Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu



Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu
Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией her2/neu

Владельцы патента RU 2655965:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России) (RU)
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" (ФГАОУ ВО НИ ТПУ) (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами DARPin для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, включающего связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, где на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией. На втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin последовательно добавляют раствор технеция-99м, свежеприготовленный раствор цитрата натрия, свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата и инкубируют при комнатной температуре. Изобретение обеспечивает получение целевого продукта с высокой радиохимической чистотой и выходом. 9 ил., 2 табл., 18 пр.

 

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu.

Значительное место в диагностике занимают радиофармацевтические препараты на основе изотопа технеция-99 м, обладающие оптимальными периодом полураспада (6 часов) и типом излучения (γ-излучение, энергия 140 кэВ). При использовании препаратов для высокоточной доставки к мишени радиоизотопа Тс-99m возможно существенное снижение его концентрации, что обеспечит снижение дозовой нагрузки на пациента и медицинский персонал.

В настоящее время радиоизотоп технеция (99mTc), получаемый непосредственно в клиниках из генератора 99Мо/99mTc, является наиболее приемлемым по цене и идеальным по физико-химическим характеристикам для создания РФП с целью проведения диагностики с использованием доступных γ-камер в медицинской практике.

Одним из наиболее изученных и часто упоминаемых в литературе опухолевых антигенов является поверхностный рецептор HER2/neu. HER2/neu - ракоассоциированный антиген клеточной поверхности, который гиперэкспрессирован во многих человеческих карциномах, таких как рак молочной железы, легких, желудка, яичников, простаты. К этому антигену разработан ряд моноклональных антител, пригодных для применения в диагностических и терапевтических целях. Перспективными являются мини-антитела DARPin, являющиеся рекомбинантными гуманизированными мини-антителами, специфичными к раковоассоциированному антигену HER2/neu [1-3].

Известны некоторые методы мечения белковых молекул (в том числе моноклональных антител, мини-антител) радионуклидом технецием-99м. Наиболее эффективным считается мечение с использованием химической модификации биомолекул химическими соединениями - прекурсорами, содержащими хелатные центры для связывания металлов, которые способны образовывать достаточно прочные координационные связи.

Поэтому главным в разработке синтеза таких радиофармпрепаратов является введение в структуры пептидов прекурсоров - лиганд с высокой хелатирующей способностью для прочного связывания технеция-99м, в качестве которых успешно могут применяться ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатические кислоты.

Таким образом, разработка способа получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu является актуальной.

Известны способы радиомечения радионуклидами иодом-125 и индием-111 мини-антител DARPin (G3) для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu [2]. В данном способе получения используют DARPin (G3), коньюгированный с DOTA, для связывания с радионуклидом индия-111, мечение проводят в буферном растворе в присутствии индия-111 хлорида при инкубировании при 37°С в течение 2 часов. Радиохимическая чистота до очистки составляет 70-80%, после очистки более 95%. Мечение иодом-125 мини-антител DARPin (G3) проводят прямым способом - иодированием остатков тирозина при комнатной температуре в течение 10 мин. Радиохимическая чистота до очистки 60-70%, после очистки более 95%. Данные способы отличаются применением других радионуклидов и хелатирующего реагента (DOTA), однако не показана устойчивость к дегалогенированию в организме меченого иодом-125 DARPin (G3).

Известен способ получения комплекса [99mTc(СО)3]+ - G3DARPin-His6, который характеризуется в 3,5 раза выше уровнем поглощения в опухолевых клетках с гиперэкспрессией HER2/neu по сравнению с HER2/neu - отрицательными клетками in vivo [4]. Однако недостатком этого комплекса является то, что комплекс [99mTc(СО)3]+ - G3DARPin-His6 в организме не показал оптимальное соотношение опухоль-печень и опухоль-кровь. В данном способе получения используют прямое связывание аквакарбонильного комплекса технеция-99м ([99mTc(СО)3]+) с G3DARPin-His6 без хелатирующих реагентов, недостатком прямого мечения является низкая стабильность такого комплекса в плазме крови.

