Способ получения гибридного белка, состоящего из рекомбинантного белка аналога интерферона гамма, конъюгированного с олигосахаридом

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения гибридного белка на основе рекомбинантного аналога интерферона гамма, обладающего противовирусной активностью. Предложенный способ включает конъюгацию рекомбинантного аналога интерферона гамма, представленного последовательностью SEQ ID NO: 1, с полимером олигосахаридной природы D3000-7(Sa-Sp)-(Sp-M), имеющим строение, представленное на фиг. 8, где D3000 - диальдегид декстран, (Sa-Sp) - Neu5Ac-Lactose-N(CH)-CH(2)-CH(2)-NH(2), (Sp-M) - Малеимид-СН(2)-NH(2), очистку полученного конъюгированного рекомбинантного белка аналога интерферона гамма от неконъюгированных компонентов методами HPLC с гельфильтрационным сорбентом Sephacryl S400 с выходом конечного продукта, содержащего примеси не более 1,2% от общей массы продукта. 16 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения гибридного белка на основе рекомбинантного аналога интерферона гамма для лечения герпесвирусной инфекции за счет конъюгации рекомбинантного аналога гамма интерферона с полимером олигосахаридной природы.

Герпесвирусной инфекцией (ГВИ) поражено более 80% человечества. ГВИ вызывает множество различных заболеваний, поражающих различные органы и системы человека. ГВИ является второй по значимости причиной смертности новорожденных и детей младшего возраста, связанной с вирусными заболеваниями [Williams E.J., Embleton N.D., Clark J.E. et al. Viral infections: contributions to late fetal death, stillbirth, and infant death. J. Pediatr. 2013, Vol. 163. № 2. P. 424-428]. Отсутствие действенных вакцин и невозможность полного излечения в совокупности с широким охватом популяции определяют актуальность герпесвирусной инфекции.

Применение интерферонов является наиболее перспективным для терапии ГВИ. Из всех видов интерферонов интерферон гамма является наиболее эффективным для терапии ГВИ [Complexity of interferon-g interactions with HSV-1. Nancy J. Bigley// Frontiers in immunology, 2014. doi: 10.3389/fimmu.2014.00015].

Существующие препараты интерферона гамма основаны на молекуле, экспрессируемой в E.coli, и имеют антивирусную активность, сравнимую с природным интерфероном гамма. Однако эти препараты имеют короткий период полувыведения и нестабильную структуру.

Человеческий интерферон гамма представляет собой гликозилированный белок, но при экспрессии в E.coli гликозилирование интерферона гамма невозможно. Показано, что N-гликозилирование обеспечивает устойчивость к гидролизу протеазами организма [N-glycosylation of human interferon-y: glycans at Asn-25 are critical for protease resistance. T. SARENEVA, J. PIRHONEN, K. CANTELL, I. JULKUNEN// Biochem. J. (1995) 308, 9-14].

Препарат на основе рекомбинантного аналога интерферона гамма, конъюгированного по остатку цистеина, введенному в район сайта природного гликозилирования олигосахаридом, несущим сиаловые кислоты, должен сохранять в полном объеме биологическую активность и обладать улучшенной фармакокинетикой по сравнению с нативным интерфероном гамма. Такой препарат представляет большой интерес для терапии ГВИ, т.к. позволит преодолеть недостатки существующих препаратов.

Наличие остатков сиаловых кислот в молекуле олигосахарида приводит к стабилизации молекулы и предотвращению образования антител к ней. На данный момент ведется активная разработка лекарственных препаратов на основе белков, несущих олигосахариды, содержащих остатки сиаловых кислот [Bioconjug Chem. 2012, Aug 15; 23(8): 1524-33. Glycoengineering approach to half-life extension of recombinant biotherapeutics].

Ковалентное присоединение олигосахаридов к субстрату возможно двумя различными путями, один из которых называют присоединение по одиночному концевому остатку, другой можно назвать многоточечным присоединением. В первом случае олигосахариды присоединяются через концевой восстанавливающий остаток (например, остаток глюкозы). Для второго метода характерно присоединение к различным остаткам внутри последовательности олигосахарида. В природе встречается только один способ присоединения через восстанавливающий конец полимера. До сравнительно недавнего времени получаемые in vitro конъюгаты олигосахаридов с белками синтезированы хорошо известным методом периодатного окисления винильных диольных групп внутренних остатков с образование двух альдегидов, реагирующих с аминогруппами белков. Это приводило к образованию сложных полимерных молекул, малопригодных для фармацевтики.

