA 1,5% (для выделения бактериофага Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), оставляли затвердевать при комнатной температуре и инкубировали при 37°С. Через 18-24 часа планшеты проверяли на наличие бактериофагов (очищенные зоны) в пределах бактериального газона, указывающее на присутствие бактериофага. Бактериофаговые бляшки собирали с применением стерильных кончиков пипетки, переносили в 100 мкл SM буфера и хранили при 4°С.

Размножение и определение характеристик фагов

Выделенные бактериофаги подвергали процессу размножения, амплификации и очистки (3 последовательных элюирования) в индикаторных штаммах до оценки их круга хозяев. Чувствительность 30 бактериальных изолятов против конкретного бактериофага проводили с применением мелкокапельной системы для анализа бляшкообразования (Mazzocco A, et al. 2009. Bacteriophages, methods and protocols vol. 1 chapter 9 Humana Press.). Кратко, бактериальные индикаторные штаммы выращивали в течение ночи в TSB при 37°С при перемешивании. Получали новую бактериальную суспензию (разведение ночной культуры: 1:200 для индикаторных штаммов Staphylococcus aureus, 1:50 для индикаторных штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), инкубировали при 37°С при перемешивании и собирали, когда она достигала экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 600 нм 0,3-0,5). Каждую культуру дополняли CaCl2 и/или MgCl2 (штаммы Staphylococcus aureus с помощью 5 мМ CaCl2 и MgCl2, штаммы Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii с помощью 10 мМ MgCl2) и помещали в стеклянные пробирки (200 мкл для штаммов Staphylococcus aureus, 400 мкл для штаммов Pseudomonas aeruginosa и 150 мкл для штаммов Acinetobacter baumannii), в которые добавляли 3 мл мягкого агара (0,35% для выделения бактериофага Staphylococcus aureus и 0,7% для выделения бактериофага Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), предварительно уравновешенного при 50°С. После кратковременного встряхивания агар-бактериальную суспензию наносили на планшеты TSA 1,5% и оставляли затвердевать при комнатной температуре. Небольшой объем (5 мкл) каждого из только что выделенных бактериофагов наносили каплями на свежеполученные бактериальные газоны и планшеты оставляли высыхать при комнатной температуре перед инкубацией в течение ночи при 37°С. Чувствительность 30 бактериальных изолятов против конкретного бактериофага определяли путем наблюдения за появлением литической зоны в области пятна.

Выбирали бактериофаг с лучшим процентным соотношением инфекции в круге хозяев и пропускали его через новый процесс амплификации, концентрации высокоскоростного центрифугирования, очистки в градиенте хлорида цезия (CsCl), экстракции бактериофаговой геномной ДНК и рестрикции. Процесс повторяли на круге хозяев с 100 бактериальными изолятами, пока не произвели окончательный отбор бактериофагов, и их геномы секвенировали.

In vitro эффективность фаговых коктейлей

In vitro анализы проводили для исследования литической активности бактериофага Staphylococcus aureus F44/10 и F125/10, Pseudomonas aeruginosa F770/05 и F510/08 и Acinetobacter baumannii F1245/05, каждого отдельно или в комбинации в жидких культурах, против индикаторных штаммов Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 vi Acinetobacter baumannii 1305/05.

Бактериальные индикаторные штаммы выращивали в течение ночи в TSB при 37°С при перемешивании. Получали свежую бактериальную суспензию (разведение ночной культуры: 1:200 для индикаторных штаммов Staphylococcus aureus, 1:50 для индикаторных штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), инкубировали при 37°С при перемешивании и собирали, когда она достигала экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 600 нм 0,3-0,5). Каждую культуру дополняли CaCl2 и/или MgCl2 (штаммы Staphylococcus aureus с помощью 5 мМ CaCl2 и MgCl2, штаммы Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii с помощью 10 мМ MgCl2).

Для каждой бактерии получали три жидких культуры 10 мл TSB и исследовали одновременно. Контрольную культуру бактерий инокулировали средой и 2,0×107 КОЕ/мл соответствующего индикаторного штамма (Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05) в экспоненциальной фазе роста. Контрольную культуру бактериофага инокулировали с помощью среды и бактериофага, подлежащего исследованию против индикаторного штамма, в заданной множественности заражения (F44/10 MOI=10, F125/10 MOI=10, F770/05 MOI=1, F510/08 MOI=10 и F1245/05 MOI=10). Исследуемую культуру инокулировали с помощью среды, бактериофага, подлежащего исследованию (F44/10 MOI=10, F125/10 MOI=10, F770/05 MOI=1, F510/08 MOI=10 и F1245/05 MOI=10) и 2,0×107 КОЕ/мл соответствующего индикаторного штамма (Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05) в экспоненциальной фазе роста. Все культуры дополняли CaCl2 и/или MgCl2 (штаммы Staphylococcus aureus с помощью 5 мМ CaCl2 и MgCl2, штаммы Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii с помощью 10 мМ MgCl2). Культуры инкубировали при 37°С со слабым перемешиванием. Образцы аликвот по 100 мкл забирали от каждой культуры с интервалами, составляющими 1 ч, в течение периода инкубации, составляющего 24 ч, и использовали для серийных разведений.

Количество жизнеспособных бактерий определяли с помощью способа 10-кратного серийного разведения (Murray PR, et al. 2003. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press.). Для контрольных культур бактерий и исследуемых культур 100 мкл каждого разведения инокулировали на планшеты с соответствующими селективными средами: маннит-солевой агар Чепмэна (Biokar diagnostics, PantinCedex, France) для Staphylococcus aureus, цетримидный агар (Merck Chemical, Darmstadt, Germany) для Pseudomonas aeruginosa, и CHROmagar Acinetobacter (CHROmagar, Paris, France) для Acinetobacter baumannii. Планшеты инкубировали в аэробных условиях при 37°С в течение 24 часов, после чего проводили подсчет колоний. Изоляты, выросшие на маннит-солевом агаре Чепмэна предположительно идентифицировали как Staphylococcus aureus на основании морфологии колоний и ферментации маннит-солевого агара (Chapman GH. 1946. J Bacteriol 51:409-410). Изоляты, выросшие на цетримидном агаре, предположительно идентифицировали как Pseudomonas aeruginosa на основании морфологии колоний (Brown VI, et al. 1965. J Clin Pathol 18:752-756). Изоляты, выросшие на CHROmagar Acinetobacter, предположительно идентифицировали как Acinetobacter baumannii на основании красного цвета колоний (Wareham DW, et al. 2011. J Clin Pathol 64:164-167).

Для контрольных культур бактериофага 100 мкл аликвоты забирали в момент времени (t0) и сразу же разводили для определения начального титра каждого бактериофага с помощью анализа бляшкообразования с двойным агаровым покрытием. Кратко, бактериальные индикаторные штаммы выращивали в течение ночи в TSB при 37°С при перемешивании. Получали свежую бактериальную суспензию (разведение ночной культуры: 1:200 для индикаторного штамма Staphylococcus aureus, 1:50 для индикаторных штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), инкубировали при 37°С при перемешивании и собирали, когда она достигала экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 600 нм 0,3-0,5). Каждую культуру дополняли CaCl2 и/или MgCl2 (штамм Staphylococcus aureus с помощью 5 мМ CaCl2 и MgCl2, штаммы Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii с помощью 10 мМ MgCl2) и помещали в стеклянные пробирки (200 мкл для штамма Staphylococcus aureus, 400 мкл для штамма Pseudomonas aeruginosa и 150 мкл для штамма Acinetobacter baumannii) с 100□ мкл разведения культуры бактериофага. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут, после чего добавляли 3 мл мягкого агара (0,35% для культуры Staphylococcus aureus и 0,7% для культур Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), предварительно уравновешенного при 50°С. После кратковременного встряхивания агар-бактериофаг-бактериальную суспензию наносили на TSA планшеты 1,5%, оставляли затвердевать при комнатной температуре и инкубировали при 37°С. Через 18-24 часа титр бактериофага определяли путем подсчета бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Получение фагового коктейля

На фиг. 1 проиллюстрировано получение иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению. После in vitro анализов бактериофагов F44/10, F125/10, F770/05, F510/08 и F1245/05, отдельно и в комбинации, литическую активность пяти бактериофагов исследовали вместе в одном бактериофаговом коктейле. Три первичных коктейль (коктейль S. aureus, коктейль P. aeruginosa и коктейль А. baumannii) и один конечный коктейль получали с применением различных концентраций и относительных пропорций очищенных бактериофагов. Бактериофаговый коктейль получали в солевом растворе, в котором каждый бактериофаг присутствовал с заданными значениями MOI (F44/10 MOI=10, 1010 БОЕ/мл; F125/10 MOI=10, 1010 БОЕ/мл; F770/05 MOI=1, 109 БОЕ/мл; F510/08 MOI=10, 1010 БОЕ/мл; и F1245/05 MOI=10, 1010 БОЕ/мл).

Каждое культивирование проводили, как описано ранее для исследования отдельных бактериофагов. Контрольные культуры бактерий, контрольную культуру бактериофагового коктейля и исследуемые культуры получали для индикаторных штаммов Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05. Культуры инкубировали при 37°C со слабым перемешиванием и 100 мкл аликвоты отбирали с временным интервалом, составляющим 1 ч, в течение 24 часов и использовали для серийных разведений.

Количества жизнеспособных бактерий подсчитывали с помощью способа 10-кратного серийного разведения (Murray PR, et al. 2003. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press.). Для контрольных культур бактерий и исследуемых культур 100 мкл каждого разведения инокулировали на планшеты с соответствующими селективными средами: маннит-солевой агар Чепмэна для Staphylococcus aureus, цетримидный агар для Pseudomonas aeruginosa и CHROmagar Acinetobacter для Acinetobacter baumannii. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 24 часов, после чего проводили подсчет колоний. Изоляты, выросшие на маннит-солевом агаре Чепмэна, предположительно идентифицировали как Staphylococcus aureus на основании морфологии колоний и ферментации маннит-солевого агара (Chapman GH. 1946. J Bacteriol 51:409-410). Изоляты, выросшие на цетримидном агаре, предположительно идентифицировали как Pseudomonas aeruginosa на основании морфологии колоний (Brown VI, et al. 1965. J Clin Pathol 18:752-756). Изоляты, выросшие на CHROmagar Acinetobacter, предположительно идентифицировали как Acinetobacter baumannii на основании красного цвета колоний (Wareham DW, et al. 2011. J Clin Pathol 64:164-167).