В способе получения комплекса технеция-99м со специфичными белками описан способ мечения с использованием другого реагента - олова фторида с добавлением хлористоводородной кислоты [5]. Радиохимическая чистота находится в пределах от 96 до 98%, радиохимический выход более 92%. В данном методе мечения использовали белки, не являющиеся мини-антителами, однако применение методики мечения технецием-99м белковых веществ в присутствии олова фторида характеризуется хорошими выходами, стабильными комплексами с высокой чистотой.

Также известен способ получения комплекса технеция-99м со специфичными белками (affibody molecules), в котором используют для мечения олова хлорид, кальция глюконат и эденат натрия [6]. Мечение проводят в фосфатном буфере после добавления элюата с генератора технеция-99м (400-500 МБк) при инкубировании смеси при 90°С 60 мин. В описанном способе указаны высокие выходы и чистота радиохимического продукта. Однако использованы иные белковые вещества, а не мини-антитела DARPin, а также условия мечения являются жесткими, высокая температура приводит к деструкции белковых веществ.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения комплекса [99mTc(СО)3]+ - DARPin, который заключается в прямом связывании 99mTc(СО)3]+ с мини-антителами DARPin [7]. В патенте предложен способ получения терапевтического радиоконъюгата, специфически связывающегося вещества с короткоживущим альфа-излучающим радиоизотопом для его доставки в патологические области. При этом осуществляют мечение рекомбинантных гуманизированных мини-антител, специфичных к раковоассоциированному антигену HER2/neu, диагностическим гамма-излучающим радиоизотопом, а именно аквокарбонильным комплексом Тс-99m, проводят конъюгирование мини-антител с человеческим сывороточным альбумином, очищают полученный конъюгат, вводят в состав конъюгата хелатирующий агент DOTA (1,4,7,10 - тетраазициклододекан тетрауксусной кислоты) или DTPA (диэтилентриамин пентауксусной кислоты), проводят мечение полученного конъюгата терапевтическими радиоизотопами, а именно короткоживущими альфа-излучающими радиоизотопами, и очищают полученный препарат. В указанном способе используют для мечения изотоп конъюгата аквокарбонильный комплекс Тс-99m, являющий труднодоступным. Также в указанном методе мечения используется прямой способ мечения мини-антител технецием-99м без использования хелатирующих агентов, что снижает устойчивость полученного комплекса мини-антител с радионуклидом в живом организме, поскольку радионуклид может переходить к белкам плазмы крови, образуя более прочные комплексы.

Новый технический результат - повышение селективности, универсальности доступности способа, повышение выходов устойчивых продуктов.

Для достижения нового технического результата в способе получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, заключающемся в связывании технеция-99м с мини-антителами DARPin, причем на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в Tris-буферном растворе, в растворе ДМСО или ДФМА, при этом используют растворы мини-антител DARPin в Tris-буфере или фосфатном буфере с pH 8,3-8,5, реакацию проводят при перемешивании 4 часа при комнатной температуре, далее выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С, модификацию проводят при соотношении мини-антител - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом - 1:5-20, далее очистку модифицированных мини-антител проводят с помощью гель-фильтрации на колонке с Superdex-75, на втором этапе проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin в количестве 50 мкг в буферном растворе при pH 8,3-8,5 последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м в количестве 300-1200 МБк и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией - 100 мг/мл (4 мг) и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл (0,21 мг) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Получают комплекс технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами с радиохимической чистотой более 96%.

Пример 1. Получение метилового эфира ω-иодгексановой кислоты

К раствору циклогексанона в 10 мл метанола (6 ммоль, 0,588 г, ρ=0,946 г/см3) добавляют иод (3 ммоль, 0,762 г), катализатор меди (I) хлорида (0,6 ммоль, 0,06 г). Затем при перемешивании при комнатной температуре по каплям вносят раствор пероксида водорода в метаноле (12 ммоль, 1,275 г пергидроля (32%-ного Н2О2, ρ=1,125 г/см3) в 5 мл метанола) в течение 4 часов. Далее добавляют 12 ммоль (1,275 г) пергидроля и меди (I) хлорида (0,3 ммоль, 0,03 г), перемешивают при комнатной температуре 10 часов и после этого добавляют еще 6 ммоль (0,638 г) пергидроля при перемешивании еще 6 часов в тех же условиях.