Использование альдегидной функции концевого восстанавливающего остатка теоретически возможно, но долгое время было затруднено из-за чрезвычайно низкой реакционной способностью присутствующего геми-ацеталя. Были разработаны методы, позволяющие получать на восстанавливающем конце олигосахарида альдегидную группу. В патенте US 6653457 от 11. 25, 2003. описано получение производных гепарина с альдегидной группой. Используя то обстоятельство, что гепарин - полностью сульфатированный олигосахарид, были разработаны методы селективного восстановления концевого полуацеталя с образованием на этом месте винициальных диолов с последующим их селективным окислением периодатом с образованием альдегидов, способных реагировать с аминогруппами различных субстратов. Гепарин как олигосахарид обладает антитромбической активностью и не может быть универсальной альтернативой пегилированию, так как у получаемых конъюгатов возможны побочные действия, связанные с такой активностью.

В патенте РФ КОНЪЮГАТЫ ПОЛИПЕПТИДА И ОЛИГОСАХАРИДА описаны ковалентные конъюгаты полипептида и олигосахарида, в которых полипептид конъюгирован по меньшей мере к одному олигосахаридно-спейсерному остатку, где олигосахарид представляет собой синтетический сульфатированный пентасахаридный остаток. По существу, синтетический олигосахарид представляет собой аналог гепарина, но его размер приводит к терапевтически не значимой активности при концентрациях до 50 нМ на дозу. В дополнение к предыдущему патенту, олигосахарид снабжен спейсером. Спейсер представляет собой алифатическую группу, на активном конце которой могут находится любые функциональные группы для образования ковалентных связей с белком. Полученные конъюгаты имеют улучшенные фармакокинетические свойства по сравнению с соответствующими неконъюгированными полипептидами. Описаны, например, конъюгаты пептида с инсулином.

Идеи, заложенные в этих двух патентах, не могут быть прямо перенесены на другие олигосахариды, так как гепарин - это полностью сульфатированное производное, не имеющее внутренних свободных диольных групп, способных к реакции окисления периодатом. Для остальных сахаров необходимо было разработать дополнительные методы инактивации таких диольных групп.

В патентах US 7807824 и 7691826 описаны методы получения конъюгатов полисиаловых кислот с белками. Конъюгаты получены путем активации восстанавливающего остатка полисиаловой кислоты и получения различных активированных производных, реагирующих с амино- и тио-группами белков. Получение концевой альдегидной группы достигается двухстадийным методом. На первом этапе происходит окисление периодатом внутренних диолов, затем их восстановление боргидридом с одновременным восстановлением концевого полукеталя до диола. На втором этапе вновь образованный диол селективно окисляется до альдегида. В итоге получается полимер, несущий единственную реакционноспособную группу на восстанавливающем конце олигосахарида. Последующая реакция альдегида с гетерофункциональными реагентами позволяет получать различные реакционноспособные производные, избирательно реагирующие с белками. Получены олигосахариды, содержащие в качестве реакционноспособных групп N-оксисукцинимидную, малеимидную или дитиопиридильную активные группы.

Описаны конъюгаты по аминогруппам белков и по свободным цистеинам. Показано, что такие конъюгаты по своим свойствам не уступают аналогичным конъюгатам с ПЭГ (по времени полувыведения и сохранением биологических свойств), но обладают низкой иммуногенностью. Описанные методы конъюгации довольно трудоемки и приводят в процессе цепи окисления-восстановления к продуктам с близкими физико-химическими свойствами и в силу этого трудно разделяемым методами хроматографии. В научной литературе описаны реакции восстанавливающего полуацеталя олигосахаридов с замещенными производными гидроксиламинов (Peri F., Dumy P., Mutter M. Chemo- and stereoselective glycosylation of hydroxylamino derivatives: a versatile approach to glycoconjugates. Tetrahedron 1998; 54:12269-12278). Такие реакции проходят селективно и в мягких условиях. Евразийский патент «Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное (варианты), способ его получения, применение конъюгата и содержащая его фармацевтическая композиция».

В патенте US 7815893 описано применение в качестве олигосахарида производных гидроксилкрахмала. Восстанавливающий конец полимера активировали реакцией с O-[2-(2-аминооксиэтокси)этил]гидроксиламином. Полученное производное обрабатывали гетеро-бифункциональными реагентами и получали конъюгаты с белками. Получено много белков, конъюгированных с крахмалом и его производными.