Начальный титр бактериофагов определяли путем анализа бляшкообразования с двойным агаровым покрытием. Образцы 100 мкл аликвот отбирали в момент времени (t0) и сразу же разводили. Бактериальные индикаторные штаммы выращивали в течение ночи в TSB при 37°С при перемешивании. Получали свежую бактериальную суспензию (разведение ночной культуры: 1:200 для индикаторного штамма Staphylococcus aureus, 1:50 для индикаторных штаммов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), инкубировали при 37°С при перемешивании и собирали, когда она достигала экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 600 нм 0,3-0,5). Каждую культуру дополняли CaCl2 и/или MgCl2 (штамм Staphylococcus aureus с помощью 5 мМ CaCl2 и MgCl2, штаммы Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii с помощью 10 мМ MgCl2) и помещали в стеклянные пробирки (200 мкл для штамма Staphylococcus aureus, 400 мкл для штамма Pseudomonas aeruginosa и 150 мкл для штамма Acinetobacter baumannii) с 100 мкл разведения культуры бактериофагового коктейля. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут, после чего добавляли 3 мл мягкого агара (0,35% для культуры Staphylococcus aureus и 0,7% для культур Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii), предварительно уравновешенного при 50°С. После кратковременного встряхивания агар-бактериофаг-бактериальную суспензию наносили на TSA планшеты 1,5%, оставляли затвердевать при комнатной температуре и инкубировали при 37°С. Через 18-24 часа титр бактериофагов определяли с помощью подсчета БОЕ (бляшкообразующих единиц).

In vivo эффективность фагового коктейля на крысиной модели

На фиг. 2 проиллюстрирован протокол исследования, используемый для демонстрации in vivo эффективности на крысиной модели иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Использовали предварительно оптимизированную модель раневой инфекции у грызунов на крысах линии Вистар с химически индуцированным сахарным диабетом (Mendes JJ, et al. 2012. Comp Med 62:1-12).

Животные

Специальных не содержащих патогенных организмов самцов крыс линии Вистар [Crl:WI(Han)], массой 250-350 г (в возрасте 8-10 недель) получали из Charles River Laboratories (L'Arbresle, Cedex, France). Животных помещали в соответствующий требованиям центр по уходу за животными при следующих условиях: размещение в микроизоляторах в помещении с контролируемой влажностью (50-70%) и температурой (20-22°С), цикл 14 часов света и 10 часов темноты и свободный доступ к гранулированному корму для грызунов и стерилизованной посредством фильтрации воде. Животных вначале размещали группами по два. После удаления шерсти и последующих процедур их размещали отдельно для сохранения кожи и позже целостности повязки. Все хирургические процедуры проводили в подвергнутой санитарной обработке операционной с применением стерилизованных в автоклаве инструментов.

Индукция DM

DM химически индуцировали, как описано Wu et al. (Wu К, et al. 2008. Curr Protoc Pharmacol 40:5,47,1-5,47,14). После 12 часового голодания животным давали одну интраперитонеальную инъекцию (i.p.) стрептозотоцина (65 мг/кг; Merck Chemical, Darmstadt, Germany) свежеприготовленного в 0,1 M цитратном буфере (pH 4,5). Измерение глюкозы крови проводили на крови из хвостовой вены с применением глюкометра через 8 дней. Крыс, демонстрирующих содержание глюкозы крови натощак выше, чем 250 мг/дл, считали больными диабетом.

Удаление шерсти

После подтверждения DM (через 8 дней), 42 больным сахарным диабетом крысам вводили анестезию путем интраперитонеальной инъекции ксилазин гидрохлорида (10 мг/кг) и кетамин гидрохлорида (25 мг/кг), и шерсть на задней поверхности подстригали с помощью электростригальной машинки, а оставшуюся шерсть полностью удаляли с помощью воска с применением полосок с холодным воском (полоски холодного воска Veet, Reckitt Benckiser, West Ryde, Australia). Спины животных затем промывали 10% повидон-йодным раствором и после высушивания и очистки, равномерно наносили жидкий образующий пленку акрилат (Cavilon Skin Cleanser, 3М Health Care, Saint Paul, MN) для покрытия области с удаленной шерстью.

Создание раны, наложение шины, получение первой фотографии и наложение повязки

Через 4 дня после удаления шерсти животным снова вводили анестезию с помощью того же протокола, и кожу на спине тщательно промывали стерильным солевым раствором с последующей дезинфекцией с помощью 10% повидон-йода и промывания 70% изопропиловым спиртом после 10 минутного периода времени контакта с повидон-йодом. Круглую рану создавали путем одного рассечения на всю глубину, проходящего через мышцу panniculus carnosus в межлопаточной области верхней части спины каждой крысы с применением инструмента для проведения точечной биопсии (диаметр 6 мм; Accu-Punch, Acuderm, Fort Lauderdale, FL, USA), и кожный лоскут вырезали с применением ножниц для иридэктомии. Силиконовую шину овальной формы модифицировали из самоклеющейся подушечки для мозолей (Comforsil, Toledo, Spain). Немедленно связывающий цианоакрилатный клей в одноразовой упаковке (Loctite, Henkel Corporation, Westlake, ОН) использовали для фиксации шина на коже, после чего ее перехватывали 3-0 нейлоновыми нитками для фиксации ее положения. Перед наложением повязки раны фотографировали со стандартной высоты (расстояния, составляющего 1,5 см) с применением установленного цифрового микроскопа (USB цифрового микроскопа SuperEyes 200×, Shenzhen Так and Assistive Technology, Shenzhen, China). Жидкий пленкообразующий акрилат затем наносили на эпилированную область, и рану и окружающую область покрывали предварительно вырезанной, полупроницаемой, нетканой полиэфирной повязкой (Fixomull Stretch, BSN Medical, Hamburg, Germany). Шину и повязку удерживали на месте в течение всего эксперимента с применением корсета, изготовленного из липкой ленты (лейкопластырь, BSN Medical, Hamburg, Germany).

Групповая рандомизация

После нанесения повязки и пока животные все еще находились под анестезией, их случайным образом разделили на 7 групп: группа отрицательного контрольная (n=6), инокулированная Staphylococcus aureus контрольная (n=6) и исследуемая группа (n=6), инокулированная Pseudomonas aeruginosa контрольная (n=6) и исследуемая группа (n=6), и инокулированная Acinetobacter baumannii контрольная (n=6) и исследуемая группа (n=6).

Раневая инфекция

В раны животных в группе отрицательного контроля вводили инъекцией 100 мкл стерильного солевого раствора, тогда как раны инокулированных групп (исследуемых и контрольных) соответственно инокулировали с помощью 100 мкл культивированных Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa или Acinetobacter baumannii (приблизительно 2,0×106 КОЕ), ресуспендированных в стерильном солевом растворе путем введения 27G/19-MM иглы, прикрепленной к 1 мл одноразовому шприцу через силиконовую шину под углом 45°.

Иссечение нежизнеспособных тканей

В 4, 5 и 8 дни после создания раны полупроницаемую повязку отрезали и у всех животные иссекали нежизнеспособные ткани раны. Иссечение нежизнеспособных тканей состояло в простом механическом удалении струпа, определяемого как твердая корка засохшей крови, сыворотки и экссудата, с применением строго асептической техники.

Протокол лечения с помощью бактериофагов

Протокол лечения с помощью бактериофагов разделили на фазу индукции и фазу поддержания дозы и проводили на всех исследуемых группах. Фазу индукции проводили после первого иссечения нежизнеспособных тканей (4 день после создания раны), и она состояла из шести (каждые 4 часа) введений 100 мкл первичного раствора бактериофага. Фазу поддержания дозы проводили с 5 дня по 8 день, и она состояла из введений дважды в день (каждые 12 часов) 100 мкл первичного раствора бактериофага. Если проводили иссечение нежизнеспособных тканей, введение бактериофага следовала за ним. Контрольные группы получали 100 мкл стерильного солевого раствора с той же частотой.

Микробиологический анализ

В 4, 5 и 8 дни после создания раны и после иссечения нежизнеспособных тканей тампон для мазков с жидкой средой Amies (eSwab Collection and Preservation System, Copan, Corona, CA) использовали для сбора и транспортировки культур мазка. Сбор бактерий проводили с применением одноточечного способа, описанного Sullivan et al. (Sullivan PK et al. 2004 Wounds 16:115-123). Кратко, с применением стерильного тампона для взятия мазков центральную поверхность каждой раны соскребали вращением тампона 3 раза по часовой стрелке с достаточным давлением руки для получения небольшого количества экссудата. Тампон затем вставляли в пробирку и транспортировали в лабораторию для немедленной обработки. Пробирку для сбора мазков откручивали на вортексе (с тампоном внутри) в течение 5 секунд и 100 мкл аликвоту полученной суспензии использовали для серийных разведений.