К реакционной смеси добавляют насыщенный раствор натрия гидрокарбоната до прекращения выделения углекислого газа и натрия сульфит для окисления остатка иода. Далее реакционную смесь фильтруют, отбрасывая осадок, содержащий соли меди (I), хлориды и иодиды. Полученный фильтрат экстрагируют этилацетатом (2×10 мл). Этилацетатное извлечение осушают путем пропускания через натрий сульфат безводный и растворитель отгоняют. Полученную светло-желтую маслообразную массу сушат под вакуумом. Выход 1,248 г (81%). Спектр ЯМР 1Н (500 MHz, CDCl3, δ, м.д.): 3,67 (с, 3Н), 3,18 (т, 2Н), 2,32 (т, 2Н), 1,84 (кв, 2Н), 1,62 (кв, 2Н), 1,43 (кв, 2Н) (фиг. 5).

Пример 2. Получение метилового эфира 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты

К метиловому эфиру ω-иодгексановой кислоты (2,37 ммоль, 0,6068 г), полученному по примеру 1, добавляют 500 мкл (2,76 ммоль) 2-(дипикалил)амина, 2 мл изопропанола и 330 мкл (2,37 ммоль) триэтиламина. Реакционную массу перемешивают при 55°С в течение 24 часов. Конец реакции определяют методом тонкослойной хроматографии (элюент : этилацетат-этанол = 10:3).

После к реакционной массе добавляют 5 мл 10% раствора соды и экстрагируют этилацетатом (2×5 мл). Этилацетатное извлечение промывают рассолом, сушат с безводным натрия сульфатом и растворитель отгоняют. Полученный продукт подвергают очистке методом колоночной хроматографии на силикагеле с использованием в качестве элюента смеси гексан - этилацетат (1:1), постепенно повышая градиент последнего. Выход продукта составил 86%.

Для идентификации синтезированного метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата был получен 1Н-ЯМР-спектр, вид которого соответствует структуре синтезированного эфира (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц): 8,48 (д, 2Наром, J = 4,8 Гц), 7,61 (т, 2Наром), 7,48 (д, 2Наром, J=7,8 Гц), 7,11(т, 2Наром), 3,8 (с, СН2), 3,67 (с, СН3), 2,52 (т, СН2), 2,24 (т, СН2), 1,52 (м, СН2), 1,25 (м, СН2) (фиг. 6). MS (ESI)-m/z: (М+Н)+ - найдено: 328,2032, (М+Н)+- вычислено: 328,2020 (фиг. 6 и 7).

Пример 3. Методика синтеза 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты (фиг. 1)

Метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат 0,053 г (0,16 ммоль) растворяют в 2 мл ацетонитрила и добавляют 50 мкл HCl (36%). Реакционную массу перемешивают в течение 2 часов при температуре 50°С. Конец реакции определяют методом тонкослойной хроматографии (элюент : этилацетат - этанол = 10:3). После окончания гидролиза растворители отгоняют при пониженном давлении. Выход продукта составил 96%. Для идентификации синтезированной 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты был получен 1Н-ЯМР-спектр, вид которого соответствует структуре синтезированной кислоты (300 МГц, H2O, δ, м.д., J, Гц): 8,65 (д, 2Наром, J=5,7 Гц), 8,4 (т, 2Наром), 7,97 (д, 2Наром, J=9,1 Гц), 7,89 (т, 2Наром), 4,24 (с, СН2), 2,20 (т, СН2), 1,40 (м, СН2), 1,10 (м, СН2) (фиг. 8). MS (ESI)-m/z для C18H24N3O2: (М+Н)+ - найдено: 314,1879; (М+Н)+ - вычислено: 314,1869 (фиг. 9).