Применяемый в заявленном способе олигосахарид приближен к сахарам, прикрепленным к природным гликопротеинам, применяемым в фармацевтике. Остатки олигосахаридов этих белков содержат сиаловую кислоту, находящуюся противоположно восстанавливающему концу. Синтез таких олигосахаридов и их ковалентное присоединение к полипептидному субстрату позволит получать конъюгаты с улучшенными свойствами по сравнению с полисиаловыми производными или производными на основе немодифицированных природных олигосахаридов типа декстрана, хитозана или крахмала.

Изобретение решает задачу получения рекомбинантного белка для лечения герпесвирусной инфекции за счет конъюгации рекомбинантного аналога интерферона гамма с последовательностью SEQ ID NO 1 с полимером олигосахаридной природы, имеющего уникальную структуру, путем образования ковалентной связи между молекулами полимера и рекомбинантного белка, а также предлагает способ очистки полученного средства.

Также задачей данной работы было создание олигосахарида путем образования ковалентных связей между семью молекулами сиаловой кислоты (N-ацетил-неурамин-лактозы (N5Ac-Lactose)) посредством спейсеров с молекулой декстрана 3000 и активирования полученной конструкции (олигосахарид) для конъюгации ее с рекомбинантным аналогом интерферона гамма человека.

Способ получения гибридного белка, обладающего противовирусной активностью, включает конъюгацию рекомбинантного аналога интерферона гамма, представленного последовательностью SEQ ID NO: 1, с полимером олигосахаридной природы D3000-7(Sa-Sp)-(Sp-M), где D3000 -диальдегид декстран, (Sa-Sp) - Neu5Ac-Lactose-N(CH)-CH(2)-CH(2)-NH(2), (Sp-M) - Малеимид-СН(2)-NH(2), очистку полученного конъюгированного рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма от неконъюгированных компонентов методами HPLC с гельфильтрационным сорбентом Sephacryl S400 с выходом конечного продукта, содержащего примеси не более 1,2% от общей массы продукта.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание гибридного белка: рекомбинантного аналога интерферона гамма с SEQ ID NO: 1, конъюгированного с полимером олигосахаридной природы, при этом полученная структура олигосахарида: D3000-7(Sa-Sp)-(Sp-M) приводит к стабилизации молекулы и предотвращению образования антител к ней, т.е. получению субстанции, обладающей противовирусной активностью.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1. Электрофорез лизата клеток, экспрессировавших рекомбинантный белок, содержащий в своем составе последовательности рекомбинантного аналога интерферона гамма, соединенного с белком-стабилизатором - тиоредоксином. Трек 1 стандарты молекулярных весов; трек 2 лизат клеток; стрелкой отмечено положение рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма, соединенного с белком-стабилизатором в геле.

Фиг. 2. Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма, соединенного с белком-стабилизатором с Ni-Sepharose. Цифрами 1-9 отмечены фракции, отобранные для анализа

Фиг. 3. Электрофорез фракций, содержащих рекомбинантный белок после хроматографии на Ni-Sepharose. Треки 1-8 - фракции, содержащие целевой белок; стрелкой отмечено положение рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма, соединенного с белком-стабилизатором в геле. Фиг. 4. Гидролиз белка-предшественника, соединенного с белком-стабилизатором ферментом энтерокиназой-F на рекомбинантный белок ИФ гамма (16868Da) и белок-стабилизатор - тиоредоксин. Фиг. 5. Электрофорез гидролизной смеси рекомбинантного белка и энтерокиназы в различные промежутки времени. Трек 1 - реакционная смесь в начале эксперимента (время Т=1 мин); трек 2 - реакционная смесь через полчаса после начала эксперимента (время Т=30 мин); трек 3 - реакционная смесь через час после начала эксперимента (время Т=60 мин); трек 4 - стандарты молекулярных весов; стрелками отмечены: положение в геле рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма, соединенного с белком-стабилизатором (а), чистого рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма(б) и чистого белка стабилизатора (в).

Фиг. 6. Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма с SP-Sepharose (колонка HiPrep16/10 Q FF).

Фиг. 7. HPLC хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма с колонки Kromasil 300-5С18. Согласно хроматограмме чистота рекомбинантного белка более 99%.