Подсчет проводили с применением способа 10-кратного серийного разведения (Murray PR et al. 2003. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press). В инфицированных/инокулированных группах 100 мкл каждого разведения помещали на планшеты с соответствующими селективными средами: маннит-солевой агар Чепмэна (Biokar diagnostics, Pantin Cedex, France) для Staphylococcus aureus, цетримидный агар (Merck Chemical, Darmstadt, Germany) для Pseudomonas aeruginosa, и CHROmagar Acinetobacter (CHROmagar, Paris, France) для Acinetobacter baumannii. В инфицированных Acinetobacter baumannii группах 100 мкл каждого разведения одновременно инокулировали на планшеты с триптон-соевый агаровыми средами (TSA, Biokar Diagnostics, Pantin Cedex, France). В группе отрицательного контроля 100 мкл каждого разведения инокулировали на планшеты с триптон-соевый агаровыми средами. Планшеты инкубировали в аэробных условиях при 37°С в течение 24 часов, после чего проводили подсчет колоний. Изоляты, выросшие на маннит-солевой агар Чепмэна, предположительно идентифицировали как Staphylococcus aureus на основании морфологии колоний и ферментации маннит-солевой агара (Chapman GH. 1946. J Bacteriol 51:409-410). Изоляты, выросшие на цетримидном агаре, предположительно идентифицировали как Pseudomonas aeruginosa на основании морфологии колоний (Brown VI, et al. 1965. J Clin Pathol 18:752-756). Изоляты, выросшие на CHROmagar Acinetobacter, предположительно идентифицировали как Acinetobacter baumannii на основании красного цвета колоний (Wareham DW, et al. 2011. J Clin Pathol 64:164-167).

Кинетические параметры закрытия раны (планиметрия)

На 9 день после создания раны перед умерщвлением раны фотографировали с 1,5 см стандартной высоты с применением установленного цифрового микроскопа, как описано ранее. Кинетические параметры раны определяли количественно с применением программного обеспечения обработки изображений (ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD) для измерения раневой площади путем планиметрии; раневую площадь выражали как процентное отношение от начальной раневой площади.

Гистологический анализ

Всех животных умерщвляли с помощью интраперитонеальной инъекции пентобарбитала (200 мг) на 9 день после создания раны и каждую язву, включая в себя 0,5 см край кожи, полностью собирали с применением стерильных хирургических ножниц и помещали в пробирку. Образец фиксировали в 10% забуференном растворе формалина и после фиксации в течение ночи ткань отщипывали и разрезали по самому широкому краю, погружали в парафин и делали срезы с 3 мкм шагом. Срезы производили перпендикулярно продольной оси и перпендикулярно поверхности раны.

Для каждой раны два серийных среза помещали на предметное стекло и окрашивали гематоксилином и эозином. Под световым микроскопом срезы фотографировали с применением инвертированного светлопольного микроскопа с электроприводом (Zeiss Axiovert 200М, Göttingen, Germany), оснащенного цветным фотоаппаратом (Leica DM2500, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) с 50 кратным увеличением. Панорамные цифровые снимки поперечных срезов каждой раны получали с применением программного обеспечения автоматической обработки данный микроскопии (MetaMorph, MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA) и обрабатывали с применением программного обеспечения для обработки изображений (ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD). Изображения анализировали в отношении эпителиального разрыва (EG) и дермального разрыва (DG) с применением того же программного обеспечения для обработки изображений.

EG определяли как расстояние между нарастающими краями чистого, многослойного неоэпидермиса (Galiano RD, et al. 2004. Wound Repair Regen 12:485-492; Scherer SS, et al. 2008. Wounds 20:18-28), и его размер измеряли в мм, при это EG, равный нуля, представлял полностью реэпителизированную рану. DG определяли как расстояние между неповрежденной дермой по обеим сторонам раны (Galiano RD, et al. 2004. Wound Repair Regen 12:485-492; Scherer SS, et al. 2008. Wounds 20:18-28) и ее измеряли в мм. Все кинетические параметры раны и гистологические измерения проводили в слепом для исследователя режиме в отношении происхождения образца (исследуемый или контрольный).

In vivo эффективность фагового коктейля на свиной модели

На фиг. 3 проиллюстрирован протокол исследования, используемый для демонстрации in vivo эффективности на свиной модели иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Предварительно оптимизированную свиную модель раневой инфекции у животного с химически индуцированным DM, как описано Hirsch et al. (Hirsch Τ, et al. 2008. BMC Surg 8:5), модифицировали, чтобы соответствовать потребностям настоящего исследования. Трех животных (животное отрицательного контроля, контрольно-инокулированное животное и инокулированное исследуемым штаммом) с общим количеством 48 эксцизионных ран (12 раны отрицательного контроля, 12 инокулированных Pseudomonas aeruginosa ран, 12 инокулированных Staphylococcus aureus ран и 12 инокулированных Acinetobacter baumannii раны) использовали в настоящем исследовании.

Животные

Трех самок йоркширских свиней (Farm) массой ±60 кг при прибытии оставляли акклиматизироваться в течение 1 недели перед началом эксперимента. Животных помещали отдельно в клетку, они имели свободный доступ к воде и их кормили дважды в день стандартной диетой. Во время процедур свиней содержали в сдерживающем устройстве.

Индукция и контроль DM

Свиней не кормили в течение 12 часов перед индукцией DM. В день процедуры животных взвешивали и вводили внутримышечную анестезию для проведения индукции с помощью ксилазин гидрохлорида и кетамин гидрохлорида. Пока животные находились под анестезией внутривенный катетер 21 калибра вводили в ушную вену. Стрептозотоцин получали в дозе 150 мг/кг массы тела, разводили в 10 мл/г стерильного солевого раствора, стерилизовали путем фильтрации и вводили через катетер в течение 1 мин. После восстановления от анестезии давали послепроцедурную противорвотную терапию с помощью метоклопрамида. За свиньями непрерывно наблюдали в течение первых 3 часов и затем предлагали пищу ad libitum, чтобы избежать гипогликемии. Глюкозу крови измеряли ежедневно в течение эксперимента. Для поддержания концентрации глюкозы в крови в диапазоне 250-400 мг/дл, свиньи получали ежедневно инъекции 16 ME предварительно смешанной нейтральной суспензии нейтрального (30%) и изофан-инсулина (70%) (Mixtard 30, Novo Nordisk, Bagsvasrd, Denmark) подкожно.

Удаление шерсти, создание раны, получение первой фотографии и инфицирование

Через 14 дней после индукции DM свиньи получали индукционную анестезию, как описано ранее. После индукции их подвергали эндотрахеальной интубации и проводили механическую вентиляцию с помощью аппарата для искусственной вентиляции легких BIRD с переключением по времени и ограниченным объемом (Mark 9; Bird Corporation, Palm Springs, CA) на смеси комнатного воздуха и титрованного изофлурана (0,5%-1,5%). Объем вдоха устанавливали на 12 мл/кг и частоту аппарата на 12 вдохов в минуту. Перед операцией шерсть на задней поверхности тела выщипывали, подстригали с помощью электростригальной машинки, а оставшуюся шерсть полностью удаляли с помощью воска с применением полосок с холодным воском, околопозвоночную область тщательно дезинфицировали с применением 10% повидон-йода и затем промывали 70% изопропанолом через 15 минут периода времени контакта.

Для контрольно инокулированных и инокулированных исследуемым штаммом свиней девять эксцизионных ран полной глубины (размером 6 мм в диаметре и с глубиной, составляющей 6 мм) создавали на каждой стороне околопозвоночной области (всего 18) с применением щипцов для проведения биопсии, диаметром 6 мм. Для свиньи отрицательного контроля только 6 эксцизионных ран создавали на каждой стороне околопозвоночной области (всего 12). Далее стерильные зажимы и лезвие скальпеля использовали для удаления кожный лоскут на всю толщу кожи, и стерильную марлю использовали для очистки ран от свернувшейся крови и для контроля кровотечения. Перед покрытием адгезивной камерой раны фотографировали со стандартной высоты с применением установленного цифрового микроскопа. Модифицированную адгезивную камеру, изготовленную для калоприемника (двухкомпонентную для 35 мм стомы, Hollister Incorporated, Libertyville, IL), покрытую полупроницаемой нетканой полиэфирной повязкой, помещали поверх каждой раны и удерживали на месте с помощью хирургических скоб (Manipler AZ, В. Braun, Tuttlingen, Germany) и лейкопластырных повязок.

У инокулированных контролем и инокулированных исследуемым штаммом животных раны разделяли на три подгруппы: Staphylococcus aureus (2×6 язв); Pseudomonas aeruginosa (2×6 язв); и Acinetobacter baumannii (2×6 язв). Для погружения закрытой поверхности раны соответственно инокулировали с помощью 2×106 КОЕ Staphylococcus aureus в 100 мкл общего раствора (стерильного 0,9% солевого раствора), 2×106 КОЕ Pseudomonas aeruginosa в 100 мкл общего раствора (стерильного 0,9% солевого раствора) и 2×106 КОЕ Acinetobacter baumannii в 100 мкл общего раствора (стерильного 0,9% солевого раствора). В группе отрицательного контроля (12 язв) в раны вводили 100 мкл стерильный солевой раствор. После восстановления от анестезии постпроцедурную анестезию (бупренорфин 0,005 мг/кг) и противорвотную терапию давали каждые 12 часов в течение 48 часов.

Иссечение нежизнеспособных тканей

На 4, 5 и 8 день после создания раны полупроницаемую повязку срезали и рану подвергали иссечению нежизнеспособных тканей. Иссечение нежизнеспособных тканей состояло в простом механическом удалении струпа, определяемого как твердая корка засохшей крови, сыворотки и экссудата, с применением строго асептической техники, как описано для модели на грызунах.

Протокол лечения с помощью бактериофагов

Использовали протокол лечения с помощью бактериофагов, разделенный на фазу индукции и фазу поддержания дозы, аналогично модели на грызунах. Фазу индукции проводили после первого иссечения нежизнеспособных тканей (4 день после создания раны), и она состояла из шести (каждые 4 часа для 24 часов) введений 100 мкл конечного раствора бактериофага. Фазу поддержания дозы проводили с 5 дня по 8 день, и она состояла из введений дважды в день (каждые 12 часов) 100 мкл конечного раствора бактериофага. Если проводили иссечение нежизнеспособных тканей, введение бактериофага следовала за ним. Контрольные группы получали 100 мкл стерильного солевого раствора с той же частотой.