Пример 4. Методика синтеза сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата (фиг. 2)

0,4 г (1,14 ммоль) 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты смешивают с 2 мл тетрагидрофурана, затем добавляют 160 мкл (1,14 ммоль) триэтиламина и перемешивают 30 минут. После добавляют 0,1575 г (1,4 ммоль) г N-гидроксисукцинимида и 0,2889 г (1,4 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида. Перемешивают 48 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок N,N-дициклогексилмочевины отфильтровывают. В фильтрате отгоняют тетрагидрофуран, к полученному маслу добавляют 3 мл воды и экстрагируют метиленхлоридом (3×5 мл). Метиленхлоридное извлечение сушат над безводным натрия сульфатом и растворитель отгоняют. Полученную светло-коричневую маслообразную массу сушат под вакуумом. Выход продукта составил 83%.

Для идентификации синтезированного сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата был получен 1Н-ЯМР-спектр, вид которого соответствует структуре синтезированного эфира (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц): 8,49 (д, 2Наром, J=5,7 Гц), 7,67 (т, 2Наром), 7,51 (д, 2Наром, J = 7,8 Гц), 7,11 (т, 2Наром), 3,81 (с, 4Н, СН2), 2,81 (с, 4Н, СН2), 2,53 (т, 4Н, СН2), 1,50-1,71 (м, 4Н, СН2), 1,32-1,41 (м, 2Н, СН2) (фиг. 3). MS (ESI)-m/z для C22H27N4O4: (М+Н)+ - найдено: 411,2113; (М+Н)+ - вычислено: 411,2020 (фиг. 4).

Пример 5. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,1

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH=8,1) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 79%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 7,8%.

Пример 6. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,3

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,3) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 94%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 4,8%.

Пример 7. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при рН 8,5

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH=8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 97%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 2,8%.

Пример 8. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,7

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,7) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 89%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 8,8%.

Пример 9. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом при pH 8,9

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,9) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 75%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 10,5%.

Пример 10. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в 5 ммоль Tris-буфере

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH=8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в Tris-буфере (концентрация 6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 95%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 3,2%.

Пример 11. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в присутствии ДМСО

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в буфере (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМСО (6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 96%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 3,1%.

Пример 12. Методика модификации мини-антител DARPin активированным эфиром - сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноатом в фосфатном буфере

К 100 мкл раствора DARPin (концентрация 3 мг/мл) в фосфатном буфере (7 мМ NaH2PO4, 3 мМ Na2HPO4, 350 мМ NaCl, pH 8,5) добавляют 10 мкл раствора сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата в ДМФА (концентрация 6,7 мг/мл). Пробу перемешивают и инкубируют 4 часа при комнатной температуре. Далее пробу выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С. Очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 96%. Активность 99mTc, связанного на коллоиде (СК), составила 3,4%.

Пример 13. Методика мечения технецием-99 м модифицированных мини-антител DARPin

Во флакон вместимостью 10 мл вносят 100 мкл модифицированных мини-антител DARpin (50 мкг/мл) в буферном растворе (5 ммоль Tris, 40 ммоль K2HPO4⋅3H2O, 500 ммоль NaCl, pH 8,5). Затем последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией - 100 мг/мл (4 мг) и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией - 7 мг/мл (0,21 мг). Далее инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Выход реакции мечения - радиохимическую чистоту (РХЧ) полученного продукта оценивают методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) путем снятия хроматограмм в двух подвижных фазах: в ацетоне и в смеси С2Н5ОН: 25% NH4OH : H2O (2:1:5) с использованием полосок силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) с последующим изучением распределения активности 99mTc по длине радиохроматограмм.