Фиг. 8. Синтез активированного олигосахарида D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M.

Фиг. 9. Хроматографический профиль элюции D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M с препаративной колонки mono-Q (очистка).

Фиг.10. Хроматографический профиль элюции D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M с аналитической колонки mono-Q.

Фиг. 11 Схема фармацевтической субстанции.

Фиг. 12 Химическая реакция конъюгации активированного олигосахарида и рекомбинантного белка.

Фиг. 13 Хроматографический профиль гельфильтрации конъюгата рекомбинантного интерферона гамма с активированным олигосахаридом через Sephacryl S400. Стрелкой отмечен выход конъюгата.

Фиг. 14 Масс-спектр MALD-TOF моноиона рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма.

Фиг. 15 Периодатное окисление диоловых групп декстрана 3000 - получение ДАД.

Фиг. 16 Аминирование малемиднй группы - получение Малемид-СН(2)-СН(2)-NH(2) (Sp-M).

Таблица 1. Молекулярные массы компонентов активированного олигосахарида D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M.

Таблица 2. Антивирусная активность препаратов интерферона гамма на клетках WISH и DAUDI выраженная в ЕС 50 (пМ).

Подробное описание изобретения.

1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАТНОГО БЕЛКА - АНАЛОГА ИНТЕРФЕРОНА ГАММА.

Для получения рекомбинантного белка, представленного последовательностью SEQ ID NO 1, была создана генетическая конструкция по стандартной методике (Maniatis Т., Fritsch E.F., 1982.) на основе коммерческой плазмиды рЕТ32а. При создании плазмиды были использованы следующие последовательности регуляторных элементов (энхансеров и промотора): Гена МхА, представленных SEQ ID NO 3 и Гена ISG56, представленных SEQ ID NO 3. Плазмидой трансфецировались клетки E.coli штамма BL21(DE3). Полученной плазмидой рЕТ-32а/ИФ гамма трансформируют компетентные бактериальные клетки штамма Escherichia coli BL21(DE3) для получения растворимой фракции белка. Штамм BL21(DE3) (Invitrogen) предназначен для экспрессии рекомбинантных белков. Обозначение DE3 означает, что штамм содержит лизоген фага λ DE3, который несет ген для Т7 РНК-полимеразы под контролем lacUV5-промотора. Для индукции экспрессии Т7 РНК-полимеразы необходим IPTG (изопропил_β-D-1-тиогалактопиранозид). Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/рЕТ-32а/ИФ гамма обеспечивает получение слитного белка тиоредоксин - интерферон гамма. После трансфекции клетки пересевали в культуральную колбу с бульоном LB и канамицином 25 мкг/мл. Культура выращивалась на шейкере при 280 об/мин при температуре 37°С до достижения оптической плотности значения OD585=0,8E. Индукция экспрессии белка проводилась добавлением IPTG до концентрации 1 мM. Культура дополнительно культивировалась 4 часа, далее клетки осаждались центрифугированием при 5000g. Осадок клеток лизировали в 8 М мочевине и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе. Лизат клеток центрифугировали при 20000g 2 часа.

Конструкция рЕТ-32а, несущая ген, кодирующая рекомбинантный белок ИФ-гамма в клетках E.coli в виде слитного белка с белком-стабилизатором тиоредоксином, увеличивает уровень экспрессии и растворимость слитного белка.

2. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА - АНАЛОГА ИНТЕРФЕРОНА ГАММА НА SP-SEPHAROSE

Хроматографическая очистка рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма проходит в один этап на ионообменном сорбенте. В качестве носителя использовалась SP-Sepharose компании GE Helthcare. Для стандартизации процесса и его воспроизводимости использовались колонки типа HiTrap. В работе использовалась хроматографическая колонка HiPrepl6/10 Q FF, емкости которой хватило на весь объем выделяемого белка. Реакционная смесь после гидролиза и нагрева фильтруется через фильтр с порами 0,22 мкм от агрегатов денатурированных белков. Фильтрованная смесь наносится на колонку HiPrep16/10 Q FF, предварительно уравновешенную 25мM NaCl. Целевой белок элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 25мM NaCl, финальный буфер: 100мM NaCl. Элюат фракционировали. Наличие белка во фракции определяли электрофорезом в ПААГ. Хроматограмма представлена на фиг.6.

3. ОЦЕНКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА - АНАЛОГА ИНТЕРФЕРОНА ГАММА МЕТОДАМИ ХРОМАТОГРАФИИ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Оценка количества полученного рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма по Бредфорд показала, что в наличие 3212 мг белка. Чистоту рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма определяли методом HPLC - хроматографии, подлинность экспресс-методикой определения подлинности рекомбинантного аналога интерферона гамма как компонента лекарственного средства. Раствор, содержащий рекомбинантный белок - аналог интерферона гамма, диализовали против раствора 0,1% трифторуксусной кислоты. Отбирали 150 мкл раствора и наносили на колонку Kromasil 300-5С18 4,6ID150. Проводили аналитическую хроматографию. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 0,1% трифторуксусная кислота, 2% ацетонитрил, финальный буфер: 0,1% трифторуксусная кислота, 80% ацетонитрил. Рекомбинантный белок - аналог интерферона гамма сошел с колонки при концентрации ацетонитрила 32%. Согласно хроматограмме Фиг. 7 чистота рекомбинантного белка более 99%.

Проведен MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ моноиона рекомбинантного белка. Результаты представлены на Фиг. 14.

На масс-спектре получен набор из нескольких пиков с массами от 16871 до 16899Da. Это связано с тем, что на каждые 1000 единиц молекулярного веса в белковых молекулах из-за накапливания изотоп С13 масса молекулы увеличивается в среднем на 1 Da, т.о., вместо одной массы мы видим набор из нескольких масс. Мажорный пик соответствует массе 16897, наблюдается «рост» пика, соответствующего массе 16869, при этом пик 16869, который соответствует рекомбинантному белку - аналогу интерферона гамма, свободному от изотопов С13, мал, т.к. статистически на белковую молекулу массой более 10 кDa должна приходиться хотя бы одна молекула С13. Можно констатировать, что полученная масса для моноиона рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма соответствовала рассчитанной массе (16868 Da).

По итогам выполненной работы можно сделать следующие выводы.

Рекомбинантный белок - аналог интерферона гамма хроматографически очищен на SP-Sepharose. Рекомбинантный белок - аналог интерферона гамма наработан в количестве 3212 мг. Рекомбинантный белок - аналог интерферона гамма определен как подлинный экспресс-методикой определения подлинности рекомбинантного аналога интерферона гамма. Чистота рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма оценена методами HPLC. Подлинность оценена экспресс-методикой определения подлинности рекомбинантного аналога интерферона гамма как компонента лекарственного средства и MALDI-TOF масс-спектра моноиона белка.

4. СИНТЕЗ АКТИВИРОВАННОГО ОЛИГОСАХАРИДА D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M.

Синтез активированного олигосахарида происходит в три стадии:

а) взаимодействие ДАД с Neu5Ac-Lactose-N(CH)-CH(2)-CH(2)-NH(2) (Sa-Sp),

б) преобразование СООН-группы терминального остатка глюкозы декстранового кора в альдегидную группу СОН за счет обработки этаноламином;

в) введение малеимидной группы в декстрановый кор олигосахарида за счет взаимодействия Малемид-СН(2)-СН(2)-NH(2) (Sp-M) с СОН-альдегидной группы терминального остатка глюкозы.

ОКИСЛЕНИЕ ДЕКСТРАНА С ВЫДЕЛЕНИЕМ ДАД

Декстран активировали периодатным окислением диольных групп глюкозы. Реакция периодата с декстраном хорошо изучена и приводит к получению альдегидных групп, способных реагировать с первичными аминами с образованием основания Шиффа. Для отделения продукта реакции от избытка окислителя был использован метод анионообменной хроматографии на сильном анионообменике типа Q, позволяющей удалять анионы периодата, иодата и формиата, образующиеся при окислении сахара. Метод очень быстр, эффективен и позволяет получать активированный полимер с повышенной стабильностью при хранении. Dextran3000 растворяли в дистиллированной воде и смешивали с свежеприготовленным раствором периодата натрия. Образовавшийся раствор содержит диальдегид декстран (ДАД). Данный раствор смешивали с взвесью Dowex-1 в ацетатной форме, который поглощает ионы и побочные продукты реакции. Dowex-1 удаляется фильтрацией в растворе остается ДАД. Уравнение химической реакции представлено на Фиг. 15.