Микробиологический анализ

Использовали микробиологический анализ, аналогичный исследованию на грызунах. На 4, 5 и 8 дни после создания раны и после иссечения нежизнеспособных тканей тампон для мазков с жидкой средой Amies использовали для сбора и транспортировки культур мазка. Сбор бактерий проводили с применением одноточечного способа, описанного Sullivan et al. (Sullivan PK et al. 2004 Wounds 16:115-123), как описано ранее. Тампон затем вставляли в пробирку и транспортировали в лабораторию для немедленной обработки. Подсчет проводили с применением способа 10-кратного серийного разведения (Murray PR, et al. 2003. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press).

В инфицированных/инокулированных группах 100 мкл каждого разведения помещали на планшеты с соответствующими селективными средами: маннит-солевой агар Чепмэна, цетримидный агар и CHROmagar Acinetobacter. В группе отрицательного контроля 100 мкл каждого разведения инокулировали на планшеты со средами триптон-соевого агара. Планшеты инкубировали в аэробных условиях при 37°С в течение 24 часов, после чего проводили подсчет колоний. Изоляты предположительно идентифицировали, как описано ранее. В группе отрицательного контроля язвы с больше чем 103 КОЕ/мазок в любой указанный день, рассматривались как критически колонизированные и исключались из последующего анализа.

Кинетические параметры закрытия раны (планиметрия)

На 9 день после создания раны перед умерщвлением раны фотографировали со стандартной высоты с применением установленного цифрового микроскопа, как описано ранее. Кинетические параметры раны определяли количественно с применением программного обеспечения обработки изображений, как для исследования на грызунах. Раневую площадь выражали как процентное отношение от начальной раневой площади.

Гистологические анализ

Всех животных умерщвляли с помощью внутривенной инъекции пентобарбитала (200 мг) на 9 день после создания раны и каждую язву, включая в себя 0,5 см край кожи, полностью собирали с применением стерильных хирургических ножниц и помещали в пробирку. Образцы обрабатывали и фотографировали, как описано для исследования на грызунах. Изображения анализировали в отношении эпителиального разрыва (EG) с применением способов, аналогичных исследованию на грызунах.

Статистический анализ

Все количественные микробиологические результаты представляют как среднее с соответствующим стандартным отклонением и выражают как логарифмически трансформированные значения [log(КОЕ/мазок) для образцов мазка и log(КОЕ/язва) для образцов ткани]. Данные сравнивали с применением логарифмической шкалы вследствие широких вариаций в значением КОЕ/мазок среди культур. Сравнения между группами проводили с применением двустороннего t-критерия Стьюдента, и значение p<0,05 рассматривалось значимым. Все планиметрические результаты выражают как среднее с соответствующим стандартным отклонением процентного отношения площади размера исходной раны. Сравнения между группами проводили с применением двустороннего t-критерия Стьюдента, и значение p<0,05 рассматривалось значимым. Результаты гистологических измерений представляют как средние значения с соответствующим стандартным отклонением. Сравнения между группами проводили с применением двустороннего t-критерия Стьюдента, и значение p<0,05 рассматривалось значимым. Все данные вводили в программу работы с электронными таблицами (Excel, Microsoft, Redmond, WA) для статистического анализа. Аналитическую статистику проводили с помощью Analyse-it version 2.21 Excel 12+ (Analyse-it Software, Leeds, UK), статистического программного расширения для программы работы с электронными таблицами.

Результаты

Доклинические исследования - фармакология/обоснованность концепции

Для преодоления проблемы возникновения резистентности к отдельному штамму бактериофага, подлежащему использованию, авторы настоящего изобретения разработали композиции бактериофагового коктейля с применением более одного различных штаммов бактериофага, каждый из которых характеризуется высокой литической активностью, несмотря на предыдущие трудности в комбинировании различных специфичностей бактериофага, таких как нестабильность при хранении. Настоящие коктейли неожиданно показали превосходную комбинированную эффективность по сравнению с использованием фага отдельно как показано на кривых цитолиза фиг. 4, 5 и 6 для анализов in vitro. Наблюдаемое снижение, например, с применением комбинированных культур F770/05 и F510/08 по сравнению с применением культур отдельных штаммов бактериофага, демонстрирует преимущество применения более одного штамма бактериофага (т.е. применения бактериофаговых коктейлей согласно настоящему изобретению) для увеличения литической активности против штаммов Pseudomonas aeruginosa при снижении возникновения бактерий, резистентных к штаммам бактериофага. В настоящем документе авторы настоящего изобретения измерили способность инфекции каждого из выбранных бактериофагов у 100 различных штаммов бактерий - F510/08 характеризуется кругом хозяев, составляющим 80%, F770/05 характеризуется кругом хозяев, составляющим 55%, F44/10 и F125/10 оба характеризуются кругом хозяев, составляющим 100%, и F1245/05 характеризуется кругом хозяев, составляющим 75%.

Разработка фагового коктейля

Литические активности вновь выделенных и охарактеризованных штаммов бактериофага Staphylococcus aureus F44/10 и F125/10, штамма бактериофага Pseudomonas aeruginosa F770/05 и F510/08 и штамма бактериофага Acinetobacter baumannii F1245/05 оценивали против штаммов Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07 и Acinetobacter baumannii 1305/05 соответственно, для разработки бактериофагового коктейля для применения при раневых инфекциях. In vitro применение бактериофагового коктейля (красная линия) приводит к значительному снижению содержаний бактерий Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, как показано на фиг. 4, 5 и 6. Результаты in vitro применения бактериофагового коктейля не показали никакого ингибирования инфицирующей способности штамма бактериофага вследствие присутствия различных штаммов бактериофага отличающихся бактерий и дополнительно показывают, что коктейль действительно усиливает лизис бактерий в некоторых случаях (например, в случае бактерий Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii).

Общепринятые кривые роста получали в контролируемых условиях с применением предварительно определенного бактериального инокулята. Предварительное исследование проводили для определения массовой нагрузки бактерий в четырехдневной инфекции штаммами Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07, или Acinetobacter baumannii 1305/05 на крысиной модели. Определение КОЕ определило бактериальную нагрузку, составляющую приблизительно 2,0×107 КОЕ/рана. Это был инокулят, используемый в in vitro анализах.

Перед оценкой композиции бактериофагового коктейля, каждый бактериофаг анализировали отдельно и в комбинации с различными значениями MOI (данные не показаны) для скрининга в отношении их эффективности для потенциального терапевтического и экспериментального применения на животных моделях. Количества жизнеспособных бактерий подвергали мониторингу с интервалами в 1 ч в течение 24 часов.

На фиг. 4 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Staphylococcus aureus 743/06, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Бактериофаг F44/10 исследовали отдельно при MOI, равной 10 для инфицирования Staphylococcus aureus 743/06. В течение первых 3 часов количества жизнеспособных бактерий снижались приблизительно на 4 логарифмические единицы по сравнению с контрольной культурой бактерий. После этого, количества бактерии начинали увеличиваться и через 6 часов после инфицирования культуры, жизнеспособные бактерии составляли 2,1×106 КОЕ/мл. Хотя наблюдалось снижение на 97% по сравнению с контрольной культурой бактерий (при 24 ч инкубации, количества жизнеспособных бактерий составляло 9,9×109 КОЕ/мл), бактериофаг F44/10 не полностью лизировал клетки - хозяева. Аналогичные результаты наблюдались для 5 бактериофагов при анализе отдельно и, вероятно, были результатом появления менее чувствительных бактерий к инфицированию бактериофагом.

Бактериофаг F125/10 использовали при значении MOI, равном 10 для инфицирования Staphylococcus aureus 743/06 (как показано на фиг. 4) и, в течение одного часа, снижали количества бактерий приблизительно на 3 логарифмические единицы по сравнению с контрольной культурой бактерий 743/06. При 6 ч инкубации жизнеспособные бактерии составляли 3,6×107 КОЕ/мл (ниже, чем значения культуры F44/10) и в конце инкубационного периода (24 ч), жизнеспособные бактерии составляли 6,6×109 КОЕ/мл. Отличающееся поведение, наблюдаемое в вариациях в течение трех первых часов инкубации активностей бактериофагов F44/10 и F125/10, отражает различия в их скоростях адсорбции, латентных периодах и выходов фага (данные не показаны).

Предполагалось, что комбинация двух штаммов бактериофага (F44/10 и F125/10) к Staphylococcus aureus 743/06 будет дополнительно снижать бактериальный рост по сравнению с наблюдаемым действием отдельных фагов. Бактериофаги F44/10 и F125/10 рано лизировали бактерии, достигая снижения на 5 логарифмических единиц (жизнеспособные бактерии составляли 1,9×104 КОЕ/мл) по сравнению с контрольной культурой бактерий. Низкое содержание жизнеспособных бактерий сохранялось в течение 4 часов, тем не менее, несмотря на снижение по сравнению с контрольной культурой бактерий. При 24 ч инкубации количества жизнеспособных бактерий достигли значения 4,3×109 КОЕ/мл (56,6% снижение количества бактерий).

На фиг. 5 проиллюстрированы результаты литического исследования, проведенного против Pseudomonas aeruginosa 433/07, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Тенденцию, аналогичную наблюдаемой с Staphylococcus aureus 743/06, наблюдали для инфицирования Pseudomonas aeruginosa 433/07 бактериофагами F770/05 и F510/08.

Бактериофаг F770/05 исследовали отдельно при значении MOI, равном 1, против Pseudomonas aeruginosa 433/07, как показано на фиг. 5. В течение первых 2 часов инкубации количества жизнеспособных бактерий снижались приблизительно на 3 логарифмических единицы по сравнению с контрольной культурой бактерий 433/07, достигая 4,6×105 КОЕ/мл. В пределах 3 часов инкубации бактерии начинали расти экспоненциально и при 6 часовой инкубации жизнеспособные бактерии составляли 7,3×107 КОЕ/мл. В конце периода инкубации культуры (24 часа), количества бактерий составляли 2,8×109 КОЕ/мл, 41,6% снижение по сравнению с контрольной культурой бактерий с 4,8×109 КОЕ/мл.