Затем РХЧ рассчитывали по формуле:

РХЧ (%) = 100 - НТ-ГТ (%),

где РХЧ - радиохимическая чистота комплекса технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin, %;

НТ - процентное содержание не восстановленных пертехнетат ионов 99mTc(VII), %;

ГТ - процентное содержание гидролизованного технеция-99м (IV), связанного в коллоид, %.

Определение НТ

Для определения содержания невосстановленных пертехнетат ионов готовят пластины силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) размером 150 мм длиной и 20 мм шириной. Пробу исследуемого раствора (3-5 мкл) наносят на линию старта, отступив от одного из краев на 20 мм (линия старта), наносят пробу в определенном количестве (около 5 мкл), так чтобы статистически достоверно зарегистрировать на радиометрической установке, по крайней мере 0,5% активности от нанесенной. После высушивания пятна на воздухе полоску помещают в камеру, предварительно насыщенную ацетоном, в течение 1 ч. Хроматографирование проводят в ацетоне в течение 10 мин. В указанных условиях пертехнетат - 99mTc-ионы продвигаются с фронтом растворителя и имеют Rf=0,95±0,05, а комплекс технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin и гидролизованный технеций-99м (99mTcO2, IV) остаются на линии старта. Полученную хроматограмму высушивают на воздухе при комнатной температуре и обклеивают с обеих сторон полиэтиленовой пленкой с липким слоем (ГОСТ 20477-86) и измеряют скорость счета от участка, содержащего пертехнетат - 99mTc-ионы, и от всей хроматограммы радиометрическим методом.

Определение ГТ

Для определения содержания гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV), связанного в коллоид, готовят пластины силикагеля ПТСХ-АФ-А-УФ (Sorbfil) размером 150 мм длиной и 20 мм шириной. Пробу исследуемого раствора (3-5 мкл) наносят на линию старта, отступив от одного из краев на 20 мм (линия старта), наносят пробу в определенном количестве (около 5 мкл) так, чтобы статистически достоверно зарегистрировать на радиометрической установке, по крайней мере 0,5% активности от нанесенной. После высушивания пятна на воздухе полоску помещают в камеру, предварительно насыщенную смесью С2Н5ОН : 25% NH4OH : H2O (2:1:5), в течение 1 ч. Хроматографирование проводят в течение 40 мин. В указанных условиях пертехнетат - 99mTc-ионы и комплекс технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin продвигаются с фронтом растворителя, а гидролизованный технеций-99м (99mTcO2, IV) остается на линии старта и имеет Rf=0,05±0,05. Полученную хроматограмму высушивают на воздухе при комнатной температуре и обклеивают с обеих сторон полиэтиленовой пленкой с липким слоем (ГОСТ 20477-86) и измеряют скорость счета участка, содержащего гидролизованный технеций-99м, от всей хроматограммы радиометрическим методом.

Расчеты, сделанные по этим хроматограммам, показывают, что общее содержание примесей НТ (99mTc (VII)) и ГТ (гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV)) в препарате не превышает 3,7%, а его радиохимическая чистота составляет более 96%.

Приготовленный комплекс технеция-99м с модифицированными мини-антителами DARpin имеет состав, приведенный в таблице 1.

Таблица 1

Пример 14. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что после смесь инкубировали при нагревании до 50°С на водяной бане в течение 30 мин.

Последующее изучение РХЧ препарата согласно методике, приведенной в Примере 13, показало, что радиохимическая чистота препарата составила 92,0%.

Пример 15. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,07 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 69%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 9,8%.

Пример 16. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,14 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 75,1%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 5,8%.

Пример 17. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,28 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 93%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 8,2%.

Пример 18. Методика мечения технецием-99м модифицированных мини-антител DARPin

Реакционную смесь готовят так же, как и в примере 13, с тем отличием, что добавляют свежеприготовленный раствор олова (II) хлорида дигидрата в количестве 0,35 мг. Радиохимическая чистота полученного комплекса составляет 83%. Содержание примеси гидролизованного технеция-99м (99mTcO2, IV) составило 16,3%.