КОНЪЮГАЦИЯ СПЕЙСЕРА (SP) С МАЛЕИМИДНОЙ ГРУППЫ (М) С ВЫДЕЛЕНИЕМ SP-M Введение малеимидной группы в олигосахарид будет осуществлено конъюгацией производного SMCC со спейсером, в результате чего образуется производная малеимида, несущая NH2-группу, по которой и произойдет конъюгация с декстрановым кором. Взаимодействие SMCC со спейсером - получение Малеимид-СН(2)- CH(2)-NH(2) (Sp-M) - происходит в боратном буфере. Эквимолярные навески SMCC и спейсера растворяются в боратном буфере, затем смешиваются. Уравнение химической реакции представлено на Фиг. 16.

Реакция проходит посредством смешивания и инкубации растворов, содержащих ДАД, Neu5Ac-Lactose-N(CH)-CH(2)-CH(2)-NH(2) (Sa-Sp), Малеимид-СН(2)-СН(2)-NH(2) (Sp-M) и этаноламин.

Раствор ДАД и Sa-Sp смешиваются и инкубируются при 24°С 2 часа, далее вносится раствор этанол амина и смесь при той же температуре инкубируется при перемешивании 10 минут, затем вносится раствор Sp-M и при перемешивании через 30 минут реакция синтеза активированного олигосахарида проходит до конца.

Количество активированного олигосахарида малеимид-амино-ДЕКСТРАН-7[NH-СН(2)-СН(2-N(СН)-Lactose-Neu5Ac] (D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M) определяется гравиметрическим методом, основаным на определении веса высушенного остатка, полученного после выпаривания пробы. 1 мл раствора олигосахарида D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M помещают в гель-фильтрационную колонку PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare 28-9180-07), уравновешенную дистиллированной водой. Собирают 1 мл «проскока» и помещают его пробирку, затем пробирку взвешивают. На вакуумном выпаривателе при 70°С выпаривают воду. Взвешивают пробирку снова. Разница весов будет соответствовать количеству олигосахарида D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M.

Активированный олигосахарид - D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M получен в количестве 5144 мг.

Уравнение химической реакции представлено на Фиг. 8.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ элюции D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M с препаративной колонки mono-Q (очистка).

Активированный олигосахарид D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M анализировали методом HPLC-хроматографии на аналитической колонке mono-Q.

D3000-7(Sa-Sp)-Sp-M разбавили в 10 раз 5мM NaCl, нанесли на аналитическую колонку с mono-Q. Элюировали линейным градиентом. Стартовый буфер: 5мM NaCl, финальный буфер: 100 мM NaCl. Целевой продукт вышел при концентрации NaCl 45 мM. Хроматография представлена на Фиг. 10.

Таким образом, активированный олигосахарид состоит из 7+1 молекул спейсера, 7 молекул Lactose-Neu5Ac и молекулы малеимида с учетом потерь масс за счет утраты части молекул при образовании ковалентных связей получим набор масс компонентов активированного олигосахарида.

Таблица 1.

Расчетная масса всех компонентов активированного олигосахарида без молекулы декстрана составляет 5409 Da.

5. КОНЪЮГАЦИЯ ОЛИГОСАХАРИДА С РЕКОМБИНАНТНЫМ АНАЛОГОМ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА.

В процессе конъюгации происходит образование ковалентной связи между малеимидной группой активированного олигосахарида и -SH группой молекулы цистеина рекомбинантного аналога интерферона гамма. Технология подобрана таким образом, что компоненты данной химической реакции поступают в реактор, где и происходит конъюгация. Конъюгация проходит в присутствии 25 мM NaCl. Химическая реакция представлена на Фиг. 12.

Активированный олигосахарид берется в избытке. Реакционная смесь инкубируется 8 часов, реакция проходит с выходом более 94%.

Хроматографический профиль гельфильтрации конъюгата рекомбинантного интерферона гамма с активированным олигосахаридом через Sephacryl S400

В реакционную смесь добавляется раствор дитиотриитола для восстановления иминов в молекуле активированного олигосахарида. После инкубации в течение 10 минут реакционную смесь наносили на гельфильтрационную колонку ХК 50*100(18-87-68 GE Healthcare) с Sephacryl S400 (17-0506-01 GE Helthcare), предварительно уравновешенную водой.

Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли. Определяли массу рекомбинантного белка по Бредтфорд. Общее количество составило 4247 мг. Данные представлены на Фиг. 13.