Бактериофаг F510/08 также исследовали отдельно при значении MOI, равном 10, против Pseudomonas aeruginosa 433/07, как показано на фиг. 5, перед исследованием его применения в комбинации с F770/05. В пределах 2 часов инкубации бактериофаг F510/08 лизировал бактерии, достигая снижения приблизительно на 5 логарифмических единиц в количествах бактерий по сравнению с контрольной культурой бактерий. При 6 часовой инкубации жизнеспособные бактерии составляли 1,7×107 КОЕ/мл, достигая содержания начального инокулята, составляющего приблизительно 2,0×107 КОЕ/мл. Через 24 часа культура F510/08 представляла количества бактерий, сходные с таковыми в контрольной культуре бактерий, с 2,8×109 КОЕ/мл, что эквивалентно 41,6% снижению.

Предыдущие анализы с бактериофагом F770/05 и F510/08 с различными значениями MOI показали подходящую множественность заражения для применения в комбинации двух бактериофагов: применение F770/05 со значением MOI, равным 1, и F510/08 со значением MOI, равным 10, было более эффективным в инфицировании Pseudomonas aeruginosa 433/07.

Бактериофаг F770/05 и F510/08 со значением MOI, равным 1 и 10 соответственно, исследовали против Pseudomonas aeruginosa 433/07 также, как показано на фиг. 5. В пределах 3 часов инкубации количества бактерий представляло снижение на 4 логарифмических единицы по сравнению с контрольной культурой бактерий, и снижение на 1 логарифмическую единицу по сравнению с культурой F770/05 отдельно. В этот момент времени F510/08 оказался более эффективным отдельно. При 6-часовой инкубации, что представляет собой 6 часов после инфицирования культуры, количества жизнеспособных бактерий составляли 1,4×108 КОЕ/мл; тогда как в конце инкубационного периода (24 часа) жизнеспособные бактерии составляли 1,7×108 КОЕ/мл. Это представляет собой 96,5% снижение по сравнению с контрольной культурой бактерий. Это снижение, наблюдаемое с применением F770/05 совместно с F510/08 по сравнению с применением отдельных культур каждого бактериофага, демонстрирует преимущество применения больше одного бактериофага (как в бактериофаговых "коктейлях"), например, обсуждаемых в настоящем документе.

На фиг. 6 проиллюстрированы результаты литических исследований, проведенных против Acinetobacter baumannii 1305/05, демонстрирующие in vitro эффективность иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Бактериофаг F1245/05 также выбирали так, чтобы он был включен в иллюстративную композицию бактериофагового коктейля, проиллюстрированную в настоящем документе, и исследовали отдельно при MOI, равной 10 против Acinetobacter baumannii 1305/05, как показано на фиг. 6. При этом значении MOI, бактериофаг F1245/05 вызывал быстрое снижение количества жизнеспособных бактерий так, что только за 1 ч количества снижались от 2,0×107 КОЕ/мл до 6,8×104 КОЕ/мл. Низкие значения КОЕ поддерживались в течение приблизительно 3 часов по сравнению с контрольной культурой бактерий. Через 6 часов инкубации количества жизнеспособных бактерий составляли 1,1×108 КОЕ/мл, и в конце инкубационного периода (24 часа) клетки выросли до 2,2×109 КОЕ/мл. Бактериофаг F1245/05 отдельно, таким образом, показал высокую литическую активность против Acinetobacter baumannii 1305/05, достигая за 24 часа инкубации 76,3% снижения количеств бактерий по сравнению с контрольной культурой.

Результаты показывают, что применение отдельных штаммов бактериофага в конечном счете может приводить к возникновению резистентности к конкретному штамму бактериофага, и одним путем избежать этого или минимизировать является разработка композиций, содержащих больше одного штамма бактериофага, причем предпочтительно каждый из них характеризуется высокой литической активностью против конкретных бактерий.

Иллюстративный бактериофаговый коктейль

Целью настоящего исследования являлось получение иллюстративного бактериофагового коктейля против штаммов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, и Acinetobacter baumannii с применением штаммов бактериофага, которые проявляют широкую активность против спектра указанных бактерий и которые можно использовать в ведении раневой инфекции.

После исследования отдельных активностей определенных штаммов бактериофага против бактериальных штаммов получали бактериофаговый коктейль, характеризующийся следующим составом: F44/10 в значении MOI=10, F125/10 в значении MOI=10, F770/05 в значении MOI=1, F510/08 в значении MOI=10 и F1245/05 в значении MOI=10. Смотрите фиг. 1.

Указанный бактериофаговый коктейль исследовали in vitro против штаммов Staphylococcus aureus 743/06, Pseudomonas aeruginosa 433/07, и Acinetobacter baumannii 1305/05. Количества жизнеспособных бактерий определяли для каждой бактерии отдельно в кривых роста с интервалами в 1 ч в течение 24 часов. In vitro применение бактериофагового коктейля приводило к значительному снижению количества бактерий Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii (смотрите фиг. 4-6 соответственно).

Одной инокуляции бактериофагового коктейля было достаточно для снижения Staphylococcus aureus 743/06 на 5 логарифмических единицы по сравнению с контрольной культурой бактерий, как показано на фиг. 4. Аналогичное снижение наблюдалось для активности двух комбинированных штаммов бактериофага Staphylococcus aureus. В течение второго и шестого часа инкубации эффективность коктейля была ниже, чем у двух штаммов бактериофага F44/10 и F125/10 вместе; тем не менее, через 24 часа разница между двумя культурами была значительной. Количества бактерий начинали снижаться и к концу инкубационного периода (24 часа) жизнеспособные бактерии составляли 6,8×108 КОЕ/мл (снижение на 93,1% по сравнению с контрольной культурой).

Бактериофаговый коктейль также исследовали против Pseudomonas aeruginosa 433/07, как показано на фиг. 5, показывающей снижение количеств бактерий приблизительно на 4 логарифмических единиц за 2 часовой инкубационный период. К концу периода инкубации культуры (24 часа) количества бактерий составляли 3,9×108 КОЕ/мл и при этом немного выше, чем когда оба штамма бактериофага исследовали вместе, это представляет собой 91,9% снижение жизнеспособных бактерий по сравнению с контрольной культурой бактерий Pseudomonas aeruginosa 433/07. Эта разница была недостаточной, чтобы связать ингибирующий эффект коктейля на штаммы бактериофага Pseudomonas aeruginosa F770/05 и литическую активность F510/08.

Бактериофаговый коктейль также исследовали против штамма Acinetobacter baumannii 1305/05, как показано на фиг. 6. К 2 часам инкубации бактериофаговый коктейль снижал количества бактерий приблизительно на 4 логарифмических единицы по сравнению с контрольной культурой бактерий 1305/05. К концу периода инкубации культуры (24 часа) количества бактерий достигли 8,6×108 КОЕ/мл, что представляет собой снижение на 92,8% по сравнению с контрольной культурой. Эти результаты указывают на лучшую активность указанного бактериофага в коктейле.

Результаты in vitro применения бактериофагового коктейля показали, что не наблюдается ингибирование инфицирующей способности каждого бактериофага вследствие присутствия различных бактериофагов отличающихся бактерий.

Результаты с применением модели на грызунах

Кратко повторим, что исследования, проведенные на грызунах, были одобрены на местном уровне Комитетом по этике отношений к животным Instituto de Medicina Molecular и на государственном уровне Главным управлением ветеринарной службы Португалии (Direccão Geral de Veterinária), согласно законодательству Португалии. Всех животных содержали в соответствии с Директивой ЕС 86/609/ЕС, законом Португалии (Закон Португалии 1005/92) и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (NRC 2011). Использовали предварительно оптимизированную модель раневой инфекции у грызунов на крысах линии Вистар с химически индуцированным сахарным диабетом (Mendes JJ, et al. 2012. Comp Med 62:1-12).

Как отмечено выше, на фиг. 2 проиллюстрирован протокол исследования. Кратко, после индукции и появления сахарного диабета лечение вводили на основании кривых лизиса штаммов бактериофага и аналогично дозировке антибиотиков, т.е. каждые 4 часа в течение первых 24 часов и затем один раз в день в течение 5 дней. Дозы были основаны на результатах, полученных в эпидемиологическом исследовании, проведенном ранее в диапазоне пациентов, собранных из различных стационаров Португалии (данные не показаны). Согласно указанному исследованию сделали вывод, что концентрация бактерий, которая инфицирует язвы диабетической стопы, находится в диапазоне от 106 до 108 - in vitro анализы показали, что значения MOI составляет 1 или 10 в зависимости от штамма бактериофага, так чтобы концентрация фага составляла 107-109 на см2 язвы.

Выбор модели инфицированной хронической раны был основан на том, факте, что бактериофаги реплицируются только на своем специфическом живом бактериальной хозяине, таким образом, было бессмысленным исследовать модели, где инфекция не будет хронической. Основной конечный показатель представлял собой микробиологическое снижение в ранах. Закрытие раны также измеряли, хотя различия в закрытии раны не всегда отражает действительное уменьшение дермального и эпидермального разрыва, если сравнивать результаты гистопатологических исследований с микробиологическими исследованиями.

Для преодоления проблем с отходами бактериофагов и появлением бактериальной резистентности, которые могут возникнуть в животных моделях, в связи с условиями окружающей среды и длительностью лечения, большие количества бактериофагов использовали в in vivo экспериментах, то есть, чтобы инокулировать раны и лечить животных. Количество бактериофаговых частиц, присутствующих в иллюстративном коктейле для in vivo применения, увеличивали на 1 log.