Обоснование режима

Как показали данные экспериментальных исследований, изложенные в вышеприведенных примерах, реакция активированного эфира с мини-антителами проявляет существенную зависимость от pH. При низких значениях pH (менее 8,1) происходит протонирование аминогрупп, в результате чего снижается эффективность реакции. При высоких значениях существенным становится процесс гидролиза активированного эфира (более 8,7). Оптимальным значением pH для модификации является 8,3-8,5 (примеры 5-9).

Поскольку активированный эфир имеет низкую растворимость в воде, в качестве сорастворителя использовали диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА) и 5 ммоль Tris-буфер (примеры 7, 10-11). Результаты мечения технецием 99m показали возможность применения всех указанных сорастворителей. Однако ДМФА может портиться при хранении, при этом в нем накапливается диметиламин, способный реагировать с активированными эфирами. Поэтому ДМФА для мечения должен быть хорошего качества или можно модификацию проводить в Tris-буфере или фосфатном буфере.

Для модификации мини-антител использовали фосфатный буфер и Tris-буфер (примеры 7 и 12). РХЧ в разных буферах имела высокое значение, следовательно, для модификации мини-антител можно проводить в указанных буферных растворах, однако, предпочтительнее фосфатный буфер.

Изменение температуры инкубирования при мечении технецием-99м модифицированных мини-антител показало, что повышение температуры приводит к снижению РХЧ, а содержание коллоида в пробе осталось на том же уровне, как и в примере 13, что говорит о нецелесообразности проведения инкубирования препарата с нагреванием на водяной бане до 50°С (примеры 13, 14).

Как известно [8], от количества хлорида олова (II) напрямую зависит радиохимическая чистота (РХЧ) получаемых радиофармпрепаратов и количество образующего в них коллоида типа (-O-TcO-O-SnCl2-O-TcO-)n, где n = 2, 3…- число, зависящее от pH раствора. Кроме того, высокая активность 99mTc, связанного на коллоиде (ГТ), приводит к нецелевому накоплению радиоактивности в печени.

В этой связи были проведены предварительные исследования для установления необходимого и достаточного количества Sn (II) в составе препарата, которое бы обеспечивало практически полное восстановление 99mTc (VII) при минимальном количестве образующегося коллоида в виде гидролизованного технеция-99м (примеры 13, 15-18).

Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Из представленных результатов следует, что оптимальной концентрацией SnCl2⋅2H2O в составе смеси является 0,21 мг (п. 3), при которой достигается максимальное значение радиохимической чистоты препарата при минимальном содержании гидролизованного технеция-99 м (табл. 2).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать целевой продукт с высокой радиохимической чистотой и выходом комплекса технеция-99 м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, также отличается простотой и доступностью выполнения, что является перспективным для производства в промышленном масштабе.

Изобретение поясняется чертежами, где:

Фигура 1 - Схема получения ω-бис(пиридин-2-илметил)амино)алифатических кислот - прекурсоров с хелатными центрами для связывания металлов.

Фигура 2 - Схема получения сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата прекурсора с хелатными центрами для связывания металлов.

Фигура 3 - 1Н-ЯМР-спектр сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц).

Фигура 4 - Элементный анализ сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино) гексаноата.

Фигура 5 - 1Н-ЯМР-спектр метил 6-иодгексаноата (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц).

Фигура 6 - 1Н-ЯМР-спектр метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата (300 МГц, CDCl3, δ, м.д., J, Гц).

Фигура 7 - Элементный анализ метил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноата.

Фигура 8 - 1Н-ЯМР-спектр 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты (в виде гидрохлорида) (300 МГц, H2O, δ, м.д., J, Гц).

Фигура 9 - Элементный анализ 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексановой кислоты.

Источники информации

1) DARPins: A new generation of protein Therapeutics / Michael T. Stumpp, H. Kaspar Binz and Patrick Amstutz // Drug Discovery Today. Volume 13, Numbers 15/16. August 2008. P. 695-701.

2) Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin)G3 for HER2 molecular imaging / Robert Goldstein, Jane Sosabowski, Maria Livanos, Julius Leyton, Kim Vigor, Gaurav Bhavsar, Gabriela Nagy-Davidescu, Mohammed Rashid, Enrique Miranda, Jenny Yeung, Berend Tolner, Andreas Pluckthun, Stephen Mather, Tim Meyer, Kerry Chester // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2015) 42:288-301.

3) Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения / С.М. Деев, Е.Н. Лебеденко // Acta naturae. №1. 2009. С. 32-50.

4) Hofstrom С, Altai М, Honarvar Н, Strand J, Malmberg J, Hosseinimehr SJ, et al. HAHAHA, HEHEHE, HIHIHI, or HKHKHK: influence of position and composition of histidine containing tags on biodistribution of [(99m)Tc(CO)3](+)-labeled affibody molecules. J Med Chem. 2013; 56: 4966-74.

5) 99mTc-labeling and in vitro characterization of N4- and N3S-RGDS-derivative peptides / A. Perera Pintado, S.J. Mather, M.A. Stalteri, D. Allison, A. Prats Capote, A. Hernandez Cairo, O. Reyes Acosta, M. Bequet Romero // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 275, No.3 (2008). P. 619-626. Патент №2537175 от 31.10.2014.

6) Use of a HEHEHE Purification Tag Instead of a Hexahistidine Tag Improves Biodistribution of Affibody Molecules Site-Specifically Labeled with 99m-Tc, 111-In and 125-I / Camilla Hofstrom, Anna Orlova, Mohamed Altai, Fredrik Wangsell, Torbjorn Graslund and Vladimir Tolmachev // J. Med. Chem. 2011, 54, 3817-3826.

7) Патент 2537175. Способ получения радиоиммунного препарата для диагностики и терапии онкологических заболеваний / Чувилин Д.Ю., Загрядский В.А., Дубинкин Д.О., Бочагин Ф.С., Панченко В.Я., Деев С.М., Головаченко В.А., Решетов И.В.

Зайцева Л.Л., Величко А.В., Виноградов И.В. Соединения технеция и области их применения // Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1984. - Т. 9. - С. 180.

Способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами DARPin для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu, включающий связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, отличающийся тем, что на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом в Tris-буферном растворе, в растворе ДМСО или ДФМА, при этом, используют растворы мини-антител DARPin в Tris-буфере или фосфатном буфере с pH 8,3-8,5, синтез проводят при перемешивании 4 часа при комнатной температуре, далее выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С, далее модификацию проводят при соотношении мини-антител к сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноату - 1:5 - 20, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75, на втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin в количестве 50 мкг в буферном растворе при pH 8,3-8,5 последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м 300-1200 МБк и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования степени вероятности выполнения циторедуктивной операции в оптимальном объеме у больных диссеминированным раком яичников.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения присутствия белка STEAP-1 в биологическом образце, полученном от индивида, имеющего подозрение на метастатический рак предстательной железы.

Изобретение относится к психологии. Диагностику школьной дезадаптации у младших школьников осуществляют путем определения методом РИА уровня АКТГ в сыворотке крови ребенка.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения времени прогрессии рака легкого. .

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и предназначено для диагностики до клинической манифестации рецидива серозного рака яичников после проведенного радикального лечения.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биохимических, иммунологических и биологических исследованиях, а также при производстве препаратов инсулинов для терапевтических целей.

Изобретение относится к области радиационной биохимии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и онкологии. .

Изобретение относится к медицине и касается способа получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами DARPin для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2neu, включающего связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, где на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-амино)гексаноатом, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией. На втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin последовательно добавляют раствор технеция-99м, свежеприготовленный раствор цитрата натрия, свежеприготовленный раствор олова хлорида дигидрата и инкубируют при комнатной температуре. Изобретение обеспечивает получение целевого продукта с высокой радиохимической чистотой и выходом. 9 ил., 2 табл., 18 пр.

Наверх