Хроматографическая очистка полученного конъюгата. Через колонку К5 с гельфильтрационным сорбентом Sephacryl S400, уравновешенную дистиллированной водой, пропускают фильтрованный раствор фармацевтической субстанции. На колонке К5 хроматографа ХР5 происходит обессоливание и отделение непрореагировавших компонентов от продукта - фармацевтической субстанции. Первый пик - целевой продукт (1.725 л), далее выходят рекомбинантный аналог интерферона гамма и активированный олигосахарид, затем соли с выходом конечного продукта, содержащего примеси не более 1,2% от общей массы продукта.

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ

Тестирование противовирусной активности препаратов проводилось с использованием культуры клеток DAUDI и WISH. Для этого клетки засеивали в 96- луночный планшет в количестве 20 тыс. кл/лунку в объеме 100 мкл/лунку полной среды Игла -MEM (содержащей 10% фетальной сыворотки 300 мг/л L-глутамина и антибиотик гентамицин 100 мг/мл). Инкубировали в течении суток в CO₂-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO₂. После инкубации культуру клеток отмывали от сывороточной среды Игла-MEM, для этого снимали старую среду Игла-MEM и, не касаясь клеточного монослоя, с помощью многоканальной пипетки вносили по 100 мкл/лунку стерильного ФБС раствора, инкубировали в течение 5 мин, затем отбирали физиологический раствор, не касаясь монослоя клеток, и вносили по 100 мкл/лунку бессывороточной среды Игла-MEM. После отмывки в культуру клеток вносили исследуемые препараты - интерферон гамма, ФС и ЛП в десятикратных разведениях (0,001 пМ, 0,01 пМ, 0,1 пМ, 1,0 пМ) и инкубировали 1 сутки в CO₂-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO₂. После инкубации в культуру клеток вносили вирус VSV штамм Indiana в дозе 100 ЦПД на лунку в объеме 100 мкл безсывороточной Игла-MEM. Рабочее разведение вируса получали путем разбавление лабораторного стандарта с титром 104 /мл двумя последовательными 10-кратными разведениями. После внесения смеси в лунки клетки инкубировали в течение 1-2 суток в CO₂-инкубаторе при 37°С до появления цитопатического действия. Ячейки планшета с клетками промывали стерильным физиологическим раствором, ФБС, два раза по 200 мкл буфера, и добавляли по 100 мкл раствора 0,1 мг/мл красителя МТТ в среде Игла-MEM. Пурпурные кристаллы формазана становятся заметными после инкубации 3-5 часов. Для растворения формазана в ячейки добавляют по 100 мкл изопропилового спирта. Планшет спектрофотометрировали при 590 нм. Результаты наносили на кривую и графически определяли ЕС 50 - (концентрация препарата, оказывающего 50%-ный противовирусный эффект). Результат исследований приведен в таблице 2.

Для ФС и ЛП в сравнении с продающимся интерфероном гамма были изучены механизмы их противовирусной активности в четырех концентрациях (0,001 пМ, 0,01 пМ, 0,1 пМ, 1,0 пМ), Было показано, что коммерческий препарат сравнения интерферон гамма проявил противовирусную активность к модельному вирусу VSV на клетках WISH и DAUDI, что продемонстрировано выраженным повышением оптической плотности в зависимости от типа клеток, противовирусную активность разработанных ФС и ЛП, практически равную с коммерческим препаратом для аналогичного ингибирования цитопатического действия вируса.

Таким образом, рекомбинантный аналог интерферона гамма не изменяет время жизни конформации (заряда) при взаимодействии с рецепторами IFNGR1 и IFNGR2 при одинаковой концентрации по сравнению с природным аналогом, что в свою очередь приводит к одинаковому уровню ингибирования вируса.

Способ получения гибридного белка, обладающего противовирусной активностью, включающий конъюгацию рекомбинантного аналога интерферона гамма, представленного последовательностью SEQ ID NO: 1, с полимером олигосахаридной природы D3000-7(Sa-Sp)-(Sp-M), имеющим строение, представленное на фиг. 8, где D3000 - диальдегид декстран, (Sa-Sp) - Neu5Ac-Lactose-N(CH)-CH(2)-CH(2)-NH(2), (Sp-M) - Малеимид-СН(2)-NH(2), очистку полученного конъюгированного рекомбинантного белка - аналога интерферона гамма - от неконъюгированных компонентов методами HPLC с гельфильтрационным сорбентом Sephacryl S400 с выходом конечного продукта, содержащего примеси не более 1,2% от общей массы продукта.