Микробиологический анализ

На фиг. 7 проиллюстрированы результаты анализов микробиологической нагрузки для контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

После индукционной терапии (t1), наблюдалась статистически значимое различие в количествах колоний в селективных средах между контрольными и исследуемыми подгруппами в инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii группах. На четвертый день после начала лечения (t4) наблюдалась статистически значимое различие в количестве колоний в селективных средах между контрольными и исследуемыми подгруппами. С t0 до t4 в инокулированных Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa контрольных подгруппах наблюдалась тенденция к снижению микробиологической нагрузки. А именно, получившие лечение с помощью бактериофагов животные показывали значительно более низкие количества, чем контрольные животные во всех трех группах в t1 и t4.

Кинетические параметры закрытия раны (планиметрия)

На фиг. 8 проиллюстрированы результаты анализов закрытия раны для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению. Раневую площадь оценивали в t1 и t9 и рассчитывали различия между двумя временными точками.

Планиметрический анализ ран на крысиной модели показал статистически значимое различие между раневыми площадями группы отрицательного контроля и всеми инокулированными контрольными подгруппами, с тенденцией к уменьшению раневой площади между контрольными и исследуемыми подгруппами во всех группах; и статистически значимое различие между раневыми площадями контрольных и исследуемых подгрупп в инокулированных S. aureus и инокулированных P. aeruginosa группах. А именно, лечение бактериофагом снижало размер раны в инфицированных как S. aureus, так и P. aeruginosa ранах (р<0,05).

Гистологический анализ

На фиг. 9 проиллюстрированы результаты гистологических анализов для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на крысиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

Наблюдалось статистически значимое различие между группой отрицательного контроля и всеми инокулированными контрольными подгруппами как в эпидермальном разрыве (EG), так и в дермальном разрыве (DG). Наблюдалось статистически значимое различие между EG контрольных и исследуемых подгрупп в инокулированных Staphylococcus aureus и инокулированных Pseudomonas aeruginosa группах (p<0,05). В DG различие между исследуемыми и контрольными подгруппами достигло статистически значимого уровня только в инокулированной Pseudomonas aeruginosa группе. Эти результаты коррелируют с тем фактом, что Pseudomonas aeruginosa проникает более глубоко в ткани, чем Staphylococcus aureus. Acinetobacter baumannii является колониеобразующим микроорганизмом, появляющимся у пациентов позже в процессе, поэтому важно, чтобы бактериофаговый коктейль согласно определенным вариантам осуществления содержал указанный бактериофаг.

Результаты с применением свиной модели

Результаты, аналогичные проиллюстрированным выше, получали с применением свиной модели. Для краткого напоминания, Предварительно оптимизированную свиную модель раневой инфекции у животного с химически индуцированным DM, как описано Hirsch et al. (Hirsch Τ, et al. 2008. BMC Surg 8:5), модифицировали, чтобы соответствовать потребностям настоящего исследования. Использовали трех животных (отрицательный контроль, инокулированного контролем и инокулированного исследуемым штаммом) с общим количеством 48 эксцизионных ран (12 ран отрицательного контроля, 12 инокулированных Pseudomonas aeruginosa ран, 12 инокулированных Staphylococcus aureus ран и 12 инокулированных Acinetobacter baumannii раны). Как отмечали выше, на фиг. 3 проиллюстрирован протокол исследования. Использовали такую же дозировку и схему дозирования, как в крысиной модели, описанной выше.

Микробиологический анализ

На фиг. 10 проиллюстрированы результаты анализов микробиологической нагрузки для контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

После индукционной терапии (t1), наблюдалось статистически значимое различие в количестве колоний в селективных средах между контрольными и исследуемыми подгруппами в инокулированных S. aureus и инокулированных P. aeruginosa группах и тенденция к снижению микробиологической нагрузки в среднем количестве колоний для инокулированных A. baumannii исследуемых и контрольных подгрупп (р<0,05). На четвертый день после начала лечения (t4) наблюдалось статистически значимое различие в количестве колоний между контрольными и исследуемыми подгруппами в инокулированных Staphyloccocus aureus и инокулированных Pseudomonas aeruginosa группах. Не наблюдалось статистически значимого различия в среднем количестве колоний в инокулированных Acinetobacter baumannii исследуемых и контрольных подгруппах, хотя наблюдалась тенденция к снижению количества колоний.

Кинетические параметры закрытия раны (планиметрия)

На фиг. 11 проиллюстрированы результаты анализов закрытия раны для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphylococcus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

Гистологический анализ

На фиг. 12 проиллюстрированы результаты гистологических анализов для отрицательных, контрольных (С) и исследуемых (Т) групп для инокулированных Staphyloccocus aureus, инокулированных Pseudomonas aeruginosa и инокулированных Acinetobacter baumannii животных, демонстрирующие in vivo эффективность на свиной модели иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению.

Наблюдалось статистически значимое различие между группой отрицательного контроля и всеми инокулированными контрольными подгруппами в отношении EG. Также наблюдалось статистически значимое различие между контрольными и исследуемыми подгруппами в инокулированных Staphyloccocus aureus и инокулированных Pseudomonas aeruginosa группах в отношении EG (p<0,05).

Обсуждение результатов

На основании предыдущих исследований на грызунах (Mendes JJ, et al. 2012. Comp Med 62:1-12), было известно, что количества бактериальных колоний в ткани, культивированной из инфицированных ран в t4, составляет в среднем 7,54±0,19 log (КОЕ) на язву. В настоящем исследовании использовали высокие дозы бактериофага (108-109 БОЕ на введение), что дает в результате множественность заражения, составляющую 10-100. Полагают, что эта начальная доза достаточно превышает целевую бактериальную популяцию, чтобы вызывать снижения без необходимости в репликации бактериофагов и завершении их жизненного цикла. Это противоположно предыдущим исследованиям бактериофаговой терапии, которые использовали относительно низкие дозы бактериофагов и, в основном, были основаны на активной терапии, которая предусматривает инфицирование фагами/циклы репликации для снижения количества целевой бактерии (Loe Carrillo С, et al., 2005, Appl Environ Microbiol. 71(11):6554-6563). Эти способы активной и пассивной бактериофаговой терапии были описаны для in vitro и in vivo исследований (Cairns BJ, et al., 2011, PLoS Pathog. 5(1):e1000253; и Hooton SP, et al., 2011, Int J Food Microbiol. 151(2):157-163).

Все три конечных результат улучшались с помощью лечения бактериофагами у животных, инфицированных S. aureus и P. aeruginosa, и снижение бактерий наблюдали у животных, инфицированных A. baumannii. Не ограничиваясь теорией, это можно объяснить исследованиями (например, Simoes LC, et al., 2008, Appl Environ Microbiol. 74(4): 1259-1263), в которых было обнаружено, что присутствие видов Acinetobacter в популяции биопленок облегчало поверхностную колонизацию другими видами, а именно, видами Staphylococcus. Результаты в настоящем документе согласуются с этими данными, в которых избыток бактерий, растущих в неселективных средах в инокулированных А. baumannii группах определяли как преимущественно виды Staphylococcus.

В настоящей работе количества бактерий оценивали в t4 (4 день после начала лечения), и количества колоний значительно отличались для S. aureus и P. aeruginosa исследуемых условий по сравнению с контролем, особенно в отношении P. aeruginosa. Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями (например, Mendes JJ, et al. 2012. Comp Med 62:1-12; и Fazli M, et al., 2009, J Clin Microbiol. 47(12): 4084-4089). В частности, Fazli и соавт. использовали конфокальную лазерную сканирующую микроскопию клинических образцов биопсии раны для демонстрации того, что расстояние от агрегатов P. aeruginosa до поверхности раны было значительно больше, чем расстояние агрегатов S. aureus, что привело к недооценке последнего в образцах мазков. Это наблюдение подтверждает возможность того, что факторы, присущие каждому патогенному бактериальному штамму, могут вносить вклад в различия между исследованиями, которые сравнивают рост культур из образцов мазков и тканей.

Планиметрические исследования выявили статистически значимые различия между контрольными и исследуемыми группами, обработанными S. aureus и P. aeruginosa, и такую же тенденцию наблюдали для A. baumanni. Эти результаты были аналогичны измерениям EG и DG в собранных гистологических образцах.

Важно отметить, что результаты, полученные в модели на грызунах, в большой степени подтвердились экспериментами на свиньях, поскольку свиньи считаются идеальной большой животной моделью для исследования кожного заболевания (Greenhalgh DG., 2005, J Burn Care Rehabil. 26(4):293-305). В обеих моделях наблюдалось значительное снижение количеств бактерий в обеих временных точках (t1 и t4) для инфекций S. aureus и P. aeruginosa.

Значительные результаты наблюдали в инокулированных S. aureus и инокулированных P. aeruginosa исследуемых животных в отношении измерений EG.

Соответственно, это исследование подтверждает, что содержащий бактериофаги ТАТ предусматривает осуществимое лечение для DFI, включая в себя инфекции, вызванные резистентными к лекарственным средствам бактериями, предлагая эффективный новый терапевтический подход к разрешению серьезных проблем, связанных с DFI и другими хроническими инфекциями кожи и мягких тканей. А именно, лечение бактериофагами эффективно снижало количества бактериальных колоний и улучшало заживление раны, на что указывали уменьшенные эпителиальные и дермальные разрывы, в инфекциях Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, и, таким образом, вводимое местно лечение бактериофагами является эффективным в разрешении хронических инфекций, особенно при применении совместно с иссечением нежизнеспособных тканей.

Токсикологическая программа для первого исследования на людях

4-недельное исследование кожного раздражения на карликовых свиньях, как показано ниже, было предложено для поддержки начального клинического исследования. Если необходимо, также могут провести 4-недельное внутривенное (iv) исследование на крысах, хотя считают, что внутривенное исследование не приводит к какому-либо заключению, поскольку штаммы бактериофага не реплицируются, если они находятся при отсутствии специфических бактерий; внутривенное исследование, тем не менее, может подтвердить это предположение, а также, что штаммы бактериофага являются безопасными, когда их вводят в намного больших количествах (так как применение во внутривенном исследование такой же дозы, что и для местного нанесения, отражает намного большую дозу по сравнению с максимально возможной абсорбцией).

4-недельное исследование кожного раздражения у карликовых свиней 4-недельный период восстановления(GLP)

Схема исследования включает в себя 5 самок карликовых свиней, где путь введения дозы является дермальным (2 участков/сторона; обернутых/промытых) с частотой один раз в день. Препарат дозы подлежит использованию в том виде, в котором получен. Наблюдения проводят дважды в день (смертность/заболеваемость), при этом подробное клиническое наблюдение проводят раз в неделю, включая в себя измерение массы тела. Физические исследования проводит сотрудник-ветеринар на всех животных до начала введения иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению, в качестве исследуемого изделия (ТА).

Для оценки кожной реакции, каждое животное оценивают в отношении эритемы и отека ежедневно перед введением каждой дозы, начиная со 2 дня. Любые не включенные в исследование местные поражения также отмечают и описывают. Используют шкалу Дрейза для сортировки кожного раздражения следующим образом. Для эритемы и образование струпа - 0 означает отсутствие эритемы; 1 означает очень слабую эритему (едва заметную); 2 означает хорошо определяемую эритему; 3 означает эритему от средней до тяжелой; тогда как 4 означает тяжелую эритему (бордовое покраснение) до образования слабого струпа (повреждения в глубине). Для образования отека - 0 означает отсутствие отека; 1 означает очень слабый отек (едва заметный); 2 означает слабый отек (края области хорошо определяются по отчетливому возвышению); 3 означает средний отек (поднятый приблизительно на 1 мм); тогда как 4 означает тяжелый отек (поднятый больше чем на 1 мм и выходящий за пределы области воздействия). Если вскрытие не проводят, то животное возвращают в стадо.

Точечные биопсии проводят для гистологических анализов. Три образца (нативный, плацебо, ТА) из левого бока собирают на 29 день; 3 образца с правого бока собирают на 57 день; все образца консервируют, обрабатывают до срезов и микроскопически оценивают. Анализ состава предусматривает сертификат анализа, предоставленный третьей стороной.

4-недельное исследование кожной токсикологии на крысах, 4-недельный период восстановления (GLP)

Схема исследования предусматривает схему дозирования для введения иллюстративной композиции фагового коктейля согласно настоящему изобретению, как представлено в таблице ниже.

Дополнительные животные/пол/группа лечения включены в качестве замещающих животных.

Путь введения дозы представляет собой внутривенный болюс с частотой один раз в день. Препарат дозы подлежит использованию в том виде, в котором получен. Наблюдения проводят дважды в день (смертность/заболеваемость), тогда как подробное клиническое наблюдение проводят раз в неделю, включая в себя измерение массы тела. Расход пищи также производят раз в неделю.

Офтальмологические исследования проводят на всех животных перед исследованием и на всех выживших в основном исследовании животных при завершении исследования и восстановления. Клинические патологические исследования, включая в себя гематологию, коагуляцию, клиническую химию и анализ мочи, проводят на всех выживших в основном исследовании животных один раз при терминальном вскрытии или вскрытии после восстановления. Исследования при вскрытии проводят на всех животных в основном исследовании и животных в фазе восстановления; животных ТК умерщвляют и отбраковывают. Массы органов определяют для надпочечников, мозга, сердца, почек, печени, легких, яичников, гипофиза, предстательной железы, слюнных желез, семенных пузырьков, селезенки, щитовидной и паращитовидной железы, тимуса, яичек и матки.

Получение срезов и микроскопическое патологическое исследование проводят для всех животных в группах контроля инертным носителем и группах с высокими дозами, а также для всех обнаруженных мертвыми животных, и включает в себя получение полного набора стандартных тканей (приблизительно 65) и целевых органов в группах с низкими и средними дозами, и для всех животных в фазе восстановления. Получение срезов и микроскопическое патологическое исследование также проводят на обширных поражениях от всех животных.

Используют стандартные статистические анализы. Также используют стандартные параметры для токсикокинетического анализа, такие как AUC, t1/2, tmax и Cmax.

Клинические исследования

Клиническое испытание/обоснованность концепции

На фиг. 13 проиллюстрированы классификации инфекций диабетической стопы и применение к ним фаговой терапии с применением иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению. В основном, композицию бактериофагового коктейля согласно настоящему изобретению наносят на язвы 2-3 степени на основании классификации PEDIS. Введение предусматривает применение наносимого местно жидкого состава после иссечения нежизнеспособных тканей раны.

На фиг. 14 проиллюстрирована схема клинического исследования для иллюстративных композиций фагового коктейля согласно настоящему изобретению для применения в терапии язв диабетической стопы. Тип исследования является интервенционным с интервенционной моделью параллельной оценки; схема исследования предусматривает рандомизированное распределение с открытой маскировкой; классификация конечных результатов включает в себя безопасность и эффективность, при этом основной целью является лечение. Основные критерии эффективности включают в себя микробиологическую нагрузку ткани (биопсия); микробиологическую нагрузку раневой жидкости (временной интервал: с каждой заменой пенной повязки); и микробиологическую нагрузку ткани (временной интервал: 24-ый/3-ый день/5-ый день/клинические признаки нет/есть). Второстепенные критерии эффективности включают в себя оценку раны каждый визит для последующего наблюдения (временной интервал 4 недели и 12 недель).

После визита скринингового обследования и иссечения нежизнеспособных тканей ран подходящие для участии в исследовании пациенты рандомизированно получают плацебо или композицию бактериофагового коктейля согласно настоящему изобретению в нанесением 109 фаги/см2/нанесение в течение 4 ч/4 ч первых 24 часов и затем один раз в день в течение 5 дней. Безопасность и эффективность лекарственного средства сравнивают с группой плацебо; тем не менее, если определяют, что пациент подвергается риску необходимости проведения ампутации, пациента также могут включить в группу терапии.

Критерии включают в себя следующие критерии включения и исключения. Критерии включения включают в себя клиническую бактериальную инфекцию в месте язвы степени 2 или 3 согласно классификации PEDIS и отсутствие противопоказаний для терапии раны отрицательным давлением. Критерии исключения включают в себя местное нанесение на рану любых средств для профессионального ухода за раной (например, применение фактора роста) в течение предыдущих 7 дней.

Определенные модификации и улучшения станут очевидными для специалистов в настоящей области техники при чтении вышеизложенного описания. Следует понимать, что все такие модификации и улучшения были удалены из настоящего документа с целью сжатости и удобочитаемости, однако соответствующим образом находятся в объеме последующей формулы изобретения.

Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки в настоящий документ для всех целей.

1. Композиция в терапевтически эффективном количестве для лечения инфекции, вызванной Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii, содержащая:

первый и второй очищенные штаммы бактериофага, причем каждый из указанных штаммов имеет геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, и демонстрирует антибактериальную активность против Staphylococcus aureus;

третий очищенный штамм бактериофага, имеющий геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:3, и демонстрирующий антибактериальную активность против Pseudomonas aeruginosa;

четвертый очищенный штамм бактериофага, имеющий геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, и демонстрирующий антибактериальную активность против Pseudomonas aeruginosa;

пятый очищенный штамм бактериофага, имеющий геном, характеризующийся по меньшей мере 99%-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, и демонстрирующий антибактериальную активность против Acinetobacter baumannii;

при этом каждый из указанных первого, второго, четвертого и пятого штаммов бактериофага присутствует в композиции в количестве приблизительно в 10 раз больше, чем третий штамм бактериофага.

2. Композиция по п. 1, причем указанная композиция составлена для местного применения.

3. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая дополнительное средство, причем указанное дополнительное средство выбрано из группы, состоящей из антибиотика, противовоспалительного средства, противовирусного средства, местноанестезирующего средства, фактора роста и кортикостероида.

4. Композиция по п. 2 или 3, причем указанная композиция предусмотрена для применения в лечении бактериальной инфекции, связанной с областью неинтактной кожи и вызванной одной или несколькими из Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus.

5. Композиция по n. 4, причем указанная область неинтактной кожи выбрана из диабетической язвы, кожной язвы, хронической язвы, ожоговой раны, воспаления подкожной клетчатки, рожистого поражения, пролежня и намина.

6. Композиция по п. 4, причем указанная композиция составлена таким образом, чтобы предоставить указанный третий штамм бактериофага в количестве 103-1013 фаговых частиц/см2 указанной области при ее местном применении.

7. Композиция по п. 4, причем указанная композиция составлена таким образом, чтобы предоставить указанный третий штамм бактериофага в количестве 107-109 фаговых частиц/см2 указанной области при ее местном применении.

8. Композиция по п. 7, причем указанная композиция составлена таким образом, чтобы предоставить указанный третий штамм бактериофага в количестве 107 фаговых частиц/см2 указанной области при ее местном применении.

9. Композиция по п. 7, причем указанная композиция составлена таким образом, чтобы предоставить указанный третий штамм бактериофага в количестве 108 фаговых частиц/см2 указанной области при ее местном применении.

10. Композиция по п. 7, при этом указанная композиция составлена таким образом, чтобы предоставить указанный третий штамм бактериофага в количестве 109 фаговых частиц/см2 указанной области при ее местном применении.

11. Композиция по п. 1, причем указанная композиция составлена для местного применения, при этом указанная композиция предусмотрена для применения в лечении бактериальной инфекции, связанной с областью неинтактной кожи, и предоставляет указанный третий штамм бактериофага в количестве 108 фаговых частиц/см2 указанной области при ее местном применении.

12. Способ лечения бактериальной инфекции у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп. 1-11, при этом указанная бактериальная инфекция вызвана одной или несколькими из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и/или Acinetobacter baumannii.

13. Способ по п. 12, при котором указанная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus.

14. Способ по п. 12 или 13, при котором композицию применяют местно.

15. Способ по п. 12 или 13, при котором субъект представляет собой человека.

16. Способ по п. 12 или 13, при котором указанная бактериальная инфекция связана с хронической язвой, ожоговой раной, инфекцией диабетической стопы; и/или

при котором указанная бактериальная инфекция связана с областью неинтактной кожи, выбранной из повреждения кожи, связанного с воспалением подкожной клетчатки, рожистым поражением, пролежнем и намином.

17. Способ по п. 16, при котором указанная бактериальная инфекция ассоциирована с инфекцией диабетической стопы, которая представляет собой кожную язву, и указанную композицию наносят местно.

18. Способ по п. 17, при котором указанное введение следует за механическим иссечением нежизнеспособных тканей указанной язвы; и/или при котором указанное введение предусматривает применение по меньшей мере одного из повязки, инсталляционного устройства и прибора для терапии ран отрицательным давлением.

19. Способ по п. 17, при котором указанную композицию вводят каждые 4 часа или каждые 6 часов в течение первых 24 часов.

20. Способ по п. 19, при котором после указанных первых 24 часов фармацевтическую композицию вводят каждые 12 часов или каждые 24 часа в течение по меньшей мере 3 или 4 дополнительных дней.

21. Способ по любому из пп. 17-20, причем указанный способ применяют в комбинации со стандартной терапией для инфекции диабетической стопы.

22. Способ по п. 21, причем указанную стандартную терапию выбирают из группы, состоящей из заместительной терапии внеклеточным матриксом, влажной терапии раны, терапии раны отрицательным давлением, терапии путем артериальной реваскуляризации, гипербарической оксигенотерапии, введения антибиотика и введения фактора роста.

23. Способ по п. 22, при котором указанная влажная терапия раны предусматривает применение пленки с адгезивной основой, покрытой силиконом пены, гидрогеля и/или гидроколлоида;

при котором указанная заместительная терапия внеклеточным матриксом предусматривает применение биоконструкционной ткани;

при котором указанный антибиотик характеризуется антибактериальной активностью против Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus; и/или

при котором указанный фактор роста представляет собой по меньшей мере один фактор роста, выбранный из группы, состоящей из тромбоцитарного фактора роста, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, эпидермального фактора роста, фактора роста фибробластов, фактора роста нервов и фактора роста сосудистого эндотелия.

24. Способ по п. 23, при котором указанный фактор роста вводят путем местного применения.

25. Способ по любому из пп. 17-20, причем указанный способ используют в комбинации с нестандартной терапией для инфекции диабетической стопы, причем указанная инфекция диабетической стопы рефрактерна к стандартной терапии.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится в области нанотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Описан способ получения нанокапсул витаминов А, С, Е, D или Q10 в оболочке из низкоэтерифицированного или высокоэтерифицированного яблочного или цитрусового пектина.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию, состоящую из полигексаметиленбигуанида, очищенной воды и по меньшей мере одного полоксамера для применения в местном и/или оромукозном лечении ран.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии. Описан фрагмент антитела для использования в качестве терапевтического средства, содержащий один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация): Серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; Серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и Треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или Серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; Треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и Серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или Серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; Треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и Треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложена противораковая наночастица, предназначенная для направленной доставки, включающая противораковое лекарственное средство, сывороточный альбумин и порфириновое соединение в качестве компонента, осуществляющего направленную доставку к опухоли.

Изобретение относится к новой кристаллической форме В (S)-4-амино-N-(1-(4-хлорфенил)-3-гидроксипропил)-1-(7Н-пирроло[2,3-d]-пиримидин-4-ил)пиперидин-4-карбоксамида (соединение (I), проявляющей ингибирующую активность в отношении PKB (протеинкиназы В).

Настоящая группа изобретений относится к медицине, в частности к фармацевтической композиции левокабастина или его соли и флутиказона фуроата для лечения воспалительного и/или аллергического состояния, в особенности ринита; к устройству для интраназальной доставки фармацевтической композиции; к способу лечения аллергического ринита; применению фармацевтической композиции для лечения пациентов с воспалительным и/или аллергическим состоянием, а также к способу лечения человека с воспалительным и/или аллергическим состоянием.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой пероральную композицию для борьбы с эндопаразитами у человека или животных, содержащую эмодепсид в аморфном состоянии в поливинилпирролидоновой матрице в форме экструдата расплава или совместного осадка.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана молекула нуклеиновой кислоты, содержащая двухцепочечную структуру,где двухцепочечная структура образована первой цепью и второй цепью, где первая цепь состоит из следующей нуклеотидной последовательности:5'-acGaGcUgGaCcAcUgGuCdTSdT-3' и вторая цепь состоит из следующей нуклеотидной последовательности:5'-GAcCaGuGgUcCaGcUcGudTSdT-3', где то, что нуклеотид указан строчной буквой, указывает на то, что нуклеотид является 2'-F-модифицированным, и подчеркивание нуклеотида указывает на то, что нуклеотид является 2'-O-метил-модифицированным и где dTSdT указывает на то, что на 3'-конце присоединен динуклеотид, состоящий из двух нуклеотидов dT, где указанные два dT ковалентно связаны посредством фосфотиоатной связи.

Фармацевтическая композиция содержит 11-дезокси-простагландиновое соединение и эфир жирной кислоты, полученный из жирной кислоты, имеющей С6-С24 атомов углерода и глицерина.

Изобретение относится медицине, в частности к стабильной фармацевтической комбинированной композиции, содержащей метформин, используемый для лечения неинсулинзависимого диабета, и ингибитор HMG-CoA-редуктазы, используемый для лечения дислипидемии, а также к способу получения устойчивой комбинированной композиции.

Группа изобретений относится к области ветеринарии, в частности к композиции, способу приготовления композиции и набору для защиты животных от инфекционных болезней, вызываемых простейшими.

Группа изобретений относится к вариантам штамма молочнокислых бактерий и их применению. Предложен штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25972, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25987, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus 25988, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25989 и штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25973.

Изобретение относится медицине, в частности к стабильной фармацевтической комбинированной композиции, содержащей метформин, используемый для лечения неинсулинзависимого диабета, и ингибитор HMG-CoA-редуктазы, используемый для лечения дислипидемии, а также к способу получения устойчивой комбинированной композиции.

Изобретение раскрывает новые соединения замещенных пиразолонов формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли, которые ингибируют активность протеин тирозинкиназы и модулируют клеточную активность, например быстрое увеличение, дифференцирование, апоптоз, миграцию и инвазию.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани, что может быть использовано в медицине. Субъекту вводят эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей (а) вещество, уменьшающее коллаген, (b) вещество для специфической доставки уменьшающего коллаген вещества к коллаген-продуцирующим клеткам фиброзной ткани и трансплантируют стволовые клетки в пространство для роста и дифференцировки стволовых клеток.

Изобретение относится к биохимии. Описана комбинация иммуноконъюгата, который содержит(i) первое антитело, направленное на фибробласт-активирующий белок (FAP) и включающее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 12 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 11, вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 16, вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 47 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 46, вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 63 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 62 или вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 67 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 66 или направленное на карциноэмбриональный антиген (СЕА) и включающее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 114 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 115, где первое антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG-класса и включает аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (EU-нумерация, представленная у Кэбота) в тяжелых цепях иммуноглобулина, и(ii) молекулу мутантного человеческого IL-2, содержащую аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G,и второго антитела, выбранного из группы(i) антитела IgG-класса, направленного на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), содержащего вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 102 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 103, где антитело сконструировано таким образом, чтобы оно имело повышенное соотношение нефуколизированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с несконструированным антителом,(ii) антитела IgG-класса к HER3, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 142 и вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 146, где антитело сконструировано таким образом, чтобы оно имело повышенное соотношение нефуколизированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с несконструированным антителом, и(iii) цетуксимаба,для применения при лечении рака у нуждающегося в этом индивидуума.

Изобретение относится к биохимии. Описано рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к биохимии. Описано антитело, которое специфично связывается с IL-6, где это антитело включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.

Группа изобретений относится к области медицины и предназначена для обработки ран и/или для использования при хирургических операциях. Антисептическая композиция содержит один или несколько антисептиков, от около 5 до около 10% мас.

Изобретение относится к области дерматологии и представляет собой композицию в виде крема для лечения двух или более симптомов розацеа, выбранных из эритемы, телеангиоэктазии или воспалительных поражений кожи, содержащую терапевтически эффективное количество оксиметазолина или его фармацевтически приемлемой соли и от приблизительно 1 мас.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят, включающий получение антигенов путем выделения из пораженных органов телят и поросят эпизоотических штаммов Escherichia coli, продуцирующих экзотоксины, гемолитических штаммов Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивание которых проводят раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего их инактивируют формалином до его конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, где после инактивации формалином антигенов осуществляют стерилизующую фильтрацию бульонной культуры Escherichia coli для получения бесклеточной культуральной среды, содержащей токсины Escherichia coli, которую смешивают с культуральными средами, содержащими клетки гемолитических штаммов Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, при следующем соотношении компонентов, мас.

Настоящее изобретение относится к области фаговой терапии и касается композиции и способа ее использования. Представленная композиция содержит: первый и второй очищенные штаммы бактериофага, причем каждый из указанных штаммов имеет геном, характеризующийся по меньшей мере 99-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, демонстрирующие антибактериальную активность против Staphylococcus aureus; третий и четвертый очищенные штаммы бактериофага, имеющие геном, характеризующийся по меньшей мере 99-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно, демонстрирующие антибактериальную активность против Pseudomonas aeruginosa; и пятый очищенный штамм бактериофага, имеющий геном, характеризующийся по меньшей мере 99-ной идентичностью последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, демонстрирующий антибактериальную активность против Acinetobacter baumannii. При этом каждый из указанных первого, второго, четвертого и пятого штаммов бактериофага присутствует в композиции в количестве приблизительно в 10 раз больше, чем третий штамм бактериофага. Представленный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества указанной композиции. Изобретения могут быть использованы для лечения и контроля бактериальных инфекций, вызванных одной или несколькими из Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, в частности, инфекций диабетической стопы. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл.

Наверх